CN101357942A - 一种中和肠出血性大肠杆菌0157：H7志贺毒素Ⅱ的单克隆抗体、Fab抗体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体地说，本发明是关于一种具有中和肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素II的单克隆抗体、Fab抗体序列与应用，所述的单克隆抗体由保藏号为CCTCC：C200822的杂交瘤细胞株制备。本发明所述抗体可用于制备诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症方面药物中。

Description

一种中和肠出血性大肠杆菌O157：H7志贺毒素Ⅱ的单克隆抗体、Fab抗体与应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体说涉及中和肠出血性大肠杆菌O157：H7志贺毒素II的单克隆抗体、Fab抗体及其应用。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7的感染是一个全球性的公共卫生问题。其引发的食物中毒在世界各地均有大规模的暴发流行。2006年在美国爆发的波及26个州的毒菠菜事件就是由该菌污染所致，1999年末至2000年初，在我国东部部分地区发生了迄今为止世界上最大规模的O157：H7感染爆发流行。由于该菌培养容易、感染力强、传播途径多样，使其极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂。美国疾病控制中心(CDC)已将EHECO157菌列为B类生物恐怖病原体严加防范。此外，EHEC O157：H7菌的烈性致病因子还有可能用于新型生物武器——基因武器的构建。

然而目前对其感染尚缺乏有效的防治方法。研究证明：抗生素可促使O157菌释放致死性志贺毒素(Shiga toxin，Stx)，从而使患者病情加重。因此，无论从公共卫生还是生物反恐的需要出发，探索新的治疗手段迫在眉睫。

研究表明：志贺毒素II(Stx2)是O157：H7主要的致病因子。Stx2进入血液循环后，可引起靶组织器官，如肾小球和结肠内皮细胞的损伤，最终导致溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等严重并发症的发生。Stx2致病是急剧快速的，因此针对Stx2的中和性抗体在O157：H7感染的紧急治疗中将发挥重要作用，但目前国内外尚无Stx2中和性抗体上市。

由于鼠源单抗可在人体内引起人抗鼠抗体反应；完整的单抗分子量大，组织摄取百分数较低，体内半衰期较长，因而使其在人体内的应用受到限制。基因工程抗体技术的发展使人们可以在基因水平上改造抗体结构，以满足用于人体治疗的抗体需低免疫原性、高特异性、高稳定性、和高亲和力的要求。对鼠源性抗体进行人源化改造，或构建主要保留抗体可变区的小分子抗体，如Fab及ScFv，既可降低分子量亦可降低异源性，同时还保留有抗原结合活性，将有利于鼠单抗在人体内应用。Fab抗体保留了全抗体的轻链和重链的可变区及第一恒定区(VH+CH1)，分子量仅为全抗体的三分之一，大大降低了抗体的鼠原性。与SeFv抗体相比，Fab抗体在体内半衰期较长、稳定性好、保留了与亲代抗体较为接近的亲和力，这对发挥中和毒素作用的治疗性抗体而言尤为重要。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种中和肠出血性大肠O157：H7的志贺毒素II的单克隆抗体，其由保藏在以下单位的杂交瘤细胞株制备：保持单位为中国典型培养物保持中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期为2008年5月27日，保藏号为CCTCC：C200822，杂交瘤细胞体系为1F2。

本发明的另外一个目的是提供上述的单克隆抗体制得的Fab抗体，其包括κ链和Fd链。

所述的κ链具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列或将所述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列的任一种。

所述的κ链的核苷酸序列具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与所述SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列中的任一种。

所述的Fd链具有SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列或将所述SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列的任一种。

所述的Fd链的核苷酸序列具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与所述SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列中的任一种。

本发明提供上述的Fab抗体的制备方法，其主要包括以下步骤：

1)提取所述杂交瘤细胞的总RNA，获得RNA；

2)以步骤1)中的RNA为克隆模板，克隆所述单克隆抗体的κ链和Fd链基因；

3)将步骤2)获得的κ链和Fd链基因克隆到T载体中，进行鉴定；

4)将步骤3)获得的κ链和Fd链基因克隆到分泌表达Fab抗体的载体中，进行表达、鉴定、纯化，得所述的的Fab抗体。

本发明还提供一种表达载体，其含有上述的κ链和Fd链的核苷酸序列。

本发明所述的表达载体，可以包括裸DNA或质粒DNA中的至少一种。

本发明还提供一种表达宿主，其中转入含有上述的κ链和Fd链的核苷酸序列的表达载体。

本发明还有一个目的是提供上述的Fab抗体的应用，其可用于制备预防或治疗肠出血性大肠杆菌感染的药物，该药物可包含上述Fab抗体和药学上可接受的载体，其中上述的药学上可接受的载体包含稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体中的至少一种。

本发明所述的Fab抗体还可用于制备ScFv抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体融合蛋白、蛋白单域抗体，具体来说，1)嵌合抗体：是用鼠单抗的V区与人IgG的C区连接而成为人-鼠嵌合抗体。由于其完整地保留了鼠单抗的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等不良反应；2)人源化抗体：是针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸残基修饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等从而降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠单抗的特异性和亲和力；3)单域抗体：由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等；4)双特异性抗体：是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体；5)重组抗体融合蛋白：把Fab基因片段，与非抗体的毒素或酶等其它蛋白基因连接形成的具有特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白。

本发明的思路如下：采用来自Stx2 A1亚单位的保护性B细胞表位肽P1_(53～80)为抗原(该肽包含Stx2A1上的毒性活性中心)，靶向性制备中和Stx2毒性活性中心的MAbs，并通过抗体的生物学鉴定证实单抗的预防和治疗作用。在此基础上，利用基因工程技术对这株中和性MAb进行Fab抗体的改造，构建具有中和Stx2毒性的Fab抗体，对Fab抗体的基因结构和蛋白质的序列进行分析，并对Fab抗体中和Stx2毒性的作用进行了鉴定。本发明的Fab抗体的重链Fd片段和κ轻链基因和多肽可以用来开发预防或治疗EHEC O157：H7感染的抗体药物。

本发明利用来自Stx2 A1亚单位的保护性B细胞表位肽P1_(53～80)为抗原制备的1F2单克隆抗体能中和Stx2蛋白的毒性作用，将1F2单克隆抗体制备成Fab基因工程抗体，动物实验显示具有良好的Stx2毒性中和作用。基于P1B表位肽制备的1F2单克隆抗体的Fab形式的抗体对O157：H7感染具有潜在的预防和作用。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1表示1F2单克隆抗体的免疫印迹；

