CN1238506C - 用作畜禽疫苗佐剂的CpG DNA基因工程重组体 - Google Patents

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CN1238506C CN 200310106226 CN200310106226A CN1238506C CN 1238506 C CN1238506 C CN 1238506C CN 200310106226 CN200310106226 CN 200310106226 CN 200310106226 A CN200310106226 A CN 200310106226A CN 1238506 C CN1238506 C CN 1238506C
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Abstract

本发明公开了一种能促进畜禽疫苗效价的用作畜禽疫苗佐剂的CpG DNA的基因工程重组体，该基因工程重组体是根据由序列为：5’————GGTGCATCGATGCAGGGGGG——3’、5’————GGTGCGTCGATGCAGGGGGG——3’及5’——-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT——3’串联而成的D19D282006目的片段DNA的序列，合成其寡核苷酸正链和负链合成其寡核苷酸正链和负链，在合成的寡核苷酸末端加上能与线形载体末端相匹配的碱基序列，然后将此寡核苷酸片段、退火缓冲液、及无菌重蒸水混合后，于90℃～100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，形成含D19D282006序列的DNA片段，此后将此DNA片段插入线性载体的相应的酶切位点，最后，将其转化感受态大肠杆菌而得到的基因工程重组体。本发明能提高CpG佐剂的效能，生产工艺简单，成本低廉，适合于大规模工业化生产。极大地降低了CpG ODN的生产成本。

Description

用作畜禽疫苗佐剂的CpG DNA基因工程重组体
一、技术领域
本发明涉及一种用作畜禽疫苗佐剂的CpG DNA(CpG DNA是指含胞嘧啶和鸟嘧啶二核苷酸基序的脱氧核糖核酸，CpG DNA是本领域技术人员熟知且惯用的技术术语)基因工程重组体。
二、背景技术
新型免疫佐剂CpG DNA的发现源于细菌DNA和特定序列反义寡核苷酸(ODN)的免疫刺激作用。最初科学家认为是细菌DNA中某些回文结构具有免疫刺激作用，后来其他科学家发现特定序列反义寡核苷酸也具有免疫刺激作用，并比较了多种序列寡核苷酸的免疫刺激作用，最后发现无论细菌DNA还是特定序列反义寡核苷酸，它们的免疫刺激作用都由于其中含有特定非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)基序。
CpG DNA引起B细胞分化，刺激B细胞分泌IL-6、IL-10等细胞因子和表达MHC II、B7-1、B7-2等表面分子，并阻止B细胞的凋亡。CpG能直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，引起这些细胞分泌IL-12、TNF-α等Th1样为主的细胞因子，并刺激细胞表面分子MHCII、B7-1、B7-2的表达。CpG在IL-12协同下直接激活NK细胞，激活的NK细胞杀伤活性增强，并分泌IFN-γ，IFN-γ反过来又能进一步促进单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的激活。CpG不仅能有效地激活天然免疫，而且能有效地激活获得性免疫，CpG能协同刺激抗原特异性B细胞和T细胞分化，在Th1细胞因子的作用下，显著增强获得性细胞免疫，这些特性使CpG DNA成为优良的T细胞免疫佐剂。
虽然CpG ODN是一种极有前途的新型高效免疫佐剂，能有效提高疫苗的效价。但要大规模地走向实际生产，就必需解决生产成本过高的问题，目前生产CpG ODN主要采用人工合成的方法，需高价格的dNTP和PCR合成仪，且生产量有限，不适应大规模工业化生产及实际应用的要求。
三、技术内容
技术问题：本发明提供一种能够提高畜禽疫苗效价且能降低生产成本的用作畜禽疫苗佐剂的CpG DNA基因工程重组体。
技术方案：一种能促进畜禽疫苗效价的用作畜禽疫苗佐剂的CpG DNA基因工程重组体，该基因工程重组体是根据由序列为：
5’---GGTGCATCGATGCAGGGGGG---3’、
5’---GGTGCGTCGATGCAGGGGGG---3’及
5’---TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT---3’
串联而成的D19D282006目的片段DNA的序列，合成其寡核苷酸的正链和负链，在合成的寡核苷酸末端加上能与线性载体末端相匹配的碱基序列，然后将此寡核苷酸片段、退火缓冲液、及无菌重蒸水混合后，于90℃-100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，形成含D19D282006序列的DNA片段，此后将此DNA片段插入线性载体的相应的酶切位点，最后，将其转化感受态大肠杆菌而得到的基因工程重组体。
