CN101570574B - 一种抗I型志贺毒素IgY抗体、及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗I型志贺毒素的IgY抗体，该抗体可以通过以下方法制备：化学合成或基因重组表达的方法制备无毒性的志贺毒素免疫抗原，通过免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，应用生物化学方法提取和纯化卵黄免疫球蛋白(IgY抗体)。该抗体具有中和志贺毒素，有效抑制志贺毒素毒性的效应，可以作为口服抗毒素用于由产毒志贺菌、肠出血性大肠杆菌O157、霍乱弧菌等感染引起的并发症的预防和治疗，同时可应用于I型志贺毒素及其病原菌的检测和感染诊断。

Description

一种抗I型志贺毒素IgY抗体、及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种IgY抗体，具体说涉及一种特异抗I型志贺毒素的IgY抗体，还涉及该抗体的制备方法及用途。

背景技术

志贺毒素(Shiga Toxin，Stx)作为肠道病原菌产生的一类具有肠毒性、细胞毒性和神经毒性的细菌外毒素，是急性细菌性痢疾、霍乱O139、O157:H7等新发肠道病原菌最为关键的强致病毒力因子。临床上引起出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)以及病死率高达80～90％的溶血性尿毒症(hemolytic uremic syndrome，HUS)等严重并发症，每年全球数百万人患此类疾病。

目前针对志贺毒素尚无特异有效的预防产品和急救治疗药物。临床普遍采用的抗生素治疗主要针对的是产毒病原菌，已经引起多重耐药菌株的出现，造成抗生素治疗的失效。抗生素使用造成更加不利的后果是菌体崩解引发志贺毒素过量释放，加大了由毒素引发各种并发症的风险。因此针对志贺毒素相关疾病的治疗主张慎用抗生素，而应寻求特异性拮抗药物作为新的有效治疗手段。

I型Stx(Stx1)由1个志贺毒素A亚单位(StxA)和5个志贺毒素B亚单位(StxB)组成，毒素通过StxB介导与真核细胞表面的Gb3受体结合，进而StxA作用于细胞28S rRNA引起细胞病变。StxB与细胞Gb3受体的结合是毒素发挥作用的起始关键环节，如能阻断这种结合，将从根本上抑制Stx分子毒性的发挥。研究方向主要集中在毒素受体类似物和抗体治疗方面。Kitov，PI.报道了能与Stx结合的多糖化合物，具有潜在的治疗应用价值(Kitov PI，Sadowska JM，Mulvey Get al.Shiga-like toxin are neutralized by tailored multivalent carbohydrate ligants.Nature 2000.403：669-672.)；2002年Natori Y.报道了Gb3受体治疗的实例(Natori Y.New drugs that prevent cytotoxicity of Shiga toxins.Nippon Rinsho.2002.60(6)：1131-1137.)，包括一种能在胃肠道途径阻止毒素扩散的新制剂和另一种可在循环系统抑制志贺毒素毒性的水溶性制剂。但是受体类多糖化合物的复杂制备工艺和副作用成为制约其发展的障碍。最近，有学者报道可表达毒素模拟受体的益生菌具有显著的毒素中和效果，可用于治疗志贺毒素(Paton AW，Morona R，Paton JC.A new biological agent fortreatment of Shiga toxigenic Escherichia coli infections and dysentery in humans.NatMed.2000.6(3)：257-8.)及破伤风类疾病，但是这种活菌治疗的安全性有待进一步考察和验证(PatonAW et al，2000；Focareta A et al，2006)。在抗体治疗方面，Nakao，H等研究报道的单克隆抗体能够阻断Stx与细胞受体的结合，中和Stx细胞毒性(Nakao H，Kataoka C，Kiyokawa N et al.Monoclonal antibody to Shiga toxin 1，which blocks receptor binding and neutralizescytotoxicity.Microbiol.and Immunol.2002.46(11)：777-780.)；2004年Inoue，KI(Inoue KI，Itoh K，Nakao H et al.Characterization of a Shiga toxin 1-neutralizingrecombinant Fab fragment isolated by phage display system.Tohoku J.Exp.Med.2004.203：295-303.)利用噬菌体展示技术筛选获得具有Stx毒性中和效应的重组Fab抗体片段。但临床应用有待于重组抗体制备工艺的改进完善。