图2表示琼脂糖电泳检测总RNA；

图3表示琼脂糖电泳检测κ轻链PCR产物

M.DNA Marker箭头所示为κ轻链

图4表示琼脂糖电泳检测Fd链PCR产物

M.DNA Marker箭头所示为Fd链

图5表示PM18T-1F2κ和PM18T-1F2Fd质粒酶切鉴定

M.DNA Marker

1～2.箭头所示为Fd链

3～4.箭头所示为κ轻链

图6表示1F2Fab抗体的κ链三维结构模型；

图7表示1F2Fab抗体的Fd分析链三维结构模型；

图8A和图8B表示Pcomb3X-1F2Fdκ重组质粒双酶切鉴定

M.DNA marker

1.用SacI和XbaI双酶切Pcomb3X-1F2Fdκ质粒

2.用XhoI and SpeI双酶切Pcomb3X-1F2Fdκ质粒

3.用SacI and SpeI双酶切Pcomb3X-1F2Fdκ质粒

4.用SpeI and NdeI双酶切Pcomb3X-1F2Fdκ质粒；

图9表示Pcomb3X-1F2Fab重组质粒双酶切鉴定

M.DNA marker

1.Pcomb3X-1F2Fab质粒

2.用SacI和XbaI双酶切Pcomb3X-1F2Fab质粒

3.用SacI和XhoI双酶切Pcomb3X-1F2Fab质粒

4.用SacI和XhoI双酶切Pcomb3X-1F2Fab质粒

5.用SpeI和NheI双酶切Pcomb3X-1F2Fab质粒；

图10表示SDS-PAGE分析Fab抗体的表达

M.蛋白质分子量标准

1.IPTG诱导Pcomb3X/XL-blue空载体菌溶菌上清

2.未诱导Pcomb3X-1F2Fab/XL-blue重组菌溶菌上清

3～4.IPTG诱导Pcomb3X-1F2Fab/XL-blue重组菌溶菌上清；

图11表示SDS-PAGE分析Fab抗体的纯化

M.蛋白质分子量标准

1.诱导Pcomb3X-1F2Fab/XL-blue重组菌溶菌上清

2.1Fab抗体蛋白洗脱样品；

图12表示免疫印迹检测1F2Fab的特异性

图13表示间接ELISA比较1F2Fab抗体和1F2单抗与抗原的结合活性；

图14表示竞争ELISA检测1F2Fab抗体竞争抑制1F2单抗与Stx2的结合；

图15表示1F2Fab抗体和1F2单抗体外中和活性比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进，对本发明重链Fd片段和κ轻链多肽及其核苷酸序列的利用都属于本发明要求保护的范围。

实施1 中和EHEC O157：H7 Stx2的单克隆抗体的制备与鉴定

1.动物免疫

以来自EHEC O157：H7 Stx2 A1亚单位的B细胞表位肽P1(SEQ ID NO：5_DIRGLDVYQARFDHLRLIIEQNNLYVAG)偶联KLH后同时免疫5只6～8周龄17g～22g的雌性健康BALB/C小鼠，免疫方法、途径、剂量同第一部分，最后一次免疫采尾血测抗体效价，选择ELISA血清抗体效价检测达1∶8000以上的BALB/C小鼠用于融合，融合前3d，不加佐剂抗原腹腔加强免疫注射1次，100μg/只。

2 杂交瘤细胞的制备

2.1 收集B淋巴细胞

追加免疫后3d，摘除小鼠眼球放血，血清留作阳性对照。按无菌操作取出脾脏，并将脾脏放在10ml预温不完全培养基中，剥去周围结缔组织，置100目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，边研磨边滴加不完全培养基冲洗。收集过滤后的细胞悬液于离心管中，计数，取1×10⁸个细胞，离心，弃上清，置室温待用。

2.2 小鼠骨髓瘤细胞的准备

融合前10天，将骨髓瘤细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中10分钟内至冷冻液完全溶解。离心，弃上清，置含8-AG的DMEM完全培养基中于37℃，5％CO₂培养。根据细胞生长状况，换液，丢弃一部分细胞。融合前2d～3d，将1瓶细胞传至4瓶，并改用不含8-AG的DMEM完全培养基继续培养。将对数生长期细胞收集至离心管中，计数，取1×10⁷～2×10⁷个细胞，离心弃上清，置室温待用。

2.3 细胞融合

融前一天将PEG细胞融合剂置37℃，5％CO₂细胞培养箱中调整pH值和温度。将1×10⁷～2×10⁷个骨髓瘤细胞悬液和1×10⁸个脾脏B淋巴细胞悬液移至一个50ml离心管中，补加30ml不完全培养基，1500rpm，离心10分钟，弃去上清。轻轻弹击管底，使细胞团松散成糊状。一手均匀地转动离心管，另一手用1ml吸管吸取0.7ml预温的PEG融合剂，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，从加入到加完的时间控制在60秒左右，然后立即将细胞悬液全部吸入吸管，时间控制在30秒左右，静置30秒，在将其吹入离心管内，时间也控制在30秒左右。立即在5分钟内加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用，具体加法是第一分钟加1ml，第二分钟加4ml，随后的3分钟之内将剩余液体加完，(注意此时操作应轻柔)，1500转/分离心10分钟，弃去上清，将融合细胞悬液移入已装有40mlClonaCell

-HY Hybridoma Recovery Medium的T-75cm的培养瓶中，37℃，5％CO₂细胞培养箱中16h～24小时，离心，弃上清。

2.4 一步法筛选阳性单克隆杂交瘤细胞

融合前一天，置ClonaCell-HY杂交瘤选择培养基(Medium D)于2℃～8℃融化过夜，融合当天，摇匀培养基并置室或37℃温备用。将融合后的细胞悬液移入50ml无菌离心管中，400×g(1350rpm)，离心，10分钟，弃上清，加Medium C至10ml后混匀细胞。(注意总体积不能超过10ml)将10ml细胞悬液加入90ml Medium D中，上下反转数次试剂瓶混合杂交瘤细胞后，室温或37℃静止15分钟，让气泡升至顶层。用10ml刻度吸管吸取上述细胞混悬液铺入10个100mm细胞培养皿中(避免气泡)，每个平皿9.5ml，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养10d～14天。注意：小心开关细胞养箱门，尽量避免振动；10天内不能移动细胞培养皿，否则会导致培养皿中细胞克隆混淆。用微量加样器吸取细胞培养皿中长出的肉眼可见的单克隆杂交瘤细胞于预先每孔加有200μl的Medium E的96孔细胞培养板中，每孔加入一个细胞克隆。大约3d～5天，当细胞长成单层时以天然Stx2为包被抗原，间接ELISA检测各培养孔的上清，检测阳性的单克隆细胞转种于6孔细胞培养板，每孔加Medium E培养基1ml，置37℃，5％CO₂培养。大约3～5天，当细胞长成单层时，以天然Stx2为包被抗原，间接ELISA检测各培养孔的上清，将ELISA检测阳性的单克隆细胞依次转种至25ml和100ml细胞培养瓶内扩大培养。此时改用含10％小牛血清的DMEM完全培养基，转种前均作ELISA检测，持续呈阳性的细胞克隆可以定株、冻存。

3 单克隆抗体的生物学鉴定

常规方法制备小鼠腹水单抗，采用HiTrap Protein A FF层析柱纯化后，采用美国Roche公司Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit鉴定单抗的亚类亚型，采用Western blot鉴定抗体的特异性，鉴定单抗的亲和力，通过体外Vero细胞毒阻断试验和小鼠体内Stx2毒性中和试验鉴定单抗对Stx2的预防和治疗作用。具体操作如下：

