CN1159333C - 旋毛虫抗原基因Ts87及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明为一种旋毛虫新抗原基因，含有该基因的载体的构建及原核和真核表达载体，以及所表达的蛋白。本发明还涉及所述基因及编码的蛋白的应用。用该基因构建的旋毛虫pc DNA 3.1/Ts87 DNA疫苗在COS7细胞和小鼠体内成功表达。旋毛虫Ts87重组蛋白免疫动物后产生高滴度的抗体并对攻击感染产生有效的免疫保护性。

Description

旋毛虫抗原基因Ts87及其应用

发明领域

本发明为一种旋毛虫新抗原基因，含有该基因的载体的构建及原核和真核表达载体，以及所表达的蛋白及由蛋白免疫动物产生的抗体。本发明还涉及所述基因和蛋白的应用。

背景技术

旋毛形线虫(Trichinella spiralis，简称旋毛虫)，可感染人及150多种动物，它所引起的旋毛虫病是一种人畜共患寄生虫病，呈全球性分布，严重地威胁了人类健康并对畜牧业造成巨大经济损失。旋毛虫生活史简述如下：当人或动物宿主生食或半生食含旋毛虫囊包的肉类(猪肉、狗肉等)，囊包内幼虫在胃液、肠液作用下逸出并在小肠内发育为成虫。雌、雄虫交配后雌虫产新生幼虫。新生幼虫侵入肠粘膜淋巴管或静脉，随淋巴和血循环到达宿主横纹肌继续发育。旋毛虫的致病过程分为三期：侵入期、幼虫移行及囊包形成期，即在该虫生活史的每个环节均可使宿主致病。

旋毛虫病临床表现复杂多样，诊断较困难，给及时的治疗造成一定难度，因此该病的免疫诊断及预防成为当务之急。由于病原体不能在体外大量传代培养，限制了抗原的获取；加之旋毛虫抗原的复杂性、多样性，造成目前尚无很好的高敏感度高特异性的抗原作为诊断或保护性疫苗的候选抗原分子。

发明内容

本发明的目的在于：寻找和克隆旋毛虫抗原新基因，对该基因的基因重组蛋白进行细胞定位及免疫学功能的研究，同时以该基因构建DNA疫苗，为旋毛虫病的免疫诊断及预防提供新的候选抗原分子。

根据本发明，提供了：

1、一种核苷酸序列，其特征在于它是选自以下几种的任何一种：

(A)与序列1有至少70％，尤其至少90％同源性的核苷酸序列；

(B)与序列1的核苷酸序列杂交或互补的核苷酸序列；和

(C)(A)或(B)核苷酸序列的片段。

2、上述1项的核苷酸序列，特征在于具有序列1所描述的核苷酸序列。

3、具有序列2所描述的氨基酸序列的多肽，或其片段，类似物或衍生物。

4、根据上述3项所要求的多肽，其特征在于具有序列2的氨基酸序列。

5、含有序列1的核苷酸序列的原核或真核表达载体。

6、含有上述5项的载体的遗传工程宿主细胞。

7、含有3或4项的多肽的药物组合物。

8、1或2项的核苷酸序列在医学、畜牧兽医学中的用途。

9、上述3或4项的多肽作为试剂在人畜旋毛虫病的诊断及疫苗在防治人畜旋毛虫疾病中的应用。

10、制备多肽的方法，包括在适合的条件下培养项6的宿主细胞，从培养物中纯化多肽。

11、抗3或4项多肽的抗体。

本发明的核苷酸序列可以用免疫筛选从旋毛虫cDNA基因文库中获得。本发明还涉及该序列的变异体，例如一个或多个碱基的缺失、添加或替换，但不改变所编码的蛋白质的功能。变异体可以是天然存在的等效变异体或非天然存在的变异体。

本发明的多肽可以通过构建上述基因的原核或真核表达载体，转化到适合的宿主细胞中，从培养物中纯化多肽来制备。本发明的多肽包括序列2的多肽，以及具有等效功能的它的衍生物、片段或类似物。

