CN1171998C - 中国对虾抗菌肽基因与克隆技术 - Google Patents

Abstract

中国对虾抗菌肽基因与克隆技术，属于分子生物学技术领域。基因的序列特征为：长度：600碱基对，类型：核酸，链型：双链，拓扑结构：线性。本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链式反应(Nested-PCR)、3’端cDNA快速扩增(3，RACE)以及Smart cDNA的方法，从中国对虾中克隆到抗菌肽基因，用于抗菌肽基因的重组表达和基因转移，并为对虾病防治和进一步开发为医药产品奠定基础。

Description

中国对虾抗菌肽基因与克隆技术

(一)技术领域

本发明涉及一种中国对虾抗菌肽基因与克隆技术，属于分子生物学技术领域。

(二)背景技术

昆虫/节肢动物的免疫反应是一个非常敏感的系统，因此能有效地抵御外界微生物的侵袭。它们的免疫应答主要依赖三种反应：蛋白水解级联反应，即动物受伤害刺激后引起的迅速的免疫应答，包括血液凝集反应、酚氧化酶级联反应和调理作用；血细胞对入侵微生物的吞噬和包围作用；接受刺激后快速和瞬时地合成大量的抗菌肽或多肽，这些分子主要是由脂肪体或血细胞合成，并迅速释放到血淋巴。自从在昆虫中发现第1种抗菌肽以来，到目前为止，约有400种抗菌肽在多细胞生物中发现，这些生物包括昆虫、其他无脊椎动物、脊椎动物和人类以及植物等，参见霍夫曼等人“天然免疫的系统发育进展”《科学》1999，284：1313-1318(Hoffmann JA，et al.Phylogenetic Perspectives in InnateImmunity.Science，1999，284：1313-1318)。根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，已发现的抗菌肽可以归为三大类：(1)不含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；(2)具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如昆虫防御素，抗真菌肽等；(3)富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等，参见布勒特等人“昆虫中抗菌肽，结构与功能”《发育和比较免疫学》1999，23：329-344(Bulet，P，et al.Antimicrobial peptides in insects；structure and function.Develp& Comp Immunology，1999，23：329-344)。也有人将后一种抗菌肽分为两类，分别称为富含脯氨酸抗菌肽和富含甘氨酸的抗菌肽，参见陈留存，王金星，“昆虫抗菌肽研究现状”《生物工程进展》，1999，19(5)：55-60。抗菌肽的作用方式、广谱抗菌活性和对真核细胞没有毒性等特征显示出它在医药和农业方面的应用前景。

随着人们生活水平的提高，对海产品的需求愈来愈大。中国对虾是我国重要的海产养殖品种。但90年代以来，对虾病大规模暴发，使海产养殖业遭受严重损失。国内许多学者在对虾病防治方面作了大量的工作，并且取得了很多进展。对虾的养殖产量也逐年回升。但到目前为止，对虾病仍是困扰对虾养殖业的一个难题。解决这一问题主要应从控制病原和提高对虾免疫力等方面入手。对虾的防御机制主要依赖血细胞的活动，包括吞噬外来物质或形成包涵体，血细胞合成抗菌物质(抗菌肽或多肽)并释放到血淋巴。另外酚氧化酶系统导致局部黑化和凝集，也起着一定的作用。狄特梅(Deatoumieux)等对凡那对虾(Litopenaeus vannamei)的抗菌肽进行了研究，从中分离得到了对虾抗菌肽(称为对虾肽，Penaeidins)并克隆到其基因，还对其进行了性质、基因表达和定位以及重组表达等方面的研究，参见狄特梅，布勒特等人“对虾肽，从凡纳对虾中分离得到的一种新的抗菌肽”《生物化学杂志》1997，：272：28398-28406(Destoumieux D，Bulet P，et al.Penaeidin，a new family of antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeusvannamei.J Biol Chem，1997，272：28398-28406)。国内在昆虫抗菌肽方面的研究较多，肢口纲中鲎抗真菌肽的表达也有报道，在抗菌肽转基因植物方面也取得了可喜的成果，但甲壳纲动物抗菌肽的研究尚未见报道。

抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗性，并且抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，仅仅作用原核细胞和发生病变的真核细胞。抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，而且也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞，同时，还能加速免疫和伤口愈合过程(赵东红等，1999，昆虫抗菌肽的功能、作用机理与分子生物学研究最新进展，生物工程进展19(5)：14-18)。特别是部分抗菌肽对一些临床耐药致病菌也有良好的抗菌作用，同时抗真菌肽的发现，对棘手的人类真菌病的治疗提供了新的思路。更为引人关注的是昆虫抗菌肽对癌细胞有杀伤作用，而对人体细胞无任何无不良影响，这是目前使用的肿瘤化疗药物所不具备的特性。在目前许多病原菌对现有抗生素逐步产生抗药性，而新的抗生素的发现极其困难的情况下，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。目前已经引起了人们的浓厚兴趣，国外已有一些公司投入大量人力物力进行肽类抗生素的研究。总之，昆虫抗菌肽的研究不仅在理论上具有重要意义，而且在实践上具有巨大的应用潜力，因此，它已成为当今生物医药研究的热点之一。

(三)发明内容

本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链式反应(Nested-PCR)、3’端cDNA快速扩增(3’RACE)以及Smart cDNA的方法，从对中国对虾抗菌肽进行了研究，首次从中国对虾中克隆到了1种抗菌肽基因，称为中国对虾肽基因，用于抗菌肽基因的重组表达和基因转移，并为对虾病防治和进一步开发为医药产品奠定基础。

本发明从中国对虾中克隆到了一种抗菌肽基因，它具有SEQ ID NO 1所示的序列：

                              序  列  表

同系基因一：

(1)SEQ ID NO 1的信息

(a)序列特征：

    *长度：600碱基对

    *类型：核酸

    *链型：双链

    *拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：对虾(Penaeus chinensis)

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

ATGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTGCCAAGGGCAA   60

AAGGGTGGTTACACACGCCCGATATCCAGACCACCCTATGGGGGAGGATATGGCAATGTT  120

TGCACTTCATGCCACGTTCTTACCACCTCACAAGCTCGTTCTTGCTGCAGTCGGTTTGGA  180

CGTTGCTGTGTGCCAAGAAGAGGATACAGTGGTTGATGAAGAAGACAACGAAAACCTGAC  240

TTCACAACGTATTCATTAATTGTGAAGAGACTGCAACCCTGATTTTGAACTGTATTTTCT  300

CGTTCCATTTTTTTTACTTTTGCTTGTGGAAAGGATGCTTTGCAAGGATGCACTAAAGAT  360

TTTTCCATGATTGCCTGATGAATGAAAGTGCATGTGGGATGTAAGTGCATTTGTCCCAGC  420

AGGTCCTCGTGTATTCATGATTTGTAACACACGAGAAAGAATACTTGTTGTTTGACTTTC  480

ATTGTAATTAATTGTACGCATGGGTCTGTGTGTGGTTGGTGATTGCATATTTCCCGAAGG  540

ACATTTGGAATAGTACTACTCCTTTACA AATAAAATCGATAACTGCAAAAAAAAAAAAAA  600

(2)SEQ ID NO.2的信息

  (a)序列特征

    *长度：71氨基酸

    *类型：氨基酸

    *链型：单链

    *拓扑结构：线性

  (b)分子类型：肽

  (c)序列描述

MRLVVCLVFL ASFALVCQGQ KGGYTRPISR PPYGGGYGNV CTSCHVLTTS

1       10         20         30         40         50

QARSCCSRFG RCCVPRRGYSG

        60          71

本发明从中国对虾中克隆上述抗菌肽基因的方法包括：

(1)从中国对虾的血细胞中提取总RNA，

(2)然后进行cDNA第一链合成，

(3)利用两对简并引物嵌进行逆转录PCR和嵌套PCR，得到对虾抗菌肽基因片段，

正向引物F1：5’ATG CGC CTC GTG GTC TG 3’，

反向引物R1：5’TCC TTT TAC TAA ITG ICA ICA 3’

