CN104072609B - 一种卵黄抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种卵黄抗体的制备方法，其采用灭活的保藏编号为CGMCC NO.9181的大肠埃希氏菌HNJD2014免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化卵黄抗体。本发明采用灭活的大肠埃希氏菌HNJD2014，能够持续性获得高纯度的抗原；获得的卵黄抗体效价高，免疫效果好；能够有效预防和治疗仔猪腹泻，增强机体的免疫功能，促进猪的生长发育。
Description
技术领域
本发明属于预防仔猪腹泻的卵黄抗体制备技术领域，具体涉及一种预防仔猪腹泻的卵黄抗体的制备方法。
背景技术
近年来，仔猪腹泻给规模化养猪场造成了巨大的经济损失。流行病学调查结果表明，在2010年至2012年，流行性腹泻病毒导致的腹泻发生率为39％至47％。大肠杆菌、沙门氏菌、轮状病毒、传染性胃肠炎病毒等病原体也是导致仔猪腹泻的重要病原体。抗生素的大量应用并没有从根本上控制仔猪腹泻的问题，大量使用还容易产生耐药性和畜产品药物残留，有悖于养猪业的绿色可持续发展。寻求绿色环保的预防性的抗生素替代品成为目前畜牧业健康发展的首选方案。卵黄抗体在疾病的预防、治疗和诊断上发挥着重要的作用。有研究表明，基于抗PRRSV-N蛋白的卵黄抗体可以诊断PRRS病原。卵黄抗体对产生相应抗原的病原体的生长具有显著的抑制作用，多项研究已经证实卵黄抗体的体内和体外的抑菌特性，其对细菌性腹泻和病毒性腹泻具有良好的防治作用。总之，卵黄抗体在动物传染性疾病的预防和治疗过程中具有良好的应用前景，可以替代抗生素的使用，减少病原体的耐药性，是一种新型的绿色环保型抗生素替代品。
卵黄抗体特点：IgY具有良好的稳定性，耐热、耐酸、耐碱，抗离子强度，并具有一定抗酶解能力。研究表明，IgY能够抵抗幼龄动物肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。家禽免疫系统的特性决定小剂量的抗原便可发挥作用，因此可以用少量抗原在较长时间获得大量高滴度特异性抗体。一个母鸡每年大约能产280枚鸡蛋，每个卵黄里面含有100～150mgIgY，因此每只鸡每年能够产生40g特异性卵黄抗体，具有很大的生产潜力。因此，与其他哺乳动物制备多克隆抗体相比，特异性IgY抗体制备有着经济、易操作、产量大等优点。但是现有的制备纯化卵黄抗体的方法还有待进一步多元化以及提高效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种预防仔猪腹泻的卵黄抗体的制备方法，该方法与现有技术相比操作简单，成本低，制备效率高，抗体效价高。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种卵黄抗体的制备方法，采用灭活的保藏编号为CGMCC NO.9181的大肠埃希氏菌HNJD2014免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化卵黄抗体。
采用TSB液体培养基培养大肠埃希氏菌HNJD2014。
大肠埃希氏菌HNJD2014采用0.25％～0.35％甲醛在37℃灭活24小时。优选大肠埃希氏菌HNJD2014采用0.3％甲醛在37℃灭活24小时。
用甲醛灭活并进行浓缩，细菌含量为(1.5～3)×109个/mL，佐剂为白油佐剂，白油佐剂包括94重量份白油、6重量份司本80、2wt％硬脂酸铝，水相与油相按体积比2:1混合，采用磁力搅拌器充分混匀。