3.1 Western blot鉴定抗体的特异性

取已处理的天然Stx2，并设定蛋白质分子量标准，在5％浓缩胶，15％分离胶上进行垂直SDS-PAGE，80V，30分钟，调整电压为150V，约1.5小时。电泳结束后，取下凝胶，一块用考马斯亮蓝R-250染液快速染色，另一块置于硝酸纤维素膜上，15V恒压电转移过夜。转移后的硝酸纤维素膜在丽春红S中染色1分钟，标记蛋白质分子标准，再用蒸馏水脱去红色。将转移膜置于封闭液(TTBS)中，37℃，150rpm，轻轻振摇封闭60分钟弃去封闭液，用洗涤液(TTBS)漂洗膜4次，每次10～15分钟。加入以洗涤液1∶2000稀释的单克隆抗体1F2，SP2/0细胞制备的小鼠腹水为阴性对照，37℃，150rpm，轻轻振摇反应60分钟；TBS漂洗膜4次，每次10～15分钟。加入以TBS稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG(1∶20000)，150rpm，轻轻振摇反应60分钟。TBS漂洗4次，每次10～15分钟。加入DAB显色液，轻摇至显色，蒸馏水漂洗终止反应。

3.2 单克隆抗体亲和常数测定

包被：用包被液将Stx2抗原稀释，设两种包被浓度检测：1μg/ml和4μg/ml，分别加入酶标板，100μl/孔，4℃过夜，PBS洗涤5遍，空干；封闭：加1％BSA封闭液300μl/孔，4℃过夜，洗涤5遍，空干，密封4℃保存备用；将抗体浓度按3000ng/ml、2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、8ng/ml、3.2ng/ml、0.8ng/ml、0.2ng/ml、0.05ng/ml稀释，取包被好的酶标板，加入依次稀释血清100μl/孔，37℃水浴30分钟，洗涤5遍，空干；加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体工作液(1∶20 000稀释)100μl/孔，37℃水浴30分钟，洗涤4遍，空干；加底物显色液100μl/孔，室温避光反应5～10分钟；加终止液100μl/孔，立即在酶标仪上以492nm波长测定OD值；按照下列公式计算单克隆抗体亲和常数：

$K_{\mathrm{aff}}=\frac{(n-1)}{2\×\left(n\right[{\mathrm{Ab}}^{\text{'}}]t-[\mathrm{Ab}\left]t\right)}n=\frac{\left[\mathrm{Ag}\right]}{\left[{\mathrm{Ag}}^{\text{'}}\right]}$

该公式中，n为平衡常数，为两种抗原包被浓度比值倍数(本发明中比值为4)；在曲线中，以每条曲线上段平台段的OD值为100％，以下段平台段OD值为0，[Ab]和[Ab′]为两条曲线中OD值为50％时所对应的抗体浓度，且[Ab]和[Ab′]分别与[Ag]和[Ag’]相对应。

结果：筛选出一株能分泌特异抗Stx2的单克隆抗体1F2杂交瘤细胞株，对该细胞株分泌产生的单克隆抗体1F2的生物学特性鉴定显示1F2单抗为IgG1κ型，具有高特异性和高亲和力(Ka＝1.7×10^-9)Western blot(图1)结果显示：1F2单抗能与天然Stx2A亚单位发生特异的抗原抗体反应。

该细胞株1F2已于2008年5月28日保藏在中国典型物保藏中心，保藏号为CCTCC：C200822，细胞株名称：1F2杂交瘤细胞株，来源：鼠源。

4.1F2单克隆抗体体内中和保护实验

选用8周龄雌性Balb/c小鼠，小鼠于实验前一周分笼，分6组，每组10只。经一周适应期后，每组动物经腹腔注射给予以PBS稀释的不同剂量的抗体液4小时后，每组动物经腹腔注射给予致死剂量的天然Stx2(LD₁₀₀约为50ng/kg)，最终每只小鼠注射的总液体量为0.5ml。阴性对照组每只小鼠给予0.5ml无关单抗3E5(1mg/ml)，PBS为正常对照组。观察各组小鼠的死亡情况，在10d的观察期后计算小鼠的存活率。抗体及毒素的剂量和体积如表6。

以上实验数据采用PEMS统计软件经χ²检验进行统计学分析，P＜0.05具有统计学意义，P＜0.01差异极显著。

            表1 动物分组及攻毒剂量

                                                                     

组别     数量    注射体积    MAb(ng/kg)    Stx2(ng/kg)

I        10      0.5         200           50

II       10      0.5         400           50

III      10      0.5         800           50

IV       10      0.5         1600          50

V        10      0.5         3200          50

3E5组    10      0.5         3200          50

PBS组    10      0.5                       50

                                                                    

体内1F2单克隆抗体中和保护试验结果如表2所示：3E5和PBS对照组小鼠全部死亡，而实验各组小鼠的症状较对照组症状轻，出现的症状相对较慢，高剂量的1F2单克隆抗体组(3200ng/kg)的小鼠存活率为80％，说明1F2单克隆抗体对Stx2有很强的中和保护作用。

        表2 体内1F2单克隆抗体中和保护试验结果

^***.P＜0.01 vs PBS组和3E5组；^**.P＜0.05 vs PBS组和3E5组；^*.P＞0.05 vs PBS组和3E5组

实施例2 Stx2中和性单克隆抗体1F2的κ轻链和Fd链基因的克隆

1.所用细胞株为本发明人采用上述方法获得的一株能分泌高亲和力、高特异性的中和Stx2毒性作用的单克隆抗体1F2的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体分子亚类和亚型为IgG1κ型。

2.取对数生长期的1F2杂交瘤细胞(2×10⁶)，采用异TRIZOL一步法(Invitrogen公司)提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1％琼脂糖凝胶电泳检测。随后采用One stepPT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)扩增单抗1F2的κ轻链(VL+CL)和Fd链(VH+CH1)基因。将含有1F2的κ链和Fd链的扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶分离目的片段。通过胶回收试剂盒(Promega公司)纯化目的片段后，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段的纯度，之后，将抗体κ轻链和Fd链基因克隆至pMD18-T Simple Vector(TaKaRa公司)，采用双脱氧末端终止法，对测序结果进行同源性比较和胚系基因来源的分析。

有关操作具体步骤如下：

2.1 RT-PCR扩增1F2抗体的κ链和Fd链

2.1.1 引物设计

参照美国Scripps研究所设计的引物，根据鼠源免疫球蛋白基因不同家族的可变区基因序列设计合成了8对Fd链引物(引入限制性酶切位点XhoI/SpeI)，7对κ链(引入限制性酶切位点SacI/XbaI)引物，序列如下：

κ链上游引物：按顺序依次表示为SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：11

LC1  5’-CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT-3’

LC2  5’-CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC-3’

LC3  5’-CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA-3’

LC4  5’-CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA-3’

LC5  5’-CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA-3’

LC6  5’-CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA-3’

LC7  5’-CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA-3’

                             

                      SacI

κ链下游引物：SEQ ID NO：12

CK   5’-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGAA-3’

                        

                 XbaI

Fd链上游引物：按顺序依次表示为SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：20

HC1  5’-AGG TCC AGC TGC TCG AGT CTGG-3’

HC2  5’-AGG TCC AGC TGC TCG AGT CAGG-3’

HC3  5’-AGG TCC AGC TTC TCG AGT CTGG-3’

HC4  5’-AGG TCC AGC TTC TCG AGT CAGG-3’

