CN1803194A - 用于预防鸡球虫病的免疫调节型dna疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有预防和治疗鸡球虫病作用的免疫调节型的DNA疫苗。本疫苗含有柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)子孢子抗原基因TA4和鸡白细胞介素－2基因，并在chIL－2基因的5’端引入了一段蛋白酶特异性水解序列。本疫苗包含有多个T细胞免疫应答元件，能够有效地预防和治疗鸡的球虫病。

Description

用于预防鸡球虫病的免疫调节型DNA疫苗

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及一种具有预防鸡球虫病作用的免疫调节型的DNA疫苗。本疫苗含有柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)子孢子抗原基因TA4和鸡白细胞介素-2基因(chIL-2)。并在chIL-2基因的5’端引入了一段蛋白酶特异性水解序列。本疫苗包含有多个T细胞免疫应答元件。

背景技术

鸡球虫病是危害养禽业的重要寄生虫病，全世界每年因球虫所造成的经济损失约为20亿英镑。该病由艾美耳属7种球虫引起，其中以柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)造成的危害最大。目前药物防治鸡球虫病已带来一系列的问题。如耐药性的产生，药物残留对环境造成的危害等等。这些问题已经引起了人们的日益关注。人们迫切希望能找到一种行之有效的办法来防治鸡球虫病。

使用强毒苗和致弱球虫苗接种预防不失为一种手段，但强毒苗仅适用于种鸡，不完全适用于蛋鸡和肉鸡，肉鸡虽可用弱毒球虫苗，但又存在稳定性差，接种量难于控制，费用高等问题，使这些球虫苗不能得到很好的开发和利用。随着分子生物学和免疫学的快速发展，人们迫切希望通过基因工程手段来研制新型基因工程疫苗，为鸡虫病的防治提供新的手段。

鸡对球虫病的免疫是机体对病原体的综合性防御表现，既有非特异性免疫又有特异性获得性免疫—体液免疫和细胞免疫。体液免疫应答主要通过依赖腔上囊的B淋巴细胞实现，细胞免疫应答主要通过依赖胸腺的T细胞实现。已经发现鸡球虫病的免疫力可因摘除胸腺而受到抑制，而摘除腔上囊则无影响。说明球虫的保护性免疫中抗体的作用较小。但通过继承性免疫淋巴细胞转移实验的结果已经证明，T细胞免疫反应在球虫免疫应答中处于核心地位。

核酸疫苗是近几年发展起来的一种新型疫苗，因其操作简便，既具有重组亚单位疫苗的安全性，又具有减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的高效、持续性的优点，成为当今疫苗研究的热点之一。近年来，在抗寄生虫感染方面，核酸疫苗研究已展开了积极的探索。

TA4基因是由Files等(1987)首次克隆，该基因具有典型的信号肽序列，在蛋白合成时引导多肽跨膜运动。该基因长约648bp，其编码的抗原由两条17KD和8KD的多肽连通过二硫键连接而成，是一种子孢子表面蛋白，能刺激感染鸡的T淋巴细胞增殖，对感染鸡具有较好的保护作用。

细胞因子是体内免疫细胞或非免疫细胞产生的一组具有广泛生物学活性的免疫调节因子，在体内能激活和调节免疫活性细胞，对免疫应答的产生和调节具有重要作用。IL-2的主要作用是促进CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞分化增殖，维护T细胞生长，促进自然杀伤细胞(NK)和B细胞功能。故又叫T细胞生长因子(TCGF)。现已证实chIL-2在抗E.tenella和抗E.acervulina感染中的作用。Gaarter等(Caarter LL.et al.，Regulation of T cell subsetsfronm native to memory.J Immunol.1998，21(3)：181-187)报道在感染第3天和第5天给鸡注射chIL-2可使卵囊排出量降低。李祥瑞等(李祥瑞，金红，卢景良.鸡白细胞介素-2cDNA的克隆.南京农业大学学报，1999，22(2)：80-84)已克隆和表达了鸡的IL-2基因。