选择100羽180～220日龄蛋鸡，胸肌分点免疫，0.8～1.0mL/羽，首次免疫后每隔15d进行加强免疫，首次免疫45～50d后，抽检蛋样滴度，当凝集效价大于1:512后作为高免鸡蛋收集，其后每隔30～40d再加强免疫一次，即可得到凝集价为1:512的持续高效价IgY的鸡蛋。
从鸡蛋蛋黄中提取纯化卵黄抗体时，获得的蛋黄充分搅匀，按照体积比1:1加入蒸馏水稀释，充分搅匀；量取蒸馏水，按2.85％～3.15％质量比添加泊洛沙姆，充分溶解，将溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黄液中充分搅匀，使包含蛋黄液的终体系中泊洛沙姆的含量为0.95～1.05wt％；静置使脂质充分沉淀。
优选鸡蛋蛋黄中提取纯化卵黄抗体时，获得的蛋黄充分搅匀，按照体积比1:1加入蒸馏水稀释，充分搅匀；量取蒸馏水，按3％质量比添加泊洛沙姆，充分溶解，将溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黄液中充分搅匀，使包含蛋黄液的终体系中泊洛沙姆的含量为1wt％；静置使脂质充分沉淀。
蛋黄脂质沉淀过后，将上清液过滤；添加8wt％～12wt％麦芽糊精、3wt％～5wt％β-环糊精、2wt％～4wt％微晶纤维素3种辅料，充分搅匀；然后喷雾干燥，喷雾干燥条件：进风温度170～190℃，蠕动泵18～20转每分钟，风速频率为55～60Hz。
一种用于制备卵黄抗体抗原的大肠杆菌，所述的大肠杆菌是大肠埃希氏菌HNJD2014，保藏编号为CGMCC NO.9181。
该菌株从患病仔猪体内分离筛选得到，经16S rRNA基因鉴定为Escherichia coli属，命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HNJD2014；
保藏日期：2014年5月20日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏号：CGMCC No.9181。
本发明带来的有益效果
1、大肠杆菌菌种保藏编号为CGMCC NO.9181由本发明人分离保藏，经PCR鉴定，该菌种可表达ST、LT及志贺毒素，能够很方便地直接获得这三种毒素引起的仔猪腹泻的抗体，使得产生的抗体具有更好的保护力，能够持续性获得高纯度的抗原；
2、利用灭活的大肠杆菌菌种CGMCC NO.9181免疫蛋鸡，可以高效率地获得卵黄抗体；
3、获得的卵黄抗体效价高，免疫效果好；能够有效预防和治疗仔猪腹泻，增强机体的免疫功能，促进猪的生长发育；
4、采用喷雾干燥技术简化卵黄抗体纯化生产工艺，使卵黄抗体在猪场大规模应用成为可能；
5、在生产过程中避免使用有机溶剂等有害物质，减少污染，保护环境；
6、操作条件容易掌握，生产效率高，生产成本可大幅降低。
附图说明
图1为大肠埃希氏菌HNJD2014菌落图；
图2为大肠埃希氏菌HNJD2014毒素PCR鉴定结果；
图2中M表示DNA分子Marker2000，ST表示耐热肠毒素，分子大小240bp；LT表示不耐热肠毒素，分子大小300bp；eVT表示志贺毒素，分子大小469bp。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1
1、大肠杆菌IgY制备具体方案
大肠杆菌菌种CGMCC NO.9181由本实验室分离保藏，采用TSB平板培养，生成圆形突起、光滑、湿润、半透明的乳白色菌落，如图1所示。本菌在普通培养基上生长良好，最适生长温度为37℃，最适生长pH为7.2～7.4。经PCR鉴定，该菌种可表达ST(耐热肠毒素)、LT(不耐热肠毒素)及志贺毒素，如图2所示。采用TSB液体培养基大量培养大肠杆菌，用0.25～0.35％甲醛灭活并进行浓缩，优选甲醛浓度为0.3％，细菌含量为(1.5～3)×109/mL，佐剂为白油佐剂(94份白油、6份司本80、2％硬脂酸铝)，水相与油相按2:1体积混合，用磁力搅拌器在室温下充分混匀，转速为1200转/分钟。选择100羽180～220日龄蛋鸡，胸肌分点免疫，0.8～1.0mL/羽。首次免疫后每隔15d进行加强免疫，首次免疫45～50d后，抽检蛋样滴度，当凝集效价大于1:512后作为高免鸡蛋收集，其后每隔30～40d再加强免疫一次，即可得到持续高价IgY的鸡蛋(凝集价为1:512)。