正向引物F2：5’TAC AIG GGC GGT TAC AC 3’

反向引物R2：5’CCG AAC TTG ATG CAG CA 3’

(4)又用一条特异性正向引物F3：5’-TAC AGG GGC GGT TAC ACA CG-3’，进行cDNA 3’端快速扩增(3’RACE)，

(5)然后进行对虾抗菌肽cDNA 5’端克隆。

本发明的关键技术是获得高质量的RNA，我们采用Catrimox-14^TM RNA分离试剂盒(宝生物公司，日本)，可以得到较好的结果。

具体操作条件如下：

1.总RNA提取：从中国对虾的第一腹节基部腹窦抽取血淋巴，收集血细胞。根据宝生物工程(大连)有限公司Catrimox-14^TMRNA提取试剂盒说明进行，自离心收集的血细胞中提取总RNA。

2.cDNA第一链合成：据上海生工生物工程技术服务有限公司cDNA合成试剂盒说明书进行。

3.对虾抗菌肽cDNA片段克隆

(1)根据已报道的凡那对虾抗菌肽成熟肽的基因序列，采用对虾偏爱的密码子设计两对简并引物，用于RT-PCR和嵌套PCR，得到对虾抗菌肽基因片段。

正向引物F1：5’ATG CGC CTC GTG GTC TG 3’，

反向引物R1：5’TCC TTT TAC TAA ITG ICA ICA 3’

正向引物F2：5’TAC AIG GGC GGT TAC AC 3’

反向引物R2：5’CCG AAC TTG ATG CAG CA 3’

(2)用所设计第一对外引物F1、R1，以合成的cDNA为模板进行第一次聚合酶链式反应(PCR)。

聚合酶链式反应(PCR)的试剂与条件：

10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)

模板cDNA                                1μl

正向引物(1.25μg/μl)                   1μl

反向引物(1.25μg/μl)                   1μl

脱氧核苷酸混合物(dNTP)                  4μl

ExTaq DNA聚合酶                         0.25μl

灭菌水                                  37.75μl

总体积                                  50μl

PCR反应程序为：94℃预变性2min，然后进入下列循环：94℃ 30s，50℃ 45s，72℃ 30s，35个循环，最后72℃延伸10min，2％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)再以第1次PCR产物为模板，用F2、R2为引物，进行第二次PCR，PCR退火温度改为51℃，其余与前面相同。取50μl扩增产物进行制备电泳，用胶纯化试剂盒进行DNA的回收和纯化，再与pUCm-T载体连接，转化DH5α菌株，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，提取质粒，用限制性内切酶Pst I酶切和F2、R2为引物做PCR检测，确认插入片段大小后进行测序。

4.对虾抗菌肽cDNA 3’端快速扩增(3’RACE)

根据得到的抗菌肽基因片段序列，又设计一条特异性正向引物F3：5’-TAC AGG GGC GGTTAC ACA CG-3’，进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’RACE试剂盒说明书进行。

取血细胞总RNA约20μg，其他试剂的调制和反应条件按说明书进行。用特异性引物F3与3′接头引物进行3’端PCR扩增，采用55℃退火，其余与上述的PCR扩增程序相同，对所得产物按前述方法进行克隆、验证和测序。

5.对虾抗菌肽cDNA 5’端克隆

按CLONTECH公司(美国)SMART^TM PCR cDNA文库构建试剂盒说明书进行，包括下列步骤：

(1)第一链cDNA合成：

1.0μl  RNA样品(0.05-1.0μg总RNA)

1μl    SMART寡核苷酸(5’TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG-3’)

1μl    CDS/3’PCR引物(Oligo(dT)₃₀N_-1N；N＝A、G、C或T，N_-1＝A、G或C)

2.0μl  水

将上述试剂在0.5ml离心管内混匀，72℃孵育2分钟。再冰浴2分钟，然后加入下列试剂：

2.0μl   5x第一链缓冲液

1.0μl   DTT(20mM)

1.0μl   dNTP(10mM)

