CN1305525C - 人和易感动物o157菌基因工程多价亚单位疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物制药领域，涉及一种用于人和易感动物O157菌感染免疫预防和治疗的基因工程多价亚单位疫苗及制备方法。该疫苗选用紧密粘附素(Intimin)和志贺毒素I结合亚单位(Stx1B)、志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)与EHEC溶血素(haemolysin，hly)及各自的免疫保护性片段，将其进行基因克隆表达后以不同组合、不同比例混合，或在基因水平以不同组合及连接方式融合，构建基因重组工程菌，经发酵及一系列的纯化程序从而获得高纯度的融合蛋白分子。该多价疫苗可用于牛、羊、猪、鸡等O157菌易感家畜家禽的免疫预防和感染的治疗，并经进一步实验验证后最终应用于人类的O157菌感染的免疫预防和治疗。该疫苗的制备工艺简捷、易于放大、重复性好，所获目标蛋白纯度较高，动物试验证明可刺激机体产生高效的免疫应答和免疫预防保护及治疗作用。

Description

人和易感动物O157菌基因工程多价亚单位疫苗及制备方法

                                技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及用于人和易感动物O157菌感染免疫预防和治疗的基因工程多价亚单位疫苗。

                                背景技术

EHEC O157作为一种新发现的传染性致病菌，其危害正由于近年来世界各国接连发生的暴发流行而逐渐被人们所认识。O157感染可以引发严重并发症如溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrom，HUS)、血栓形成性血小板减少性紫癜(Thromboricthromobocytopenic porpura，TTP)，并可致病人死亡。O157感染的治疗较困难，抗菌治疗促使细菌毒素释放导致HUS等并发症的发生率增高。研制O157疫苗和其有效接种可能是预防感染与控制大规模暴发流行最有效、最有前景的方法。但目前世界各国均无可用于人或易感动物的O157疫苗。

O157菌的致病性主要体现于细菌的粘附定植力和细菌毒素两个方面。紧密粘附素(Intimin)是该菌重要而且特异的粘附分子，intimin及其受体(转位紧密粘附素受体Tir)介导细菌粘附于肠上皮细胞，Intimin的胞外区(C-端片段)是与Tir受体结合的功能区，现有实验结果已经证明intimin尤其是C-端片段(Intimin-C)的特异性抗体可以阻断细菌的粘附进而使其丧失致病力，因而具有较强的免疫保护性。(1.Son W G和Graham T A，GannonV P J.临床免疫学实验诊断杂志2002；9(1)：46；2.Gansheroff L J和Wachtel M R，()’Brien A D.感染免疫杂志1999；67(12)：6409)

EHEC O157主要产生两种志贺毒素毒素，分别称为志贺毒素I(Stx1)和志贺毒素II(Stx2)。在细菌体内，Stx2为分泌型表达，Stx1为胞内表达。两种毒素均由1个A亚单位和5个B亚单位组成，A亚单位具有细胞内毒性，能与28SrRNA作用导致蛋白质合成停止，是大肠杆菌O157:H7引起临床表现的病理基础；B亚单位无毒，而具有细胞结合特性，能与具有特定受体(Gb3)的细胞结合，从而引导A亚单位发挥作用。已有实验表明Stx1B和Stx2B具有良好的免疫原性和免疫保护性，刺激机体可以产生较高效价的保护性抗体，具有中和毒素的作用(1.Konadu，EY等人，感染免疫杂志1999；67(9)：6191-6193；2.Paola Marcato等人，感染性疾病杂志2001；183(1)：435-443)。Stx1B和Stx2B能与具有Gb3受体的抗原递呈细胞-树突状细胞(DC细胞)结合，有助于疫苗抗原的递呈和诱导免疫应答(Nacilla H等人，国际免疫学杂志，2003，15(10)1161-1171)，因而在本疫苗设计中兼具有免疫原和佐剂的双重作用，这正是本发明的创新点之一。

EHEC溶血素(haemolysin，hly)是孔道形成细胞溶素家族成员，可在靶细胞膜上形成孔道而杀死靶细胞。Hly溶解红细胞，释放铁源供细菌快速繁殖，是重要的细菌致病因子。

尽管EHEC O157自确认为致病菌以来20多年已经过去了，但至今尚无可用于人或易感动物的疫苗研制成功。原因之一是疫苗抗原的选择集中于细菌脂多糖(1.Konadu，EY等人，感染免疫杂志1999；67(9)：6191-6193；2.Konadu，EY等人，感染性疾病杂志，1998；177(2)：383-387.)，而O157脂多糖所诱生的抗体具有类似抗生素一样促使O157菌释放致死性志贺毒素的作用，因此该技术路线难以最终成功。而以上保护性抗原亚单位的发现也未能进入实质性的疫苗研究，因为单个亚单位抗原所产生的免疫保护作用有限，难以有效预防和清除病菌的感染。本发明在疫苗抗原的选择上直接针对EHEC O157的重要致病因子，并且强调多个致病因子相关保护性抗原的组合应用以产生强大的免疫保护作用，全方位对付这一棘手的病魔，实验证明效果良好。这是本发明的创新点之二。

由肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157天然产生的紧密粘附素(Intimin)、志贺毒素I结合亚单位(Stx1B)、志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)、EHEC溶血素(haemolysin，hly)等保护性抗原亚单位非常有限，细菌抗原组分复杂致分离提纯困难，且大量培养O157菌也非常危险，所以采用病原菌直接培养分离纯化保护性抗原亚单位可行性差。本发明采用基因工程的手段克隆表达保护性抗原亚单位，高效、安全、便于分离纯化。这是本发明的创新点之三。

                                发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，旨在提供一种高效安全的肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157基因工程多价亚单位疫苗及其制备方法，这种疫苗采用与细菌致病性密切相关的几个保护性抗原分子：肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157紧密粘附素(Intimin)、志贺毒素I结合亚单位(Stx1B)、志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)、EHEC溶血素(haemolysin，hly)及其免疫保护性片段进行不同的组合，获得同时具有阻断粘附与对抗毒素的疫苗备选抗原分子。

本发明将肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157紧密粘附素(Intimin)、志贺毒素I结合亚单位(Stx1B)、志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)、EHEC溶血素(haemolysin，hly)及其免疫保护性片段进行基因克隆表达纯化、或在基因水平进行连接构建融合蛋白，进而获得这些保护性抗原亚单位不同种类组合、不同组份比例及不同融合方式的疫苗抗原。在抗原亚单位组合方式上，优选地，将这些保护性抗原亚单位在基因水平进行连接构建融合蛋白；在抗原亚单位组分的选择上，优选地，疫苗抗原是紧密粘附素胞外区免疫保护性片段(Intimin-C)和志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)的组合物或在此基础上加入其他抗原组分。因此更优选地，将O157菌紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C)和志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)在基因水平进行连接构建融合蛋白。

本发明在分别克隆表达紧密粘附素胞外区免疫保护性片段(Intimin-C)和志贺毒素I结合亚单位(Stx1B)、志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)、EHEC溶血素(haemolysin，hly)的基础上，重点完成了紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C)和志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)在基因水平进行连接构建融合蛋白，连接的方式是：紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C)的编码基因通过编码连接子的一段核苷酸序列与Stx2B基因连接，从而获得融合蛋白Stx2B-Intimin-C。编码所述融合蛋白的基因序列是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列。所述的融合蛋白的结构是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。所述的免疫保护性片段Intimin-C的基因序列是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。所述将肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C300)的编码基因和志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)基因相连接的方式是：志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)位于5’端，O157菌紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C300)的编码基因通过编码连接子(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸，GGGGS)的一段核苷酸序列连接于Stx2B基因的3’端，在Stx2B-IntiminC300紧密粘附素免疫保护性片段编码基因的3’端连接6聚组氨酸编码序列。

本发明采用与细菌致病性密切相关的保护性抗原分子：紧密粘附素胞外区(Intimin-C)及志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)进行融合表达，获得了较高的表达量。建立了融合蛋白Stx2B-Intimin-C的纯化工艺，研究了其抗原活性与免疫保护性，并经动物实验证实其免疫预防和感染治疗效果。

本发明的基因工程重组菌及重组融合蛋白的基本特性：a.在摇瓶条件下，目的蛋白表达量达50％，高密度发酵条件下，目的蛋白表达量约40％。b.重组蛋白以包涵体形式表达，分子量为43kDa。c.纯化的重组蛋白能够诱导动物产生较高滴度的抗体，并有良好的免疫保护作用。

本发明的基因工程亚单位单体的构建见实施例2。

本发明还提供了一种工艺简捷、免疫保护效果良好、成本低廉、对人无害的融合型肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C)及志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)基因工程疫苗的制备方法。基因重组融合蛋白疫苗的制备方法如下：

1.克隆肠出血性大肠杆菌O157:H7的Stx2B和Intimin-C的编码基因。

1)培养肠出血性大肠杆菌O157:H7(EHEC O157:H7)

2)用PCR方法扩增EHEC O157:H7的Stx2B和Intimin-C的编码基因。

3)PCR产物的克隆。

4)PCR产物的序列分析。

2.构建Stx2B和Intimin-C基因的融合基因。

1)用限制性内切酶切Stx2B和Intimin-C的克隆质粒。

2)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离。

3)切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带。

4)将Intimin-C和Stx2B目的基因的回收产物克隆入原核细胞表达载体，获得含有Stx2B-Intimin-C基因的重组质粒。

5)将含有Stx2B-Intimin-C基因的重组质粒转化大肠杆菌。

3.测定Stx2B-Intimin-C融合基因的序列。

4.诱导表达Stx2B-Intimin-C融合基因，获得目的蛋白Stx2B-Intimin-C。

5.目的蛋白Stx2B-Intimin-C的N端氨基酸序列分析。

6.纯化分离目的蛋白Stx2B-Intimin-C。

7.鉴定目的蛋白Stx2B-Intimin-C的纯度。

此目的蛋白Stx2B-Intimin-C即为融合型肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C)及志贺毒素II结合亚单位(Stx2B)基因工程疫苗。

