CN1887349A - 基于尿素酶b亚单位活性片段的幽门螺杆菌疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于预防和治疗人幽门螺杆菌感染的基因工程多价亚单位疫苗及其制备方法。该疫苗以幽门螺杆菌UreB活性片段UreB414为中心抗原组分，结合其他相关保护性抗原，并辅以分子内或分子外佐剂组成多价组合疫苗。与单价疫苗相比，该多价组合疫苗能够激发机体产生更强和更全面的幽门螺杆菌特异性免疫反应。

Description

基于尿素酶B亚单位活性片段的幽门螺杆菌疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及用于人幽门螺杆菌感染免疫预防和治疗的基因工程多价亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种全世界范围的人类感染病原菌，感染者达到世界人口的一半以上。Hp与慢性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)和胃癌等多种疾病相关，对人类健康构成严重危害。世界卫生组织已将其列为一类致癌因子。1998年，日本学者Watanadbe等首先报道Hp感染的蒙古沙鼠可致胃癌发生，为Hp感染能诱发胃癌提供了直接证据。药物治疗Hp根除率低，费用昂贵，而且不能有效阻止Hp的再感染，耐药菌株的增加也使药物治疗Hp面临越来越复杂的难题。疫苗是控制感染性疾病最为经济有效的办法，通过疫苗刺激机体产生不同于自然感染导致的特异性免疫应答，可以达到预防或者治疗Hp感染的目的。

尿素酶占Hp总蛋白的5％-10％，含量最为丰富，能够水解代谢尿素，释放氨中和胃酸，使细菌增强抵抗胃部强酸，穿过胃粘液层到达粘膜表面；能够激活单核吞噬细胞和刺激炎性细胞因子的产生，在体外试验中对人胃上皮细胞仍具有毒性作用。尿素酶对Hp在胃内的寄生和致病都起重要作用，是定植因子又是毒力因子，是Hp疫苗研究中一种重要的蛋白质。尿素酶分子量为550KD左右，其单体由A、B两个亚单位组成，呈六聚体。A、B两个亚单位的分子量分别为30KD和66KD左右，在尿素酶中比例为1∶1。

尿素酶在Hp细胞内和细胞膜上都有分布，在Hp感染患者中，尤其是有症状的患者中都能够检测到尿素酶B的抗体，抗体水平与病情的严重程度有一定的相关性。有研究者证明，用大肠肝菌表达的重组尿素酶亚单位辅以粘膜免疫佐剂大肠杆菌不耐热肠毒素或霍乱毒素喂服小鼠，对猫螺杆菌的攻击有60％～80％的保护作用，其中UreB的作用比UreA更为明显(Ikewaki J，Nishizono A，Goto T，et al.Therapeutic oral vaccination induces mucosalimmune response sufficient to eliminate long-term Helicobacter pylori infection.Microbiol-Immunol.2000；44(1)：29-39)。尿素酶活性在Hp感染中具有重要作用，缺失尿素酶活性的Hp在动物模型中不能导致感染，中和尿素酶活性的抗体可能在抵抗Hp定植中起关键作用。从以上的实验结果可以认为尿素酶抗体，尤其是能够中和尿素酶活性的抗体，才在抵抗Hp感染中发挥着主要作用，而尿素酶其他抗原表位在抵抗入侵中并不重要。在这种情况下，能够激发机体产生抗尿素酶活性抗体的小片段蛋白，就有可能替代全长的尿素酶在疫苗中发挥作用。

本发明人在前期的实验研究中发现，使用包括全长度尿素酶B亚单位的融合蛋白(分子量130KD以上)作为免疫原制备疫苗将主要存在以下问题：(1)融合蛋白的表达率低；(2)融合蛋白的纯化困难；(3)融合蛋白复性困难，活性低。所以，在进一步的研究中我们试图以尿素酶B亚单位活性功能片段代替完整的尿素酶B亚单位，以避免了分子量过大造成的上述困难。

发明内容

本发明提供一种以尿素酶B亚单位的活性片段为主要免疫原的幽门螺杆菌重组多价亚单位疫苗。多为一种多价疫苗，

尿素酶是一种催化尿素水解成氨和碳酸的镍依赖性酶，为幽门螺杆菌中表达最丰富的蛋白质。尿素酶通过中和胃酸帮助细菌在胃内的定居并为细菌蛋白质合成提供氨。宿主组织可直接受到尿素酶介导的氨产生的损伤，或间接受到尿素酶诱导的炎性反应的刺激作用的损伤。阻断尿素酶基因的表达将抑制幽门螺杆菌在宿主内的定居、减少细菌蛋白质合成，并降低与幽门螺杆菌相关的炎性反应。

有人发现，口服接种幽门螺杆菌尿素酶或重组尿素酶B亚单位(rUreB)可保护小鼠免受幽门螺杆菌的感染(预防性疫苗)并可消除已存在的感染(治疗性疫苗)(Michetti et al.，1994；Corthesy-Theulaz et al.，Gastroenterol.，)。Kaoru等人(Kaoru h et al.，infection and immunity，2001.)的研究发现，抗尿素酶B亚单位单克隆抗体可有效地阻断尿素酶活性，并因此确定尿素酶分子中第321～339位氨基酸序列与酶活性相关。

首先，通过生物信息学方法对尿素酶B亚单位蛋白亲水性、抗原性和结构功能域等进行分析，结合尿素酶B亚单位蛋白的三级结构X射线衍射图，依据尿素酶B亚单位蛋白功能、结构稳定性，选择了从UreB蛋白中5’端251位氨基酸到389位氨基酸的138个氨基酸为目的片段，即UreB414。该片段含有已确定的尿素酶活性相关位点，即12肽CHHLDKSIKEDV。实验验证，UreB414是UreB的活性功能片段，具有UreB相似的生物学活性和免疫原性及反应原性，完全可以替代UreB全长蛋白并发挥其生物学功能。UreB414的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：2则显示的UreB414的相应氨基酸序列。

除了以UreB414作为核心抗原组分，本发明的多价疫苗免疫原成分中还可包括选自与幽门螺杆菌的粘附和定植功能，以及致病性密切相关的保护性抗原分子，例如热休克蛋白A亚单位HspA、粘附素HpaA、空泡毒素Vac、细胞毒素相关抗原CagA、中性粒细胞激活蛋白NAP、以及过氧化氢酶Catalase。分别进行单基因克隆及基因融合，获得单个重组蛋白和融合重组蛋白，然后再与佐剂成分如大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)、或霍乱毒素B亚单位(CTB)，以不同组合方式(蛋白物理性混合或基因水平上融合等)，制备出不同类型(分子外佐剂或分子内佐剂)的Hp基因工程重组多价组合疫苗。简单地说，可以按照下述方法制备含有分子外佐剂或分子内佐剂的重组多价疫苗。

分子外佐剂的Hp基因工程重组多价组合疫苗及其制备：

方法一：针对Hp保护性抗原成分尿素酶B亚单位活性功能片段UreB414、热休克蛋白A亚单位HspA、粘附素HpaA、空泡毒素Vac、细胞毒素相关抗原CagA、中性粒细胞激活蛋白NAP及过氧化氢酶Catalase，分别进行单基因克隆，获得单个重组蛋白，再以不同的组合方式，分别与佐剂成分，如LTB或CTB，以适当比例进行物理性混合，制备出Hp多价组合疫苗，分别用于粘膜途径和非粘膜途径的免疫接种。动物试验结果显示：不同类型疫苗以不同接种方式免疫后均激发较强的系统免疫和粘膜免疫，获得较好的免疫保护效果。