-1.0μl  MMLV逆转录酶

10μl    总体积混匀，42℃孵育1小时，冰浴终止反应。

(2)cDNA的长PCR扩增：

模板用上述合成cDNA，正向引物为5’PCR引物：5’-TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAA-3’，逆向引物为CDS/3’PCR引物，其余试剂与上述PCR反应相同，DNA聚合酶均为为ExTaq聚合酶，总体积为50μl。反应条件为：95℃1分钟，然后进入下列循环：95℃15秒。68℃5分钟，共进行22个循环。

(3)以长PCR扩增的cDNA为模板，以试剂盒提供的5’PCR引物和反向引物R1为引物进行第一次PCR扩增，然后再以此次PCR产物为模板，用F1和特异性反向引物R3：5’ACAGCA ACG TCC AAA CCG ACT G 3’进行第二次PCR扩增，从而获得了对虾抗菌肽cDNA的全部信号肽和部分成熟肽序列。

6.对虾抗菌肽cDNA序列验证：根据拼接得到的对虾抗菌肽cDNA全序列的5’和3’端特异性序列，设计1对特异性引物进行全长序列扩增，再测序验证。通过网上相似性和同源性检索，提示对虾抗菌肽可以抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌生长，也可以抑制真菌生长。对虾抗菌肽的分子量很小，不会引起人体产生免疫反应，有很大的药用开发的前景，或者用于对虾病的防治。

(四)具体实施方式

实施例1.一种克隆的中国对虾抗菌肽基因，具有如下序列：

                                    序列表

同系基因一：

(1)SEQ ID N0 1的信息

(a)序列特征：

        *长度：600碱基对

        *类型：核酸

        *链型：双链

        *拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：对虾(Penaeus chinensis)

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

ATGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTGCCAAGGGCAA   60

AAGGGTGGTTACACACGCCCGATATCCAGACCACCCTATGGGGGAGGATATGGCAATGTT  120

TGCACTTCATGCCACGTTCTTACCACCTCACAAGCTCGTTCTTGCTGCAGTCGGTTTGGA  180

CGTTGCTGTGTGCCAAGAAGAGGATACAGTGGTTGATGAAGAAGACAACGAAAACCTGAC  240

TTCACAACGTATTCATTAATTGTGAAGAGACTGCAACCCTGATTTTGAACTGTATTTTCT  300

CGTTCCATTTTTTTTACTTTTGCTTGTGGAAAGGATGCTTTGCAAGGATGCACTAAAGAT  360

TTTTCCATGATTGCCTGATGAATGAAAGTGCATGTGGGATGTAAGTGCATTTGTCCCAGC  420

AGGTCCTCGTGTATTCATGATTTGTAACACACGAGAAAGAATACTTGTTGTTTGACTTTC  480

ATTGTAATTAATTGTACGCATGGGTCTGTGTGTGGTTGGTGATTGCATATTTCCCGAAGG  540

ACATTTGGAATAGTACTACTCCTTTACA AATAAAATCGATAACTGCAAAAAAAAAAAAAA  600

(2)SEQ ID NO.2的信息

  (b)序列特征

      *长度：71氨基酸

      *类型：氨基酸

      *链型：单链

      *拓扑结构：线性

  (b)分子类型：肽

  (c)序列描述

MRLVVCLVFL ASFALVCQGQ KGGYTRPISR PPYGGGYGNV CTSCHVLTTS

1       10         20         30         40         50

   QARSCCSRFG RCCVPRRGYSG

        60          71

实施例2.中国对虾抗菌肽基因的克隆方法

1.总RNA提取：从10cm以上中国对虾的第一腹节基部腹窦抽取血淋巴，内加1/10体积的抗凝剂(10％柠檬酸钠，pH7)和终浓度为200μM的苯基硫脲(作为黑化抑制剂)。30毫升血淋巴在4℃ 700g离心15分钟，收集血细胞。将收集的血细胞用日本宝生物公司RNA提取试剂盒Catrimox^TM提取总RNA。