HC5  5’-AGG TCC AAC TGC TCG AGT CTGG-3’

HC6  5’-AGG TCC AAC TGC TCG AGT CAGG-3’

HC7  5’-AGG TCC AAC TTC TCG AGT CTGG-3’

HC8  5’-AGG TCC AAC TTC TCG AGT CAGG-3’

                               

                     XhoI

Fd链下游引物：SEQ ID NO：21

IgG1  5’-AGG CTT ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3’

                          

                   SpeI

2.1.2 1F2杂交瘤细胞的总RNA提取(使用invitrogen公司的TRIZOL试剂)

对数生长期的1F2杂交瘤细胞(5×10⁶～10×10⁶)于10ml离心管中，离心1000rpm，5分钟，弃上清，加1ml不完全培养基悬浮细胞，移入DEPC水处理的2ml EP管中，离心1500rpm，5分钟，弃上清，置液氮冻存备用或用于总RNA的提取。取上述对数生长期的F2杂交瘤细胞(1×10⁶～10×10⁶⁾，加入1ml的TRIZOL试剂，以移液器吹打细胞数次，室温放置5分钟，确保核蛋白复合物有充分的时间解离。按每毫升的TRIZOL加入200μl氯仿，振荡15秒，混匀后室温(15℃～30℃)孵育2～3分钟。4℃离心，12 000×g，15分钟，混合物被分成3层，低层为红色液相，顶层为无色液相(RNA包含其中)。吸取上层水相至另一个DEPC处理的2ml EP管中，按每毫升原始体积的TRIZOL加入0.5ml异丙醇，置室温10min，4℃离心，12 000×g，10分钟，沉淀RNA，弃上清加入1ml 75％的乙醇悬浮沉淀。(洗涤RNA，RNA可在乙醇中4保存1周)。4℃离心，7 500×g，10分钟，尽量弃去上清。温晾干或真空干燥5～10分钟，(注意RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。加入DEPC处理过的双蒸水50μl，溶解RNA样品，取5μl琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的总RNA。A溶液1μl，分别以500μl DEPC处理过的双蒸水稀释，取稀释液100μl测定A₂₆₀、A₂₆₀/A₂₈₀，从而获知所抽提的RNA的含量：CRNA(ng/μl)＝A₂₆₀×40×稀释倍数)及纯度，余下样品分装后-70℃冻存或用于RT-PCR。以提取的总RNA为模板，采用上述7对κ轻链和8对Fd链的引物，使用Takara公司的One Step RNA PCR试剂盒，分别扩增1F2单克隆抗体κ轻链和Fd链基因，体系如下：

将反应体系振荡混匀，离心处理后，进行PCR。反应条件：

●50℃    30分钟    RT-PCR反应

●94℃    2分钟     Rtase失活

●72℃    2分钟

反应完毕后取3μl反应产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。

结果：从分泌Stx2中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F2中提取总RNA(图2)，以总RNA为模板，采用7对鼠源κ轻链及8对Fd链引物，通过一步法RT-PCR扩增1F2κ轻链及1F2Fd链。1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR扩增分别得到大小约为660bp的1F2κ轻链(图3)和1F2Fd链基因(图4)，均与预期片段大小相符，初步证实扩增产物为所需目的片段，下一步可对PCR产物进行回收。

3.PCR产物的克隆与基因序列测定及结构分析

1.采用T-A克隆方法克隆PCR回收产物，将抗体κ链和Fd片段的PCR产物分别克隆至pMD-18T载体，对插入片段酶切鉴定。

结果：从pMD18-T-1F2Fd载体和pMD18-T-1F2κ载体上均切出约660bp左右的目的片段(图5)

2.将酶切鉴定正确的pMD18-T-1F2Fd载体和pMD18-T-1F2κ载体进行序列测定；分别应用下列二个数据库对所得序列与现有已报道的其它各种抗体基因进行同源性比较，并分析其胚系基因来源，数据库网址如下：

http://www.ncbi.nim.nih.gov/blast/Blast.cgi

http://imgt.cines.fr/IMGT-vquest/share/textes

用ANTHEPROT软件(V5.0)对κ链和Fd片段的氨基酸序列和理化性质进行分析；将氨基酸序列提交SWISS-MODEL在线工具通过分子模建预测κ链和Fd链的蛋白三级结构并提交PDB数据库比对。

基因测序结果表明：1F2κ链基因为648bp(SEQ ID NO：3)，经比对与鼠抗体的κ链的胚系基因具有较高的一致性，为92％，1F2Fd链基因为636bp(SEQ ID NO：4)，经比对与鼠抗体重链的胚系基因具有较高的一致性，为87％。

1F2κ链的胚系基因来源：

V-GENE：D00081 IGKV1-117*01

J-GENE：V00777 IGKJ1*01

3.2 1F2κ链通过FR-IGMT and CDR-IGMT分析显示：

CDR1：CAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTAT

CDR2：AAAGTTTCC

CDR3：TGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGG

1F2 Fd片段的胚系基因来源：

V-GENE：AJ851868 IGH5-6-3*01

D-GENE：IGHD2-1*01

J-GENE：IGHDJ4*01

1F2 Fd片段通过FR-IGMT and CDR-IGMT分析显示：

CDR1：GGGTTCACTTTCAGTGTCTATGGC

CDR2：ATTAATAATAATGGTGGTAGCACC

CDR3：TGTGCAAGCATCCCTCTCTTTGGTAACTACTGG

1F2κ链基因编码216个氨基酸(SEQ ID NO：1)，可变区位于1～106位氨基酸(SEQ IDNO：1)，CDR1、CDR2和CDR3的区域分别为24aa～34aa，52aa～54aa和91aa～98aa，分子量约为23883Da；1F2Fd链基因编码212个氨基酸(SEQ ID NO：2)，可变区位于1～108位氨基酸(SEQ ID NO：3)，CDR1、CDR2和CDR3的区域分别为20aa～27aa、45aa～52aa和91aa～100aa；分子量约为22436Da；1F2Fd链基因链氨基酸序列的第16、90、137、192、212位氨基酸和1F2κ链氨基酸序列的第21、91、137、197位氨基酸均为半胱氨酸，可以形成链内和链间二硫键。将κ链和Fd链的氨基酸序列提交SWISS-MODOL蛋白质网上三维结构预测系统预测其三维结构，结果(图6～图7)提交PDB数据库比对后显示：获得的κ链和Fd链具有鼠源抗体κ轻链和重链结构特征。

1F2κ链基因编码的氨基酸序列：(SEQ ID NO：1)

MTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKFLIYKVSNRFS

                            CDR1                  CDR2

GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIKRADAAP

                                 CDR3

TVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDST

YSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

1F2Fd链基因编码的氨基酸序列：(SEQ ID NO：3)

SGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSVYGMSWVRQTPDKRLELVATINNNGGSTYYPDSVK

                     CDR1                    CDR2

GRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCASIPLFGNYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY

                                  CDR3

PLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVP

SSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC

经比对κ链和Fd链的基因和氨基酸序列与现已报道的各种其它已知抗体基因序列和氨基酸序列均不完全一致。说明单克隆抗体1F2基因序列的确来自小鼠胚系基因，是属于一种新的有功能的针对Stx2活性中心的抗体基因。下一步可以采用1F2κ链和1F2Fd链构建1F2抗体的Fab基因工程抗体。