本发明的内容包括应用分子生物学技术，如：cDNA文库免疫筛选、分子克隆、聚合酶链式反应(PCR)、DNA序列测定、5’-RACE、Southern杂交、Western印迹杂交法，克隆鉴定了旋毛虫抗原新基因Ts87；利用基因表达及免疫学技术获得该基因的重组蛋白及高效价免疫血清；并对该蛋白的细胞定位、免疫原性及免疫保护性进行了分析。同时，应用基因克隆技术构建了pcDNA3.1/Ts87 DNA疫苗及进行了真核细胞体外及动物体内表达。

该基因达到的技术指标为：

1.在本发明中采用cDNA文库免疫筛选和5’-RACE技术获得该基因的全长cDNA序列。全长1172bp，起始密码子ATG位于序列第13bp处，TAA为终止密码子，编码的蛋白质含347个氨基酸。5’端含18个氨基酸的信号肽，切割位点位于18与19氨基酸之间(见序列表部分)。

2.旋毛虫Ts87基因的347个氨基酸重组蛋白在大肠杆菌BL21株中获得表达并纯化(图1)。

3.旋毛虫Ts87基因重组蛋白免疫动物获高滴度抗Ts87免疫血清。

4.旋毛虫Ts87基因重组蛋白为感染旋毛虫的病人血清、病猪血清、病兔血清所识别。并与Ts87重组蛋白免疫血清发生反应(图2)。

5.旋毛虫Ts87基因重组蛋白主要分布于虫体体壁(图3)。

6.成功构建旋毛虫pc DNA 3.1/Ts87 DNA疫苗，在COS7细胞(图4)和小鼠体内成功表达(图5)。

7.旋毛虫Ts87重组蛋白免疫动物后对攻击感染产生有效的免疫保护性(表1)。

本发明发现了旋毛虫Ts87抗原基因全长cDNA；获得了纯化的Ts87基因重组蛋白及进行了免疫学的研究，为旋毛虫病的免疫预防提供了新的保护性候选抗原。并且也可以用于制备诊断试剂。

附图说明

图1SDS-PAGE电泳：Ts87基因重组蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

M.蛋白分子量Marker

1.未经IPTG诱导的含Ts87基因片段质粒的裂解物

2.IPTG诱导后的含Ts87基因片段质粒的裂解物

3.纯化的Ts87基因重组蛋白

箭头所指为重组蛋白带

图2Western免疫印迹鉴定Ts87基因表达蛋白的免疫特性

1.纯化的Ts87基因表达蛋白与旋毛虫病人血清反应

2.纯化的Ts87基因表达蛋白与感染旋毛虫的猪血清反应

3.纯化的Ts87基因表达蛋白与感染旋毛虫的兔血清反应

4.纯化的Ts87基因表达蛋白与Ts87重组蛋白免疫兔血清反应

图3共聚焦显微镜分析Ts87基因重组蛋白的细胞定位

图4Western印迹鉴定pc DNA 3.1/Ts87DNA疫苗在COS7中特异表达

1.一抗为正常兔血清

2.一抗为旋毛虫感染兔血清

3.一抗为Ts87重组蛋白免疫兔血清

4.一抗为旋毛虫虫体可溶性抗原免疫兔血清

图5肌注pc DNA 3.1/Ts87DNA疫苗的免疫组化结果

A.pc DNA 3.1/Ts87DNA疫苗在肌肉中阳性表达结果

B.阴性对照组

实施例

实施例1  旋毛虫抗原基因Ts87的克隆及序列分析

1.筛选血清的制备

收集旋毛虫成虫，匀浆超声制备全虫可溶性抗原。免疫家兔(200μg/只)，隔周加强3次，获得人工免疫兔血清；实验兔喂以4000条旋毛虫肌幼虫，4周后获人工感染血清。经ELISA测定两者的血清滴度均达1∶8000以上。