                             附图说明

图1为本发明目的基因Stx2B和Intimin-C的PCR克隆扩增。

泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，

泳道2为目的基因Intimin-C的PCR扩增产物(900bp)；

泳道3为目的基因Stx2B的PCR扩增产物(300bp)。

表明目的基因Stx2B和Intimin-C的PCR克隆扩增效果良好。

图2是Stx2B和Intimin-C重组表达质粒的酶切鉴定。

泳道1为Intimin-C重组质粒Hind III/BamH I双酶切产物(900bp)；

泳道2为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；

泳道3，4为重组质粒Nco I/BamH I双酶切产物(300bp)。

酶切片段大小与设计一致，初步证明重组质粒构建成功。

图3是Stx2B基因重组菌诱导表达PAGE电泳图

泳道1：基因重组菌诱导前(0hr)；

泳道2-3：基因重组菌诱导2，5hr；

泳道4：蛋白质分子量标准(Marker)。

基因重组菌经过诱导后在分子量9KDa处有增加的蛋白表达条带，与目的蛋白分子量一致。

图4是Intimin-C基因重组菌诱导表达PAGE电泳图

泳道1，2：空质粒菌诱导前后；

泳道3：基因重组菌诱导前(0hr)；

泳道4，5：基因重组菌诱导2，5hr；

泳道6：蛋白质分子量标准(Marker)。

基因重组菌经过诱导后在分子量35KDa处有增加的蛋白表达条带，与目的蛋白分子量一致。

经过UVP图像扫描分析，诱导5小时目的蛋白表达量约50％。

图5是融合基因Stx2B-Intimin-C重组表达质粒的酶切鉴定。

泳道1，2为重组质粒NcoI/BamH I双酶切产物(300bp)；

泳道3，6为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；

泳道4，5为重组质粒Hind III/BamH I双酶切产物(900bp)；

泳道7，8为重组质粒Nco I/Hind III双酶切产物(1200bp)。

酶切片段大小与设计一致，初步证明重组质粒构建成功，目的基因连接正确。

图6是基因重组菌诱导表达PAGE电泳图

泳道1：空质粒菌；

泳道2：基因重组菌诱导前(0hr)；

泳道3-5：基因重组菌诱导1，2，5hr；

泳道6：蛋白质分子量标准(Marker)。

基因重组菌经过诱导后在分子量43KDa处有增加的蛋白表达条带，与目的蛋白分子量一致。

经过UVP图像扫描分析，诱导5小时目的蛋白表达量约50％。

图7为目的蛋白Stx2B-Intimin-C包涵体洗涤PAGE电泳图

泳道1：诱导后基因重组菌破菌液

泳道2：空

泳道3：破菌上清液

泳道4：包涵体洗涤液A(洗涤后)

泳道5：包涵体洗涤液B(洗涤后)

泳道6～8：包涵体溶解液15μL、10μL、8μL

电泳结果显示目的蛋白为包涵体形式表达，且包涵体洗涤纯化目的蛋白效果良好：洗涤过程中目的蛋白损失小，获得的目的蛋白经UVP扫描分析纯度达到65％。

图8为目的蛋白Stx2B-Intimin-C纯化效果PAGE电泳图

泳道1：包涵体溶解液(纯化前样品)；

泳道2：空；

泳道3，4，5，6：目的蛋白洗脱峰样品；

泳道7：蛋白质分子量标准(Marker)。

结果显示经过纯化步骤，目的蛋白的纯度得到明显改善，收获的目的蛋白峰经UVP扫描分析纯度达到85-99％。

图9、图10为目的蛋白Stx2B-Intimin-C的N端氨基酸测序图

测序结果与设计序列完全一致。

                                具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的描述。

实施例1肠出血性大肠杆菌O157:H7的Stx2B和Intimin-C编码基因的克隆

1.肠出血性大肠杆菌O157:H7(EHEC O157:H7)来源于中国生物制品检定所(菌株编号：44828)

2.摇瓶150rpm过夜培养。取5mL菌液10000rpm离心5分钟去上清，加入0.5mL双蒸水混匀煮沸10分钟，同上离心后取上清作模板。

3.采用PCR方法自EHEC O157:H7基因组扩增Stx2B和Intimin-C的编码基因。

1)引物设计合成如下(下划线示酶切位点)

根据GenBank公布的Stx2B(ACCESSION NC_000902)及Intimin(ACCESSIONZ11541)基因序列和引物合成原则设计引物，引入酶切位点。将linker序列设计在上游基因(Stx2B)的3’端并引入BamH I位点，以BamH I酶切的粘性末端即可将两基因进行正确连接。