发明内容

本发明提供了一种具有预防和治疗鸡球虫病作用的免疫调节型的DNA疫苗。

本发明提供了一种制备具有预防和治疗鸡球虫病作用的免疫调节型DNA疫苗的方法。

另外，本发明还提供了所述DNA疫苗的用途。

本发明是部分地建立在本发明人的下列发现之上：含有柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)子孢子抗原基因TA4的真核质粒载体能够为鸡提供针对柔嫩艾美耳球虫的有效免疫保护；含有chIL-2可提高柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)感染鸡盲肠扁桃体和脾脏淋转水平及chIL-2的诱生，并可降低球虫感染的病变记分和粪便中的卵囊数；在制备DNA疫苗时，将鸡白介素-2基因与球虫保护性基因(子孢子抗原基因TA4)一起引入真核质粒，能够进一步增强所述球虫保护基因的免疫保护效果。

一个方面，本发明提供了一种具有预防和治疗鸡球虫病作用的免疫调节型的DNA疫苗，该疫苗包含其中插入了柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)子孢子抗原基因TA4的真核质粒载体。

本发明所述DNA疫苗使用真核质粒表达载体作为结构框架，所述真核质粒载体除具有表达载体基本元件，在限制性酶切位点处插入了目的基因。本领域已知的任一种真核质粒载体都可用于本发明，例如，包括但不限于pcDNA3.0、pcDNA3.1、pVAX 1.0和pcDNA4/His Max。在本发明的一个具体优选的实施方案中，所述的真核质粒载体为pcDNA4/His Max(购自美国Invitrogen公司)。

本发明使用的具有免疫原性的TA4基因，该基因具有典型的信号肽序列，在蛋白合成时引导多肽跨膜运动。该基因长约648bp，其编码的抗原由两条17KD和8KD的多肽连通过二硫键连接而成，是一种子孢子表面蛋白，能刺激感染鸡的T淋巴细胞增殖，对感染鸡具有较好的保护作用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述疫苗进一步还包含与所述基因TA4连接在一起插入所述真核质粒载体的鸡白细胞介素-2基因(chIL-2)，以增强DNA疫苗的免疫原性。本发明人成功克隆和表达了鸡的IL-2基因(chIL-2)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中第667-1089位所示。本发明人进一步研究了鸡IL-2对鸡柔嫩艾美耳球虫病细胞免疫水平的影响。简而言之，试验设对照组、不同剂量卵囊感染组和不同剂量卵囊感染加白细胞介素-2(IL-2)组，在首次感染的基础上攻虫，对首次感染后和攻虫后不同时间的盲肠扁桃体和脾淋巴细胞的淋转水平进行检测，同时结合盲肠病变记分和粪便卵囊记数对结果进行分析。结果表明，首次感染后，单纯感染组盲肠扁桃体淋巴细胞淋转水平持续受抑制；各卵囊感染组脾淋巴细胞转化水平在第4天均下降。感染的同时注射IL-2使1、2、5万卵囊感染组盲肠扁桃体淋转水平分别在第4、6、9天高于单纯感染组；1、2万卵囊感染组脾淋巴细胞转化水平明显升高。攻虫后不同感染组盲肠扁桃体和脾淋转水平均出现下降趋势。加IL-2后能提高盲肠扁桃体淋巴细胞转化水平，但不显示剂量的差异性；脾淋巴细胞转化水平高于单纯感染组，第9天高于对照组。本试验结果表明：1)加入重组鸡IL-2可以使首次感染和攻虫后1万、2万卵囊感染组的病变记分和粪便中卵囊排出量明显降低；2)球虫感染雏鸡后引起脾和盲肠扁桃体淋巴细胞免疫抑制，随感染剂量的加大，免疫抑制程度加深；3)重组IL-2能提高首次感染鸡盲肠扁桃体和脾淋巴细胞转化水平，从而改善球虫首次感染引起的脾和盲肠扁桃体免疫抑制；4)重组IL-2能提高攻虫后盲肠扁桃体和脾淋巴细胞转化水平，对攻虫有免疫保护作用。

