CN1142854A

CN1142854A - 基本上不具有激动剂活性的C5a受体拮抗剂

Info

Publication number: CN1142854A
Application number: CN94194914A
Authority: CN
Inventors: J·范奥斯特卢姆; W·C·波亚; N·G·加拉卡托斯; J·V·佩帕
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1993-12-06
Filing date: 1994-11-16
Publication date: 1997-02-12
Also published as: MXPA99008669A; AU698919B2; CA2176825A1; FI962319A; BR9408265A; NO962348D0; HU9601538D0; JPH09506258A; AU8002594A; NZ274917A; WO1995016033A1; FI962319A0; NO962348L; ZA949647B; IL111792A0; EP0733107A1; HUT75990A; TW429262B

Abstract

公开了人C5a的多肽类似物，它是基本上不具有过敏毒素或激动剂活性的C5a受体拮抗剂，以及该类似物的衍生物，该类似物或衍生物的二聚物形式。也提供了编码多肽的DNA分子和制备类似物的方法。含有C5a类似物的药物制剂在治疗学上用于治疗哺乳动物C5a介导疾病或炎症，并且预防学上用来防止或减轻由分别引起炎症或恶化已存在炎症的症状引起的炎症。并进一步公开了C5a类似物，其衍生物，其类似物和衍生物的二聚物的特异性抗体，该抗体基本上不具有与人C5a交叉反应的活性。该抗体被用来检测或定量循环C5a类似物或衍生物，以及调整，例如中和体内C5a受体拮抗剂活性。

Description

基本上不具有激动剂活性的C5a受体拮抗剂

发明领域

本发明涉及免疫学领域，特别涉及哺乳动物补体介导疾病和炎症的治疗。发明背景

炎症是局部保护反应，由损伤引起，用来除灭，稀释或阻塞有害试剂和损伤组织。它包括复杂的一系列反应，包括动脉、毛细管、小静脉的扩张，伴随着增加的血管渗透性，增加的血液流速，和体液及血浆蛋白质的渗出。这些过程经常很快接着白细胞对血管内壁的粘连，接着是细胞流入周围组织。

已证明抗外源物质的主要免疫防御机理的补体系统影响每一构成炎症应答的因子。通常补体包括一套减少组织和血液中微生物和其它抗原的蛋白质。这一任务或者通过单独的补体成分或者通过补体成分与抗体或与表达补体受体的细胞共同作用来完成。更特别地，该系统由大约30种血浆蛋白，其相应的细胞受体和几种膜调节蛋白质组成。Kinoshita，Immunology Today，12：291-300(1991)。补体系统的激活作用，例如抗原-抗体复合物或细菌表面结构对补体系统的激活作用，触发补体成分蛋白酶裂的裂解和装配蛋白发生的放大级联，其最终导致外源抗体的消灭和最终减少。Muller-Eberhard，Annu.Rev.Biochem，57：321-347(1988)。

补体系统激活作用产生几种生物活性肽。含有74个氨基酸且Mr为11000的糖蛋白C5a是由补体的第五成分C5的N-末端通过C5转化酶的蛋白酶解的裂解而产生的。Nilsson等，J.Immunol.114：815-822(1975)。C5a生物性质蔓延急性和慢性炎症过程中所涉及的大量细胞和组织。Hugli，CRC Crit.Rev.Immunol.，1：321-366(1981)。这些性质中的许多是有利于免疫的。已发现C5a介导应答各种病理状态的宿主防御机理。C5a参与一般与炎性反应相关的多种特异生物功能，例如平滑肌收缩，血管渗透性的增强，当注入人皮肤时风块和潮红的产生，组胺由肥大细胞释放，诱发氧化性爆发集落和溶酶体酶自多形核白细胞(PMNLs)释放。C5a刺激来自每种循环白血细胞的可测反应，包括嗜碱性白细胞，嗜酸性细胞，单核细胞和嗜中性白细胞。Hugli，上文；Bautsch等，Immunobiol，185：41-52(1992)。还进一步证明C5a是一潜在的化学引诱物。Fernandez等，J.Immunol.120：109-115(1978)。这种蛋白质是引诱PMNLs如炎性位点噬细胞的中枢刺激物。