考虑到进一步提高CpG DNA疫苗佐剂的作用且进一步降低生产成本，上述寡核苷酸包括第一片段的寡核苷酸，该第一片段的寡核苷酸正链碱基序列为
5’----GGTGC ATCGATGCAGGGGGGTC GTCGTTTT GTCGTTTTGTCGTTGGTGC GTCGATGCAGGGGGGA----3’
负链碱基序列为
5’----CCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCA----3’，
退火后形成的DNA片段的两端含有突出的碱基A，线形载体为线形的T载体，连接后形成第一重组质粒PCPG1/T。
上述寡核苷酸还包括第二片段的寡核苷酸，该第二片段的寡核苷酸正链碱基序列为
5’---- CGGTGC ATCGATGCAGGGGGGTC GTCGTTTT GTCGTTTT GTCGTTGGTGC GTCGATGCAGGGGGG C----3’
负链碱基序列为
5’----CATGGCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCGCATG----3’
退火后形成的DNA片段的两端为粘性末端，与经SphI、NcoI双酶切的第一重组质粒的两端相匹配，连接后形成第二重组质粒PCPG12/T。
上述寡核苷酸还包括第三片段的寡核苷酸，该第三片段的寡核苷酸正链碱基序列为
5’---- CTAGTGGTGC ATCGATGCAGGGGGGTC GTCGTTTT GTCGTTTT GTCGTTGGTGC GTCGA TGCAGGGGGG CTGCA----3’
负链碱基序列为
5’----GCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCA----3’
退火后形成的DNA片段的两端为粘性末端，与经SpeI、pstI双酶切的第二重组质粒的两端相匹配，连接后形成第三重组质粒PCPG123/T。
技术效果：①本发明所提供的含CpG基序的基因工程重组体，将对猪具有良好免疫刺激活性的CpG ODN D19、D28和2006串联在一起，其中D型CpG ODN D19、D28能中等程度的刺激猪PBMC的增殖，且能分泌高水平的IFN-γ；K型ODN 2006能最高水平的刺激猪PBMC的增殖，K型和D型的串联，能取长补短，提高CpG佐剂的效能。[3H]-脱氧胸苷掺入检测法、以刺激指数(SI值)为检测指标，比较了CpG DNA重组质粒刺激猪外周血单个核细胞增殖的作用。结果表明：CpG DNA重组质粒对猪外周血单个核细胞均具有良好的免疫刺激活性，SI＞4.0。配合疫苗使用，提高疫苗的免疫效果，并能有效避免现常用佐剂中造成的炎症反应等不良副作用，对牛、鸡、马的研究清楚地显示CpGODN能增强并能调节对抗原的Th1型或Th2型的免疫反应。因此，CpG ODN作为动物疫苗的新型、高效免疫佐剂是有充实证据的。和大多数用于动物疫苗的佐剂不同，按10毫克/公斤体重剂量注射CpG ODN，CpG ODN没有引起家畜注射部位的局部炎症、肉芽肿等毒副反应。
②用本发明新构建的基因工程体E.coli-PCPG1/T、E.coli-PCPG12/T、E.coli-PCPG123/T(3株)分别用于生产3种含CpG的重组质粒——PCPG1/T、PCPG12/T、PCPG123/T。其基因工程体通过常规的细菌发酵，用简单地碱裂解法即可提取大量的含不同CpG数目的重组质粒，生产工艺简单，成本低廉，适合于大规模工业化生产。极大地降低了CpG ODN的生产成本。
③含CpG基序的系列基因工程重组体E.coli-PCPG1/T、E.coli-PCPG12/T、E.coli-PCPG123/T，分别含有重组质粒PCPG1/T，PCPG12/T，PCPG123/T，其中PCPG1/T含有一个拷贝的D19D282006核心序列，其中PCPG12/T含有2个拷贝的D19D282006核心序列，其中PCPG123/T含有3个拷贝的D19D282006核心序列；均可用相同的方法大规模生产，根据实际生产的要求，既可单独使用，也可混合使用；作为一种新型高效免疫佐剂，充分发挥了CpG的佐制作用，配合疫苗使用，能有效地提高疫苗的效价，增强疫苗的免疫保护力。
四、附图说明
图1是CpG片段重组克隆战略图。
图2是重组质粒琼脂糖凝胶电泳图。
图3是第一重组质粒PCPG1/T负链序列分析图及其序列。
图4是第二重组质粒PCPG12/T正链序列分析图及其序列。
图5是第三重组质粒PCPG123/T正链序列分析图及其序列。
五、具体实施方案
实施例1：本发明是一种能促进畜禽疫苗效价的用作畜禽疫苗佐剂的CpG DNA的基因工程重组体，该基因工程重组体是根据由序列为：
5’---GGTGCATCGATGCAGGGGGG---3’、
5’----GGTGCGTCGATGCAGGGGGG---3’及