2.cDNA第一链合成：约30微克总RNA，加反应液20微升(50毫摩尔氯化钾，3毫摩尔氯化镁，10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)pH 8.3，1毫摩尔二硫苏糖醇(DTT)，5微摩尔寡聚脱氧胸腺核苷酸(Oligod(T)17)，500微摩尔脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶)42℃反应90分钟。70℃10分钟终止反应。

3.PCR反应：聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件：

正向引物F1：5’ATG CGC CTC GTG GTC TG 3’，

反向引物R1：5’TCC TTT TAC TAA ITG ICA ICA 3’

正向引物F2：5’TAC AIG GGC GGT TAC AC 3’

反向引物R2：5’CCG AAC TTG ATG CAG CA 3’

首先将下列试剂混在一起

·10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)

·模板cDNA                     1μl

·正向引物F1(1.25μg/μl)      1μl

·反向引物R1(1.25μg/μl)      1μl

·脱氧核苷酸混合物(dNTP)       4μl

·Taq DNA聚合酶                0.25μl

· 灭菌水                      37.75μl

·总体积                       50μl

PCR反应条件为：首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环：94℃30秒，51℃30秒，72℃30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。

然后以该PCR产物为模板，以F2和R2为引物，其余条件相同，进行第二次PCR扩增，获得约120bp扩增片段。

4.反应产物纯化：利用德国卡珍(QIAGEN)公司产品(QIAquick Gel Extraction Kit)，操作步骤按产品说明书进行。

5.抗菌肽基因克隆：取纯化产物3微升，连接于pUCm-T载体(上海生工产品)。转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有安苄青霉素(100微克/毫升)和5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体培养基(5毫升，含100微克/毫升安苄青霉素)过夜培养。

6.质粒纯化：收取过夜培养菌液1-2毫升，离心(10000转，1分钟)收集细胞。用微量DNA纯化试剂盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美国普洛麦Promega公司)纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。

7.序列测定与同源检索：取纯化质粒2-5微升，用载体引物T7进行全自动测序(上海生工公司)，将所得序列与基因库序列比较。

8.对虾抗菌肽cDNA 3’和5’端克隆基本程序与上述相同。

根据得到抗菌肽基因片段后，又用一条特异性正向引物F3：5’-TAC AGG GGC GGT TACACA CG-3’，进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’RACE试剂盒说明书进行。

取血细胞总RNA约20μg，其他试剂的调制和反应条件按说明书进行。用特异性引物F3与3’接头进行3’端PGR扩增，采用55℃退火，其余与上述的PCR扩增程序相同，对所得产物按前述方法进行克隆、验证和测序。

对虾抗菌肽cDNA 5’端克隆如下：

按美国克隆技术公司(CLONTECH)SMART^TMPCR cDNA文库构建试剂盒说明书进行，包括下列步骤：

(1)第一链cDNA合成：

1.0μl    RNA样品(0.8μg总RNA)

1μl      SMART寡核苷酸(5’TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG-3’)

1μl      CDS/3’PCR引物(Oligo(dT)₃₀N_-1N；N＝A、G、C或T，N_-1＝A、G或C)

2.0μl    水

将上述试剂在0.5ml离心管内混匀，72℃孵育2分钟。再冰浴2分钟，然后加入下列试剂：

2.0μl   5x第一链缓冲液

1.0μl   DTT(20mM)

1.0μl   dNTP(10mM)

1.0μl   MMLV逆转录酶

10μl    总体积

混匀，42℃孵育1小时，冰浴终止反应。

(2)cDNA：的长PCR扩增：

模板用上述合成cDNA，正向引物为5’PCR引物：5’-TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAA-3’，逆向引物为CDS/3’PCR引物，其余试剂与上述PCR反应相同，DNA聚合酶均为为ExTaq聚合酶，总体积为50μl。反应条件为：95℃1分钟，然后进入下列循环：95℃15秒。68℃5分钟，共进行22个循环。

(3)以长PCR扩增的cDNA为模板，以试剂盒提供的5’PCR引物和反向引物R1为引物进行第一次PCR扩增，然后再以此次PCR产物为模板，用F1和特异性反向引物R3：5’ACAGCA ACG TCC AAA CCG ACT G 3’进行第二次PCR扩增，从而获得了对虾抗菌肽cDNA的全部信号肽和部分成熟肽序列。