2.免疫筛选表达文库

1μl旋毛虫成虫入ZAP II cDNA表达文库稀释液加入600μl宿主菌XL1-Blue中，37℃，吸附20分钟加入顶层琼脂，倒置于42℃温箱中培养至有针尖大小的噬菌斑长出。把硝酸纤维素膜铺在平板上，放在37℃温箱培养过夜。第二天在室温下将膜做好标记，从平板上揭下，浸入一抗工作液30分钟，血清中加入了大肠杆菌噬菌体裂解液(STRTAGENE公司)。把膜浸入二抗工作液一1∶7500碱性磷酸酶-羊抗兔IgG(Promega公司)，30分钟。浸入显色液NBT、BCIP中(Promega公司)，显色充分后，加入终止液。用1∶1000人工免疫兔血清筛选获得的阳性克隆，再用1∶1000人工感染兔血清复筛，获得3个阳性克隆。经PCR及SouthernBlot鉴定后，选取Ts87克隆进行DNA序列测定。

3.5’端cDNA末端快速扩增技术获DNA全长

用5’-RACE试剂盒(Gibco BRL公司)进行Ts87基因的5’末端延伸。根据该基因的cDNA第一链设计三个特异扩增引物进行PCR。引物序列为：

T87-R1：GGCTCGAGTTAGGTGCATGCATCCAAGT

T87-R2：GGCATCTATATCTGCTGCAG

T87-R3：CAGTTGGTAGAAGATGATGT，扩增产物经克隆测序，获Ts87 cDNA全长序列。

4.cDNA序列与编码的氨基酸分析

Ts87cDNA全长1172bp，开放阅读框为347个氨基酸，有一个18个氨基酸的信号肽，其理论分子量为37.97KD。

实施例2  制备Ts87基因重组蛋白及免疫血清

1.Ts87基因原核表达及纯化

Ts87基因片段经BamH I和Xho I酶切后，亚克隆于原核表达载体PET-28a(+)。正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21株，经37℃ 150转/分1.0mM IPTG诱导3小时，获得Ts87基因重组蛋白，重组蛋白经His-binding(Novagen公司)亲和层析柱纯化后，经电洗脱仪洗脱使纯度更高(图1)。

2.纯化的Ts87重组蛋白经皮肤多点注射免疫家兔(200μg/只)，加强4次。5周后兔颈动脉取血。ELISA测定抗体效价高达1∶128000。

实施例3  Ts87重组蛋白的免疫特性

1.酶联免疫吸附(ELISA)检测

以1μg Ts87重组蛋白为抗原包被96孔酶标板，一抗为待检血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的相应二抗，该蛋白可与旋毛虫病人血清、感染旋毛虫的兔及猪血清产生阳性反应，而与包虫病人血清、囊尾蚴病人血清及感染日本血吸虫的兔血清未发生交叉反应，说明Ts87基因的重组蛋白具有特异的免疫原性，是极具潜力的诊断试剂。

2.Western印迹分析

纯化的Ts87表达蛋白(200ng)经SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜，用ECL化学发光试剂盒(Amersham公司)检测，分别以病人血清1∶200、感染猪血清1∶10000、感染兔血清1∶10000、Ts87重组蛋白免疫血清1∶10000作为第一抗体。结果显示约40KD处均呈现一明显的蛋白印迹带(图2)，表明Ts87重组蛋白可为感染旋毛虫的人、猪、兔血清及Ts87重组蛋白免疫血清所识别。

实施例4  Ts87重组蛋白在旋毛虫的免疫细胞定位

取旋毛虫肌幼虫做冰冻切片，利用Ts87免疫兔血清作为第一抗体，用FITC标记的山羊抗兔IgG作为第二抗体(北京中山公司)，进行共聚焦显微镜分析，证明Ts87主要定位于旋毛虫的虫体壁上(图3)。

实施例5  pcDNA3.1/Ts87 DNA疫苗的构建及表达

1.pcDNA3.1/Ts87 DNA疫苗的构建

截取Ts87序列的1044核苷酸，在其两端引入Hind III和BamH I酶切位点，并使启始密码子环境符合KOZAK序列，和pcDNA 3.1(+)真核表达载体连接，经酶切鉴定，构建成功。