5’---TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT---3’
串联而成的D19D282006目的片段DNA的序列，合成其寡核苷酸正链和负链，在合成的寡核苷酸末端加上能与线形载体末端相匹配的碱基序列，然后将此寡核苷酸片段、退火缓冲液、及无菌重蒸水混合后，于90℃～100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，形成含D19D282006序列的DNA片段，此后将此DNA片段插入线性载体的相应的酶切位点，最后，将其转化感受态大肠杆菌而得到的基因工程重组体，在本实施例中，寡核苷酸包括第一片段的寡核苷酸，该第一片段的寡核苷酸正链碱基序列为
5’----GGTGC ATCGATGCAGGGGGGTC GTCGTTTT GTCGTTTT GTCGTTGGTGC GTCGATGCAGGGGGGA----3’
负链碱基序列为
5’----CCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGC ACCA----3’，
退火后形成的DNA片段的两端含有突出的碱基A，线形载体为线形的T载体，连接后形成第一重组质粒PCPG1/T；本实施例中的寡核苷酸还包括第二片段的寡核苷酸，该第二片段的寡核苷酸正链碱基序列为
5’---- CGGTGC ATCGATGCAGGGGGGTC GTCGTTTT GTCGTTTT GTCGTTGGTGC GTCGATGCAGGGGGG C----3’
负链碱基序列为
5’----CATGGCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCGCATG----3’
退火后形成的DNA片段的两端为粘性末端，与经SphI、NcoI双酶切的第一重组质粒的两端相匹配，连接后形成第二重组质粒PCPG12/T；本实施例中的寡核苷酸还包括第三片段的寡核苷酸，该第三片段的寡核苷酸正链碱基序列为
5’---- CTAGTGGTGC ATCGATGCAGGGGGGTC GTCGTTTT GTCGTTTT GTCGTTGGTGC GTCGATGCAGGGGGG CTGCA----3’
负链碱基序列为
5’----GCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCA----3’
退火后形成的DNA片段的两端为粘性末端，与经SpeI、pstI双酶切的第二重组质粒的两端相匹配，连接后形成第三重组质粒PCPG123/T。
实施例2：
1基因工程体构建
1.1第一片段正链和负链寡核苷酸的人工合成
人工合成第一片段寡核苷酸正链序列为
5’----GGTGC ATCGATGCAGGGGGGTC GTCGTTTT GTCGTTTT GTCGTTGGTGC GTCGATGCAGGGGGGA----3’
寡核苷酸负链序列为
5’----CCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCA----3’，
1.2第一片段片段的合成
将人工合成并纯化的上述寡核苷酸正负链、退火缓冲液、无菌重蒸水按下列配方混合后，以1000转/分离心30秒，于90℃-100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，该退火反应体系如下：
正链           1μl
负链           1μl
5倍退火缓冲液  16μl
无菌重蒸水     2μl
总体积         80μl
1.3DNA片段与T载体连接反应
将上述DNA片段10倍稀释后，与T载体在大肠杆菌DNA连接酶的作用下，4℃连接反应约16h，获得重组质粒PCPG1/T。用市场购买的promega T载体试剂盒中的对照片段与T载体连接做阳参，T载体自身连接做阴参，连接反应体系如下：
                         DNA片段    T载体    Control
T载体                    0.5μl     0.5μl   0.5μl
DNA片段                  1.25l      0.0μl   0.0μl
Control DNA(4ng/μl)     0.0μl     0.0μl   1.5μl
10×buffer               1.0μl     1.0μl   1.0μl
T4DNA ligase(3unit/μl)  0.5μl     0.5μl   0.5μl
ddH2O                   6.75μl    8.0μl   6.5μl
Total volume             10.0μl    10.0μl  10.0μl
1.4重组质粒转化大肠杆菌DH5α
1.4.1LB琼脂板和氨苄青霉素抗性LB琼脂板的制备：