基于上述发现，因此在本发明的一个实施方案中，在本发明所述的DNA疫苗中引入与所述基因TA4连接在一起插入所述真核质粒载体的鸡白细胞介素-2基因(chIL-2)，结果发现该DNA疫苗的免疫保护作用进一步增强。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述疫苗还包含在所述的基因TA4与基因chIL-2之间插入一段蛋白酶凝血因子X_a特异性水解序列编码核苷酸序列GAATTCCCTACCCTCGAT。在球虫保护性基因和chIL-2之间插入蛋白酶特异性水解序列编码核苷酸序列，这样就可使得本发明所述DNA疫苗在肌肉细胞或抗原呈递细胞中表达的球虫保护性抗原与chIL-2的融合蛋白中含有了蛋白酶特异性位点。因而，可确保蛋白酶能够在蛋白酶特异性位点水解该融合蛋白，得到球虫抗原和chIL-2蛋白，从而使得这两种蛋白能独自形成高级结构并发挥相应的功能。

在本发明的一个优选的具体实施方案中，通过在chIL-2基因的5’端引入蛋白酶凝血因子X_a特异性水解序列编码核苷酸序列GAATTCCCTACCCTCGAT(如SEQ ID NO：1中第649-666位核苷酸所示)，从而制备出一种插入真核质粒载体中的融合基因TA4-X_a-chIL-2(按从5’到3’的方向)，该融合基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第二个方面，提供了一种生产柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)免疫调节型DNA疫苗的方法。简而言之，其技术路线如下：

1.P CR扩增制备球虫保护性抗原基因TA4和鸡白介素2基因(chIL-2)

通过PCR扩增手段，克隆得到基因TA4和chIL-2。其中在本发明的一个优选实施方案中，通过引物设计手段，在chIL-2基因的5’端引入了一段蛋白酶凝血因子Xa特异性水解序列编码核苷酸序列GAA TTC CCT ACC CTCGAT；

2.DNA疫苗重组真核质粒及相应基因工程菌的构建

利用分子生物学常规的重组方法，制备出含TA4或含TA4-(Xa)-chIL-2的重组真核质粒，然后用其转化宿主菌，在本发明的一个技术方案中，所述宿主菌为大肠杆菌JM109，筛选后获得重组基因工程菌；

3.基因工程菌的发酵及DNA疫苗重组真核质粒的大规模分离纯化。

在本发明的第三个方面是本发明所述的柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)免疫调节型DNA疫苗的用途。用纯化的含TA4或含TA4-(Xa)-chIL-2的重组DNA疫苗直接免疫动物后，通过每克粪便指数、卵囊减少率、盲肠病变记分和抗球虫指数等多项试验指标发现，这两者都具有很好的免疫保护效果(其中后者保护效果更为显著)。因此，本发明所述的DNA疫苗可用于制备预防和治疗鸡球虫病的药物制剂。

附图说明

图1为本发明柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗的结构示意图。

图2为本实验室构建的编码鸡白细胞介素2的重组质粒pBV220-chIL-2的结构示意图。

图3为重组质粒pMD18-T-TA4的构建流程图。

图4为重组质粒pET-chIL-2的构建流程图。

图5为重组质粒pcDNA4/His Max-TA4的构建流程图。

图6为重组质粒pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2的构建流程图。

图7为RT-PCR检测pcDNA4/His Max-TA4和pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2 DNA疫苗在在鸡肌肉细胞内转录情况，RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。A1为DL2000 Marker；A2为pcDNA4/His Max-TA4重组质粒非注射部位肌肉(腿部)的RT-PCR扩增产物；A3为pcDNA4/His Max-TA4重组质粒注射部位肌肉(胸肌)的RT-PCR扩增产物。B1为标准分子量DL2000；B2为pcDNA4/His Max-TA4-Xα-chIL2重组质粒注射部位肌肉(胸肌)的RT-PCR扩增产物(用TA4引物扩增)；B3为pcDNA4/His Max-TA4-Xα-chIL2重组质粒非注射部位肌肉(腿肌)的RT-PCR扩增产物(用TA4引物扩增)。B4为pcDNA4/His Max-TA4-Xα-chIL2重组质粒非注射部位肌肉(腿肌)的RT-P CR扩增产物(用chIL-2引物扩增)；B5为pcDNA4/HisMax-TA4-Xα-chIL2重组质粒注射部位肌肉(胸肌)的RT-PCR扩增产物(用chIL-2引物扩增)。