方法二：将尿素酶B亚单位活性功能片段UreB414、热休克蛋白A亚单位HspA、粘附素HpaA、空泡毒素Vac、细胞毒素相关抗原CagA、中性粒细胞激活蛋白NAP、及过氧化氢酶Catalase，以不同组合方式进行基因水平连接，构建表达出含有不同抗原组合的多种重组融合蛋白，并在此基础上与LTB或CrB等佐剂成分，按照适当比例物理混合，制备出不同分子外佐剂的基因工程重组多价融合蛋白疫苗。该疫苗适用于粘膜途径和非粘膜途径的免疫接种，可激发产生较强的粘膜免疫和系统免疫应答，达到免疫预防和治疗Hp感染的目的。

分子内佐剂的Hp基因工程重组多价融合疫苗及其制备：

本发明将尿素酶B亚单位活性功能片段UreB414、热休克蛋白A亚单位HspA、粘附素HpaA、空泡毒素Vac、细胞毒素相关抗原CagA、中性粒细胞激活蛋白NAP、及过氧化氢酶Catalase，以及佐剂成分LTB或CTB，以不同组合方式进行基因水平连接，构建表达出含有不同抗原组合的重组融合蛋白，制备出包括多种分子内佐剂的多价融合蛋白疫苗。这类分子内佐剂多价融合蛋白疫苗可通过粘膜途径(胃肠粘膜、鼻粘膜等)进行免疫接种，激发机体产生高滴度sIgA和较强的粘膜免疫应答以及一定的系统免疫应答。动物试验结果表明：该类疫苗具有良好的抗Hp感染的免疫预防效果和清除Hp感染的免疫治疗作用。

本发明采用与细菌粘附、定植和致病性密切相关的保护性抗原分子：HspA，HpaA和UreB414以及分子佐剂LTB，分别进行单独表达或两个或三个或四个亚单位的融合表达，均获得了较高的表达量。分别建立不同亚单位蛋白HspA、HpaA、UreB414及LTB414，融合蛋白UreB414-LTB、HspA-UreB414、HpaA-UreB414、HspA-UreB414-LTB、HpaA-UreB414-LTB、HspA-HpaA-UreB414及HspA-HpaA-UreB414-LTB的纯化工艺，研究了其抗原活性与免疫保护性，并经动物实验证实其免疫预防和感染治疗效果。

本发明的基因工程重组菌及重组蛋白的基本特性：a.在摇瓶条件下，目的蛋白表达量达26％，高密度发酵条件下，目的蛋白表达量约25％。b.重组蛋白以包涵体形式或可溶性表达。c.纯化的重组蛋白能够诱导动物产生不同滴度的抗体，并有良好的免疫保护作用。

概括地说，生产或制备本发明多价疫苗的方法包括以下步骤：

1.分别克隆幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA、粘附素HpaA、空泡毒素Vac、细胞毒素相关抗原CagA、中性粒细胞激活蛋白NAP、外膜蛋白OMP18和过氧化氢酶HspA以及LTB和CTB的编码核苷酸序列，并克隆幽门螺杆菌UreB414氨基酸序列或与其95％以上同源且具有其蛋白活性的氨基酸序列的编码核苷酸序列；

2.采用PCR的方法，将上述步骤1中克隆得到的核苷酸序列以不同组合连接在一起，构成融合基因核苷酸序列；

3.构建含有上述步骤1和2中克隆得到的单条核苷酸序列或其两条以上的融合基因核苷酸序列的重组质粒，所得到的重组质粒中至少包含了上述幽门螺杆菌的UreB414氨基酸序列或与其95％以上同源且具有其蛋白活性的氨基酸序列的编码核苷酸序列；

4.用上述步骤3中得到的重组质粒转化宿主细胞；

5.从上述步骤4所述的宿主表达重组蛋白，经分离纯化后，用其部分或全部种类的蛋白制成疫苗。

根据本发明的优选实施方案，其中步骤2中构建的融合基因包括UreB414-LTB、HspA-UreB414、HpaA-UreB414、HspA-UreB414-LTB、HpaA-UreB414-LTB、HspA-HpaA-UreB414及HspA-HpaA-UreB414-LTB融合基因。

根据本发明的优选实施方案，其中步骤4中所说的宿主细胞是感受态大肠杆菌细胞。

本发明分析了以下三方面的材料：一是参考Kaoru在尿素酶单抗研究中发现一株能够阻断尿素酶活性的单克隆抗体，并进一步确定该单抗是针对尿素酶B中321aa-339aa的活性中心(Kaoru h，kumiko n，identification of an antigenic epitope in helicobacter pyloriurease that induces neutralizing antibody production infection and immunity.2001(11)：6597-03)。二是本发明利用蛋白质internent在线工具http：//cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein对UreB蛋白功能区及全序列蛋白的亲水性、表面概率、抗原性等二级结构进行分析。蛋白功能结构分析结果表明，尿素酶B亚单位蛋白中从319位氨基酸到335位氨基酸为尿素酶活性位点，如附图1所示，与Kaoru的研究基本一致。且亲水性、抗原性分析认为该片段区域抗原性强，且大多位于整个蛋白表面。三是本发明分析了尿素酶B蛋白晶体衍射图和二级结构，发现尿素酶B蛋白从250位氨基酸到390位氨基酸之间共有5个α螺旋，第251位氨基酸和第389位氨基酸分别为2个α螺旋的起点和终点，且对蛋白的稳定性有很大的作用，如附图2，3。

基于上述的分析，本发明确定了从251位氨基酸到389位氨基酸的138个氨基酸为目的片段(命名为UreB414)，替代尿素酶B亚单位全长片段。这138个氨基酸不仅包含了前面已经确定的活性相关抗原位点，还包含5个α螺旋，以及对蛋白稳定作用的251位氨基酸和389位氨基酸。这样的尿素酶片段不仅能够保护活性片段的稳定性和空间构象，而且具有较小的分子量(分子量在15KD左右)，有利于前期的表达及后期的纯化和性质研究，为下一步构建多亚单位融合蛋白打下基础，这是本专利的创新点之二。

本发明通过实验验证了UreB414的稳定性及能否代替尿素酶B全长蛋白。采用PCR方法扩增目的UreB414片段基因，并构建到原核表达载体pET-28a(+)上，转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导稳定表达可溶性UreB414蛋白，分子量约为15.8KD。首先，ELISA及免疫印迹分析，证实重组UreB414具有良好的免疫原性和反应原性；其次，纯化后的UreB414免疫家兔，产生的抗体在体外能够中和尿素酶活性，表现出与天然HP的UreB相似的生物学活性；再者，重组UreB414辅以粘膜佐剂LTB口服免疫BalB/c小鼠，能有效激发机体产生Th1、Th2平衡的免疫应答反应，与重组UreB(吴超，邹全明等.幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB基因融合及表达的研究.中华微生物学和免疫学杂志，2002，22(2)：175-179)一致；最后，小鼠攻毒保护试验表明，UreB414的保护率为66.5％，与全长UreB的保护率68％基本一致。首次证实了UreB414为UreB的活性功能片段，具有全长UreB相似的生物学活性和免疫原性及反应原性，能够替代UreB全长蛋白。这是本专利的创新点之三。