对虾抗菌肽cDNA序列验证：根据拼接得到的对虾抗菌肽cDNA全序列的5’和3’端特异性序列，设计1对特异性引物进行全长序列扩增，再测序验证。

                     序列表

同系基因一：

(1)SEQ ID NO 1的信息

(a)序列特征：

      *长度：600碱基对

      *类型：核酸

      *链型：双链

      *拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：对虾(Penaeus chinensis)

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

ATGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTGCCAAGGGCAA  60

AAGGGTGGTTACACACGCCCGATATCCAGACCACCCTATGGGGGAGGATATGGCAATGTT 120

TGCACTTCATGCCACGTTCTTACCACCTCACAAGCTCGTTCTTGCTGCAGTCGGTTTGGA 180

CGTTGCTGTGTGCCAAGAAGAGGATACAGTGGTTGATGAAGAAGACAACGAAAACCTGAC 240

TTCACAACGTATTCATTAATTGTGAAGAGACTGCAACCCTGATTTTGAACTGTATTTTCT 300

CGTTCCATTTTTTTTACTTTTGCTTGTGGAAAGGATGCTTTGCAAGGATGCACTAAAGAT 360

TTTTCCATGATTGCCTGATGAATGAAAGTGCATGTGGGATGTAAGTGCATTTGTCCCAGC 420

AGGTCCTCGTGTATTCATGATTTGTAACACACGAGAAAGAATACTTGTTGTTTGACTTTC 480

ATTGTAATTAATTGTACGCATGGGTCTGTGTGTGGTTGGTGATTGCATATTTCCCGAAGG 540

ACATTTGGAATAGTACTACTCCTTTACA AATAAAATCGATAACTGCAAAAAAAAAAAAAA 600

(2)SEQ ID NO.2的信息

  (a)序列特征

        *长度：71氨基酸

        *类型：氨基酸

        *链型：单链

        *拓扑结构：线性

  (b)分子类型：肽

  (c)序列描述

MRLVVCLVFL ASFALVCQGQ KGGYTRPISR PPYGGGYGNV CTSCHVLTTS

1       10         20         30         40         50

    QARSCCSRFG RCCVPRRGYSG

        60          71

Claims (6)

1.一种克隆的中国对虾抗菌肽基因，其特征在于，具有以下的序列：

ATGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTGCCAAGGGCAA   60

AAGGGTGGTTACACACGCCCGATATCCAGACCACCCTATGGGGGAGGATATGGCAATGTT  120

TGCACTTCATGCCACGTTCTTACCACCTCACAAGCTCGTTCTTGCTGCAGTCGGTTTGGA  180

CGTTGCTGTGTGCCAAGAAGAGGATACAGTGGTTGATGAAGAAGACAACGAAAACCTGAC  240

TTCACAACGTATTCATTAATTGTGAAGAGACTGCAACCCTGATTTTGAACTGTATTTTCT  300

CGTTCCATTTTTTTTACTTTTGCTTGTGGAAAGGATGCTTTGCAAGGATGCACTAAAGAT  360

TTTTCCATGATTGCCTGATGAATGAAAGTGCATGTGGGATGTAAGTGCATTTGTCCCAGC  420

AGGTCCTCGTGTATTCATGATTTGTAACACACGAGAAAGAATACTTGTTGTTTGACTTTC  480

ATTGTAATTAATTGTACGCATGGGTCTGTGTGTGGTTGGTGATTGCATATTTCCCGAAGG  540

ACATTTGGAATAGTACTACTCCTTTACAAATAAAATCGATAACTGCAAAAAAAAAAAAAA  600。

2.一种权利要求1所述中国对虾抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，包括：

(1)从中国对虾的血细胞中提取总RNA，

(2)然后进行cDNA第一链合成，

(3)利用两对简并引物嵌套链式聚合酶反应(PCR)，得到对虾抗菌肽基因片段，

正向引物F1：5’ATG CGC CTC GTG GTC TG 3’，

反向引物R1：5’TCC TTT TAC TAA ITG ICA ICA 3’