实施例3 Stx2中和性单克隆抗体1F2的Fab形式抗体的构建和可溶表达

首先将分析正确的1F2κ链和1F2Fd链基因克隆至分泌表达Fab抗体的载体pcomb3X之中，构建pcomb3X-1F2Fdκ质粒，酶切鉴定后，切除pcomb3X载体上的噬菌体外壳蛋白III基因后自连，构建成pcomb3X-1F2Fab表达质粒，经限制性酶切鉴定及DNA测序分析，证实基因构建正确后转化到大肠杆菌XL-blue中，构建成pcomb3X-1F2Fab/XL-blue重组子，IPTG诱导1F2Fab抗体蛋白的表达。SDS-PAGE电泳ELISA和Western-blot分析表明Fab基因在大肠杆菌中的表达。有关操作具体步骤如下：

1.质粒DNA提(使用Omega公司质粒抽提试剂盒)

挑取平板上分隔良好的菌落转种于带相应抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；取菌液分装于1.5mL离心管中，12000g离心3分钟，留取沉淀。每管加100μL Solution I悬浮，充分振荡混匀。加入100μL Solution II，轻柔混匀，冰水浴5分钟；加入250μL SolutionIII，轻振混匀，室温放置10分钟。4℃、12000g离心10分钟，将上清移至分离管中；12000g离心1分钟，倾倒收集管中的废液；加入500μL washing buffer于分离管中，同上离心并弃去收集管中的废液。重复洗涤一次；12000g离心1分钟，使乙醇完全挥发；将分离管置于另一干净EP管中并加入一定量的TE buffer，65℃水浴5分钟，12000g离心1分钟；取一定量洗脱液进行电泳，其余置于-20℃保存备用。

2.感受态菌的制备(CaCl₂法)

无菌接种环蘸取-70℃冻存的DH5α或XL-Blue细菌保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16小时。挑取单个菌落接种于2mL LB培养液中，37℃摇床培养12～16小时；将过夜培养的DH5α或XL-Blue菌按1％比例转种至LB培养液中，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.2～0.4时，8000g离心5分钟收集细菌；加入1mL预冷的0.1M CaCl₂重悬沉淀，冰水浴3小时；4℃8000g离心5分钟，弃上清；加入100μL预冷的0.1M CaCl₂悬浮沉淀，冰水浴1小时，备用。

3.构建重组质粒Pcomb3X-1F2Fd

pMD18-1F2Fd质粒经XhoI+SpeI双酶切回收目的片段后与同样经XhoI+SpeI双酶切回收的载体Pcomb3X相连接，构建重组质粒Pcomb3X-1F2Fd。

3.1 大量抽提质粒pMD18-1F2Fd及Pcomb3X，操作方法同前。

3.2 酶切反应

载体Pcomb3X及pMD18-1F2Fd均用XhoI+SpeI双酶切，反应体系如下：

混匀，37℃水浴4小时。

3.3 酶切后目的片段的回收

将上述酶切反应体系中分别加入5μl 10×Loading Buffer，电泳，100V，待指示剂迁移至距凝胶前沿1.5cm时停止电泳。分别回收Fd基因片段(636bp)，以及载体Pcomb3X的大片段，具体操作同前。

3.4 连接反应

紫外分光光度计检测回收产物核酸含量，目的基因片段为10ng/μl，载体片段为50ng/μl。根据目的片段与载体摩尔数比一般为1∶2～10的原则，确连接反应体系如下：

                                            

● Fd片段(10ng/μl)           2μl

● Pcomb3X大片段(50ng/μl)    1μl

● T4 DNA连接酶(5U/μl)       1μl

● 缓冲液                     1μl

● ddH₂O                      5μl

                                           

● 总体积                     10μl

22℃连接1小时，65℃灭活10分钟。

3.5 连接产物转化及阳性重组子的筛选、鉴定

感受态细菌E.coli DH5α的制备(CaCl₂法)同前；Amp⁺LB平板的制备同前；连接产物转化，方法同前；阳性重组子的筛选与鉴定，采用XhoI+SpeI双酶切，其余方法同前

4.构建重组质粒Pcomb3X-1F2Fdκ(含噬菌体外壳蛋白III基因)

pMD18-1F2κ质粒经ScaI+XbaI双酶切回收目的片段后与同样经ScaI+XbaI双酶切回收的载体Pcomb3X-1F2Fd大片段相连接，构建重组质粒Pcomb3X-1F2Fdκ(含噬菌体外壳蛋白III基因，PIII)。

4.1.大量抽提质粒pMD18-1F2κ及Pcomb3-1F2Fd，操作方法同前。

4.2.酶切反应

载体pMD18-1F2κ及Pcomb3X-1F2Fd均用ScaI+XbaI双酶切，反应体系如下：

混匀，37℃水浴4小时。

4.3.酶切后目的片段的回收

灌制1％琼脂糖回收胶，将上述酶切反应体系中分别加入5μl 10×Loading Buffer，电泳，100V，待指示剂迁移至距凝胶前沿1.5cm时停止电泳。分别回收κ基因片段(655bp)，以及载体Pcomb3X-1F2Fd的大片段，具体操作同前。

4.4.连接反应

紫外分光光度计检测回收产物核酸含量，目的基因片段为10ng/μl，载体片段为50ng/μl。根据目的片段与载体摩尔数比一般为1∶2～10的原则，确连接反应体系如下：

22℃连接1小时，65℃灭活10分钟。

4.5.连接产物转化及阳性重组子的筛选、鉴定

阳性重组子的筛选与鉴定采用SacI和XbaI、XhoI和Spe、ISacI和SpeI双酶切鉴定，其余方法同前。

结果(图8A和图8B)：分别用SacI和XbaI、XhoI和Spe、ISacI和SpeI双酶切，分别获得655bp、636bp、1400bp的基因片段，片段大小分别与1F2单抗的κ轻链、Fd片段和1F2Fdκ全长的基因大小相符，说明Pcomb3X-1F2Fdκ重组质粒构建成功，下一步可将构建成功的Pcomb3X-1F2Fdκ质粒采用NheI和SpeI双酶切，切除PIII基因后自连，构建Pcomb3X-1F2Fab表达载体。

5.构建Pcomb3X-1F2Fab表达载体(无PIII基因)

重组质粒Pcomb3X-1F2Fdκ(含PIII基因)，经SpeI+NheI双酶切(切除PIII基因)回收Pcomb3X-1F2Fd1κ5大片段后自连，转化大肠杆菌XL-Blue感受态菌，构建Pcomb3X-1F2Fab表达载体。

5.1.大量抽提质粒Pcomb3X-1F2Fdκ，操作方法同前。

5.2.酶切反应

质粒Pcomb3X-1F2Fdκ用SpeI+NheI双酶切，反应体系如下：

混匀，37℃水浴4小时。

5.3.酶切后目的片段的回收

灌制1.0％琼脂糖回收胶，将上述酶切反应体系中分别加入5μl 10×Loading Buffer，电泳，100V，待指示剂迁移至距凝胶前沿1.5cm时停止电泳。分别回收经SpeI+NheI双酶切后的Pcomb3X-1F2Fdκ的大片段，具体操作同前。