传统的疫苗多采用病原菌的裂解产物，或者选择灭活全菌作为免疫原，接种机体产生免疫保护性，但是由于病原菌抗原成份复杂，含有多种致病致癌因子，全菌抗原中存在与人体组织交叉成分，易引起机体产生变态反应；而且对Hp而言，Hp菌体培养条件苛刻，难以进行大规模生产性培养，使Hp全菌疫苗应用受到限制。由于在细菌感染过程中，宿主和致病菌之间有着复杂的作用机制，单一抗原组分构建的疫苗难以产生完全有效的保护作用。所以，多抗原成分的疫苗可以激发机体更强的免疫应答，将会是更完美的疫苗形式。本发明在Hp单个保护性抗原疫苗研究基础上，构建Hp多个抗原组分的亚单位疫苗，能够激发机体产生比单一亚单位成分更强的免疫反应，同时抗原成分相对于全菌疫苗更为简单，能够减少机体变态反应的发生。本发明以UreB414为中心抗原组分，选用多个致病因子相关保护性抗原及并辅以分子内或分子外佐剂组成多价组合疫苗，实验证明产生了良好的免疫保护作用，可作为人HP感染预防和治疗用的UreB活性片段多价亚单位疫苗，这是本发明的创新点之四。

生物学活性实验分析显示，本发明的重组融合蛋白疫苗具有良好的和全面的免疫原活性。将本发明的多价重组疫苗接种于受体动物后，可有效的产生针对幽门螺杆菌的保护性免疫反应(参见实施例10和11)。

附图说明

图1为尿素酶B亚单位蛋白质3级结构品体衍射图

图2为尿素酶功能区分析图

图3为尿素酶B亚单位2级结构分析图

title：标题；scale：刻度；sequence：序列；surface probalility：分布在表面的机率；surface reqions：表面区域；antigenic index：抗原指数。

图4显示本发明目的基因HspA，HpaA和UreB414的PCR克隆扩增，其中泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2，3，4为UreB414，HpaA，HspA的PCR扩增产物。

图5是重叠延伸方法得到的HspA-HpaA融合基因，其中泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2，3为HspA-HpaA融合基因的PCR扩增产物。

图6是分别扩增的HspA-HpaA-UreB414融合基因和LTB基因，其中泳道1为LTB基因的PCR扩增产物；泳道2核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道3为目的融合基因HspA-HpaA-UreB414的PCR扩增产物(1517bp)。

图7显示重叠延伸方法得到的HspA-HpaA-UreB414融合基因，其中泳道1为目的融合基因HspA-HpaA-UreB414的PCR扩增产物(1517bp)；泳道2为核酸(DNA)分子量标准(Marker)。

图8显示重叠延伸方法分别得到HspA-HpaA和HspA-HpaA-UreB414融合基因，其中泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2，3为目的融合基因HspA-HpaA-UreB414的PCR扩增产物(1300bp)；泳道4，5为目的融合基因HspA-HpaA的PCR扩增产物(700bp)。

图9显示HspA-HpaA-UreB414重组表达质粒的酶切鉴定结果。其中泳道1为目的融合基因HspA-HpaA-UreB414的PCR扩增产物(1300bp)；泳道2为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道3为重组质粒。

图10是融合基因HspA-HpaA-UreB414重组菌表达PAGE电泳图，其中泳道1：基因重组菌诱导5hr；泳道2：空质粒菌诱导1hr；泳道3：蛋白质分子量标准(Marker)。

从中可见，基因重组菌经过诱导后在分子量43KDa处有增加的蛋白表达条带，与目的蛋白分子量一致。经过UVP图像扫描分析，诱导5小时目的蛋白表达量约26％。

图11为目的蛋白HspA-HpaA-UreB414纯化效果PAGE电泳图，其中，泳道1：蛋白质分子量标准(Marker)；泳道2：包涵体溶解液(纯化前样品)空；泳道3，4，5，6，7，8，9：目的蛋白洗脱峰样品。

结果显示经过纯化步骤，目的蛋白的纯度得到明显改善，收获的目的蛋白峰经UVP扫描分析纯度达到85-99％。

图12显示以1％琼脂糖凝胶电泳方法检测重叠延伸PCR扩增产物HHUL基因，其中泳道1：为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2：为目的融合基因HHUL的PCR扩增产物。

图13显示重组克隆质粒T-hhul酶切鉴定结果，其中泳道1：为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2：重组质粒pUCm-T-hhul Nco I和Xho1双酶切鉴定；泳道3：融合基因HHUL的PCR扩增产物；泳道4：质粒pUCm-T BamHI酶切鉴定。

图14显示重组表达质粒phhul酶切鉴定结果，其中泳道1：质粒pET-28a(+)Nco I和Xho I双酶切鉴定；泳道2：重组质粒pET28a-hhul d Nco I和Xho1双酶切鉴定；泳道3：为核酸(DNA)分子量标准(Marker)。

图15显示SDS-PAGE方法检测rHHUL蛋白表达的结果，其中泳道1：质粒pET-28a(+)/BL21诱导表达前；泳道2：质粒pET-28a(+)/BL21 IPTG诱导表达；泳道3，5：重组质粒phhul/BL21诱导表达前；泳道4，6：重组质粒phhul/BL21 IPTG诱导表达5h；泳道7：蛋白质分子量标准(Marker)。

图16显示融合蛋白rHHUL表达形式鉴定结果，其中泳道1：蛋白质分子量标准(Marker)；泳道2，3：诱导表达后重组工程菌phhul/BL21超声沉淀；泳道4：诱导表达后重组工程菌phhul/BL21；泳道5：诱导表达后重组工程菌phhul/BL21超声上清。

图17显示rHHUL镍离子亲和层析纯化后SDS-PAGE分析，其中泳道1为包涵体；泳道2～9为收集的峰值馏分；泳道10为蛋白质分子量标准(Marker)。

具体实施方式

实施例1  幽门螺杆菌尿素酶B活性片段的筛选

利用http：//cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein蛋白质在线工具对UreB蛋白功能区及全序列蛋白的亲水性、表面概率、抗原性等二级结构进行分析。结合UreB蛋白X射线晶体衍射三级构象，选择结构相对稳定且包含功能活性域的活性片段，即UreB蛋白中5’端第251位氨基酸到第389位氨基酸的138个氨基酸序列(命名为UreB414)，来替代全长度UreB蛋白。SEQ ID NO：1所示的为UreB414核苷酸序列，所述的蛋白结构为SEQ ID NO：2所示的UreB414氨基酸序列。