IgY抗体，即卵黄免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin)，最早由Williams等人于1962年发现存在于禽类的卵黄中，具有许多其它哺乳动物抗体都无法比拟的优点，因为鸡IgY不与人类补体、蛋白A和类风湿因子结合，在检测应用中具有更高的特异性，而避免了假阴性假阳性反应的出现，成为抗原检测的理想材料。近年来，IgY抗体已被发展应用于人和畜禽感染性疾病的治疗，1988年由Kuhlmann和Yolken等(Kühlmann R，Wiedemann V，Schmidt P et al.Chicken egg antibodies forprophylaxis and therapy of infectious intestinal diseases.Immunization and antibodydetermination.Zentralbl Veterinarmed B.1988 Oct；35(8)：610-6.)提出了口服特异性卵黄抗体可以防治肠道细菌与病毒感染。目前国外的人用抗轮状病毒IgY抗体、抗沙门氏菌感染的研究已进入临床试验阶段。应用志贺毒素的重组保护性抗原，免疫制备的特异抗志贺毒素的IgY抗体，具有功能明确，副作用小，安全性高的特点，可以作为口服制剂等应用于产志贺毒素病原菌感染并发症的预防和治疗，也可以应用于I型志贺毒素的检测和相关疾病诊断。IgY抗体可以大量低成本制备的优势，使其具有广泛的应用前景。目前国内外针对志贺毒素的IgY抗体研究未见报道。

发明内容

针对志贺毒素抑制剂的缺乏，本发明提供了一种具有特异抗I型志贺毒素并有效抑制志贺毒素毒性的IgY抗体。

该IgY抗体分子量为180000，制备纯度大于90％，具有较好的稳定性且易于保存、运输。

本发明的抗I型志贺毒素的IgY抗体是通过以下的方法进行制备的。首先通过基因工程技术和分子生物学方法，设计引物，对基因进行表达适应性修饰，制备Stx1B基因，构建重组表达Stx1B的原核基因工程菌-重组大肠杆菌，然后诱导表达并通过一系列纯化步骤，制备高纯度具有生物学活性的重组Stx1B蛋白。动物实验验证结果表明，重组Stx1B蛋白可以诱导机体产生高滴度中和抗体，能拮抗致死剂量毒素的攻击，具有完全保护作用。选用产蛋鸡，以重组Stx1B为免疫原，通过动物定向免疫方法，在动物体内诱导产生特异抗I型志贺毒素的IgY抗体。收集产蛋，采用水稀释法、盐析或PEG法等提取卵黄免疫球蛋白，可以进一步采用DEAE色谱、凝胶过滤或亲和层析分离纯化方法等进行纯化。

本发明的IgY抗体可以通过本领域已知的生物化学的方法进行大量制备。在IgY抗体全分子基础上，可以应用蛋白酶消化方法制备F(ab)’等衍生物，以优化改善其理化性质、提高或增加其应用性和应用范围。

通过试验测定本发明IgY抗体与I型志贺毒素特异结合活性，显示其结合态稳定，结合动力学表现优良。在细胞模型上，本发明的IgY抗体能够抑制志贺毒素的细胞毒效应，并具有剂量依赖活性。动物试验观察志贺毒素中和作用，结果显示本发明的IgY抗体通过中和志贺毒素，可完全抑制志贺毒素的致死毒性，对受试小鼠起到保护作用。

通过上述体内和体外试验证实，本发明的IgY抗体能通过抑制志贺毒素与宿主细胞受体的结合，具有抑制志贺毒素毒性的生物学效应，具有良好的应用前景，可以提供一种志贺毒素新的有效治疗剂，应用于志贺毒素所引起相关疾病的治疗，这些疾病包括由产毒志贺菌、肠出血性大肠杆菌O157或霍乱弧菌等产生志贺毒素的微生物所引起疾病。