图8为Western-印迹检测pcDNA4/His Max-TA4和pcDNA4/His Max-TA4-Xα-chIL-2DNA疫苗在肌肉中的表达图。

A、B分别为Western-印迹检测pcDNA4/His Max-TA4-TA4和pcDNA4/His Max-TA4-Xα-chIL-2重组质粒注射部位肌肉(胸肌)的蛋白表达结果。

图9为重组质粒pET-TA4-Xa-chIL-2的构建流程图。

图10为重组质粒pET-TA4-Xa-chIL-2的诱导表达SDS-PAGE图。

1.为蛋白标准分子量；4.为pET28b空载体质粒表达1小时的结果；2、3、5、6和7分别为诱导表达后第0、1、2、3和4小时的结果。

实施例

基础材料：含柔嫩艾美耳球虫子孢子抗原基因TA4的重组质粒pUC18-TA4(本实验室构建)；含鸡白细胞介素-2基因(chIL-2)的重组质粒pBV220-chIL-2(本实验室构建，结构见附图2)；真核表达载体pcDNA4/HisMax(美国Invitrogen公司产品)；pMD18-T(大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司)；pET-28a，b，c(+)(美国Novagen公司产品)。

实施例1.TA4基因的制备：

1.合成引物P1、P2：

根据TA4基因的公开的核苷酸序列设计下列引物：

P1：5’- GGATCCGATGAACAAGCTGA-3′

P2：5’- GAATTCAAAGAGAGCGAAAGCGGA-3’

其中下划线部分分别为引入的酶切位点BamHI和EcoR I。

2.TA4基因的PCR扩增

在薄壁PCR管中加入下列成分进行PCR扩增：

质粒pUC18-TA4(50ng/μl)       1.0μl

2.5mmol/L dNTP                4.0μl

P1(50pmol)                    1.0μl

P2(50pmol)                    1.0μl

10×PCR buffer                5.0μl

25mmol/L MgCL₂               23.0μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)         0.5μl

ddH ₂ O                        34.5μl

总计                          50.0μl

将上述成分离心混匀后，于PCR仪上95℃变性5分钟；94℃60秒，58℃60秒，72℃60秒，共30个循环；然后72℃延伸15分钟。

经测序表明，扩增得到的TA4基因具有如SEQ ID NO：1中第1-648位所示的核苷酸序列。

实施例2.chIL-2基因的制备：

1.合成引物P3、P4，序列分别为：

P3：5’-CTA GAATTCCCTACCCTCGAT TGCAAAGTACTGATCT-3’

P4：5’-TTA GTCGACTTGCAGATATCTCACAAAGTT-3’

其中下划线部分为引入的酶切位点EcoR I和SalI；方框部分为起始密码子；斜体字母部分为凝血因子X_a特异性水解序列编码核苷酸序列(如SEQID NO：1中第649-666位所示的核苷酸序列)。

2.chIL-2基因的PCR扩增

在薄壁PCR管中加入下列成分进行PCR扩增：

质粒pBV220-chIL-2(50ng/μl)     1.0μl

2.5mmol/L dNTP                  4.0μl

P3(50pmol)                      1.0μl

P4(50pmol)                      1.0μl

10×PCR buffer                  5.0μl

25mmol/L MgCL₂                 23.0μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)           0.5μl

ddH ₂ O                          34.5μl

总计                            50.0μl

将上述成分离心混匀后，于PCR仪上94℃变性5分钟；94℃30秒，58℃45秒，72℃45秒，共30个循环；然后72℃延伸10分钟。

由于使用P3和P4作为引物，所以得到的chIL-2基因的5’端含有凝血因子Xa特异性水解序列编码核苷酸序列(即，Xa-chIL-2)。

经测序表明，扩增得到的chIL-2基因具有如SEQ ID NO：1中第667-1089位所示的核苷酸序列。

实施例3.DNA疫苗的构建

1.重组质粒pMD 18-T-TA4的构建(见图3)

取实施例1中获得的PCR产物50μl，1％琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下切下目的条带处琼脂糖凝胶，用大连宝生物公司的胶回收试剂盒回收纯化目的片段，方法参照说明书。取纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接，反应体系如下：