实施例2  重组抗原蛋白、重组佐剂蛋白及重组融合蛋白的制备

1按照常规方法克隆幽门螺杆菌的HspA，HpaA，UreB414和LTB的编码基因。

2按下述步骤分别构建UreB414-LTB、HspA-UreB414、HpaA-UreB414、HspA-UreB414-LTB、HpaA-UreB414-LTB、及HspA-HpaA-UreB414融合基因。

a)重叠延伸法得到UreB414-LTB、HspA-UreB414、HpaA-UreB414、HspA-UreB414-LTB、HpaA-UreB414-LTB、及HspA-HpaA-UreB414的融合基因，各基因间引入接头(linker)序列。

b)经琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。

c)分别将UreB414-LTB、HspA-UreB414、HpaA-UreB414、HspA-UreB414-LTB、HpaA-UreB414-LTB、及HspA-HpaA-UreB414的融合基因的回收产物克隆入原核细胞表达载体，获得含有上述融合基因的重组质粒。

d)分别用含有上述融合基因的重组质粒转化大肠杆菌。

3分别测定上述克隆和融合基因的序列。

4诱导表达上述融合基因，获得目的蛋白HspA、HpaA、UreB414、LTB、UreB414-LTB、HspA-UreB414、HpaA-UreB414、HspA-UreB414-LTB、HpaA-UreB414-LTB、及HspA-HpaA-UreB414。

5纯化分离目的蛋白HspA、HpaA、UreB414、LTB、UreB414-LTB、HspA-UreB414、HpaA-UreB414、HspA-UreB414-LTB、HpaA-UreB414-LTB及HspA-HpaA-UreB414。

6鉴定目的蛋白HspA、HpaA、UreB414、LTB、HspA-LTB、HpaA-LTB、UreB414-LTB、HspA-UreB414、HpaA-UreB414、HspA-UreB414-LTB及HspA-HpaA-UreB414的纯度。

上述基因工程重组菌及重组蛋白的基本特性：a.在摇瓶条件下，目的蛋白表达量达26％，高密度发酵条件下，目的蛋白表达量约25％。b.重组蛋白以包涵体形式或可溶性表达。c.纯化的重组蛋白能够诱导动物产生不同滴度的抗体，并有良好的免疫保护作用。

实施例3  多价组合疫苗的制备方法

方法一：将重组UreB414蛋白、至少一种重组抗原蛋白(重组HspA、重组HpaA、重组Vac、重组CagA、重组NAP及重组Catalase)、和重组佐剂蛋白LTB或CTB，按适当比例进行物理性混合，制备出Hp多价组合疫苗。

方法二：将UreB414的核酸序列，与至少一种重组抗原(HspA、HpaA、Vac、CagA、NAP及Catalase)的核酸序列，以不同组合方式进行基因水平连接，构建表达出含有不同抗原组合的多种重组融合蛋白，并在此基础上与LTB或CTB等佐剂成分，按照适当比例物理混合，制备出不同分子外佐剂的基因工程重组多价融合蛋白疫苗。

方法三：将重组UreB414蛋白、至少一种重组抗原蛋白(重组HspA、重组HpaA、重组Vac、重组CagA、重组NAP及重组Catalase)、与重组佐剂蛋白LTB或CTB，以不同组合方式进行基因水平连接，构建表达出含有不同抗原组合的重组融合蛋白，制备出多种分子内佐剂多价融合蛋白疫苗。

实施例4  幽门螺杆菌的HspA，HpaA，UreB414和LTB编码基因的克隆

1、幽门螺杆菌SSI株(Hp悉尼株，澳大利亚Lee A等命名，本室保存)，野生型产毒大肠杆菌H44815(购自中国药品生物制品检定所，本室保存)。

2、分别以野生型产毒大肠杆菌H44815，及幽门螺杆菌SS1基因组DNA为模板，用P1和P2、P3和P4、P5和P6、P7和P8扩增HspA、HpaA、UreB414和LTB基因，细菌基因组抽提按常规方法(颜子颖，王海林译.精编分子生物学实验指南.科学出版社，1998，P39)进行。PCR扩增体系为：10×不含镁离子扩增缓冲液10μL，MgCl₂(25mmol/L)10μL，dNTPs(2.5mmol/L each)8μL，上下游引物(P1和P2或P5和P6)各2μL，上述LTB基因组2μL，Ex-Taq DNA聚合酶(3单位/μL)1μL，加灭菌水至100μL。

PCR扩增反应：94℃预变性5min，94℃变性50s，60℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环，72℃完全延伸10min。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。

3、采用PCR方法自Hp基因组分别扩增HspA，HpaA和UreB414的编码基因。

1)引物设计合成如下(下划线标示酶切位点，及linker碱基序列)

根据GenBank公布的HspA(ACCESSION AY295084)，HpaA(ACCESSION X92502)和UreB414(ACCESSION AY368265)基因序列及引物设计原则，设计相应的引物，引入酶切位点。在中间引入设计linker的碱基序列。

P1                 HspA                  5- CCATGGAGTTTCAACCATTAGGAG

                                              NcoI

P2                 HspA                  5-T AGGTGGTGGTACAGCAGGGTGTTTTTTGTGATC

                                              linker

P3                 HpaA                  5-C CCTGCTGTACCACCACCTAATTACCATCCA

                                              linker

P4                 HpaA                  5-C AGGTGGAGGTACTGCAGGAACCTTAATAAACCCAG

                                              linker

P5                 UreB414               5-T CCTGCAGTACCTCCACCTGACACTTTGAATGAA

                                              linker

P6                 UreB414               5- CTCGAGAAATTTCTTTTTTG

                                              XhoI

P7                 LTB                   5’- GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCGCACCCCAGTCT

                                              linker

P8                 LTB                   5’- CTCGAGGTTATCCATACTGATTGCCGCA

                                              XhoI

2)目的基因的PCR扩增：

以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，用P1和P2、P3和P4、P5和P6、P7和P8扩增HspA、HpaA、UreB414和LTB基因，采用如下PCR体系和程序：

在-500μl微量离心管中加入下列试剂：模板DNA 2μl；10×PCR缓冲液(含氯化镁)5μl；dNTPs(10mmol/L)4μl；上、下游引物(0.025mmol/L)各1μl；Taq DNA聚合酶(5u/μl)1μl；加去离子水至终体积50μl；混合后加入矿物油3滴。

反应条件：94℃预变性5分钟后，94℃，90s；60℃，60s；72℃，90s，35个循环周期，然后72℃延伸10min。

4、PCR产物的克隆

采用TA克隆方法克隆PCR产物，方法见文献(于永利，麻彤辉，杨贵贞：TA克隆及双链DNA测序，介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法，中国免疫学杂志，1994，10(1)：5)。

5、PCR产物的序列分析

按常规方法(J.Sambrook，分子克隆，冷泉港实验室出版社1989聚丙烯酰胺凝胶电泳1.21-1.32)提取TA克隆转化菌株的质粒DNA，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。

PCR扩增效果如图4所示，其中，泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2为目的基因UreB414的PCR扩增产物(414bp)；泳道3为目的基因HpaA的PCR扩增产物(360bp)；泳道4为目的基因HspA的PCR扩增产物(300bp)。表明目的基因HspA，HpaA和UreB414的PCR克隆扩增效果良好。

实施例5  幽门螺杆菌融合基因ul(UreB414-LTB)、hu(HspA-UreB414)、hau(HpaA-UreB414)、hul(HspA-UreB414-LTB)、haul(HpaA-UreB414-LTB)及hhu(HspA-HpaA-UreB414)的获得