附图说明

图1为重组大肠杆菌pBV220-stx1b/DH5α诱导表达产物的SDS-PAGE图谱，其中1.蛋白分子量标准；1和2.重组菌未诱导对照；3.重组大肠杆菌诱导表达(箭头所指处为目的蛋白)。

图2为重组Stx1B纯化产物的SDS-PAGE图谱，其中1.纯化后的Stx1B；M.蛋白分子量标准。

图3为制备的IgY抗体的电泳分析图，其中1.IgY抗体(箭头所指处分别为IgY的重链和轻链)M.蛋白分子量标准。

图4为BIAcore系统动态分析梯度IgY与Stx1B的特异结合。(图中曲线由上到下分别显示，1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320的IgY与Stx1B的动态结合情况，结果表明IgY能与Stx1B发生特异结合，并具有量效关系)。

图5为IgY抗体的志贺毒素体外细胞毒性抑制实验，其中A.15μg/mL FITC-Stx1B的细胞结合活性；B.15μg/mL FITC-Stx1B与IgY抗体孵育后的细胞结合活性。

图6为IgY抗体的志贺毒素体外细胞毒性抑制实验，图中显示，与毒素孵育的IgY剂量越大，反映活细胞数量的OD₅₇₀越高，说明毒素抑制效应越明显。其中，无关抗体做为对照。

具体实施方式

实施例1重组Stx1B的表达与纯化

1.材料

1.1菌株

工程菌株pBV220-stx1b/DH5α由本实验室构建，用于外源蛋白Stx1B表达。

1.2试剂

离子交换层析柱Sepharose^TM HP HTrap^TM和Sephacry S-100凝胶柱(26/100)购自GE公司。

2.方法与结果

2.1重组StxB在大肠杆菌中的诱导表达

将工程菌株pBV220-stx1b/DH5α接种至含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡过夜，次日以1∶100接种至LB液体培养基，继续在37℃振荡培养，至菌液浓度达到OD₆₀₀为0.8～1.0，迅速提高温度至41℃，继续培养5h。4℃5000g离心10min，以预冷的PBS洗菌体一次，离心收集菌体，待超声破碎。

SDS-PAGE分析：收集经过41℃温度诱导的重组菌体进行SDS-PAGE电泳，结果显示重组菌体样品中出现分子量为7.7kD的蛋白条带，与Stx1B预期分子量相符，凝胶扫描分析显示重组蛋白占总蛋白量20％左右(附图1)。

2.2重组Stx1B的纯化

将离心收集的菌体用缓冲液A(20mM Tris-HCl，10mM NaCl，1mM EDTA，pH7.4)悬浮，置于冰浴中超声波破碎菌体，每次300W超声波处理20s，间隙10s，90个循环。破碎后的菌体悬液4℃10000g离心10min。上清缓慢滴加饱和硫酸铵溶液至30％浓度，边滴加边搅拌，4℃静置4h以上，4℃10000g离心10min，上清继续滴加饱和硫酸铵至80％浓度，4℃静置4h以上，4℃10000g离心10min，沉淀以缓冲液A复溶。复溶物装入透析袋(截流分子量3.5kD)，4℃下搅拌以缓冲液A透析，4h换液一次，共4次。4℃ 10000g离心10min，弃沉淀，留取上清。

透析后的样品进行离子交换层析。上样前以缓冲液A平衡QSepharose^TM HP HTrap^TM柱，2mL/min上样后仍以缓冲液A平衡，以缓冲液B(20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.4，)线性梯度洗脱，60min内缓冲液B升至100％浓度，收集280nm洗脱峰，SDS-PAGE鉴定目的蛋白峰位。

将离子交换层析收集获得的Stx1B样品，加样至Sephacry S-100凝胶柱(26/100)，以10mM PBS(pH7.4)洗脱，流速0.5mL/min，收集280nm洗脱峰，SDS-PAGE鉴定目的蛋白峰位。Stx1B纯化的SDS-PAGE分析见附图2。

实施例2  抗I型志贺毒素IgY抗体的制备

1.材料

产蛋来航鸡由北京实验动物中心提供，完全和不完全佐剂均购自Sigma公司。

2.方法与结果

2.1动物免疫(表1)