当补体定向于抗一合适的靶物如侵入微生物或肿瘤细胞时是有益的，但如果激活不得当，则有明显致病潜力。过敏毒素，例如C5a，在一些炎性疾病如成年人呼吸窘迫综合症和类风湿性关节炎发病机理中作为致病和恶化因子。Bautsch等，Biochem.J.288：261-266(1992)；Haslett等，J.Immunol.142：3510-3517(1989)。特别是，患者体内可检测到组织中C5a的异常存在会引起类风湿性关节炎，骨关节炎，牛皮癣，和非贲门肺水肿。Hammerschmidt，J.Amer.Med.Soc. 244：199-(1980)。已发现C5a是由凭借包括炎性白细胞的募集现象和刺激作用以及抗体产生的加强的增加活性的补体激活产生的主要炎性间介器。参见Mollison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：292-296(1989)。

假设炎症的体内或药理学控制是依赖于趋化性的调制。已认识到有三种抑制作用的水准发生，它们是(1)对趋化性刺激物应答的白细胞的抑制作用；(2)防止化学吸引素产生；和(3)化学吸引素的失活。另外，因为C5a通过与一些人细胞如嗜中性白细胞，嗜酸性白细胞和单核细胞衍生细胞膜中发现的特异C5a受体结合而产生各种功能，C5a介导趋化性的抑制作用，特别是C5a受体拮抗剂的设计已引起相当的关注。

Cleary等人在U.S.4772584中公开了由链球菌A属分离的肽，它通过从C5a C-末端切割六个氨基酸肽来抑制C5a对PMNLs的结合。Hahn在U.S.4692511中公开了C5a的肽受体拮抗剂，它含有必需的核心四肽Tyr-Asp-Gly-Ala(SEQID NO.1)或Asp-Gly-Ala-Tyr(SEQ ID NO.2)，或核心三肽Asp-Gly-Ala，它具有C5a阻断活性。

Abbott Laboratories在U.S.5190922，WO 90/09162和92/11858公开了各种寡肽，其与C5a受体结合并且主旨调整过敏毒素活性。但是，这些分子中的一些被证明保持明显的激动剂活性。参见Mollison等人在Progress in InflammationResearch and Therapy，Birkhauser Verlag，Basel，(1991)，pp.17-21中的“C5a Structural Requirements for Neutrophil Receptor Interaction”，Kawai等，J.Med.Chem.35：220-223(1992)；Kawai等，J.Med.Chem.34：2068-2071(1991)；和Or等J.Med.Chem.35：402-406(1992)。因此非常需要基本上无激动剂活性的有潜力和治疗效果的C5a受体拮抗剂。发明概要

本发明的一个方面涉及人C5a肽类似物，它是C5a受体拮抗剂且基本上不具有过敏毒素和激动剂活性，这种类似物的衍生物，以及类似物及衍生物的二聚体形式。编码肽(即其类似物及其衍生物)的DNA分子，质粒，载体和DNA分子转化的宿主细胞，并且也提供了制备C5a类似物的方法。

含C5a类似物，其衍生物或二聚物的药物制剂被有益地应用在治疗哺乳动物的C5a介导炎性症状和疾病的方法中，并且作为防止这种炎症的预防剂。

本发明的另一方面涉及特异于C5a类似物及其衍生物的抗体，它基本上不具有与人C5a的交叉反应活性。这些抗体被用来检测或计量受治疗者(预先给药相同物质)体内循环C5a类似物和衍生物，以及用来改变，例如中和，体内C5a类似物和衍生物的活件。附图简要说明