先按下列配方配制LB液体培养基、LB琼脂液，15磅，20min，高压灭菌，铺于直径为90mm的培养皿中，制备成LB琼脂板；按上述同样的方法；配制LB琼脂液，冷却到50℃，加入终浓度为75μg/ml的氨苄青霉素，混匀后，铺于直径为90mm的培养皿中，制备成含氨苄青霉素抗性LB琼脂板，冷却后置4℃放置备用。
LB液体培养基：
蛋白胨(Bacto-Tryptone)             8g
酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract)    5g
NaCl                              5g
加ddH2O溶解，用10N NaOH调pH至7.4，定容至1000ml，即为LB液体培养基。
LB琼脂液：称取15g的琼脂粉，加入1000ml的LB液体培养基，即为LB琼脂液。
1.4.2感受态大肠杆菌DH5α的制备：
用白金耳从-70℃冻存的用预冷的大肠杆菌DH5α中沾取少许，在该LB琼脂板培养板上划线，37℃培养过夜。挑取一单菌落接种于含75μg/ml的Amp的LB液体培养基(配方见下)，37℃培养过夜，以2％的比例转种入LB液体培养基，240rpm，37℃振荡培养至OD600约0.5，置冰水中10min；4℃，6000rpm离心2min，弃上清，菌体沉淀用0.5倍菌体体积、冰水预冷的100mmol/L CaCl2悬浮；冰水中孵浴30min，4℃，6000rpm离心2min，弃上清，菌体沉淀用0.1倍菌体体积、冰水100mmol/L CaCl2悬浮，置冰水中备用。
1.4.3重组子转化大肠杆菌DH5α：
将10μl连接产物与100μl感受态菌混合后，置冰水中孵浴30min，再于42℃水浴90sec，立即置冰水中放置2min，加入0.8ml的LB培养基，150rpm，37℃振荡培养1h。
1.4.4铺板
取备用的氨苄青霉素抗性LB琼脂板，37℃孵箱中放置1h，取200μl重组子转化大肠杆菌DH5α的菌液均匀涂于氨苄青霉素抗性LB琼脂板，置37℃孵箱中过夜。
本发明采用以下方法来验证：
1.5重组质粒的制备
1.5.1细菌的收获：
1)将2ml含75μg/ml氨苄青霉素的LB加入到容量为15ml并通气良好的试管中，
从上述氨苄青霉素抗性LB琼脂板挑取一单菌落接入，于37℃剧烈震荡培养过夜。
2)将1.5ml培养物倒入离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30sec，将剩余的培养物贮存于4℃。
3)吸取培养液，使菌体沉淀尽可能干燥。
1.5.2碱裂解法
1)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈震荡。
溶液I
50mmol/L
50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
在10bf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于4℃。
2)加入200μl新配制的溶液II。
溶液II
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现配现用)1％SDS
盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，以确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要震荡，将离心管置于冰上。
3)加150μl冰冷的溶液III。
溶液III
5mol/L乙酸钾           60ml
冰乙酸                 11.5ml
水                     28.5ml
所配制的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。
盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10sec，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3～5min。
4)用微量离心机于4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。
5)加等量的酚：氯仿，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000g离心2min，将上清转移到另一离心管中。
6)加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀，于室温放置2min。
7)用微量离心机于4℃以12000g离心5min。
8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。
9)用1ml 4℃ 70％乙醇洗涤双链DNA沉淀，按步骤8)所述方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10min。