                  Stx2B P1 5’-gaattc ccatgggcatgaagaagatgttta-3’(Nco I)

                        P2 5’- gaattcgctgccaccaccgccgtcattattaaact-3’(BamH I)

Stx2B-Intimin-C：

                 Intimin-C P3 5’-gt gaattcacttcagcacttaat-3’(BamH I)

                           P4 5’-a aagcttttctacacaaaccgcata-3’(Hind III)

2)目的基因的PCR扩增：

以肠出血性大肠杆菌EHEC O157:H7基因组DNA(煮沸破菌上清液)为模板，以P1和P2，P3和P4分别扩增Stx2B和Intimin-C基因，采用如下PCR体系和程序：

在一500μl微量离心管中加入下列试剂：

模板DNA  2μl

10×PCR缓冲液(含氯化镁)  5μl

dNTPs(10mmol/L)  4μl

上、下游引物(0.025mmol/L)各  1μl

Taq DNA聚合酶(5u/μl)  1μl

加去离子水至终体积50μl

混合后加入矿物油3滴

反应条件：94℃预变性5分钟后，94℃，90s；60℃，60s；72℃，90s，35个循环周期，然后72℃延伸10min。

4.PCR产物的克隆

采用TA克隆方法克隆PCR产物，方法见文献(于永利，麻彤辉，杨贵贞：TA克隆及双链DNA测序，介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法，中国免疫学杂志，1994，10(1)：5)。

5.PCR产物的序列分析

将TA克隆转化菌株送至公司，按常规方法(J.Sambrook，分子克隆，冷泉港实验室出版社1989聚丙烯酰胺凝胶电泳1.21-1.32)提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。

PCR扩增效果如附图1所示。

实施例2肠出血性大肠杆菌O157:H7的Stx2B和Intimin-C表达质粒的构建及高效表达工程菌的构建及筛选

1.重组质粒的构建

将Stx2B和Intimin-C基因扩增(PCR)产物经1.0％琼脂糖电泳、胶回收纯化后与载体pMD-18T连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，分别用Nco I和BamH I，BamH I和HindIII酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将含Intimin-C目的基因的pMD-18T载体及pET-28a(+)用BamH I和Hind III酶切，酶切产物经2.0％琼脂糖电泳、目的片段胶回收纯化后，用连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，BamH I和Hind III酶切，2.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将含Stx2B目的基因的pMD-18T载体及pET-28a(+)用Nco I和BamH I酶切，酶切产物经2.0％琼脂糖电泳、目的片段胶回收纯化后，用连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，分别用Nco I和BamH I酶切，2.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。酶切鉴定结果如附图2所示。

有关操作具体步骤如下：

I)质粒DNA抽提(使用Omega公司质粒抽提试剂盒)

[1]挑取平板上分隔良好的菌落转种于带相应抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。

[2]取菌液分装于1.5mL离心管中，12000g离心3min，留取沉淀。

[3]每管加100μL Solution I悬浮，充分振荡混匀。

[4]加入100μL Solution II，轻柔混匀，冰水浴5min。

[5]加入250μL Solution III，轻振混匀，室温放置10min。

[6]4℃、12000g离心10min，将上清移至分离管中。

[7]12000g离心1min，倾倒收集管中的废液。

[8]加入500μL washing buffer于分离管中，同上离心并弃去收集管中的废液。重复洗涤一次。

[9]12000g离心1min，使乙醇完全挥发。

[10]将分离管置于另一干净EP管中并加入一定量的TE buffer，65℃水浴5min，12000g离心1min。

[11]取一定量洗脱液进行电泳，其余置于-20℃保存备用。

2)琼脂糖凝胶电泳：

1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120-150mA，电泳20-40分钟。

50×TAE储存液配方：2.0mol/L Tris base，1.0mol/L NaAc，0.1mol/L Na₂EDTA；用冰醋酸调节pH8.3。

3)质粒DNA的酶切反应：

1μg质粒DNA

1μl 10×缓冲液(见Takara公司产品说明书)

1μl限制性内切酶Nco I或BamH I(10u/μl)

1μl限制性内切酶BamH I或Hind III(10u/μl)

用双蒸水补齐至10μl

混合后37℃温育2-3小时。

4)琼脂糖电泳胶的目的DNA回收纯化：

在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带，移入1.5mL EP管。

加入Omega公司胶回收试剂盒的DNA binding buffer，65℃水浴使凝胶完全溶化并保持溶液pH在5.0～6.0之间。将溶胶液移入分离管，12000g离心1min，弃去收集管中的液体。

加入配套的Washing buffer，12000g离心1min，弃去收集管中的液体。重复洗涤1次。

12000g离心1min，分离管移置另一干净1.5mL EP管，加入一定体积的TE buffer，65℃孵育10min，12000g离心1min，取一定量电泳，UVP紫外扫描仪检测回收纯化效果。

5)连接反应(使用Takara公司连接试剂盒)