图1是说明通过寡核苷酸偶联合成编码人C5a合成基因的流程图；

图2是pB-6/C5a质粒图谱。优选实例的详细说明

本发明C5a肽类似物是基本上不具有激动剂活性的C5a受体拮抗剂。术语“C5a受体”在本领域公知是指C5a，其去ArgC5a降解产物，和本发明拮抗剂与之结合的人血细胞如PMNLs和单核细胞表面上的位点。参见例如U.S.5177190；和Oppermann等，J.Immunol.151(7)：3785-3794(1993)。C5a通过羧肽酶B-类酶在人血清中酶促转化为去ArgC5a，去ArgC5a是人体内主要生理终产物。Chenoweth等，Md.Immunol.17：151-161(1980)。

术语“拮抗剂”是指马上公开的肽是C5a抑制剂。即它们阻碍C5a对C5a受体的结合。尽管不趋向于结合任何特别理论，申请人相信C5a类似物是C5a竞争抑制剂，它们与C5a竞争与C5a受体结合。

本发明C5a类似物的拮抗作用可以以Seligmann等人在Agents and Action21：375-378(1987)中公开的，实施例7详细描述的钙升高测定中的IC₅₀进行定量测定。IC₅₀定义为100pM人C5a攻击剂量后通过拥有C5a受体的PMNLs抑制50％钙离子细胞内活动化的C5a类似物浓度，本发明C5a受体拮抗剂具有Seligmann等公开的钙升高测定中不大于大约2.0×10^-6M的IC₅₀值。

词组“基本上没有过敏毒素活性”或“基本上没有激动剂活性”指C5a类似物(下文与C5a受体拮抗剂交互换使用)与受体的结合没有导致内源信号转导的发生，这种信号最终产生一般与C5a与其受体结合而引起的过敏毒素诱导炎症相关的生理反应如噬细胞激活，平滑肌收缩，血管渗透性增加，炎性介体如组胺，前列腺素，凝血烷，白三烯，白介素(IL)-1，IL-6和IL-8的过量产生。参见Hugli等，CRC Crit，Rev.Immunol.1：321-326(1981)和PCT WO92/10205。这些性质的定量测定也可以应用Seligmann等上文所公开的，并在实施例7中说明的钙升高测定而获得。EC₅₀是激动活性的量度。为本发明目的，EC₅₀是产生最大应答(由相同C5a类似物引起)50％的C5a类似物的浓度。申请人在相同钙升高测定中，在本发明C5a类似物浓度至少是大约8.0×10^-7M，优选至少大约3.0×10^-6M时未检测到激动剂活性。本发明C5a类似物是那些在C5a类似物浓度至少约8.0×10^-7M，且优选至少大约3.0×10^-6M的Seligmann钙升高测定中不能测得EC₅₀的化合物，因为在该测定中不能检测到应答。

C5a是-74氨基酸肽，其序列公开于Fernandez等，J.Biol.Chem.253：6955-6964(1978)。在推导的核酸序列基础上构建的合成基因公开于Mandecki等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 82：3543-3547(1985)和Davidow等人的U.S.4937189。Fernandez公开的C5a氨基酸序列，和Davidow等公开的相应的合成核苷酸序列列于下面表1。

表1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10EcoRI thr leu gln lys lys ile glu glu ile ala

(SEQ. ID. NO. 3)AATTCT ATG ACT CTG CAA AAG AAG ATC GAA GAA ATC GCT

GA TAC TGA GAC GTT TTC TTC TAG CTT CTT TAG CGA

(SEQ. ID. NO. 4)11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23ala lys tyr lys his ser val val lys lys cys cys tyrGCT AAG TAC AAG CAC TCC GTC GTT AAG AAG TGT TGT TACCGA TTC ATG TTC GTG AGG CAG CAA TTC TTC ACA ACA ATG24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36asp gly ala cys val ash ash asp glu thr cys glu glnGAT GGT GCA TGC GTC AAC AAC GAC GAA ACC TGT GAA CAACTA CCA CGT ACG CAG TTG TTG CTG CTT TGG ACA CTT GTT37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49arg ala ala arg ile ser leu gly pro arg cys ile lysCGA GCT GCT CGT ATT TCT CTG GGC CCT CGC TGT ATC AAGGCT CGA CGA GCA TAA AGA GAC CCG GGA GCG ACA TAG TTC50 51 51 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62ala phe thr glu cys cys val val ala ser gln leu argGCT TTC ACT GAA TGT TGT GTT GTC GCT TCC CAA CTG CGCCGA AAG TGA CTT ACA ACA CAA CAG CGA AGG GTT GAC CCG63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74ala asn ile ser his lys asp met gln leu gly arg stop