10)用40μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃备用。
1.6质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
1)用胶布将洗净、干燥的水平制胶板开口封住，形成一个胶模，放在水平工作台上。
2)配制足够量的1×TAE电泳缓冲液。取100ml的1×TAE电泳缓冲液放入三角烧瓶中，加入准确称量的1g的琼脂糖。
1×TAE
0.04mol/LTris-乙酸
0.001mol/LEDTA
3)在微波炉中将悬浮液加热至琼脂糖溶解。
4)使溶液冷却至60℃。加入终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭，充分混匀。
5)将温热的琼脂糖倒入胶模中，凝胶的厚度在3~5min，并插入梳子。
6)在凝胶完全凝固后，小心移去梳子和胶布，将凝胶放入电泳槽中。
7)加入恰好没过胶面约1mm深的足量的电泳缓冲液玻璃板感受态的DH5α和BL21(DE3)，分别用作克隆菌和表达菌，将重组质粒分别转入，用于进行鉴定和表达。
8)取5μl质粒DNA样品，加适量的加样缓冲液混合后，用微量加样器慢慢将混合物加至样品槽中。
9)盖上电泳槽并通电，适量电压下电泳40～60min。
10)断电流，在紫外灯下检查凝胶，并用凝胶成像仪进行摄影(见图2)。
1.7重组质粒的核苷酸序列测定与分析
本发明将筛选出的重组阳性克隆菌株，用上海申能博彩的质粒提取试剂盒提取质粒，核酸定量分析后作为模板，分别用通用的T7启动子引物、SP6引物，在ABI377全自动序列分析仪进行序列测定(见图3)。
实施例3：
2.1基因工程体构建
2.1.1第二片段正链和负链寡核苷酸的人工合成
人工合成第二片段寡核苷酸正链序列为
5’---- CGGTGC ATCGATGCAGGGGGGTC GTCGTTTT GTCGTTTT GTCGTTGGTGC GTCGATGCAGGGGGG C----3’
寡核苷酸负链序列为
5’----CATGGCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCGCATG----3
2.2第二片段2的合成
将人工合成并纯化的上述寡核苷酸正负链、退火缓冲液、无菌重蒸水按下列配方混合后，在1000转/分下离心30秒，于90℃-100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，该退火反应体系如下：
正链              1μl
反链              1μl
5×退火缓冲液     16μl
无菌重蒸水        72μl
总体积            80μl
2.3连接反应
用实施例2获得的阳性重组质粒PCPG1/T作为载体，经酶切与第二片段连接反应
在K缓冲液中，将获得的阳性重组质粒PCPG1/T用限制性内切酶SphI、NcoI分别酶解，琼脂糖凝胶电泳显示酶切完全；再用限制性内切酶SphI、NcoI双酶切，用上海申能博彩的回收纯化试剂盒回收，与第二片段在大肠杆菌DNA连接酶的作用下，4℃连接反应约16h。转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒，经序列分析测定获得阳性重组质粒PCPG12/T。重组质粒的限制性内切酶反应体系和连接反应体系如下：
双酶切反应：
质粒PCPG1/T    8μl
10×bufferK    5μl
0.1％BSA       5μl
SphI           2μl
NcoI           2μl
ddH2O         28μl
Total          50μl
混合均匀后，短暂离心，于37℃水浴2h。1％琼脂糖凝胶电泳，切胶用上海申能博彩的回收纯化试剂盒回收。
连接反应体系如下：
PCPG2          1.5μl
PCPG1/T        10.0μl
10×buffer     1.5l
T4DNA ligase(3unit/μl)      1.0μl
ddH2O                       1.0μl
Total volume                 15.0μl
2.4重组质粒转化大肠杆菌DH5α
方法同实施例2中的1.4。
本发明采用以下方法来验证：
2.5重组质粒的制备
方法同实施例2中的1.5；
2.6质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
方法同实施例2中的1.6，其检测结果(见图2)
2.7重组质粒的核苷酸序列测定与分析
方法同实施例2中的1.7，其检测结果(见图4)
实施例4：
3基因工程体构建
3.1第三片段正链和负链寡核苷酸的人工合成
人工合成第三片段寡核苷酸正链序列为
5’---- CTAGTGGTGC ATCGATGCAGGGGGGTC GTCGTTTT GTCGTTTT GTCGTTGGTGC GTCGA TGCAGGGGGG CTGCA----3’
寡核苷酸负链序列为