正向引物F2：5’TAC AIG GGC GGT TAC AC 3’

反向引物R2：5’CCG AAC TTG ATG CAG CA 3’

(4)又用一条特异性正向引物F3：5’-TAC AGG GGC GGT TAC ACA CG-3’，进行cDNA 3’端快速扩增，

(5)然后进行对虾抗菌肽cDNA 5’端克隆。

3.如权利要求2所述中国对虾抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述的提取总RNA是从中国对虾的第一腹节基部腹窦抽取血淋巴，收集血细胞，根据宝生物工程(大连)有限公司Catrimox-14^TMRNA提取试剂盒说明进行，自离心收集的血细胞中提取总RNA。

4.如权利要求2所述中国对虾抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述的对虾抗菌肽cDNA片段克隆步骤如下：

用第一对外引物F1、R1，以合成的cDNA为模板进行第一次链式聚合酶反应，试剂与条件：

10xTaq DNA聚合酶缓冲液    5微升

模板 cDNA                 1μl

正向引物(1.25μg/μl)     1μl

反向引物(1.25μg/μl)     1μl

脱氧核苷酸混合物(dNTP)    4μl

ExTaq DNA聚合酶           0.25μl

灭菌水                  37.75μl

总体积                  50μl

PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃ 30s(秒)，50℃ 45s，72℃ 30s，35个循环，最后72℃延伸10min，2％琼脂糖凝胶电泳检测；

再以第1次PCR产物为模板，用F2、R2为引物，进行第二次PCR，PCR退火温度改为51℃，其余与前面相同，取50μl扩增产物进行制备电泳，用胶纯化试剂盒进行DNA的回收和纯化，再与pUCm-T载体连接，转化DH5α菌株，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，提取质粒，用PstI酶切和F2、R2为引物做PCR检测，确认插入片段大小后进行测序。

5.如权利要求2所述中国对虾抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述的对虾抗菌肽cDNA3’端快速扩增步骤如下：

得到抗菌肽基因片段后，又设计一条特异性正向引物F3：5’-TAC AGG GGC GGT TAC ACACG-3’，进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’RACE试剂盒说明书进行，取血细胞总RNA约20μg，其他试剂的调制和反应条件按说明书进行，用特异性引物F3与3’接头进行3’端PCR扩增，采用55℃退火，对所得产物进行克隆、验证和测序。

6.如权利要求2所述中国对虾抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述的对虾抗菌肽cDNA5’端克隆步骤如下：

(1)第一链cDNA合成：

1.0μl    RNA样品(0.05-1.0μg总RNA)

1μl      SMART寡核苷酸(5’TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG-3’)

1μl      CDS/3’PCR引物(Oligo(dT)₃₀N_-1N；N＝A、G、C或T，N_-1＝A、G或C)

2.0μl    水

将上述试剂在0.5ml离心管内混匀，72℃孵育2分钟，再冰浴2分钟，然后加入下列试剂：

2.0μl    5x第一链缓冲液

1.0μl    DTT(20mM)

1.0μl    dNTP(10mM)

10μl     MMLV逆转录酶

10μl     总体积

混匀，42℃孵育1小时，冰浴终止反应；

(2)cDNA的长PCR扩增：

模板用上述合成cDNA，正向引物为5’PCR引物：5’-TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAA-3’，逆向引物为CDS/3’PCR引物，其余试剂与上述PCR反应相同，DNA聚合酶均为为ExTaq聚合酶，总体积为50μl，反应条件为：95℃ 1分钟，然后进入下列循环：95℃ 15秒，68℃ 5分钟，共进行22个循环；

(3)以长PCR扩增的cDNA为模板，以试剂盒提供的5’PCR引物和反向引物R1为引物进行第一次PCR扩增，然后再以此次PCR产物为模板，用F1和特异性反向引物R3：5’ACA GCAACG TCC AAA CCG ACT G 3’进行第二次PCR扩增，从而获得了对虾抗菌肽cDNA的全部信号肽和部分成熟肽序列。