5.4.连接反应

紫外分光光度计检测回收产物核酸含量，载体片段为30ng/μl，连接反应体系如下：

22℃连接1小时或过夜，65℃灭活10分钟。

5.5.连接产物转化及阳性重组子的筛选、鉴定

连接产物转化XL-Blue菌，阳性重组子采用SacI和XbaI、SacI和XhoI、XbaI和XhoI.XhoI和SpeI双酶切鉴定，其余方法同前。

结果(图9)：将经NheI和SpeI双酶切后自连的Pcomb3X-1F2Fab载体，分别采用SacI和XbaI、SacI和XhoI进行双酶切，分别切出约655bp和750bp的基因片段，与预期片段大小相符；采用XbaI和XhoI切出约100bp的基因片段，凝胶上显现条带，原因是片段太小，电泳时跑出凝胶外，但载体大片段与预期片段大小相符。采用XhoI和SpeI未切出基因片段，与预期结果相符。酶切鉴定结果表明：表达载体Pcomb3X-1F2Fab构建成功，质粒送生物技术公司测序。序列测定结果表明：插入Fab抗体表达质粒Pcomb3X的κ链与Fd链的基因序列与1F2单抗的κ轻链及Fd链的序列完全一致，无突变发生，且方向为5’κ-pelB-Fd 3’，噬菌体衣壳蛋白III(PIII)的基因已切出，该结果证明：1F2κ链及1F2Fd链正确插入Pcomb3X载体，来源于1F2单克隆抗体的Fab基因工程抗体表达载体Pcomb3X-F2Fab构建成功。

5’κ-pelB-Fd 3’序列如下：SEQ ID NO：23

GAGCTCGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTC

TTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAA

ACCAGGCCAGTCTCCAAAGTTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACA

GGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCGCAGAGTGGAGGCTGAGGAT

CTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCT

GGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAA

CATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAG

TGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGC

AAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATA

ACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAG

GAATGAGTGTTAATTCTAGATAATTATATGGAGGAATTTAAAATGAAATACCTATTGCCTACGGCAG

                                                     pelB

CCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAACAAGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG

GGGAGGCTTAGTGCAGCCCGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCGCTGGGTTCACTTTC

AGTGTCTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTTGGTCGCAACCA

TTAATAATAATGGTGGTAGCACCTATTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAG

ACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGATACAGCCATGTAT

TACTGTGCAAGCATCCCTCTCTTTGGTAACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCT

CAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAAC

TCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTG

GAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCT

ACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTG

CAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGT

ACTAGT

实施例4 1F2Fab抗体的可溶表达

1取含表达质粒Pcomb3X-1F2Fab的XL-blue工程菌菌种，按1％的浓度接种4ml SB-A⁺培养液中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃过夜培养后，按2％的浓度转种50ml SB-A⁺培养液中，37℃振荡培养至A₆₀₀＝0.8，加入1mmol/L IPTG，置30℃振荡培养10h～12h，同时设空载体菌诱导对照；4℃4000rpm离心15min。弃上清，用1/10体积PBS(PH7.4)重悬细菌沉淀，冰浴下超声破碎，功率300W，超声10S，间歇10S，50次，每个油镜视野未破菌少于2个为裂菌完全；4℃10 000rpm离心20min；收集上清，间接ELISA和SDS-PAGE鉴定1F2Fab抗体的表达。

2 SDS-PAGE鉴定1F2Fab抗体的表达

灌制5％浓缩胶，15％的分离胶，以含表达质粒Pcomb3-1F2Fab的XL-blue工程菌超声上清为样品进行SDS-PAGE，Pcomb3X空载体菌超声上清为阴性对照。

3 间接ELISA鉴定1F2Fab抗体的表达

将羊抗鼠Fab抗体用包被液(pH 9.6碳酸盐缓冲液)1∶1000稀释，100μl/孔包被ELISA，4℃放置10h后，300μl/孔1％BSA封闭过夜加含表达质粒Pcomb3X-1F2Fab的XL-blue工程菌超声上清，37℃室温30min，加入HRP标的羊抗鼠Fab抗体，37℃室温30min，加OPD显色于波长492nm测定吸光度值(具体操作同前)，鼠1F2单克隆抗体为阳性对照，Pcomb3X空载体菌超声上清为阴性对照，PBS为空白对照。

结果：将重组子Pcomb3X-1F2Fab转入XL-blue中，构建重组工程菌。30℃下经IPTG诱导，收集诱导后重组工程菌破菌上清。间接ELISA检测重组工程菌超声破菌上清，出现阳性结果；SDS-PAGE检测显示(图10)：在Mr约为23KDa处出现1条新的蛋白表达带，与1F2Fab的κ链和Fd链理论预测的分子量相近，结果说明在IPTG的诱导下，成功实现了抗Stx2毒性活性中心的Fab抗体的原核可溶表达，ELISA减色结果表明：表达的Fab抗体具有与天然Stx2特异结合的能力，为其在诊断和治疗EHEC O157感染及其并发症中的进一步应用奠定了基础。

实施5 1F2Fab抗体的生物学特性鉴定

采用亲和层析纯化表达蛋白后以SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果，Western blot检测1F2Fab特异性竞争ELISA检测1F2Fab相对亲本单抗1F2的亲和力；通过1F2Fab体外抑制Stx2对Vero细胞的细胞毒实验和1F2Fab抗体在Balb/c小鼠体内中和Stx2毒性的实验鉴定1F2Fab抗体对Stx2的中作用。具体操作如下：

1.1F2Fab抗体蛋白的纯化

1.1大量制备1F2Fab抗体表达菌超声上清

按1％的浓度接种150ml SB-A⁺培养液中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃过夜培养后，按2％的浓度转种5 000ml SB-A⁺培养液中，37℃振荡培养至A₆₀₀＝0.8，加入1mmol/L IPTG，置30℃振荡培养过夜或14h，4℃8 000g离心20min收集细菌，称重后备用。取100g表达菌，1/10体积PBS(PH7.4)重悬细菌沉淀，冰浴下超声破碎，功率300W，超声10s，间歇10s，50次，每个油镜视野下未破菌少于2个为裂菌完全。

1.2 1F2 Fab抗体的纯化

1.2.1 用10倍于柱床体积的Binding buffer A平衡Protein L Resin层析柱；以1ml/min的速度上样于Protein L Resin柱，用Binding buffer A洗柱子直至所有的未结合的蛋白都被洗脱，采用A₂₈₀监测；10倍柱床体积的Elution buffer B连续洗脱结合蛋白，洗脱下的蛋白直接接入装有中和缓冲液的管中，调节纯化蛋白的PH至7.4；Lowry法测定洗脱下的抗体蛋白质的浓度。

1.2.2 1F2Fab蛋白浓缩

纯化后溶液中Fab含量低，不宜进行后续的鉴定实验，故采用固体聚乙二醇吸水浓缩Fab。具体操作操作步骤如下：将1F2Fab抗体溶液装入透析袋，透析完毕后，置于一平皿中。加入适量PEG 6 000包埋透析袋，直到容积合适为止；用PBS悬浮透析袋，漂洗净表面的PEG；取出透析袋中的1F2Fab抗体，分装贮存备用。