HindIIIGCT AAC ATT TCT CAC AAG GAC ATG CAA CTC GGC CGC TAA ACGA TTG TAA AGA GTG TTC CTG TAC GTT GAG CCG GCG ATT TTCGA

申请人出人意料地惊奇地发现通过诱变编码C-末端区，即人C5a(下文与“C5a(1-74)”互换使用)的氨基酸64-74合成C5a基因的部分而产生的人C5a的一些类似物，具有与C5a明显不同的性质。即它们具有极好的拮抗性质而基本上没有激动剂活性。特别地，本发明C5a类似物定义在C5a(1-74)C-末端区修饰和突变两个方面中，

N′-Asn-Ile-Ser-His-Lys-Asp-Met-Gln-Leu-

(64)(65)(66)(67)(68)(69)(70)(71)(72)Gly-Arg-C′(SEQ ID NO.5)，(73)(74)(C5a(1-74)的氨基酸64-74)。首先至少截短至Leu(72)；即去除Gly(73)和Arg(74)残基。其次在该区中至少一个半胱氨酸被取代，前提是该肽的末端氨基酸(即C-末端)是半胱氨酸，且C-末端半胱氨酸的巯基(SH)处于还原态(即具有自由巯基)，或处于能自发转化或将要被转化为自由巯基状态。

在一个优选实例中，2至最多6个C-末端氨基酸从C5a(1-74)截短。因此N-末端63氨基酸区保持完整，只有一个半胱氨酸被取代的情况下，各相应实例可以设计如下：C5a(1-72，Leu72Cys)，C5a(1-71，Gln71Cys)，C5a(1-70，Met70Lys)，C5a(1-69，Asp69Cys)和C5a(1-68，Lys68Cys)。在一个更优选的实例中，C-末端被截短为Met70，Gln71或Leu72，包括相应于前三个设计实例。最优选的实例为C5a(1-71，Gln71Cys)。

C-末端区能进一步被在N-末端截短至Lys68，其相应于各设计的实例C5a(1-67，His67Cys)，C5a(1-66，Ser66Cys)，C5a(1-65，Ile65Cys)和C5a(1-64，Asn64Cys)，前提是所得C5a类似物具有上述必需的拮抗剂性质(IC₅₀不大于大约2.0×10^-6M)且基本上不具有过敏毒素或激动剂活性(在至少3.0×10^-6M C5a类似物浓度下不能测得EC₅₀值)。本领域熟练技术人员公知人C5a类似物不包括特异于C5a或C5a受体上位点的抗体。

这里所说明的人C5a类似物的衍生物包括在本发明范围内。这些包括在N-末端63氨基酸区(C5a(1-74)氨基酸1-63)的修饰如点突变，取代，增加和缺失，Carney等，Protein Science 2：1391-1399(1993)，以及如此诱变的C-末端区的进一步氨基酸取代。修饰的类型和程度并不重要，只要所得衍生物保持如上所述的基本上无激动剂活性的C5a受体拮抗性。例如C5a(1-74)N-末端区的Cys27残基可以被改为例如丝氨酸残基，以减少再折叠过程中的重杂性。因此在一更优选实例中，C5a类似物衍生物被设计为C5a(1-71，Cys27Ser，Gln71Cys)。N-末端也可以通过取代或增加变为蛋氨酸，以使C5a类似物编码基因在不同宿主细胞中表达。C-末端区进一步改变的例子是苯基丙氨酸残基取代天然的C5a(1-74)位的组氨酸。因此在最优选实例中，C5a类似物衍生物被设计为C5a(1-71，Cys27Ser，His67Phe，Gln71Cys)。