2、鸡蛋消毒及蛋黄分离
采用千分之一浓度的聚维酮碘浸泡鸡蛋消毒，清除蛋壳上的污点，打蛋分离蛋黄和蛋清。
3、蛋黄脂质沉淀
获得的蛋黄充分搅匀，按照体积比1:1加入蒸馏水稀释，充分搅匀；量取蒸馏水，按2.85～3.15wt％的量添加泊洛沙姆，优选3wt％的泊洛沙姆，充分溶解，将溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黄液中充分搅匀；使蛋黄液终体系中泊洛沙姆的含量为0.95～1.05wt％，优选1wt％的泊洛沙姆；静置使脂质充分沉淀。
蛋黄中脂质含量达到36％，在喷雾干燥过程中容易导致旋风分离器发生粘壁。降低蛋黄中脂肪含量是解决粘壁问题的关键。泊洛沙姆能够沉淀蛋黄中的脂肪，脱脂后的蛋黄液喷雾干燥过程粘壁现象明显降低。泊洛沙姆是一类由聚氧乙烯(PEO)、聚氧丙烯(PPO)组成的PEO-PPO-PEO型非离子三嵌段共聚物。它具有表面活性，良好的安全性。
4、卵黄抗体喷雾干燥
蛋黄脂质沉淀过后，将上清液过滤。添加8wt％～12wt％麦芽糊精、3wt％～5wt％β-环糊精、2wt％～4wt％微晶纤维素3种辅料，充分搅匀。采用BILON-6000Y喷雾干燥机喷雾干燥。喷雾干燥条件：进风温度170～190℃，蠕动泵18～20转每分钟，风速频率为55～60Hz。将收集的喷雾干燥卵黄抗体粉装入封口袋，密封保存。
5、大肠杆菌IgY滴度评估(微量凝集实验)
将过夜培养的大肠杆菌液进行10倍浓缩，过夜培养菌含量为1.5×109个/mL。采用PEG6000沉淀法提取蛋黄中的IgY，具体过程为：蛋黄液与PBS按1:2混合，加入3.5％PEG6000，10000rpm离心15min，收集上清并过滤，加入8.5％PEG6000,10000rpm，15min，弃上清，用PBS悬浮沉淀，加入12％PEG6000再次沉淀，即可获得较纯的IgY。
按棋盘法对抗原抗体进行稀释，抗原作1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8，抗体作1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024，各加50μl，37℃作用1～4h，每隔30min进行观察，观察沉淀的效果，结果显示抗原在1:4～1:6，抗体在1:128～1:512，结果最为明显。
实施例2本发明制备的卵黄抗体预防腹泻效果
株洲某猪场，该场2013年10月份爆发腹泻，仔猪出生后3～4天腹泻严重，黄色水样粪便，小猪死亡很多。经实验室诊断为大肠杆菌导致的腹泻。
随机选择30头待产母猪，试验组和对照组各15头，按照栏位间隔排列。试验组(A)母猪所产仔猪采用本发明制备的卵黄抗体灌服：卵黄抗体粉采用生理盐水稀释，1克卵黄抗体粉加生理盐水2mL，出生后1小时内灌服3mL；对照组(B)母猪所产仔猪不做任何处理。饲养管理条件一致。观察并记录仔猪腹泻情况。试验结果如下所示。
数字1、2、3分别表示不同程度的腹泻：1表示轻微腹泻，粪便变软；2表示中度腹泻，粪便水样；3表示严重腹泻，粪水分离状态。表格中数字表示每天观察到的腹泻次数，根据漏粪板上粪便状况而定。最终结果由腹泻指数评定，数值越大，腹泻越严重。腹泻指数＝粪便评分之和/供试验仔猪总头数。