PCR回收产物                      4.0μl

pMD18-T vector                   1.0μl

Ligation solution I              5.0μl

总体积                           10.0μl

将上述成分在薄壁eppendorf管中混合均匀后4℃连接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切及测序等鉴定，确定为pMD18-T-TA4。

2.重组质粒pET-Xa-chIL-2的构建(见图4)

取实施例2中获得的PCR产物50μl，1％琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下切下目的条带处琼脂糖凝胶，用大连宝生物公司的胶回收试剂盒回收纯化目的片段，方法参照说明书。取纯化的PCR产物和质粒pET-28a(+)，分别用EcoRI和SalI双酶切，产物进行纯化回收。然后将两种纯化产物用T4 DNA连接酶进行连接。连接反应体系如下：

PCR产物/EcoR I+SalI(20ng/μl)          5.0μl

pET-28a(+)/EcoRI+SalI(25ng/μl)        2.0μl

5×T4连接buffer                        2.0μl

T4DNA连接酶(2U/μl)                    1.0μl

总体积                                 10.0μl

将上述成分在薄壁eppendorf管中混合均匀后4℃连接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，提取质粒，用EcoRI和SalI双酶切及测序等鉴定，确定为pET-Xa-chIL-2。

3.重组质粒pcDNA-TA4的构建(见图5)

分别用BamHI和EcoRI双酶切克隆质粒载体pMD 18-T-TA4和pcDNA4/HisMax，回收TA4目的基因和pcDNA4/His Max大片段，按照合适比例进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，确定为pcDNA4/His Max-TA4DNA疫苗。

4.重组质粒pcDNA-TA4-Xa-chIL-2的构建(见图6)

分别用EcoRI+NotI双酶切克隆质粒载体pET-Xa-chIL-2和pcDNA4/HisMax-TA4，然后回收Xa-chIL-2目的基因和pcDNA4/His Max-TA4大片段，按照合适比例进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，提取质粒，用EcoRI和NotI双酶切鉴定，确定为pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2 DNA疫苗。

实施例4.免疫调节型DNA疫苗在鸡体内表达情况的检测

分别大量提取pcDNA4/His Max-TA4和pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2重组质粒，经胸部肌肉注射14日龄雏鸡100μg/只，7天后分别取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)

1、RT-PCR检测DNA疫苗的转录

一步法提取肌肉总RNA，用RT-PCR法分别扩增TA4基因和chIL-2基因。结果表明DNA疫苗在鸡肌肉细胞内获得了转录(见图7)。

2、Western-印迹检测DNA疫苗的翻译

分别取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)制样，SDS-PAGE电泳后转印硝酸纤维素膜，丽春红染色，洗涤后加入5％脱脂奶粉封闭无关蛋白结合位点1小时，然后加入抗TA4重组蛋白免疫兔血清(一抗)作用1小时，洗涤缓冲液洗涤后加入HRP标记的羊抗兔抗体(二抗)作用1小时，最后DAB显色液显色。结果发现DNA疫苗在鸡肌肉细胞内获得了很好的表达(见图8)

3.重组质粒pET-TA4-Xa-chIL-2的构建(见图9)

分别用BamHI和EcoRI双酶切克隆质粒载体pMD18-T-TA4和pET28b(+)，回收TA4目的基因和pET28b(+)大片段，按照合适比例进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，确定为pET-TA4重组载体。再用EcoRI和SalI双酶切pET-TA4重组载体和pET-Xa-chIL-2，回收Xa-chIL-2目的基因和pET-TA4大片段，按照合适比例进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，提取质粒，用BamHI和SalI双酶切鉴定，确定为pET-TA4-Xa-chIL-2重组载体。

4.重组质粒pET-TA4-Xa-chIL-2的诱导表达

转化有pET-TA4-Xa-chIL-2质粒的阳性克隆28℃振荡培养过夜。将摇起的菌液以1∶50稀释至含Kna⁺的LB培养液中，37℃继续培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，然后用终浓度1mMol/L IPTG进行诱导表达，分别收集诱导表达后第0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时和6小时的菌液，菌体蛋白进行SDS-PAGE鉴定(见图10)。