1、分别回收HspA，HpaA，UreB414和LTB的PCR产物。

2、ul(UreB414-LTB)、hu(HspA-UreB414)、hau(HpaA-UreB414)融合基因的获得。

                回收的DNA片段1                     1μL

                回收的DNA片段2                     1μL

                P1(25pmol/μL)                     2μL

                P4(25pmol/μL)                     2μL

                dNTPs(2.5mmol/L each)              8μL

                10×PCR buffer                     10μL

                MgCl2(25mmol/L)                    10μL

               Ex-Taq DNA polymerase             1μL

               ddH2O                             66μL

               Total volume                      100μL

将反应体系振荡混匀，加入40μL石蜡油。94℃预变性5min，94℃变性50s，60℃退火50s10个循环后，再加入引物再94℃变性50s，60℃退火50s，72℃延伸50s 35个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后取3μl反应产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，如图5所示，泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2，3为目的融合基因HspA-HpaA的PCR扩增产物(700bp)；图中显示：融合基因片段大小与预计一致，表明重叠延伸得到融合基因。

3、hul(HspA-UreB414-LTB)、haul(HpaA-UreB414-LTB)、hhau(HspA-HpaA-UreB414)融合基因的获得

以回收的hh、hu、hau片断和前回收的UreB414片段为模板，P1、P3、P5、P8为引物，具体方法同上PCR扩增hul、haul、hhau融合基因。

反应体系如下：

                    回收的双融合DNA片段                  1μL

                    回收的单基因DNA片段                  1μL

                    P1(25pmol/μL)                       2μL

                    P6(25pmol/μL)                       2μL

                    dNTPs(2.5mmol/L each)                8μL

                    10×PCR buffer                       10μL

                    MgCl2(25mmol/L)                      10μL

                    Ex-Taq DNA polymerase                1μL

                    ddH2O                                66μL

                    Total volume                         100μL

PCR扩增效果如图6所示，其中泳道2为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道3为目的融合基因HspA-HpaA-UreB414的PCR扩增产物(1176bp)。(泳道1为LTB的PCR扩增产物(309bp)。

实施例6  融合基因ul(UreB414-LTB)、hu(HspA-UreB414)、hau(HpaA-UreB414)、hul(HspA-UreB414-LTB)、haul(HpaA-UreB414-LTB)及hhu(HspA-HpaA-UreB414)表达质粒及高效表达工程菌的构建及筛选

1.重组质粒的构建

将ul(UreB414-LTB)、hu(HspA-UreB414)、hau(HpaA-UreB414)、hul(HspA-UreB414-LTB)、haul(HpaA-UreB414-LTB)、及hhu(HspA-HpaA-UreB414)融合基因扩增(PCR)产物经1.0％琼脂糖电泳、胶回收纯化后与载体pMD-18T连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，分别用NcoI和XhoI，酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将含ul(UreB414-LTB)、hu(HspA-UreB414)、hau(HpaA-UreB414)、hul(HspA-UreB414-LTB)、haul(HpaA-UreB414-LTB)及hhu(HspA-HpaA-UreB414)目的基因的pMD-18T载体及pET-28a(+)用NcoI和XhoI双酶切，酶切产物经1.0％琼脂糖电泳、目的片段胶回收纯化后，用连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，NcoI和XhoI双酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。酶切鉴定结果如图3所示。

有关操作具体步骤如下：

1)使用0mega公司提供的质粒抽提试剂盒，按照试剂盒使用说明书推荐的方法提取质粒DNA。

2)以常规琼脂糖凝胶电泳法：(1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120-150mA，电泳20-40分钟。50×TAE储存液配方：2.0mol/L Tris base，1.0mol/L NaAc，0.1mol/L Na₂EDTA；用冰醋酸调节pH8.3)分离质粒DNA。

3)质粒DNA的酶切鉴定：反应混合物包括：1μg质粒DNA；1μl 10×缓冲液(见上海生工公司产品说明书)；1μ1限制性内切酶NcoI和XhoI(10u/μl)；用双蒸水补齐至10μl。混合后37℃温育1-2小时。

4)琼脂糖电泳胶的目的DNA回收纯化：

在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带，移入1.5mL EP管。

加入0mega公司胶回收试剂盒的DNA结合缓冲液，65℃水浴使凝胶完全溶化并保持溶液pH在5.0~6.0之间。将溶胶液移入分离管，12000g离心1min，弃去收集管中的液体。

加入配套的洗涤缓冲液，12000g离心1min，弃去收集管中的液体。重复洗涤1次。

12000g离心1min，分离管移置另一干净1.5mL E管，加入一定体积的TE缓冲液，65℃孵育10min，12000g离心1min，取一定量电泳，UVP紫外扫描仪检测回收纯化效果。

5)连接反应(使用上海生工公司连接试剂盒)

通过紫外分光光度计检测目的DNA片段和载体片段的浓度，根据外源片段与载体摩尔数比一般为1∶2～10的原则，设计连接反应体系如下：

目的DNA 1μL；质粒载体1～2μL；连接溶液5μL；ddH₂O 2～3μL；总体积10μL。22℃连接反应12-16h。

6)感受态菌的制备(CaCl₂法)

(1)无菌接种环蘸取-70℃冻存的细菌保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16小时。(2)挑取单个菌落接种于2mL LB培养液中，37℃摇床培养12～16h。(3)将过夜培养的DH5α按1％比例转种至LB培养液中，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.2～0.4时，8000g离心5min收集细菌。(4)加入1mL预冷的0.1M CaCl₂重悬沉淀，冰水浴3h。4℃8000g离心5min，弃上清。加入100μL预冷的0.1M CaCl₂悬浮沉淀，冰水浴1h，备用。

7)用连接产物转化大肠杆菌宿主细胞

(1)取感受态菌液100μL，加入连接反应产物；冰水浴60min，42℃水浴热休克100s，迅速放置冰水浴1～2min。(2)加100μL LB培养液，37℃摇床培养1h。(3)以8000g离心10min，吸弃100μL上清后混匀沉淀，各取50μL涂布平板，37℃孵箱培养过夜。

2.高效表达融合蛋白工程菌的构建及筛选

将含ul(UreB414-LTB)、hu(HspA-UreB414)、hau(HpaA-UreB414)、hul(HspA-UreB414-LTB)、haul(HpaA-UreB414-LTB)、及hhu(HspA-HpaA-UreB414)融合基因的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21并提取质粒酶切鉴定。图9为HspA-HpaA-UreB414重组表达质粒的酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为HspA-HpaA-UreB414重组质粒NcoI/XhoI双酶切产物(5300bp，1300bp)；泳道2为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道3为空载体质粒NcoI单酶切产物(5300bp)。酶切片段大小与设计一致，初步证明重组质粒构建成功。基因工程大肠杆菌BL21的感受态菌制备、转化及重组菌的质粒抽提酶切鉴定同前。

取鉴定无误的重组菌接种于3mL含Kan的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20mL含Kan的LB培养液中，37℃摇床培养2.5小时，以IPTG诱导5小时，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达形式和表达量，筛选高效表达菌株。诱导表达结果如10所示。