通过紫外分光光度计检测目的DNA片段和载体片段的浓度，根据外源片段与载体摩尔数比一般为1∶2～10的原则，设计连接反应体系如下：

目的DNA  1μL

质粒载体  1～2μL

ligation solution   5μL

ddH₂O  2～3μL

Total volume  10μL

16℃连接12-16h。

6)感受态菌的制备(CaCl₂法)

(1)无菌接种环蘸取-70℃冻存的细菌保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16小时。

(2)挑取单个菌落接种于2mL LB培养液中，37℃摇床培养12～16h。

(3)将过夜培养的DH5a按1％比例转种至LB培养液中，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.2～0.4时，8000g离心5min收集细菌。

(4)加入1mL预冷的0.1M CaCl₂重悬沉淀，冰水浴3h。4℃ 8000g离心5min，弃上清。加入100μL预冷的0.1M CaCl₂悬浮沉淀，冰水浴1h，备用。

7)连接产物转化

(1)取感受态菌液100μL，加入连接反应产物；冰水浴60min，42℃水浴热休克100s，迅速放置冰水浴1～2min。

(2)加100μL LB培养液，37℃摇床培养1h。

(3)以8000g离心10min，吸弃100μL上清后混匀沉淀，各取50μL涂布平板，37℃孵箱培养过夜。

2.高效表达融合蛋白工程菌的构建及筛选

将分别含Stx2B和Intimin-C基因的重组质粒pET-28a(+)转化大肠杆菌BL21并提取质粒酶切鉴定。基因工程大肠杆菌BL21的感受态菌制备、转化及重组菌的质粒抽提酶切鉴定同前。

取鉴定无误的重组菌接种于3mL含Kan的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20mL含Kan的LB培养液中，37℃摇床培养2.5小时，以IPTG诱导4小时，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达形式和表达量，筛选高效表达菌株。

诱导表达及表达方式鉴定结果如附图3、4所示。

实施例3融合基因表达质粒的构建及高效表达融合蛋白工程菌的构建及筛选

1.重组质粒的构建

将Stx2B和Intimin-C基因扩增(PCR)产物经1.0％琼脂糖电泳、胶回收纯化后与载体pMD-18T连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，分别用Nco I和BamH I，BamH I和HindIII酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将含Intimin-C目的基因的pMD-18T载体及pET-28a(+)用BamH I和Hind III酶切，酶切产物经2.0％琼脂糖电泳、目的片段胶回收纯化后，用连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，BamH I和Hind III酶切，2.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将含Stx2B目的基因的pMD-18T载体及含Intimin-C目的基因的pET-28a(+)用Nco I和BamH I酶切，酶切产物经2.0％琼脂糖电泳、目的片段胶回收纯化后，用连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，分别用Nco I和BamH I，BamH I和Hind III，Nco I和HindIII酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切鉴定结果如附图5所示。

有关操作具体步骤同前。

2.高效表达融合蛋白工程菌的构建及筛选

将含Stx2B-Intimin-C融合基因的重组质粒pET-28a(+)转化大肠杆菌BL21并提取质粒酶切鉴定。基因工程大肠杆菌BL21的感受态菌制备、转化及重组菌的质粒抽提酶切鉴定同前。

取鉴定无误的重组菌接种于3mL含Kan的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20mL含Kan的LB培养液中，37℃摇床培养2.5小时，以IPTG诱导4小时，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达形式和表达量，筛选高效表达菌株。

诱导表达及表达方式鉴定结果如附图6所示。

实施例4基因重组菌的发酵

发酵工艺如下：

采用德国B.Bron 10L发酵罐，发酵过程中种子菌10％比例接种，保持70％溶氧、温度37℃、pH7.0，在A600未达到2时不加补料，之后每0.5h流加补料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的终浓度分别为0.5％、0.2％、和0.2％。在第4次补料后待葡萄糖浓度降为0.1％时加入IPTG 500μmol/L诱导4h收菌。

发酵过程在级联溶氧控制的分批培养基础上，流加补料。

发酵过程所用培养基为改良M9-CAA培养基，在M9-CAA的基础上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl₂·4H₂O、2mg/LCoCl₂·4H₂O、4mg/L FeSO₄·16H₂O、5mg/L H₃BO₃、1.6mg/LMnCl₂·4H₂O、4mg/L CuSO₄而成。

发酵结束后回收菌液，4℃离心(8000g)15分钟。吸弃上清，收集细菌，称重后冻存备用。

结果：10L发酵菌液可以收获细菌湿重800克。

实施例5重组蛋白的纯化

1.包涵体提取：将高效表达的菌体200-500g以TE缓冲液1∶10(W/V)比例悬浮，4℃预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀。采用高压均质机在压力为40-70Mpa的条件下进行破菌(共破菌4～6次)，破菌完毕后，取少量菌液涂片染色，显微镜下观察细胞的完整性，确保细胞破碎完全，随后以500g离心25min，弃沉淀，再以15,000g离心40min，弃上清收集沉淀。以1∶10(W/V)的比例分别用洗涤液A和B各洗涤2次。洗涤条件为：4℃搅拌20min，15,000g离心40min，收集包涵体沉淀；最后将包涵体用包涵体溶解液以1∶10(W/V)的比例混合，4℃搅拌3h，15,000g离心45min，取上清作为下一步纯化的原料。