2.pcDNA3.1/Ts87 DNA疫苗导入COS7细胞后的表达蛋白的制备

利用Lipofectamine脂质体，把重组质粒pcDNA3.1/Ts87和质粒pcDNA3.1(+)分别导入COS7细胞，收集自转染开始48-72小时的细胞产物，加入等体积的SDS上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，用同样体积的正常COS7细胞内的蛋白做阴性对照。

3.Western印迹分析DNA疫苗在COS7中特异性表达

等体积的pcDNA3.1/Ts87和pcDNA3.1(+)转染COS7细胞后收集的蛋白和正常COS7细胞内的蛋白经SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，分别以Ts87重组蛋白免疫兔血清、旋毛虫人工免疫兔血清和人工感染兔血清作为第一抗体，结果证明pcDNA3.1/Ts87DNA疫苗有约40KD的特异性表达带(图4)。该表达蛋白具有特异的免疫原性，均为上述一抗所识别。

4.pcDNA3.1/Ts87 DNA疫苗免疫BABL/c小鼠

利用小鼠股四头肌肌肉注射的方法免疫小鼠。小鼠分为实验组、对照组和空白组。实验组注射pcDNA3.1/Ts87，对照组注射pcDNA3.1(+)，空白组注射生理盐水。免疫4次，每次间隔4周，每次每只小鼠注射100μg质粒。

免疫成功后，取相应的组织进行免疫组化分析。以Ts87重组蛋白免疫兔血清为第一抗体，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒(北京岳泰公司产品)，阳性表达的肌肉显示棕褐色染色(图5)。

实施例6  动物体内保护性实验

BABL/c小鼠8只，随机分为2组，每组4只。Ts87重组蛋白免疫组以200μg/只的抗原加等量的弗氏完全佐剂(FCA)腹腔、皮下注射。以后每隔10天以相同剂量抗原加等量不完全弗氏佐剂，加强3次。末次注射后7天，每只鼠用200条旋毛虫感染性幼虫进行攻击感染。对照组注射相同剂量的PBS，与免疫组同时接受200条旋毛虫感染性幼虫攻击。于攻击4周后将小鼠处理，取全部肌肉用胃蛋白酶消化收集幼虫，计数。经单因素方差分析，Ts87重组蛋白免疫组减虫率为27％，与对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)。

由于本实验Ts87重组蛋白在动物体内产生有效的减虫率，据此可作为保护性候选抗原，应用于旋毛虫病的免疫治疗。

表1  Ts87重组蛋白免疫BABL/c小鼠的保护性结果

组别      BABL/c    平均幼虫数      幼虫保护率      P值

          的数目      ±SD            ％

Ts87蛋白    4      6135.6±1437.3      27          ＜0.01

对照        4      8397.8±1488.4      -

                       序列表

<110>首都医科大学

<120>旋毛虫抗原基因Ts87及其应用

<160>2

<210>1

<211>1172

<212>DNA

<213>旋毛形线虫种(Trichinella spiralis sp.)