5’----GCCCCCCTGCATCGACGCACCAACGACAAAACGACAAAACGACGACCCCCCTGCATCGATGCACCA----3’
3.2第三片段的合成
将人工合成并纯化的上述寡核苷酸正负链、退火缓冲液、无菌重蒸水按下列配方混合后，在1000转/分下离心30秒，于90℃-100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，该退火反应体系如下：
正链            1μl
反链            1μl
5×退火缓冲液   16μl
无菌重蒸水      72μl
总体积           80μl
3.3连接反应
用实施例3获得的阳性重组质粒PCPG12/T作为载体，经酶切与第三片段连接反应
在K缓冲液中，将获得的阳性重组质粒PCPG12/T用限制性内切酶SphI、NcoI分别酶解，琼脂糖凝胶电泳显示酶切完全；再用限制性内切酶SphI、NcoI双酶切，用上海申能博彩的回收纯化试剂盒回收，与第三片段在大肠杆菌DNA连接酶的作用下，4℃连接反应约16h。转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒，经序列分析测定获得阳性重组质粒PCPG123/T。重组质粒的限制性内切酶反应体系和连接反应体系如下：
双酶切反应：
质粒PCPG1/T             8μl
10×bufferK             5μl
pst I                   2μl
Spe I                   2μl
ddH2O                  33μl
Total                   50μl
混合均匀后，短暂离心，于37℃水浴2h。1％琼脂糖凝胶电泳，用上海申能博彩的回收纯化试剂盒回收。
连接反应体系如下：
PCPG2                   1.5μl
PCPG1/T                 10.0μl
10×buffer              1.5μl
T4DNA ligase(3unit/μl) 1.0μl
ddH2O                  1.0μl
Total volume            15.0μl
3.4重组质粒转化大肠杆菌DH5α
方法同实施例2中的1.4
3.5重组质粒的制备
方法同实施例2中的1.5。
本发明采用以下方法来验证：
3.6质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
方法同实施例2中的1.6，其检测结果(见图2)
3.6重组质粒的核苷酸序列测定与分析
方法同实施例2中的1.6，其检测结果(见图5)
3.7CpG DNA增强口蹄疫疫苗的免疫效果
1.猪口蹄疫疫苗的免疫：猪口蹄疫O型灭活购自中牧实业股份有限公司兰州生物药厂，按产品说明书进行免疫。将20头，体重为15公斤左右的断奶仔猪，随机分成对照组和试验组，分别用口蹄疫疫苗和口蹄疫疫苗+PCPG123/T(200μg/每头)于耳根后肌肉免疫。
2.口蹄疫血清中抗体效价检测：免疫后第三周采血，分离血清，采用正向间接血凝试验检测抗体效价。口蹄疫正向间接血凝抗原、阳性血清、阴性血清，均购自兰州兽医研究所。按操作方法按说明书操作。在血凝板上将待检血清用稀释液依次稀释为1∶0、1∶2、1∶4、……、1∶512，设1∶16稀释的阴性血清、1∶512稀释的阳性血清、稀释液对照，每孔各加25μl口蹄疫正向间接血凝抗原，充分振荡混匀。室温静置2小时后判定结果。以50％红细胞出现凝集的最大稀释倍数为该血清的效价。
3.结果：对照组10份血请中仅有2份抗体效价达到1∶128，其余8份血清的抗体均小于1∶128，试验组10份血请中有8份抗体效价达到1∶128，其余2份血清的抗体达到1∶64。
上述3株E.coli-PCPG1/T、E.coli-PCPG12/T、E.coli-PCPG123/T基因工程体，经基因的序列测定，证明其正确无误。三者均应用发酵工艺生产。可用简易的碱裂解法制备，生产成本低廉，适于大规模工业化生产。

Claims (1)

1、一种能提高畜禽疫苗效价的用作畜禽疫苗佐剂的CpG DNA的基因工程重组体，其特征在于：该基因工程重组体是按如下步骤制备的，按照
5’-GGTGC ATCGATGCAGGGGGG-3’、
5’-GGTGC GTCGATGCAGGGGGG-3’及
5’-TC GTCGTTTT GTCGTTTT GTCGTT-3’串联而成的目的DNA序列，合成其正链和负链，在合成的寡核苷酸末端加上能与线形载体末端相匹配的碱基序列，然后将如此得到的寡核苷酸片段、退火缓冲液及无菌重蒸水混合后，于90℃～100℃水浴中孵浴3分钟以上，自然冷却至室温，将由此形成的一个或多个这样的双链DNA片段插入线性载体的相应的酶切位点，最后，将其转化感受态大肠杆菌而得到的基因工程重组体。
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