将纯化的重组Stx1B与福氏佐剂(羊毛脂∶液体石蜡＝1∶3，高压灭菌后备用)等体积混合，搅拌均匀后免疫SPF-2级蛋鸡，初次免疫时添加1mg/ml卡介苗(中国药品生物制品检定所)。

表1  动物免疫实施

免疫时间	免疫剂量	免疫佐剂	免疫途径
				0d	1mg/只	福氏完全佐剂	皮下、肌肉多点注射
14d	1mg/只	福氏不完全佐剂	皮下、肌肉多点注射
				28d	0.5mg/只	福氏不完全佐剂	皮下、肌肉多点注射
42d	0.5mg/只	福氏不完全佐剂	皮下、肌肉多点注射

2.2 IgY抗体的提取

将免疫来航鸡所产鸡蛋于消毒液中浸泡15分钟，灭菌纱布拭净。去蛋青留取蛋黄，按1∶8的体积比加入灭菌蒸馏水(pH4.2-4.4)，充分搅拌混匀，4℃静置过夜。移液管小心吸取上清液，滴加饱和硫酸铵溶液至终浓度20％并搅拌均匀，4℃静置4小时以上。10000g离心10分钟后吸取上清液，向其中继续滴加饱和硫酸铵溶液至终浓度40％并搅拌均匀，4℃静置过夜。10000g离心15分钟，去尽上清，沉淀重溶于10mM PBS(pH7.4)溶液中，经10mM PBS(pH7.4)透析后，即为提取的IgY。对提取的IgY进行SDS-PAGE分析，结果显示提取的抗体纯度大于80％(附图3)。

2.3 IgY抗体效价的动态检测(ELISA)

以重组Stx1B和I型志贺毒素分别包被酶联板，每孔10ng，ELISA方法检测IgY效价，二抗为HRP标记兔抗鸡抗体(SIGMA公司)。结果显示，随着免疫次数增加，抗体效价呈明显上升趋势，经四次免疫后，抗体效价可达5.12×10⁵，在免疫结束后一年效价保持稳定(表2)。

表2  抗Stx1特异IgY效价的测定

取样时间点	效价/mg
		10d	1.6x102
24d	3.2x103
		38d	6.4x104
52d	5.12x105
		150d	5.12x105
250d	5.12x105
		350d	5x105

实施例3  IgY抗体在志贺毒素检测中的应用

1.材料

BIAcore 3000生物传感器系统及CM5芯片、耦联试剂、工作液等均为GE公司产品，抗IgY-HRP购自SIGMA公司。酶联板及显色试剂购自百奥康公司。

2.方法与结果

2.1 IgY抗体与Stx1B结合特异性(ELISA)

以I型志贺毒素(Stx1)、II型志贺毒素(Stx2)、破伤风毒素(Tet)、金葡菌肠毒素B(SEB)等抗原分别包被酶联板，每孔10μg，ELISA方法检测IgY的结合活性，二抗为HRP标记兔抗鸡抗体(SIGMA公司)。结果显示，IgY抗体能够特异识别I型志贺毒素，发生明显结合作用，而与其他毒素抗原(破伤风毒素-Tet，金葡菌肠毒素B-SEB)不结合，特别是与II型志贺毒素(Stx2)无明显交叉反应(表3)，表明IgY抗体特异性良好，可以用于I型志贺毒素的检测。