<220>

<223>n＝a或g或c或t

<400>1

AAA   ATT   AGA   AAA   ATG   TTC   ATA   TTT   TAT   GCT    30

                       Met   Phe   Ile   Phe   Tyr   Ala

                                                5

ATA   GCT   CTA   TAT   ACC   TTG   CAG   TTA   GGT   GTA    60

Ile   Ala  Leu   Tyr   Thr   Leu   Gln   Leu   Gly   Val

                  10                            15

ACA   CCC   ATT   GAT   TAC   CAA   TGC   AAA   GAA   CAA    90

Thr   Pro   Ile   Asp  Tyr   Gln   Cys  Lys   Glu   Gln

                 20                            25

AAT   AAT   GAT   GTG   GAT   TGG   TTC   TTT   GTC   TAT    120

Asn   Asn   Asp   Val  Asp   Trp   Phe   Phe  Val   Tyr

                   30                           35

AAA   TTG   CCA   GGA   GGG   AAA   TCT   TCA   CAT   CAT    150

Lys   Leu   Pro   Gly   Gly  Lys   Ser   Ser   His   His

                   40                          45

CTT   CTA   CCA   ACT   GCT   GCA   ACA   GAC   TGG   TCA    180

Leu   Leu   Pro   Thr   Ala  Ala   Thr   Asp   Trp   Ser

                   50                          55

GCT   GCA   GCA   GAT   ATA   GAT   GCC   CAA   CAG   CAA    210

Ala   Ala   Ala   Asp  Ile   Asp   Ala   Gln   Gln   Gln

                   60                          65

CCA   ATT   CAT   TCT   ACA   ATG   AAT   ATT   TAT   ATT    240

Pro   Ile   His   Ser  Thr   Met   Asn   Ile   Tyr   Ile

                  70                           75

GGT   TCA   CAA   AAC   AAG   CCC   AAT   ACA   AAT   ATT    270

Gly   Ser   Gln   Asn  Lys   Pro   Asn   Thr   Asn   Ile

                  80                           85

GTA   GCA   TAC   AGC   AAT   TAT   CCT   CCA   CAT   TTT    300

Val   Ala   Tyr   Ser   Asn   Tyr   Pro  Pro   His   Phe

                 90                            95

AAA   TTT   GAA   CTT   CCC   ATG   AGT   CCT   GGA   AAA    330

Lys   Phe   Glu  Leu   Pro   Met  Ser   Pro   Gly   Lys

                 100                         105

GGT   GTA   ATA   ATG   GCT   GAA   GAT   AAT   AAT   AAA    360

Gly   Val   Ile   Met   Ala   Glu   Asp   Asn  Asn   Lys

                  110                          115

GGA   TTT   TGG   TTG   GTA   CAC   ACA   GCA   AAG   TAT    390

Gly   Phe   Trp   Leu  Val   His   Thr   Ala   Lys   Tyr

                 120                           125

TTT   CCA   AAT   TTA   GCA   CTT   GCT   ATA   GGA   GAT    420

Phe   Pro   Asn  Leu   Ala   Leu   Ala   Ile   Gly   Asp

                  130                          135

CTA   TTT   TCG   AAT   GAA   AAG   ACC   ACA   AAG   GAA    450

Leu   Phe   Ser  Asn   Glu   Lys   Thr   Thr  Lys   Glu

                 140                          145

GCA   GCT   GCA   TTT   TTA   TGC   ATG   TCA   TAT   TCT    480

Ala   Ala   Ala  Phe   Leu   Cys   Met   Ser   Tyr   Ser

                  150                          155

GAT   GTC   AAT   TTG   AGG   GCT   ATT   GCA   AAA   ATA    510

Asp   Val   Asn   Leu   Arg  Ala   Ile   Ala   Lys   Ile

                  160                          165

ATC   GAT   TAT   GAA   CAA   CCC   ATC   GTA   TTT   TTT    540

Ile  Asp   Tyr   Glu   Gln   Pro  Ile   Vla   Phe   Phe

                 170                          175

GCT   CAG   AAA   TCT   GCA   ACA   GTA   CCC   GCT   TTC    570