包涵体提取所用缓冲液：

1)TE缓冲液：20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 8.5

2)包涵体洗涤液A：5mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、1％Triton X-100，pH 8.5

3)包涵体洗涤液B：20mmol/L Tris、2mol/L Urea，pH 8.5

4)包涵体溶解液：1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、8mol/L尿素(pH 8.5)

2.阴离子柱纯化：选择阴离子柱HiTrap Q进行纯化，使用10mmol/L PB，8mol/L Urea在PH11条件下对目的蛋白进行纯化，采用NaCl梯度洗脱。

3.Superdex凝胶过滤层析纯化：步骤(3)所获目标蛋白经葡聚糖PEG透析袋内浓缩或超滤浓缩后用凝胶过滤柱Superdex纯化，用凝胶过滤平衡缓冲液平衡。

4.纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE，检定其纯度。Lowry法检测蛋白浓度。

其中，步骤1所述采用生产或中试纯化中使用的高压破菌技术，破菌至细菌破解率大于98％，差速离心获得包涵体沉淀物。

步骤2所述阴离子纯化填料为Q Sepharose HP、Q Sepharose FF、Q Sepharose XL之一。

步骤3所述所用凝胶过滤层析柱为Superdex 75、Superdex 200、Superdex HR 10/30之一。

包涵体洗涤结果如附图7所示，纯化结果如附图8所示。

实施例6目的蛋白的N端测序

将部分纯化的目的蛋白Stx2B-Intimin-C经SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜，考马斯亮蓝染色并脱色至目的条带清晰，剪下目的条带，送至中国医学科学院基础医学研究所中心实验室进行目的蛋白N端15个氨基酸测序。

测序结果N端15个氨基酸与设计序列完全一致。测序结果如附图9、附图10所示。

实施例7动物免疫及抗体检测

目的蛋白经过纯化后免疫Balb/c小鼠，100ug/只，100μL抗原与等量Al(OH)3佐剂混合，注射小鼠腹部和腹股沟皮下免疫。每周一次，分别于免疫3、4次后的4天采血，ELISA检测血清特异性抗体效价的改变。

结果免疫3次后的抗体阳性率在90％，免疫4次后的抗体阳性率达到98％。

实施例8免疫动物的攻毒保护

同实施例6的免疫方案，免疫4次后的第10天采用致死剂量的O157菌超声上清液(含Stx2毒素及其他致病物质，蛋白浓度1mg/mL)0.05mL腹腔注射对免疫小鼠及对照小鼠进行攻毒实验，观察各组小鼠的死亡情况，在30天的观察期后计算免疫小鼠的死亡/生存率如表1。

表1  Stx2B-Intimin-C皮下免疫小鼠，O157菌超声上清攻毒—免疫保护效果

组别	攻毒后死亡情况					30天后存活数量	存活率(保护率)
								3天	4天	5天	6天	7～30天
	Stx2B-Intimin-C免疫组(50只)对照组(50只)	00	239	111	10								00	460	92％0

结果显示，免疫组小鼠的保护率达到90％以上。

结论：疫苗抗原Stx2B-Intimin-C免疫小鼠，可针对O157菌毒性物质攻击产生有效保护作用。

实施例9感染动物的疫苗治疗观察

以高浓度EHEC O157培养物(10⁹Cfu)经胃灌饲Balb/c小鼠，48hr后以疫苗抗原Stx2B-Intimin-C 100ug(100uL)/只或等体积PBS连续两天每天一次对饲菌小鼠进行灌胃治疗。观察治疗后小鼠排菌时间。

表2  Stx2B-Intimin-C治疗饲菌小鼠后排菌时间观察

组别	治疗后小鼠终止排菌天数					10天后持续排菌小鼠数量	平均排菌时间(天)
								3天	4天	5天	6天	7～10天
	Stx2B-Intimin-C治疗组(50只)对照组(50只)	100	221	83	64								44	038	4.6＞10

两组结果经统计学分析，p＜0.001。说明疫苗抗原Stx2B-Intimin-C对饲菌小鼠进行灌胃治疗可有效缩短染菌小鼠排菌时间。

结论：疫苗抗原Stx2B-Intimin-C对O157菌感染有一定治疗作用。

人和易感动物O157菌感染免疫预防和治疗用途的基因工程多价亚单位疫苗.txt

                                    序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>人和易感动物O157菌感染免疫预防和治疗用途的基因工程多价亚单位疫苗及其制备方法