本发明C5a类似物(此后总起来指其类似物和衍生物)可以通过本领域各种标准方法制备。例如，可以通过直接的化学合成制备，也可以通过于合适宿主细胞中表达编码肽的DNA分子即合成基因而制备。可由C5a类似物氨基酸序列推断的这些DNA分子也可通过已知技术制备。这些DNA可根据Narang，Tetrahedron39：3-22(1983)和EPA 146785；Mandecki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3543-3547(1985)(公开C5a编码基因的化学合成)中公开的进行化学合成。可以化学合成DNA分子片段再酶接。参见Volume 1，Chapter 8 ofCurrent Protocols in Molecular Biology，Ausubel等(Eds)，Wiley，NY(1990)。

编码本发明C5a类似物的DNAs也可以通过编码C5a已知合成的或天然基因的诱变制备，如Fernandez，Mandecki和Davidson所公开的。参见上文Ausubel等，Volum II，Chapter 15 of Maniatis等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；和Mollison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 86：292-296(1989)。而且DNAs可以通过PCR技术制备。PCR Protocols，Innis等(Eds)，Aeademic Press，San Diego，CA(1990)。

编码本发明C5a类似物的DNA分子被操作连接到已知调节序列上，例如启动子，增强子，3’-非翻译序列，和5’翻译序列，例如信号和前导序列，然后根据本领域认可的技术转化到能表达这些基因的宿主细胞中。然后被转化宿主细胞在适于拮抗剂编码基因表达的条件下培养。代表性的宿主细胞包括原核生物如大肠杆菌和芽胞杆菌属，例如枯草芽胞杆菌；真核生物如丝状真菌，例如黑曲霉；酵母，例如酿酒酵母，Pichia pastoris和Yarrowia lipolytica；杆状病毒/昆虫细胞系(Summers等，A Manual of Methods for Baculovirus Vectors andInsect Cell Culture Procedures，Texas Agricultural Experiment Station(1987)；哺乳动物细胞系；和植物(J.Vandekercknove等，Bio/TECHNOLOGY7：929-932(1989)。

C5a在大肠杆菌(E.coli)中的表达方法一般也适合于C5a类似物基因表达。参见Mandecki，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3543-3547(1985)；Mollison等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86：292-296(1989)；和Bautsch等Immunobiol. 185：41-52(1992)。选择合适的调节序列如启动子(例如T7聚合酶，UV5-D，色氨酸或乳糖)，核糖体结合位点，以及含转录终止位点的合适质粒载体，例如pKK223-2，在本领域熟练技术人员水平之内。为优化在E.coli中的表达，应该使用E.coli优选的密码子合成DNA分子，如Guoy等，Nucleic Acids Res. 10：7055-7074(1982)所公开的，并让几个限定内切核酸酶位点易化合成DNA的鉴定和可能的DNA序列的突变。这一研究通过在直接和紧接着肽第一氨基酸三联密码子上游引入蛋白质合成ATG起始密码子而使C5a类似物直接表达。而且缺乏野生型细胞中存在的几种蛋白酶中的一种的E.coli菌株，例如，lon，有利于增加蛋白质产量。Franke等，Meth.Enzymol.162：653-658(1988)。

一般C5a类似物编码基因可根据已知方法在酵母中表达。参见例如Romanos等，Yeast 8：423-488(1992)；Section IV of Goeddel(Ed)，Meth.Enzymol. 185：231-484(1990)；Davidow等，上文，和U.S.4775622。为优化在酵母中的表达，应该使用酵母优选密码子制备DNA分子，特别要避免内源KEX2蛋白酶靶物的Arg-Arg对。使用与蛋氨酸相对的谷氨酰胺为N-末端，有利于从信号序列例如α-因子信号序列的蛋白水解裂解。进一步优选消除任何潜在糖基化位点，如本发明C5a受体拮抗剂各实例的64位的天冬氨酰。