2.1 F2Fab抗体的生物学特性检测

2.1 Western blot检测1F2Fab特异性

Stx2经SDS-PAGE后转印硝酸纤维素膜，分别以纯化后的抗Stx2单抗1F2和1F2Fab蛋白为一抗，分别以HRP标记的羊抗小鼠Fab IgG为二抗，进行Western blot，具体操作步骤参见实施1。

2.2 间接ELISA比较1F2Fab抗体与亲本单抗1F2的抗原原结合活性

以天然Stx2(2μg/ml)，每孔加100μl，4℃包被过夜。洗板，加1％BSA溶液，300μl/孔，37℃封闭2h。洗板，空干，分别依次加入以PBS倍比稀释的不同浓度的1F2Fab抗体和1F2单抗(0.2μg/ml，0.4μg/ml，0.8μg/ml，1.6μg/ml，3.2μg/ml，6.4μg/ml，12.8μg/ml)，100μl/孔，37℃温育40min，PBS作空白对照，正常鼠血清为阴性对照。洗板，分别加入HRP标记的羊抗小鼠重链和轻链IgG血清(1∶20 000)，100μl/孔，37℃温育40min。洗板，加入酶作用底物液，100μl/孔，37℃避光显色5min。加入2mol/L H₂SO₄，50μl/孔，终止反应。在酶标仪上以空白对照调零，测定A₄₉₂值。

2.3 竞争ELISA检测1F2Fab相对亲本单抗1F2的亲和力

以天然Stx2(2μg/ml)，每孔加100μl，4℃包被过夜。洗板，加1％BSA溶液300μl，37℃封闭2h。洗板，空干，依次加入PBS倍比稀释的不同浓度1F2Fab抗体(0.2μg/ml，0.4μg/ml，0.8μg/ml，1.6μg/ml，3.2μg/ml，6.4μg/ml，12.8μg/ml)分别与PBS稀释的12.8μg/ml1F2单抗混合后，100μl/孔，37℃温育40min。同时以只加入100μl/孔1F2单抗作为对照。洗板，分别加入HRP标记羊抗小鼠重链和轻链IgG血清(1∶20 000)，100μl/孔，37℃温育40min。洗板，加入酶作用底物液，100μl/孔，37℃避光显色5min。加入2mol/L H₂SO₄，50μl/孔，终止反应。在酶标仪上以空白对照调零，测定A₄₉₂值。计算抑制率。抑制率(％)＝[(对照组A值-抑制组A值)/对照组A值]×100％

3.1F2Fab抗体的生物学功能研究

3.1 1F2Fab与1F2单抗体外抑制Stx2的细胞毒作用的比较

分别取以DMEM完全培养基稀释的不同浓度的与DMEM完全培养基稀释的浓度为0.2ng/ml的天然Stx2(10×LC₅₀的剂量)等体积混合(抗体终浓度为0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml)，37℃，孵育1h。将Vero细胞在含10％小牛血清的DMEM全培养基中培养至对数生长期，按1×10⁴/100μl接种于96孔细胞培养板，37℃，5％CO₂培养24h。分别取以DMEM完全培养基稀释的不同浓度的1F2Fab抗体、1F2单抗和与DMEM完全培养基稀释的浓度为0.2ng/ml的天然Stx2(10×LC₅₀的剂量)等体积混合后37℃，孵育1h。将上述混合液加入Vero细胞培养板中，100μl/孔(抗体终浓度为0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml)，37℃，5％CO₂，继续培养72h。以只加毒素不加抗体的培养孔为阴性对照，以只加抗体不加毒素的孔为阳性对照，，以只加细胞培养液的孔为正常对照。每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃，继续培养4小时后终止培养，小心吸弃孔内培养上清，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟。在酶联免疫检测仪上选择波长492nm测定各孔光吸收值，计算细胞存活率。若实验组细胞存活率大于阴性对照孔，则说明抗体有中和作用。

3.2 1F2Fab抗体在Balb/c小鼠体内中和Stx2毒性的实验

选用8周龄雌性Balb/c小鼠，小鼠于实验前一周分笼，分6组，每组10只。经一周适应期后，每组动物经腹腔注射给予以PBS稀释的不同剂量的1F2Fab抗体液1h后，每组动物经腹腔注射给予50ng/kg致死剂量(LD₁₀₀)的天然Stx2，最终每只小鼠注射的总液体量为0.5ml。阴性对照组每只小鼠给予0.5ml无关单抗3E5(1mg/ml)，PBS为正常对照组。观察各组小鼠的死亡情况，在10d的观察期后计算小鼠的存活率。采用PEMS统计软件经χ²检验进行统计学分析，P＜0.05具有统计学意义，P＜0.01差异极显著。抗体及毒素的剂量和体积如表8所示。

                表3 动物分组及攻毒剂量

结果：大量制备1F2Fab抗体表达菌超声上清，采用Protein L Resin亲和层析纯化1F2Fab抗体，纯化后样品经SDS-PAGE后，采用凝胶成像分析系统扫描分析蛋白纯度为95％(图11)，Western blot结果(图12)表明，纯化后的1F2Fab抗体能与相应转移至硝酸纤维素膜上的天然Stx2蛋白在32KDa处形成单一的蛋白质染色带；间接ELISA检测结果(图13)表明，抗体的抗原结合活性随着抗体浓度的增加而增强；在相同抗体浓度时，单抗1F2的结合力大于1F2Fab。竞争ELISA检测结果(图14)表明，1F2Fab抗体能与亲本鼠单抗1F2竞争性结合同一抗原表位，且竞争作用随着抗体浓度增加而加强。根据50％抑制率时1F2Fab与亲本鼠单抗1F2抗体浓度的比值，可计算出1F2Fab的亲和力为亲本鼠单抗1F2的85％。

1F2Fab与1F2单抗体外中和活性的比较试验结果(图15)表明：1F2Fab抗体在体外能中和天然Stx2毒素，从而抑制Stx2对Vero细胞的细胞毒作用，与无关抗体3E5比较，差异极显著，p＜0.01。相同剂量下，1F2Fab抗体比亲本鼠单抗1F2对Stx2的细胞毒作用的抑制率低，1F2单抗浓度约为20ng/ml时，对Stx2细胞毒作用的抑制率达98％，而同等剂量下，1F2Fab抗体对Stx2细胞毒作用的抑制率达83％。1F2Fab抗体内中和活性试验结果(表4)表明，3E5对照组小鼠全部死亡，而实验各组的小鼠症状较3E5对照组轻，出现症状相对较慢，且均有部分小鼠因抗体中和毒素，而能够耐受致死剂量的天然Stx2毒素攻击而得以存活。说明1F2Fab抗体在动物体内具有一定的中和活性，3200ng/kg剂量的1F2Fab抗体对致死剂量的Stx2攻毒小鼠的保护率达到60％，与3E5对照组比较，差异极显著，p＜0.01。

            表4 1F2Fab抗体体内保护试验结果

^*p＜0.01vs control groups of 3E5 and PBS；^**p＜0.05 vs control groups of 3E5 and PBS