表3  IgY抗体与Stx1的结合特异性

2.2 IgY抗体与Stx1B特异结合的动态分析

借助BIAcore生物传感器系统，测定IgY抗体与Stx1B特异结合活性。将Stx1B偶联到芯片CM5上，偶联量为785RU，以EDC/NHS活化和乙醇胺封闭。测定不同浓度的IgY抗体与Stx1B结合的动力学常数。检测流速在20μL/min下进行，由Sensorgram记录曲线观察IgY抗体的动态结合过程。结果显示，IgY抗体与作为对照通道(Fc1)的无关蛋白结合的RU值为9.8，不同浓度IgY抗体与Stx1B结合的RU值，随着IgY抗体浓度的逐渐增加(1∶320、1∶160、1∶80、1∶40、1∶20)，IgY抗体与Stx1B偶联通道(Fc2)的结合量也随之升高，RU值分别为34.5、65.6、103.5、132.3、158.1。附图4所示的结合动态曲线反映出了不同浓度IgY抗体与Stx1B结合的动态过程，IgY抗体呈现了较快速的结合(图中“结合区”所示结合曲线上升趋势明显)，并且解离的很缓慢，(图中“解离区”所示解离曲线没有明显下降趋势)，其结合态稳定，结合动力学表现优良。表明IgY抗体可以用于I型志贺毒素的检测。

实施例4  抗I型志贺毒素IgY抗体的体内外中和活性

1.材料

Balb/C小鼠由军事医学科学院动物中心提供，菌株S.dys 51054购自中国药物生物制品检定所，抗Stx1抗体购自Biodesign公司(ELISA效价为1∶200)。

2.方法与结果

2.1 IgY抗体对I型志贺毒素的靶细胞结合抑制效应

2.1.1 FITC标记Stx1B的制备

将纯化的Stx1B以碳酸盐缓冲液(pH9.2)透析过夜，透析后的蛋白移入小烧杯，加入用二甲亚砜(DMSO)溶解的FITC(1mg FITC/1mlDMSO，0.05mg FITC/mg Stx1B)，室温下用磁力搅拌器避光搅拌2h后以PBS透析，换液数次直到不再由FITC析出。

2.1.2 IgY抗体对毒素与细胞受体结合的抑制效应

将制备的5μg FITC-Stx1B与IgY混合均匀，避光于4℃过夜孵育，以PBS孵育组为阴性对照。在DMEM(10％FBS)中培养Hela细胞，待细胞铺满培养瓶底，弃去培养液，贴壁的Hela细胞经胰酶适当消化后弃去消化液，以培养液吹打培养瓶壁，使松散的细胞脱落，调整细胞浓度至5x10⁵-1x10⁶/ml制备成细胞悬液。向每毫升细胞悬液中加入FITC-Stx1B与抗体的孵育物，37℃避光作用2h后，1000rpm离心5min，弃去上清，PBS洗涤后1000rpm离心5min，细胞沉淀以4％的多聚甲醛于4℃固定15min后，1000rpm离心5min，沉淀以PBS悬浮。采用流式细胞术，通过检测FITC强度反映抗体孵育对Stx1B细胞结合活性的影响。结果显示FITC-Stx1B与IgY孵育后，Stx1B与细胞的结合活性受到抑制，荧光强度明显下降，提示IgY能够较好地阻断Stx1B与细胞结合(附图5)。

2.2  IgY抗体的细胞毒性抑制效应

2.2.1  志贺毒素作用Hela细胞模型的建立

取新培养的细胞加入96孔培养板，待细胞铺满平板底90％面积，分别加入不同剂量的志贺毒素，以不作处理的细胞为对照，培养12h。用新鲜培养液洗涤各孔2次，每孔加含50μg MTT的培养液100μL，继续培养3h。用10mmol/L PBS(pH7.2)洗涤2次，每孔加入含40mmol/L HCl的异丙醇100μL，室温30min，溶解形成颗粒。酸化异丙醇调零，570nm处测定各孔吸光值。根据观察结果，毒素处理细胞12h后，细胞出现明显病变，细胞边缘模糊，折光率下降，活细胞数量减少。确定5μL毒素是合适的细胞染毒实验剂量。

2.2.2  细胞毒性抑制实验

取5μL Stx，分别与5μg、10μg、20μg、40μg、80μg、160μg、320μg、640μg的IgY抗体4℃孵育过夜。按照上述模型，待培养的Hela细胞长至平板90％满时，小心吸去培养液，加入含上述混合物的新鲜培养液200μL，细胞于37℃5％CO2培养箱中孵育12h后，MTT法测定活性细胞数量。