<130>

<160>3

<210>1

<211>1200

<212>DNA

<213>肠出血性大肠杆菌O157:H7(Enterohemorrhagic E.coliO157:H7，EHEC O157:H7)天然序列人工融合改建

<400>1

atgggcatga agaagatgtt tatggcggtt ttatttgcat tagcttctgt taatgcaatg  60

gcggcggatt gtgctaaagg taaaattgag ttttccaagt ataatgagga tgacacattt  120

acagtgaagg ttgacgggaa agaatactgg accagtcgct ggaatctgca accgttactg  180

caaagtgctc agttgacagg aatgactgtc acaatcaaat ccagtacctg tgaatcaggc  240

tccggatttg ctgaagtgca gtttaataat gacggcggtg gtggcagcca tatgacttca  300

gcacttaatg ccagtgcggt tatatttttt gatcaaacca aggccagcat tactgagatt  360

aaggctgata agacaactgc agtagcaaat ggtaaggatg ctattaaata tactgtaaaa  420

gttatgaaaa acggtcagcc agttaataat caatccgtta cattctcaac aaactttggg  480

atgttcaacg gtaagtctca aacgcaagca accacgggaa atgatggtcg tgcgacgata  540

acactaactt ccagttccgc cggtaaagcg actgttagtg cgacagtcag tgatggggct  600

gaggttaaag cgactgaggt cacttttttt gatgaactga aaattgacaa caaggttgat  660

attattggta acaacgtcag aggcgagttg cctaatattt ggctgcaata tggtcagttt  720

aaactgaaag caagcggtgg tgatggtaca tattcatggt attcagaaaa taccagtatc  780

gcgactgtcg atgcatcagg gaaagtcact ttgaatggta aaggcagtgt cgtaattaaa  840

gccacatctg gtgataagca aacagtaagt tacactataa aagcaccgtc gtatatgata  900

aaagtggata agcaagccta ttatgctgat gctatgtcca tttgcaaaaa tttattacca  960

tccacacaga cggtattgtc agatatttat gactcatggg gggctgcaaa taaatatagc  1020

cattatagtt ctatgaactc aataactgct tggattaaac agacatctag tgagcagcgt  1080

tctggagtat caagcactta taacctaata acacaatacc ctcttcctgg ggttaatgtt  1140

aatactccaa atgtctatgc ggtttgtgta gaaaagcttc accaccacca ccaccactga  1200

<210>2

<211>399

<212>PRT

<213>Stx2B-Intimin-C融合蛋白的氨基酸序列

<400>2

Met Gly Met Lys Lys Met Phe Met Ala Val Leu Phe Ala Leu Ala Ser

1               5                   10                  15

Val Asn Ala Met Ala Ala Asp Gys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser

人和易感动物O157菌感染免疫预防和治疗用途的基因工程多价亚单位疫苗.txt

            20                  25                  30

Lys Tyr Asn Glu Asp Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Asp Gly Lys Glu

        35                  40                  45

Tyr Trp Thr Ser Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln

    50                  55                  60

Leu Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Ser Ser Thr Cys Glu Ser Gly

65                  70                  75                  80

Ser Gly Phe Ala Glu Val Gln Phe Asn Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser

                85                  90                  95

His Met Thr Ser Ala Leu Asn Ala Ser Ala Val Ile Phe Phe Asp Gln

            100                 105                 110

Thr Lys Ala Ser Ile Thr Glu Ile Lys Ala Asp Lys Thr Thr Ala Val

        115                 120                 125

Ala Asn Gly Lys Asp Ala Ile Lys Tyr Thr Val Lys Val Met Lys Asn

    130                 135                 140

Gly Gln Pro Val Asn Asn Gln Ser Val Thr Phe Ser Thr Asn Phe Gly

145                 150                 155                 160

Met Phe Asn Gly Lys Ser Gln Thr Gln Ala Thr Thr Gly Asn Asp Gly

                165                 170                 175

Arg Ala Thr Ile Thr Leu Thr Ser Ser Ser Ala Gly Lys Ala Thr Val

            180                 185                 190

Ser Ala Thr Val Ser Asp Gly Ala Glu Val Lys Ala Thr Glu Val Thr

        195                 200                 205

Phe Phe Asp Glu Leu Lys Ile Asp Asn Lys Val Asp Ile Ile Gly Asn

    210                 215                 220

Asn Val Ary Gly Glu Leu Pro Asn Ile Trp Leu Gln Tyr Gly Gln Phe

225                 230                 235                 240

Lys Leu Lys Ala Ser Gly Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Trp Tyr Ser Glu