实施例5.本发明DNA疫苗的动物实验结果

150羽1日龄雏鸡，随机分为5组，每组30羽。14日龄和21日龄时分别肌肉注射100μl PBS(第一组)、100μl PBS(第二组)、100μg pcDNA4/His Max-TA4(第三组)、100μg pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2(第四组)；TA4-Xa-chIL-2重组融合蛋白(第五组)。28日龄时分别经口感染E.tenella孢子化卵囊0个(第一组)、10⁵个(第二组)、10⁵个(第三组)、10⁵个(第四组)、10⁵个(第五组)。对免疫保护效果进行统计分析。

1、增重效果

注射DNA疫苗前每组鸡逐只称重，然后在攻虫前、攻虫后第7天对对应的鸡再逐只称重，观察攻虫前、攻虫后鸡的体重变化情况，然后计算平均增重和相对增重。平均增重1＝攻虫时重-首免时重；平均增重2＝最后扑杀时重-攻虫时重；相对增重＝(各试验组平均增重/非感染非免疫组平均增重)×100％。增重结果(见表1)表明，疫苗的注射对鸡的增重无影响，即疫苗的毒副作用与PBS相当。而攻虫后pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2DNA疫苗免疫组增重与非感染非免疫组差异不显著，说明pcDNA4/HisMax-TA4-Xa-chIL-2DNA疫苗具有明显的保护作用。

表1：本发明DNA疫苗的增重效果

组别	平均增重1	相对增重1(％)	平均增重2	相对增重2(％)
					非感染非免疫组(第一组)感染非免疫组(第二组)pcDNA4/His Max-TA4(第三组)pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2(第四组)TA4-Xa-chIL-2蛋白(第五组)	60.40±9.583a56.50±13.717ab51.80±17.357b62.60±13.971a61.55±12.488a	100.0093.5485.76103.64101.90	191.30±22.983a130.40±28.957c173.00±16.957b186.20±30.473a156.50±35.995b	10068.1790.4397.3381.81

同一列中含相同字母表示差异不显著，不含相同字母表示差异显著，不同小写字母代表差异显著(p＜0.05)。

2.每克粪便卵囊数

攻虫后每天检查粪便，第7天分别收集各组粪便，混匀后，每组各取10g，加入90mL蒸馏水制成10倍稀释液，经充分搅拌均匀后于显微镜下用红细胞记数板记数每克粪便中的虫卵数。

表2.每克粪便卵囊数

组别	每克粪便卵囊数×106
		非感染非免疫组(第一组)感染非免疫组(第二组)pcDNA4/His Max-TA4重组质粒(第三组)pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2重组质粒(第四组)TA4-Xa-chIL-2蛋白(第五组)	02.660.830.661.00

3、卵囊减少率

卵囊减少率是判断疫苗保护效果的另外一个指标，其计算公式如下：卵囊减少率＝[(感染非免疫组粪便卵囊排出数-试验组粪便卵囊排出数)/感染非免疫组粪便卵囊排出数]×100％。

表3：卵囊减少率

组别	卵囊减少率％
		非感染非免疫组(第一组)感染非免疫组(第二组)pcDNA4/His Max-TA4重组质粒(第三组)pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2重组质粒(第四组)TA4-Xa-chIL-2蛋白(第五组)	100068.7975.1962.04

4、盲肠病变记分

攻虫后第7天，每组取10只鸡剖杀，观察盲肠病变。按Johnson方法进行盲肠病变记分。也就是将盲肠病变分为0～+4五个等级。0分：表示正常，无肉眼病变；+1分：盲肠壁有很少量散在的淤点，肠壁不增厚，内容物正常；+2分：病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，内容物正常；+3分：盲肠内有多量血液或盲肠芯(血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物)，盲肠壁肥厚明显，盲肠中粪便含量少；+4分：因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，死亡鸡只也记+4分。两侧盲肠病变不一致时，以严重的一侧为准。相对病变记分＝(实验组病变记分/感染非免疫组病变记分)×100％。