表1卵黄抗体预防仔猪腹泻效果
从表1可以看出，试验组仔猪腹泻指数比对照组偏低，说明本发明所制备的卵黄抗体具有很好的预防腹泻的效果。
实施例3本发明制备的卵黄抗体的促生长性能
选用21日龄的早期断奶仔猪180头，随机均匀分成2组，每组90头，第Ⅰ组采用基础日粮饲喂，第Ⅱ组采用基础日粮加0.5％的卵黄抗体粉。试验期共10天。每组分成3栏饲喂，自由饮水，饲养管理条件一致。
表2卵黄抗体粉促生长效果
从表2数据可以看出，添加本发明制备的卵黄抗体组的平均个体日增重均大于对照组。结果表明，本发明制备的卵黄抗体能够促进保育猪的生长发育。从料肉比来说，本发明制备的卵黄抗体的促生长作用高于对照组，添加本发明制备的卵黄抗体的料肉比(1.214)低于对照组(1.391)。综上所述，本发明制备的卵黄抗体具有很好的促生长作用。
Claims (5)
1.一种用于制备卵黄抗体抗原的大肠杆菌，其特征在于，所述的大肠杆菌是大肠埃希氏菌HNJD2014，保藏编号为CGMCC NO.9181。
2.利用权利要求1所述的大肠杆菌制备卵黄抗体的方法，其特征在于，采用灭活的保藏编号为CGMCC NO.9181的大肠埃希氏菌HNJD2014免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化卵黄抗体；具体如下：
1)大肠埃希氏菌HNJD2014采用0.25％～0.35％甲醛在37℃灭活24小时；
2)用甲醛灭活后进行浓缩，细菌含量为(1.5～3)×109个/mL，佐剂为白油佐剂，白油佐剂包括94重量份白油、6重量份司本80、2wt％硬脂酸铝，水相与油相按体积比2:1混合，采用磁力搅拌器充分混匀；
3)选择100羽180～220日龄蛋鸡，胸肌分点免疫，0.8～1.0mL/羽，首次免疫后每隔15d进行加强免疫，首次免疫45～50d后，抽检蛋样滴度，当凝集效价大于1:512后作为高免鸡蛋收集，其后每隔30～40d再加强免疫一次，即可得到凝集价为1:512的持续高效价IgY的鸡蛋；
4)从鸡蛋蛋黄中提取纯化卵黄抗体时，获得的蛋黄充分搅匀，按照体积比1:1加入蒸馏水稀释，充分搅匀；量取蒸馏水，按2.85％～3.15％质量比添加泊洛沙姆，充分溶解，将溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黄液中充分搅匀，使包含蛋黄液的终体系中泊洛沙姆的含量为0.95～1.05wt％；静置使脂质充分沉淀；
5)蛋黄脂质沉淀过后，将上清液过滤；添加8wt％～12wt％麦芽糊精、3wt％～5wt％β-环糊精、2wt％～4wt％微晶纤维素3种辅料，充分搅匀；然后喷雾干燥，喷雾干燥条件：进风温度170～190℃，蠕动泵18～20转每分钟，风速频率为55～60Hz。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用TSB液体培养基培养大肠埃希氏菌HNJD2014。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，大肠埃希氏菌HNJD2014采用0.3％甲醛在37℃灭活24小时。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，从鸡蛋蛋黄中提取纯化卵黄抗体时，获得的蛋黄充分搅匀，按照体积比1:1加入蒸馏水稀释，充分搅匀；量取蒸馏水，按3％质量比添加泊洛沙姆，充分溶解，将溶解好的泊洛沙姆溶液倒入蛋黄液中充分搅匀，使包含蛋黄液的终体系中泊洛沙姆的含量为1wt％；静置使脂质充分沉淀。
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