Ala   Gln   Lys   Ser   Ala  Thr   Val   Pro   Ala   Phe

                 180                           185

TAT   GAT   TCA   ACT   GAA   ATT   CAA   AGA   CTC   GTT    600

Tyr   Asp   Ser  Thr   Glu   Ile   Gln   Arg  Leu   Val

                  190                         195

AAT   GGC   TTG   CAT   ACA   TAT   CAG   CCA   ACT   GCA    630

Asn   Gly   Leu  His   Thr   Tyr   Gln   Pro   Thr   Ala

                  200                          205

TCT   GCT   TCT   GGT   GAT   GGC   GTA   GCG   ACT   TTG    660

Ser   Ala   Ser   Gly  Asp   Gly   Val   Ala   Thr   Leu

                 210                           215

ACT   GCA   CCA   GGA   ACT   GTG   AAA   ATA   TTT   GCA    690

Thr   Ala   Pro   Gly  Thr   Val   Lys   Ile   Phe   Ala

                 220                           225

TCA   GCA   CCA   GTA   GCA   TAT   TCA   TCG   GAT   ATA    720

Ser   Ala   Pro   Val   Ala  Tyr   Ser  Ser   Asp   Ile

                  230                        235

TAT   TTG   AAT   TAT   ATC   GTT   AAA   ATT   ATG   CAA    750

Tyr   Leu   Asn   Tyr   Ile  Val   Lys   Ile   Met   Gln

                 240                           245

AAA   TCC   TTC   CAA   GTT   TAC   ACA   CCT   GGA   ACA    780

Lys   Ser   Phe   Gln   Val   Tyr   Thr   Pro   Gly   Thr

                 250                            255

ACT   GCA   ACT   GTT   TTG   AGA   AAA   TCA   TGC   GCT    810

Thr   Ala   Thr   Val  Leu   Arg   Lys   Ser   Cys   Ala

                  260                          265

GGC   ACA   TTA   AAA   GTG   GAA   AAT   GTA   TTA   GGG    840

Gly   Thr   Leu   Lys   Val   Glu  Asn  Val   Leu   Gly

                  270                         275

CCA   ATA   ACT   GTT   AGA   GAT   ACT   GAA   ATT   CCA    870

Pro   Ile   Thr   Val   Arg   Asp   Thr   Glu   Ile  Pro

                 280                            285

ATA   GGA   CAA   GAC   AGT   GCA   AGA   TGG   TCT   GTT    900

Ile   Gly   Gln   Asp   Ser  Ala   Arg   Trp   Ser   Val

                 290                           295

CCG   AAA   TCA   GAT   TCT   GAT   TTC   ATA   TGC   TTA    930

Pro   Lys   Ser   Asp   Ser  Asp   Phe   Ile   Cys   Leu

                 300                           305

AGC   AAT   ACT   GGA   AGA   ACG   GCG   AAA   GAT   GCA    960

Ser   Asn   Thr   Gly  Arg   Thr   Ala   Lys   Asp   Ala

                 310                           315

AAA   TAT   GGA   GCA   AGC   GTT   GCT   TGC   GTT   TTG    990

Lys   Tyr   Gly  Ala   Ser   Val   Ala   Cys    Val  Leu

                  320                           325

AGC   AAA   GAA   GCA   GCT   GAC   TTA   TTC   AGA   AAG    1020

Ser  Lys   Glu   Ala   Ala    Asp   Leu   Phe   Arg   Lys

                  330                          335

ATG   ATC   ACC   ACG   AAG   AAC   TTG   GAT   GCA   TGC    1050

Met   Ile   Thr   Thr   Lys   Ash   Leu   Asp   Ala   Cys

                  340                           345

ACC   TAA   TAT   AAT   TAT   ACT   GTT   TAC   TGT   GCA    1080

Thr

TGT   AAT   TAA   TTT   TGT   GCA   TTG   AAA   AGT   TGG    1110

AAT   CTT   CTT   TGT   AAA   ATT   GAA   AAT   AAA   ATT    1140

TTA   TAA   AAC   ATA   CAA   AAA   AAA   AAA   AAA   AAA    1170

AA   1172

<210>2

<211>347

<212>PRT

<213>旋毛形线虫种(Trichinella spiralis sp.)