表4.盲肠病变记分

组别	盲肠病变记分
		非感染非免疫组(第一组)感染非免疫组(第二组)pcDNA4/His Max-TA4重组质粒(第三组)pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2重组质粒(第四组)TA4-Xa-chIL-2蛋白(第五组)	0±0a3.50±0.71b0.60±0.69a0.40±0.66a1.30±0.67a

同一列中含相同字母表示差异不显著，不含相同字母表示差异显著，不同小写字母代表差异显著(p＜0.05)。

5.抗球虫指数(ACI)

ACI是包括存活率、增重、病变、卵囊产量等多项参数，综合评定后作为判定球虫耐药性或药物效力的指标，也可用于球虫疫苗保护效果检测的指标。ACI判定公式：ACI＝(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)。(ACI≥180为保护效果明显，ACI＝160～179为保护效果一般，ACI＜160为无保护效果。)

结果如表，本发明的pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2DNA疫苗ACI达到192.33，具有很好的免疫保护效果。

表5：抗球虫指数(ACI)

组别	存活率	相对增重率	病变值	卵囊值	ACI
						非感染非免疫(第一组)感染非免疫(第二组)pcDNA4/His Max-TA4(第三组)pcDNA4/His Max-TA4-Xa-chIL-2(第四组)TA4-Xa-chIL-2蛋白(第五组)	100100100100100	10068.1790.4397.3381.81	0356413	010111	200.00123.17183.43192.33167.81

                                  序列表

<110>南京农业大学

<120>用于预防鸡球虫病的免疫调节型DNA疫苗

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1089

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>融合基因

<220>

<221>CDS(子孢子抗原基因TA4)

<222>(1)..(648)

<223>

<220>

<221>CDS(鸡白介素-2基因)

<222>(667)..(1089)

<223>

<220>

<221>蛋白酶凝血因子X_a特异性水解序列的编码序列

<222>(649)..(666)