本发明C5a类似物编码基因在哺乳动物细胞中的表达可根据已知方法进行。参见Maniatis等上文中“Expression of Cloned Genes in MammalianCells”中的第16章。在人细胞中表达的有代表性的方法公开于Berg等，Bio/Techniques 14(6)：972-978(1993)。合适的人细胞包括公众可得到的细胞系如HeLA 3(ATCC CCL 2.2)和HEK 293(ATCC CRL 1573)。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达公开于，例如，Asselbergs等，Fibrinolysis7：1-14(1993)。合适的卵巢细胞系包括CHO-K1(ATCC CCL 61)，BHK(ATCC CRL 6281)，BHK-21(ATCC 6281，CCL 10和CRL 8544)。有代表性的猴细胞是CV-1(ATCC CCL70)，COS-7(ATCC CRL1650)，和VERO细胞(ATCC CCL 81)。合适的鼠细胞系是C127(ATCC1804)。优选的细胞系是二氢叶酸还原酶-阴性CHO(DHFR-minus CHO)细胞系，公开于Uriaub等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77：4216-4220(1980)。非血清依赖细胞系是更优选的。参见Kurano等，Bio/Technology 16：245-258(1990)。在哺乳动物宿主中可生产糖基化或非糖基化形式的C5a类似物。

将由转化大肠杆菌细胞分离的C5a类似物复性以保证生物活性，其中C-末端半胱氨酸是还原态的，即其含有一自由巯基，优选使用常规一步法。申请人不可预料地发现以还原剂对氧化剂摩尔比为至少约100∶1至约500∶1，用氧化还原对处理改性C5a类似物会产生有还原态C-末端半胱氨酸的生物活性的C5a类似物。这一比例比已知比例(还原巯基与氧化巯基化合物优选比例10∶1公开于Builder等U.S.4620948第17栏第43-45行)大大约10倍至大约50倍。根据这一方法，转化的大肠杆菌细胞在足以引起C5a类似物产生的条件下培养后，与变性和增溶剂例如6M盐酸胍混合，生产变性的C5a类似物，优选进一步用已知技术如超声处理进行破裂，French Press或DynoMill。然后如此混合或如此破裂的含有改性C5a类似物的细胞与氧化还原对按还原剂/氧化剂重量的摩尔比至少大约100∶1至大约500∶1，在合适条件下生产复性的，生物活性的C5a类似物。合适的氧化还原对包括半胱氨酸/胱氨酸和还原的谷胱甘肽/氧化的谷胱甘肽。也可以使用其它本领域熟知适合的氧化还原对。优选谷胱甘肽氧化还原对。其它合适的条件包括pH6.5至7.5，优选7.4。让混合物在室温放置足够得到最大蛋白质产量的一段时间。优选时间为大约1/2小时至大约4小时。因此，这种方法不需要从细菌细胞中分离折射的包涵体(即被表达蛋白的不溶质)，然后还原C-末端半胱氨酸的巯基。

或者，可以根据如Builder等U.S.4620948中所公开的标准再折叠和纯化方法将C5a类似物复性，例如，根据这些方法，C-末端半胱氨酸将是加合物形式，例如Cys-Cys，或Cys-谷胱甘肽。因此，该加合物必须被进一步还原得到自由巯基。申请人发现这种公开的C5a类似物的加合物也象C5a受体拮抗剂一样起作用，其基本上不具有这里所定义的激动剂活性，因此包括在本发明范围中。但如果使用标准复性技术，需要进一步的还原作用制备优选实例。

复性后，C5a类似物可以被纯化至所需程度。有代表性的纯化方法包括超滤，渗滤，凝胶电泳，色谱方法，如离子交换色谱，颗粒排阻色谱法，HPLC，反相HPLC，用葡聚糖凝胶处理，透析，亲和层析等。本领域熟练技术人员会理解能结合使用这些纯化方法。

具有C-末端半胱氨酸残基的C5a类似物可以根据标准技术被氧化生成二聚体。为制备这种二聚体，各单体(类似物)的C-末端半胱氨酸的巯基(-SH)被氧化生成二硫键。均二聚体和杂二聚体都包括在术语“二聚体”中。