实施例7  基因重组菌的发酵

发酵工艺如下：

采用德国B.Bron 10L发酵罐，发酵过程中种子菌10％比例接种，保持70％溶氧、温度37℃、pH7.0，在A600未达到2时不加补料，之后每0.5h流加补料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的终浓度分别为0.5％、0.2％、和0.2％。在第4次补料后待葡萄糖浓度降为0.1％时加入IPTG 500μmol/L诱导4h收菌。

发酵过程在级联溶氧控制的分批培养基础上，流加补料。

发酵过程所用培养基为改良M9-CAA培养基，在M9-CAA的基础上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl₂·4H₂O、2mg/LCoCl₂·4H₂O、4mg/L FeSO₄·16H₂O、5mg/L H₃BO₃、1.6mg/LMnCl₂·4H₂O、4mg/L CuSO₄而成。

发酵结束后回收菌液，4℃离心(8000g)15分钟。吸弃上清，收集细菌，称重后冻存备用。

结果：10L发酵菌液可以收获细菌湿重600克左右。

实施例8  重组蛋白的纯化

1.包涵体提取：将高效表达的菌体200-500g以TE缓冲液1∶10(W/V)比例悬浮，4℃预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀。采用高压均质机在压力为40-70Mpa的条件下进行破菌(共破菌4~6次)，破菌完毕后，取少量菌液涂片染色，显微镜下观察细胞的完整性，确保细胞破碎完全，随后以500g离心25min，弃沉淀，再以15,000g离心40min，弃上清收集沉淀。以1∶10(W/V)的比例分别用洗涤液A和B各洗涤2次。洗涤条件为：4℃搅拌20min，15,000g离心40min，收集包涵体沉淀；最后将包涵体用包涵体溶解液以1∶10(W/V)的比例混合，4℃搅拌3h，15,000g离心45min，取上清作为下一步纯化的原料。

包涵体提取所用缓冲液：1)TE缓冲液：20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 8.0；2)包涵体洗涤液A：5mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、1％Triton X-100，pH 8.0；3)包涵体洗涤液B：20mmol/L Tris、2mol/L Urea，pH 8.0；4)包涵体溶解液：1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、8mol/L尿素(pH 8.0)。

2.金属离子螯合层析：选择亲和层析柱Chelating Sepharose Fast Flow进行纯化，使用20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 8.0对目的蛋白进行纯化，采用咪唑梯度洗脱。

3.阴离子柱纯化：选择阴离子柱HiTrap Q进行纯化，使用20mmol/L Tris，5mmol/LEDTA，pH 8.0对目的蛋白进行纯化，采用NaCl梯度洗脱。

4.亲和层析凝胶过滤层析浓缩：步骤3所获纯化目标蛋白经亲和层析柱后采用Chelating Sepharose Fast Flow高浓度咪唑洗脱浓缩。

5.Superdex 25凝胶过滤脱盐，脱尿素及咪唑。

6.纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE，检定其纯度。Lowry法检测蛋白浓度。

其中，步骤1所述采用生产或中试纯化中使用的高压破菌技术，破菌至细菌破解率大于98％，差速离心获得包涵体沉淀物。

步骤2所述亲和层析纯化填料选自Chelating Sepharose Fast Flow。

步骤3所述阴离子纯化填料选自Q Sepharose HP、Q Sepharose FF和Q Sepharose XL。

纯化结果如图11所示。

实施例9  HspA-HpaA-UreB414-LTB融合蛋白的制备

1.融合蛋白间接头序列(linker)的选择

依据接头序列的大小，柔韧性分析，选择非螺旋结构且柔韧性较好的GGGSGGGS包括8个氨基酸的接头序列。

2.引物设计与合成

根据三亚单位hhu融合基因序列和重叠延伸的实验目的，设计引物P1、P2用于扩增hhu基因；在上游引物P15’端引入Nco I酶切位点，并在酶切位点后添加碱基g以形成起始密码子atg；在下游引物P25’端引入氨基酸linker的核苷酸序列并构成重叠延伸的尾部。设计引物P7、P8用于扩增ltB基因；在上游引物P35’端引入氨基酸linker的互补序列以构成重叠延伸的头部，在下游引物P45’端引入Xho I酶切位点。引物采用Primer Premier5.0软件分析评价，并由上海生工生物技术公司合成。

3.PCR扩增hhu基因和ltB基因

反应体系同第一部分，将反应体系振荡混匀，离心处理后，加入20μl石蜡油。94℃预变性10min，94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后各取3μl反应产物，于1％琼脂糖凝胶电泳检测，并回收PCR产物。

1％琼脂糖凝胶电泳观察PCR结果(图12)。可见两条清晰条带，大片段约为1200bp，小片段约为330bp，与理论预测相一致。

4.重叠延伸PCR获得hhul融合基因

重叠延伸PCR反应体系

               回收的hhu DNA片段                    1μl

               回收的ltB DNA片段                    1μl

               P1(5pmol/μl)                        2μl

               P4(5pmol/μl)                        2μl

               10×PCR buffer                       10μl

               dNTPs(5mmol/L each)                  4μl

               Taq plus DNA polymerase(3U/μl)      1μl

               ddH2O                                79μl

               total volume                         100μl

将反应体系振荡混匀，离心处理后，加入20μl石蜡油。94℃预变性10min，94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后取3μl反应产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并回收目的基因片段hhul。采用PCR重叠延伸技术得到hhul融合基因片段。1％琼脂糖凝胶电泳分析(见图13)，图中所示片段大小与预计相符(1517bp)，初步判定为目的基因片段，并命名为hhul，如SEQ ID NO：3所示。

5.重组质粒pUCm-T-hhul的构建(购自大连TAKARA公司，本室保存)

将回收的PCR扩增产物hhul连接至克隆载体pUCm-T vector，具体方法同第一部分。抽提经过蓝白斑筛选的重组质粒pUCm-T-hhul，Nco I+Xho I双酶切鉴定阳性重组子。pUCm-T-hhul重组质粒经Nco I+Xho I双酶切后，产生1500bp和2770bp的两条片段，与理论预测一致，证明hhul重组成功。见图14

6.表达质粒pET28a-hhul的构建(购自美国Novagen公司，本室保存)

抽提阳性重组子pUCm-T-hhul质粒，Nco I+Xho I双酶切回收目的片段hhul与同样经Nco I+Xho I双酶切的pET-28a(+)载体相连接，转化E.coli DH5α感受态菌，Kan抗性平板筛选后抽提重组表达质粒pET28a-hhul，Nco I+Xho I双酶切鉴定，阳性重组子命名为phhul。

Nco I+Xho I双酶切体系如下：

                Recombinant plasmid DNA phhul            3μl

                Nco I                                    0.5μl

                Xho I                                    0.5μl

                10×Y+/Tango buffer                      2μl

                ddH2O                                    4ul

                Total volume                             10μl

重组表达质粒pET28a-hhul经Nco I+Xho I双酶切后，进行1％琼脂糖凝胶电泳(图15示)，可见两条酶切条带依次为1500bp和5300bp左右，大片段与pET28a(+)空质粒经双酶切片段一致。阳性重组子命名为phhul。