<223>

<400>1

atg aac aag ctg aga aaa gca gca gga ctt cct gca ttc gaa gat gct         48

Met Asn Lys Leu Arg Lys Ala Ala Gly Leu Pro Ala Phe Glu Asp Ala

1               5                   10                  15

gtg gga gac aca ttt gtt cta cca gca tac tcg cat gaa gag tct agg         96

Val Gly Asp Thr Phe Val Leu Pro Ala Tyr Ser His Glu Glu Ser Arg

            20                  25                  30

gcg gca cca gta gct gaa act ctc tgg aag acg gag ata tgc ccc aaa        144

Ala Ala Pro Val Ala Glu Thr Leu Trp Lys Thr Glu Ile Cys Pro Lys

        35                  40                  45

gtc tta gga ggc gga agg tcc agg aac gtt act gaa gct gtc aag tta        192

Val Leu Gly Gly Gly Arg Ser Arg Ash Val Thr Glu Ala Val Lys Leu

    50                  55                  60

act ggc aat ttt gcc tac tac ccc gtc aca gac ggc aaa aag gag tgc        240

Thr Gly Asn Phe Ala Tyr Tyr Pro Val Thr Asp Gly Lys Lys Glu Cys

65                  70                  75                  80

ggc gat gct gtg gag tac tgg aaa ggc gga ctt tct cag ttc aac gac        288

Gly Asp Ala Val Glu Tyr Trp Lys Gly Gly Leu Ser Gln Phe Asn Asp

                85                  90                  95

aca att ccc cca acg ttc caa gcg ttg aac gac ccc gtt gtg tac aat        336

Thr Ile Pro Pro Thr Phe Gln Ala Leu Asn Asp Pro Val Val Tyr Asn

            100                 105                 110

ggc agg gct gtt tcc ttt gtc gcc cta tac aac ccc aaa acc agc ccc        384

Gly Arg Ala Val Ser Phe Val Ala Leu Tyr Asn Pro Lys Thr Ser Pro

        115                 120                 125

gtt gtc agt tgc gtg ctc ctc cag tgc cct aat gca ggt gtt ggt gga        432

Val Val Ser Cys Val Leu Leu Gln Cys Pro Asn Ala Gly Val Gly Gly

    130                 135                 140

cgc agg ctt gcg gca ggc acg aca gac gct gtc att tgc ttg aca aat        480

Arg Arg Leu Ala Ala Gly Thr Thr Asp Ala Val Ile Cys Leu Thr Asn

145                 150                 155                 160

ccg gct cct ttg gaa gca agg tca caa cca ttc gac gac gag caa tgg        528

Pro Ala Pro Leu Glu Ala Arg Ser Gln Pro Phe Asp Asp Glu Gln Trp

                165                 170                 175

aag aaa att ggt gac tct cta tct ctc tct gag gaa gaa gaa gag aag        576

Lys Lys Ile Gly Asp Ser Leu Ser Leu Ser Glu Glu Glu Glu Glu Lys

            180                 185                 190

ggc gga gtt tct cca gtc gtc cct tca gta gcc ctc atc tct gcg gcg        624

Gly Gly Val Ser Pro Val Val Pro Ser Val Ala Leu Ile Ser Ala Ala

        195                 200                 205

gtc atc tcc gct ttc gct ctc ttt gaattcccta ccctcgat atg tgc aaa        675

Val Ile Ser Ala Phe Ala Leu Phe                     Met Cys Lys

    210                 215

gta ctg atc ttt ggc tgt att tcg gta gca acg cta atg act aca gct        723

Val Leu Ile Phe Gly Cys Ile Ser Val Ala Thr Leu Met Thr Thr Ala

220                 225                 230                 235

tat gga gca tct cta tca tca gca aaa agg aaa cct ctt caa aca tta        771

Tyr Gly Ala Ser Leu Ser Ser Ala Lys Arg Lys Pro Leu Gln Thr Leu

                240                 245                 250

ata aag gat tta gaa ata ttg gaa aat atc aag aac aag att cat ctc        819

Ile Lys Asp Leu Glu Ile Leu Glu Asn Ile Lys Asn Lys Ile His Leu

            255                 260                 265

gag ctc tac aca cca act gag acc cag gag tgc acc cag caa act ctg        867

Glu Leu Tyr Thr Pro Thr Glu Thr Gln Glu Cys Thr Gln Gln Thr Leu

        270                 275                 280

cag tgt tac ctg gga gaa gtg gtt act ctg aag aaa gaa act gaa gat        915

Gln Cys Tyr Leu Gly Glu Val Val Thr Leu Lys Lys Glu Thr Glu Asp

    285                 290                 295

gac act gaa att aaa gaa gaa ttt gta act gct att caa aat atc gaa        963

Asp Thr Glu Ile Lys Glu Glu Phe Val Thr Ala Ile Gln Asn Ile Glu

300                 305                 310                 315

aag aac ctc aag agt ctt acg ggt cta aat cac acc gga agt gaa tgc       1011

Lys Asn Leu Lys Ser Leu Thr Gly Leu Asn His Thr Gly Ser Glu Cys

                320                 325                 330

aag atc tgt gaa gct aac aac aag aaa aaa ttt cct gat ttt ctc cat       1059

Lys Ile Cys Glu Ala Asn Asn Lys Lys Lys Phe Pro Asp Phe Leu His

            335                 340                 345

gaa ctg acc aac ttt gtg aga tat ctg caa                               1089

Glu Leu Thr Asn Phe Val Arg Tyr Leu Gln

Claims (6)

1.一种柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)免疫调节型DNA疫苗，该疫苗包含其中插入了柔嫩艾美耳球虫子孢子抗原基因TA4的真核质粒载体。

2.权利要求1所述的DNA疫苗，其中进一步还包含与所述基因TA4连接在一起插入所述真核质粒载体的鸡白细胞介素-2基因。

3.按权利要求2所述的DNA疫苗，其中进一步还包含在所述的基因TA4与基因chIL-2之间插入一段蛋白酶凝血因子X_a特异性水解序列编码核苷酸序列GAA TTC CCT ACC CTCGAT，组成一融合基因TA4-X_a-chIL-2。

4.权利要求3所述的DNA疫苗，其中所述的融合基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

5.权利要求1-4中任一项所述的DNA疫苗，其中所述的真核质粒载体为pcDNA4/His Max。

6.权利要求1-4中任一项所述的DNA疫苗在制备预防和治疗鸡球虫病的药物制剂中的用途。

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