综上所述，本发明的Fab抗具有与亲本鼠源性单抗1F2相当的Stx2毒性中和作用，且Fab抗体分子量小，仅为全抗体分子量的1/3，大大降低了该中和性抗体的免疫原性，与亲本单抗1F2相比更具临床应用价值。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

                                序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>一种中和肠出血性大肠杆菌O157：H7志贺毒素II的单克隆抗体、Fab抗体与应用

<130>

<160>6

<170>Patent In version 3.2

<210>1

<211>216

<212>PRT

<213>κ链的氨基酸序列

<400>1

Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala

1               5                   10                  15

Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn

            20                  25                  30

Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Phe

        35                  40                  45

Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ash Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val

65                  70                  75                  80

Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val

                85                  90                  95

Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp

            100                 105                 110

Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr

        115                 120                 125

Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys

    130                 135                 140

Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly

145                 150                 155                 160

Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

                165                 170                 175

Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn

            180                 185                 190

Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val

        195                 200                 205

Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

    210                 215

<210>2

<211>648

<212>DNA

<213>编码k链的核苷酸序列

<400>2

atgacccaga ctccactctc cctgcctgtc agtcttggag atcaagcctc catctcttgc     60

agatctagtc agagcattgt acatagtaat ggaaacacct atttagaatg gtacctgcag    120

aaaccaggcc agtctccaaa gttcctgatc tacaaagttt ccaaccgatt ttctggggtc    180

ccagacaggt tcagtggcag tggatcaggg acagatttca cactcaagat cagcagagtg    240

gaggctgagg atctgggagt ttattactgc tttcaaggtt cacatgttcc gtggacgttc    300

ggtggaggca ccaagctgga aatcaaacgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc    360

ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac    420

ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc    480

gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc    540

ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac    600

aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgt                 648

<210>3

<211>212

<212>PRT

<213>Fd链的氨基酸序列

<400>3

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys

1               5                   10                  15

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg

            20                  25                  30

Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Thr Ile Asn Asn Asn

        35                  40                  45

Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

    50                  55                  60

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu

65                  70                  75                  80

Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Ile Pro Leu Phe

                85                  90                  95

Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys

            100                 105                 110

Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln

        115                 120                 125

Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

    130                 135                 140

Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val

145                 150                 155                 160

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser

                165                 170                 175

Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys

            180                 185                 190

Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val

        195                 200                 205

Pro Arg Asp Cys

    210

<210>4

<211>636

<212>DNA

<213>编码Fd链的核苷酸序列

<400>4

tctgggggag gcttagtgca gcctggaggg tccctgaaac tctcctgtgc agccgctggg     60

ttcactttca gtgtctatgg catgtcttgg gttcgccaga ctccagacaa gaggctggag    120

ttggtcgcaa ccattaataa taatggtggt agcacctatt atccagacag tgtgaagggc    180

cgattcacca tctccagaga caatgccaag aacaccctgt acctgcaaat gagcagtctg    240

aagtctgagg acacagccat gtattactgt gcaagcatcc ctctctttgg taactactgg    300

ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca    360

ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag    420

ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg    480

cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc    540

ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc    600

accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg gattgt                              636

<210>5

<211>28

<212>PRT

<213>自EHEC O157：H7 Stx2 A1亚单位的B细胞表位肽氨基酸序列

<400>5

Asp Ile Arg Gly Leu Asp Val Tyr Gln Ala Arg Phe Asp His Leu Arg

1               5                   10                  15

Leu Ile Ile Glu Gln Asn Asn Leu Tyr Val Ala Gly

            20                  25

<210>6

<211>1414

<212>DNA

<213>Pcomb3X-1F2Fab质粒的测序序列

<400>6

gagctcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc     60

atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg    120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ttcctgatct acaaagtttc caaccgattt    180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc    240

gcagagtgga ggctgaggat ctgggagttt attactgctt tcaaggttca catgttccgt    300

ggacgttcgg tggaggcacc aagctggaaa tcaaacgggc tgatgctgca ccaactgtat    360

ccatcttccc accatccagt gagcagttaa catctggagg tgcctcagtc gtgtgcttct    420

tgaacaactt ctaccccaaa gacatcaatg tcaagtggaa gattgatggc agtgaacgac    480

aaaatggcgt cctgaacagt tggactgatc aggacagcaa agacagcacc tacagcatga    540

gcagcaccct cacgttgacc aaggacgagt atgaacgaca taacagctat acctgtgagg    600

ccactcacaa gacatcaact tcacccattg tcaagagctt caacaggaat gagtgttaat    660

tctagataat tatatggagg aatttaaaat gaaataccta ttgcctacgg cagccgctgg    720

attgttatta ctcgctgccc aacaagccat ggccgaggtg cagctgctcg agtctggggg    780

aggcttagtg cagcccggag ggtccctgaa actctcctgt gcagccgctg ggttcacttt    840

cagtgtctat ggcatgtctt gggttcgcca gactccagac aagaggctgg agttggtcgc    900

aaccattaat aataatggtg gtagcaccta ttatccagac agtgtgaagg gccgattcac    960

catctccaga gacaatgcca agaacaccct gtacctgcaa atgagcagtc tgaagtctga   1020

ggatacagcc atgtattact gtgcaagcat ccctctcttt ggtaactact ggggtcaagg   1080

aacctcagtc accgtctcct cagccaaaac gacaccccca tctgtctatc cactggcccc   1140

tggatctgct gcccaaacta actccatggt gaccctggga tgcctggtca agggctattt   1200

ccctgagcca gtgacagtga cctggaactc tggatccctg tccagcggtg tgcacacctt   1260

cccagctgtc ctgcagtctg acctctacac tctgagcagc tcagtgactg tcccctccag   1320

cacctggccc agcgagaccg tcacctgcaa cgttgcccac ccggccagca gcaccaaggt   1380

ggacaagaaa attgtgccca gggattgtac tagt                               1414

Claims (12)

1.一种中和肠出血性大肠O157:H7的志贺毒素II的单克隆抗体，其特征在于由保藏号为CCTCC：C200822的杂交瘤细胞株制备。

2.一种由权利要求1所述的单克隆抗体制得的Fab抗体，其特征在于包括κ链和Fd链。

3.根据权利要求2所述的Fab抗体，其特征在于所述的κ链具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列或将所述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列的任一种。

4.根据权利要求3所述的Fab抗体，其特征在于编码所述的κ链的核苷酸序列具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与所述SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列中的任一种。

5.根据权利要求2所述的Fab抗体，其特征在于所述的Fd链具有SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列或将所述SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列的任一种。

6.根据权利要求5所述的Fab抗体，其特征在于编码所述的Fd链的核苷酸序列具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与所述SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列中的任一种。

7.一种表达载体，其特征在于含有权利要求4和6所述的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于该表达载体包括裸DNA或质粒DNA中的至少一种。

9.一种表达宿主，其特征在于转入了权利要求8所述的表达载体。

10.权利要求2所述的Fab抗体在制备预防或治疗肠出血性大肠杆菌感染的药物中的应用。

11.权利要求2所述的Fab抗体在制备ScFv抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体融合蛋白或蛋白单域抗体中的应用。

12.一种预防或治疗肠出血性大肠杆菌感染的药物，其特征在于包含权利要求2所述的Fab抗体和药学上可接受的载体。

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