                245                 250                 255

Asn Thr Ser Ile Ala Thr Val Asp Ala Ser Gly Lys Val Thr Leu Asn

            260                 265                 270

Gly Lys Gly Ser Val Val Ile Lys Ala Thr Ser Gly Asp Lys Gln Thr

        275                 280                 285

Val Ser Tyr Thr Ile Lys Ala Pro Ser Tyr Met Ile Lys Val Asp Lys

    290                 295                 300

Gln Ala Tyr Tyr Ala Asp Ala Met Ser Ile Cys Lys Asn Leu Leu Pro

305                 310                 315                 320

Ser Thr Gln Thr Val Leu Ser Asp Ile Tyr Asp Ser Trp Gly Ala Ala

                325                 330                 335

Asn Lys Tyr Ser His Tyr Ser Ser Met Asn Ser Ile Thr Ala Trp Ile

            340                 345                 350

Lys Gln Thr Ser Ser Glu Gln Arg Ser Gly Val Ser Ser Thr Tyr Asn

        355                 360                 365

Leu Ile Thr Gln Tyr Pro Leu Pro Gly Val Asn Val Asn Thr Pro Asn

    370                 375                 380

Val Tyr Ala Val Cys Val Glu Leu Glu His His His His His His

385                 390                 395

<210>3

人和易感动物O157菌感染免疫预防和治疗用途的基因工程多价亚单位疫苗.txt

<211>909

<212>DNA

<213>肠出血性大肠杆菌O157:H7(Enterohemorrhagic E.coliO157:H7，EHEC O157:H7)

<400>3

atgacttcag cacttaatgc cagtgcggtt atattttttg dtcdddgcaa ggccagcatt  60

actgagatta aggctgataa gacaactgca gtagcaaatg gtaaggatgc tattaaatat  120

actgtaaaag ttatgaaaaa cggtcagcca gttaataatc aatccgttac attctcaaca  180

aactttggga tgttcaacgg taagtctcaa acgcaagcaa ccacgggaaa tgatggtcgt  240

gcgacgataa cactaacttc cagttccgcc ggtaaagcga ctgttagtgc gacagtcagt  300

gatggggctg aggttaaagc gactgaggtc actttttttg atgaactgaa aattgacaac  36O

aaggttgata ttattggtaa caacgtcaga ggcgagttgc ctaatatttg gctgcaatat  420

ggtcagttta aactgaaagc aagcggtggt gatggtacat attcatggta ttcagaaaat  480

accagtatcg cgactgtcga tgcatcaggg aaagtcactt tgaatggtaa aggcagtgtc  540

gtaattaaag ccacatctgg tgataagcaa acagtaagtt acactataaa agcaccgtcg  600

tatatgataa aagtggataa gcaagcctat tatgctgatg ctatgtccat ttgcaaaaat  660

ttattaccat ccacacagac ggtattgtca gatatttatg actcatgggg ggctgcaaat  720

aaatatagcc attatagttc tatgaactca ataactgctt ggattaaaca gacatctagt  780

gagcagcgtt ctggagtatc aagcacttat aacctaataa cacaataccc tcttcctggg  840

gttaatgtta atactccaaa tgtctatgcg gtttgtgtag aaaagcttca ccacgacgac  900

caccactga                                                          909

Claims (4)

1.人和易感动物O157菌感染免疫预防和治疗用途的基因工程双价亚单位疫苗，其特征在于：其疫苗抗原组分是肠出血性大肠杆菌EHEC O157紧密粘附素免疫保护性片段Intimin-C、志贺毒素II结合亚单位Stx2B，其中所说的紧密粘附素免疫保护性片段Intimin-C具有序列表中SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的O157菌基因工程双价亚单位疫苗，其特征在于：该疫苗抗原是肠出血性大肠杆菌EHEC O157紧密粘附素免疫保护性片段Intimin-C、志贺毒素II结合亚单位Stx2B通过基因克隆表达。

3.根据权利要求1所述的O157菌基因工程双价亚单位疫苗，其特征在于：该疫苗抗原是肠出血性大肠杆菌EHEC O157紧密粘附素免疫保护性片段Intimin-C、志贺毒素II结合亚单位Stx2B在基因水平上连接融合而得到的基因工程重组融合蛋白。

4.制备根据权利要求1-3的任何一项所述的疫苗的方法，包括如下步骤：

1)培养肠出血性大肠杆菌O157:H7；

2)克隆肠出血性大肠杆菌O157:H7的Intimin-C与Stx2B的编码基因；

(1)用PCR方法扩增EHEC O157的Intimin-C与Stx2B的编码基因；

(2)PCR产物的克隆；

(3)PCR产物的序列分析；

3)构建Intimin-C与Stx2B基因的原核细胞表达质粒及融合基因表达质粒；

(1)用限制性内切酶酶切Intimin-C与Stx2B的克隆质粒；

(2)酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离；

(3)切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带；

(4)将目的基因回收产物分别克隆或以不同组合及顺序克隆入原核细胞表达质粒并转化大肠杆菌；

4)测定融合基因的序列；

5)诱导基因重组工程菌，表达获得目的蛋白；

6)目的蛋白的N端氨基酸序列分析；

7)纯化分离目的蛋白，采用离子交换柱、亲和及疏水层析柱或凝胶过滤层析柱对目的蛋白进行纯化；

8)鉴定目的蛋白的纯度。

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