实验结果显示，正常未作处理的细胞，MTT法测得570nm处吸光值为2.163；毒素处理的细胞吸光值为0.272，对细胞具有明显的细胞毒效应。各实验组细胞，随IgY浓度的加大，吸光值逐渐提高，反应活性细胞的数量的增多趋势，表明IgY对毒素毒性有抑制作用，并随浓度的增加而加强，表现出剂量依赖的量效关系。当IgY剂量达到17.5μM时，可以完全抑制志贺毒素的细胞毒效应，其IC50为0.428μM(附图6)。实验中，没有观察到IgY本身对细胞的毒副作用。

2.3  IgY抗体的志贺毒素体内中和效应

2.3.1  志贺毒素粗制品的制备

接种S.dys 51054于LB培养基过夜培养，次日按1∶100接种至1L培养基，震荡培养72h，5000rpm离心10min。菌体沉淀悬于PBS缓冲液，超声波破碎细胞，10000rpm离心10min，上清滴加饱和硫酸铵溶液至50％浓度，收集盐析沉淀，以PBS溶解并透析完全，得到志贺毒素粗制产物。

2.3.2  IgY抗体的志贺毒素体内中和实验

将5LD₅₀(约65ul)I型志贺毒素与不同浓度的IgY抗体分别混合至1ml，4℃孵育过夜。按照IgY抗体使用剂量的不同，将小鼠分为4组，每组12只；另设阴性对照组，即以PBS与志贺毒素混合；PBS空白对照组，即单独注射PBS。各组混合液体按照腹腔注射的方法，对小鼠进行攻毒，观察7d存活状况。结果显示，阴性对照组中，全体小鼠在48h内全部死亡；空白对照组中，小鼠在7d观察期内，无死亡发生。实验组中，低剂量组小鼠出现眼睛闭合、皮毛耸立、四肢无力、不进食等志贺毒素中毒症状，严重程度与IgY使用剂量呈反比。IgY抗体剂量为0.4mg时，小鼠存活率为8.3％(1/12)；浓度升至1.2mg，小鼠存活率为41.67％(5/12)；浓度达到3.6mg时，小鼠全部存活。结果证实，IgY抗体与志贺毒素孵育中和后，较好地抑制了志贺毒素的毒性，对受试小鼠起到保护作用，结果见表4。

表4：IgY抗体的志贺毒素体内中和实验

Claims (2)

1.一种抗志贺毒素的IgY抗体，其特征在于：该抗体特异识别I型志贺毒素；

所述抗志贺毒素IgY抗体按照如下方法制备：

(1)重组制备I型志贺毒素抗原，所述I型志贺毒素抗原为I型志贺毒素B亚单位；

(2)应用I型志贺毒素抗原多次加强免疫产蛋鸡；

(3)收集鸡蛋，分离出蛋黄，提取卵黄免疫球蛋白；

所述多次加强免疫产蛋鸡的方法如下：

第一次免疫：免疫时间为0d；免疫剂量为1mg/只；

第二次免疫：免疫时间为14d；免疫剂量为1mg/只；

第三次免疫：免疫时间为28d；免疫剂量为0.5mg/只；

第四次免疫：免疫时间为42d；免疫剂量为0.5mg/只；

所述I型志贺毒素B亚单位是用工程菌株pBV220-stx1b/DH5α表达得到的。

2.权利要求1所述抗志贺毒素IgY抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)重组制备I型志贺毒素抗原，所述I型志贺毒素抗原为I型志贺毒素B亚单位；

(2)应用I型志贺毒素抗原多次加强免疫产蛋鸡；

(3)收集鸡蛋，分离出蛋黄，提取卵黄免疫球蛋白；

所述多次加强免疫产蛋鸡的方法如下：

第一次免疫：免疫时间为0d；免疫剂量为1mg/只；

第二次免疫：免疫时间为14d；免疫剂量为1mg/只；

第三次免疫：免疫时间为28d；免疫剂量为0.5mg/只；

第四次免疫：免疫时间为42d；免疫剂量为0.5mg/只；

所述I型志贺毒素B亚单位是用工程菌株pBV220-stx1b/DH5α表达得到的。

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