7.基因序列测定

采用T7启动子和终止子通用引物测定重组质粒phhul的碱基序列，委托上海博亚公司完成。序列测定结果显示融合基因hhul的序列正确

8.表达质粒phhul在E.coli BL21(DE3)中的表达。

将表达质粒phhul转化至感受态细菌E.coli BL21(DE3)，Nco I+Xho I双酶切鉴定阳性重组子。重组工程菌的诱导表达方法参见实施例六，诱导条件为37℃，5h。同时用空载体菌pET28a/BL21(DE3)作诱导对照。工程菌phhul/BL21(DE3)在37℃条件下经IPTG诱导5h后，SDS-PAGE电泳图上可见与空质粒菌相比，重组工程菌在55,000Da附近出现一条新增蛋白条带，如图16所示。UVP扫描分析约占菌体总蛋白的20％。

9.免疫印迹鉴定目的蛋白的表达

分别用兔抗Hp血清、兔抗LTB血清为一抗对融合蛋白rHHUL(SEQ ID NO：4)进行免疫印迹检测，融合蛋白rHHUL在55,000Da附近出现一明显褐色沉淀，空质粒菌相应部位没有条带产生。

10.融合蛋白rHHUL的发酵

具体操作同实施例七。

11.融合蛋白rHHUL的纯化

采用镍离子亲和层析填料Chelating Sepharose Fast Flow装填于XK16/10柱中，柱床体积(CV)为10ml，5CV的去离子水流洗至电导平稳，1.5CV 0.1M/L硫酸镍中性溶液上柱，然后用5CV去离子水洗去游离的金属离子，直至电导平稳。去离子水流冲上样A、B管及亲和层析柱，至基线平稳；分别以缓冲液A、缓冲液B流冲上样A、B管道，并以缓冲液A 5CV平衡亲和层析柱至基线平稳；调零并记录。以包含体溶解液上清上样20ml，亲和层析缓冲液A流洗亲和层析柱，收集流穿峰；待流穿峰消失回复至基线，以亲和层析缓冲液B梯度洗脱解离，收集洗脱峰。通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白纯化的效果，调整实验条件，确定镍离子亲和层析柱纯化rHHUL缓冲液的配制、洗脱方式、洗脱梯度等最佳纯化条件。纯化后收集目的蛋白样品，置于葡聚糖PEG8000透析袋内浓缩60min，Lowry法监测样品浓度。Sephadex^G-25凝胶装柱，柱型XK16，CV33ml，脱盐缓冲液为20mmol/L Tris.HCl(pH 8.0)，配制方法参考常用数据手册。在AKTA explorer-100蛋白纯化系统设置自动程序，脱盐样品置superloop中，每循环上样量10ml，样品为浓缩后的目的蛋白。亲和层析结果如图17所示。从图上可见泳道6，7，8，9显示亲和层析达到较好的分离纯化效果。

12.融合蛋白的Western Blotting结果

分别以兔抗LTB、兔抗HspA多抗血清及小鼠抗HpaA、UreB单抗为一抗进行免疫印迹。结果显示在大约55kD位置出现非常明显的显色带。证明rHHUL融合蛋白有良好的免疫反应性，其中各蛋白成分保持了原有的免疫原性，为下一步动物免疫试验的实施奠定了基础。

实施例10  免疫动物的攻毒保护

各组沙鼠于末次免疫后10天同时灌喂制备好的Hp菌液。所有实验动物提前24h断食、断水，每次每只灌喂菌液0.3ml，约108CFU；上、下午各一次，间隔6h，末次灌喂后2h供食水。攻毒后第4周所有实验动物均处死并采集标本，处死前24小时断食水，解剖沙鼠，取出鼠胃，沿胃大弯剖开，用生理盐水轻轻冲掉胃内残留物，将一半胃粘膜组织涂布Hp培养基，三线法划线接种，微需氧培养，本观察免疫后小鼠Hp的定植情况如表1。

                表1  融合蛋白口服免疫小鼠后攻毒免疫保护效果

	组别	攻毒后存活数(只)	感染数(只)	保护率(％)
					12345678910	PBS组UreB组U组UL组HspA+U组HspA+U组HspA+UL组HpaA+UL组HHU组HHUL组	28302927302729302830	27201921242527262728	-66.765.571.372.871.476.275.976.691.6*

结果显示，HHUL免疫组小鼠的保护率达到90％以上。

结论：融合疫苗抗原HHUL免疫小鼠，与未免疫组相比可产生针对Hp全菌攻击有效的保护作用。

实施例11  感染动物的疫苗治疗观察

以融合蛋白与三个亚单位体外混合后肌肉注射免疫已经确定Hp感染的Balb/c小鼠模型，每0，2，4周各免疫一次，免疫剂量为100ug(100uL)/只与等体积铝佐剂混合。末次免疫后4周，处死小鼠，采集不用样本，以不同实验方法观察治疗后小鼠带菌情况。

                  表2  多亚单位蛋白疫苗治疗Hp感染小鼠观察

组别	治疗后小鼠未检测到Hp只数	治疗后小鼠Hp定植数量明显减少只数
			HHUL治疗组(30只)四个亚单位混合组(30只)对照组(30只)	21230	971

两组结果经统计学分析，p＜0.001。说明疫苗抗原HHUL或者四个亚单位抗原体外混合后对已经感染小鼠进行免疫治疗后可有效减少小鼠带菌量或者能够清楚小鼠的感染。多亚单位疫苗抗原包括融合抗原HHUL对Hp感染有一定治疗作用。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

                                   序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>基于尿素酶B亚单位活性片段的幽门螺杆菌疫苗及其制备方法

<160>414

<210>1

<211>414

<212>DNA

<213>E.coli BL21(DE3)UreB414

<220>

<221>gene

<222>(1)…(414)

<400>

GACAC TTTGA ATGAA GCTGG TTGTG TAGAA GACAC TATGG CAGCT ATTGC TGGGC GCACT ATGCACACTT TCCAC ACTGA AGGCG CTGGC GGCGG ACACG CTCCT GATAT TATTA AAGTG GCCGG CGAAC ACAACATTCT ACCCG CTTCC ACTAA CCCCA CTATC CCTTT CACTG TGAAT ACAGA AGCAG AACAC ATGGA CATGCTTATG GTGTG CCACC ACTTG GATAA AAGCA TTAAA GAAGA TGTTC AGTTC GCTGA TTCAA GGATC CGCCCTCAAA CCATT GCGGC TGAAG ACACT TTGCA TGACA TGGGG ATTTT CTCAA TCACC AGTTC TGACT CTCAAGCTAT GGGTC GTGTG GGTGA AGTTA TCACT AGAAC TTGGC AAACA GCTGA CAAAA ACAAG AAAGA ATTT

<160>138

<210>1

<211>138

<212>PRT

<213>E.coli BL21(DE3)UreB414

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(138)

<400>

DTLNE AGCVE DTMAA IAGRT MHTFH TEGAG GGHAP DIIKV AGEHN ILPAS TNPTI PFTVN TEAEHMDMLM VCHHL DKSIK EDVQF ADSRI RPQTI AAEDT LHDMG IFSIT SSDSQ AMGRV GEVIT RTWQT ADKNKKEF

<160>1517

<210>1

<211>1517

<212>DNA

<213>E.coli BL21(DE3)HHUL

<220>

<221>gene

<222>(1)…(1517)