<400>2

Met   Phe   Ile   Phe   Tyr   Ala   Ile   Ala   Leu   Tyr

1                        5                            10

Thr   Leu   Gln   Leu   Gly   Val   Thr   Pro   Ile   Asp

                        15                            20

Tyr   Gln   Cys   Lys   Glu   Gln   Asn   Asn   Asp   Val

                        25                            30

Asp   Trp   Phe   Phe   Val   Tyr   Lys   Leu   Pro   Gly

                        35                            40

Gly   Lys   Ser   Ser   His   His   Leu   Leu   Pro   Thr

                        45                            50

Ala   Ala   Thr   Asp   Trp   Ser   Ala   Ala   Ala   Asp

                        55                            60

Ile   Asp   Ala   Gln   Gln   Gln   Pro   Ile   His   Ser

                        65                            70

Thr   Met   Asn   Ile   Tyr   Ile   Gly   Ser   Gln   Asn

                        75                            80

Lys   Pro   Asn   Thr   Asn   Ile   Val   Ala   Tyr   Ser

                       85                            90

Asn   Tyr   Pro   Pro   His   Phe   Lys   Phe   Glu   Leu

                       95                            100

Pro   Met   Ser   Pro   Gly   Lys   Gly   Val   Ile   Met

                        105                           110

Ala   Glu   Asp   Asn   Asn   Lys   Gly   Phe   Trp   Leu

                       115                            120

Val   His   Thr   Ala   Lys   Tyr   Phe   Pro   Asn   Leu

                       125                            130

Ala   Leu   Ala   Ile   Gly   Asp   Leu   Phe   Ser   Asn

                       135                            140

Glu   Lys   Thr   Thr   Lys   Glu   Ala   Ala   Ala   Phe

                       145                           150

Leu   Cys   Met   Ser   Tyr   Ser   Asp   Val   Asn   Leu

                       155                           160

Arg   Ala   Ile   Ala   Lys   Ile   Ile   Asp   Tyr   Glu

                       165                            170

Gln   Pro   Ile   Vla   Phe   Phe   Ala   Gln   Lys   Ser

                        175                          180

Ala   Thr   Val   Pro   Ala   Phe   Tyr   Asp   Ser   Thr

                       185                            190

Glu   Ile   Gln   Arg   Leu   Val   Asn   Gly   Leu   His

                       195                            200

Thr   Tyr   Gln   Pro   Thr   Ala   Ser   Ala   Ser   Gly

                        205                          210

Asp   Gly   Val   Ala   Thr   Leu   Thr   Ala   Pro   Gly

                       215                            220

Thr   Val   Lys   Ile   Phe   Ala   Ser   Ala   Pro   Val

                       225                            230

Ala   Tyr   Ser   Ser   Asp   Ile   Tyr   Leu   Asn   Tyr

                       235                           240

Ile   Val   Lys   Ile   Met   Gln   Lys   Ser   Phe   Gln

                       245                           250

Val   Tyr   Thr   Pro   Gly   Thr   Thr   Ala   Thr   Val

                       255                            260

Leu   Arg   Lys   Ser   Cys   Ala   Gly   Thr   Leu   Lys

                       265                           270

Val   Glu   Asn   Val   Leu   Gly   Pro   Ile   Thr   Val

                       275                            280

Arg   Asp   Thr   Glu   Ile   Pro   Ile   Gly   Gln   Asp

                        285                           290

Ser   Ala   Arg   Trp   Ser   Val   Pro   Lys   Ser   Asp

                       295                            300

Ser   Asp   Phe   Ile   Cys   Leu   Ser   Asn   Thr   Gly

                        305                          310

Arg   Thr   Ala   Lys   Asp   Ala   Lys   Tyr   Gly   Ala

                       315                            320

Ser   Val   Ala   Cys   Val   Leu   Ser   Lys   Glu   Ala

                       325                            330

Ala   Asp   Leu   Phe   Arg   Lys   Met   Ile   Thr   Thr

                       335                           340

Lys   Asn   Leu   Asp   Ala   Cys   Thr

                        345

Claims (9)

1、一种核苷酸序列，其特征在于它是：(A)具有序列1的核苷酸序列；或(B)与序列1互补的核苷酸序列。

2、具有序列2所描述的氨基酸序列的多肽。

3、含有序列1的核苷酸序列的原核或真核表达载体。

4、含有权利要求3的表达载体的遗传工程宿主细胞。

5、含有权利要求2的多肽的药物组合物。

6、权利要求1的核苷酸序列在制备防治人或畜旋毛虫疾病的疫苗或诊断试剂中的应用。

7、权利要求2的多肽在制备防治人或畜旋毛虫疾病的疫苗或诊断试剂中的应用。

8、制备多肽的方法，包括培养权利要求4的宿主细胞，从培养物中纯化多肽。

9、抗权利要求2的多肽的抗体。