<400>

CCATG  GAGTT TCAAC CGTTA GGAGA GAGGG TCTTA GTAGA AAGAC TTGAA GAAGA GAACA AAACCAGTTC AGGCA TTATC ATCCC TGATA ACGCT AAAGA AAAGC CTTTG ATGGG CGTAG TCAAA GCGGT TAGCCATAAA ATCA GTGAG GTTTG CAAAT GCGTC AAAGA AGGCG ATGTG ATCGC TTTTG GCAAA TATAA AGGTGCAGAA ATCGT TTTAG ATGGC ACCGA ATACA TGGTG CTAGA ACTAG AAGAC ATTCT CGGCA TTGTG GGTTCAGGCT CTTGT TGTCA TACAG GTAAT CATGA TCATA AGCAT GCTAA AGAGC ATGAA GCTTG CTGTC ATGATCACAA AAAAC ACCCT GCTGT ACCAC CACCT AATTA CCATC CAGCT AGCGA GAAAG TTCAA GCGTT GATGAAAAGA TTTTG CTTTT AAGGC CAGCT TTCCA GTATA GCGAT AATAT CGCTA AAGAG TATGA AAACA AATTCAAGAA TCAAA CCGCG CTCAA GGTTG AACAG ATTTT GCAAA ATCAA GGCTA TAAGG TTATT AGCGT AGATAGCAGC GATAA AGACG ATTTT TCTTT TGCAC AAAAA AAAGA AGGGT ATTTG GCGGT TGCTAT GAATG GCGAAATTGT TTCAC GCCCC GATCC TAAAA GGACC ATACA GAAAA AATCA GAACC CGGGT TATTA TTCTC CACCGGTTTG GACAA AATGG AAGGG GTTTT AATCC CGGCT GGGTT TATTA AGGTT CCTGC AGTAC CTCCA CCTGACACTT TGAAT GAAGC TGGTT GTGTA GAAGA CACTA TGGCA GCCAT TGCTG GGCGC ACTAT GCACA CTTTCCACAC TGAAG GCGCT GGCGG CGGAC ACGCT CCTGA TATTA TTAAA GTGGC CGGCG AACAC AACAT TCTACCCGCT TCCAC TAACC CCACT ATCCC TTTCA CTGTG AATAC AGAAG CAGAA CACAT GGACA TGCTT ATGGTGTGCC ACCAC TTGGA TAAAA GCATT AAAGA AGATG TTCAG TTCGC TGATT CAAGG ATCCG CCCTC AAACCATTGC GGCTG AAGAC ACTTT GCATG ACATG GGGAT TTCTC AATCA CCAGT TCTGA CTCTC AAGCT ATGGGTCGTG TGGGT GAAGT TATCA CTAGA ACTTG GCAAA CAGCT GACAA AAACA AAAAA GAATT GGGAG GCGGAAGTGG AGGAG GTAGC GCACC CCAGT CTATT ACAGA ACTAT GTTCG GAATA TCGCA ACACA CAAAT ATATACGATA AATGA CAAGA TACTA TCATA TACGG AATCG ATGGC AGGTA AAACA GAAAT GGTTA TCATT ACATTTAAGA GCGGC GCAAC ATTTC AGGTC GAAGT CCCGG GCAGT CAACA TATAG ACTCC CAAAA AAAAG CCATTGAAAG GATGA AGGAC ACATT AAGAA TCACA TATCT GACCG AGACC AAAAT TGATA AATTA TGTGT ATGGAATAAT AAAAC CCCCA ATTCA ATTGC GGCAA TCAGT ATGGA TAACC TCGAG AG

<160>505

<210>1

<211>505

<212>PRT

<213>E.coli BL21(DE3)HHUL

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(505)

<400>

MKFQP LGERV LVERL EEENK TSSGI IIPDN AKEKP LMGVV KAVSH KISEG CKCVK EGDVI AFGKYKGAEI VLDGV EYMVL ELEDI LGIVG SGSCC HTGNH DHKHA KEHEA CCHDH KKHPA VPPPN YHPAS EKVQALDEKI LLLRP AFQYS DNIAK EYENK FKNQT ALKVE QILQN QGYKV ISVDS SDKDD FSFAQ KKEGY LAVAMNGEIV LRPDP KRTIQ KKSEP GLLFS TGLDK MEGVL IPAGF IKVPA VPPPD TLNEA GCVED TMAAI AGRTMHTFHT EGAGG GHAPD IIKVA GEHNI LPAST NPTIP FTVNT EAEHM DMLMV CHHLD KSIKE DVQFA DSRIRPQTIA AEDTL HDMGI FSITS SDSQA MGRVG EVITR TWQTA DKNKK EFGGG SGGGS APQSI TELCS EYRNTQIYTI NDKILS YTESM AGKRE MVIIT FKSGA TFQVE VPGSQ HIDSQ KKAIE RMKDT LRITY LTETK IDKLCVWNNK TPNSI AAISM ENL

Claims (9)

1.一种人幽门螺杆菌疫苗，特征在于该疫苗的免疫原成分由尿素酶B亚单位活性片段(UreB414)、选自热休克蛋白A亚单位HspA、粘附素HpaA、空泡毒素Vac、细胞毒素相关抗原CagA、中性粒细胞激活蛋白NAP、外膜蛋白OMP18和过氧化氢酶HspA幽门螺杆菌的至少一种其它抗原成分组成。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其中还包括细胞内或细胞外粘膜免疫佐剂。

3.根据权利要求2所述的疫苗，其中所说的佐剂选自大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB和霍乱毒素B亚单位CTB。

4.根据权利要求1的疫苗，其中所说的尿素酶B亚单位活性片段具有序列表中SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的疫苗，特征在于该疫苗是以DNA方法制备的。

6、根据权利要求1所述的疫苗，特征在于所说的佐剂成分与免疫原成分是以重组方式结合的或以物理方法混合的。

7.一种制备人幽门螺杆菌感染预防和治疗用的疫苗的方法，主要包括以下步骤：

(1)分别克隆幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位HspA、粘附素HpaA、空泡毒素Vac、细胞毒素相关抗原CagA、中性粒细胞激活蛋白NAP、外膜蛋白OMP18和过氧化氢酶HspA以及LTB和CTB的编码核苷酸序列，并克隆幽门螺杆菌UreB414氨基酸序列或与其95％以上同源且具有其蛋白活性的氨基酸序列的编码核苷酸序列；

(2)采用PCR的方法，将上述步骤(1)中克隆得到的核苷酸序列以不同组合连接在一起，构成融合基因核苷酸序列；

(3)构建含有上述步骤(1)和(2)中克隆得到的单条核苷酸序列或其两条以上的融合基因核苷酸序列的重组质粒，所得到的重组质粒中至少包含了上述幽门螺杆菌的UreB414氨基酸序列或与其95％以上同源且具有其蛋白活性的氨基酸序列的编码核苷酸序列；

(4)用上述步骤(3)中得到的重组质粒转化宿主细胞；

(5)从上述步骤(4)所述的宿主表达重组蛋白，经分离纯化后，用其部分或全部种类的蛋白制成疫苗。

8.根据权利要求6所述的方法，其中上述步骤(3)中所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。

9.根据权利要求6所述的方法，其中尿素酶B亚单位活性片段具有如序列表中SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

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