本发明C5a类似物和二聚体在治疗和预防有害症状或疾病中是有用的，其中涉及补体系统，特别是C5a和过敏毒素。当对面临C5a介导组织损伤和死亡的高危的任何哺乳动物患者，尤其是人给药时，它们在治疗上是最有效的。一般这些症状和疾病如炎症疾病其中C5a是通过血清中蛋白水解而产生的。响应于C5a类似物治疗的有代表性的疾病包括肺炎，成年人呼吸窘迫综合症(ARDS)；自发性肺纤维化，肺炎或肺损伤，慢性进行性肺双囊纤维化、棉屑肺，石棉引发的炎症，心肌梗塞，心肌梗塞后的炎症，局部缺血心损伤，肝硬变，原发性胆汁性肝硬变炎症，慢性肝炎，胰腺炎，出血性胰腺炎，炎性肠炎，结肠炎，局部缺血性脑损伤，脑炎，脑膜炎中的颅神经损伤，脑膜炎，眼色素层炎，普尔夏氏视网膜病，免疫复合物介导肾小球性肾炎，肾皮质坏死症，痛风，脉管炎，血清病，血管水肿，重症肌无力，全身性红斑狼疮，类风湿性关节炎，大疱性皮肤病，过敏性，牛皮癣，内毒素休克，脓毒症，严重外伤或烧伤。它们也可以在治疗学上用来治疗移植物排斥的患者，治疗接受免疫抑制治疗的患者或大量输血的患者，治疗那些建议药物疗法的患者，治疗血液透析和白细胞除去法后有肺功能障碍的患者。

本发明类似物和二聚物进一步具有作为预防剂的应用于医疗，特别是预防再灌注例如局部缺血后再灌注和循环接触药物方法而引起的疾病，以及防止移植物排斥现象。在这种情况下，在已知引发炎症或使已有炎症恶化的症状之前或基本上同时适当地施用C5a类似物。

本发明C5a类似物和其二聚物可通过蛋白质药物任何治疗有效途径给药，例如非经肠，鼻内，直肠或口腔含化，以含有常规无毒药用载体，辅剂和所期望的载体的剂量单位制剂给药。术语“非经肠”包括如皮下，静脉内，肌内，胸骨内的，动脉内注射和输注技术的给药方式。

本发明C5a类似物(和二聚体)的剂量可以改变以实现针对个别病人的满意的治疗效果。这将决定于例如个别拮抗剂的活性，给药方式，要治疗疾病的严重程度，以及患者的药物条件。确定给定疾病和患者的治疗有效剂量在本领域熟练技术人员的水平之内。通常，对哺乳动物宿主的日给药量为每天大约每公斤体重给药1μg至100mg的剂量水平。优选每天大约0.1mg/kg至大约20mg/kg体重的剂量水平范围。C5a类似物作为单一连续剂量长期时间周期对患者给药，但是，如果需要，总有效剂量可以分成多种剂量，例如每天2至4分开剂量。

本发明C5a类似物(和二聚体)可以用已知药用成分和制剂方法配制成组合物。参见例如Remington等，Pharmaceutical Science，15 th Ed.，Mack Pub.(Easton，PA)(1975)。非经肠给药合适的组合物包括药用无菌水溶液或非水溶液，分散剂，悬浮剂或乳液，以及仅在使用前再溶解成无菌可注射液或分散剂的无菌粉末。合适的含水和非水载体，稀释剂，溶剂或载剂代表性例子包括水，乙醇，多元醇，例如甘油，丙二醇，聚乙二醇，和其合适的混合物，蔬菜油，例如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。可以用各种方法保持流度，包括使用包衣材料如卵磷酯，所需颗粒大小的保持(分散剂的情况)，和表面活性剂。

本发明组合物也可以含有助剂，如保鲜剂，湿润剂，乳化剂，分散剂，抗细菌和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚和山梨酸，等渗剂如糖，氯化钠或延迟吸收剂如一硬脂酸铝和明胶。本发明受体拮抗剂也可以混合到缓慢或持续释放或靶向释放系统如聚合物基质，脂质体，和微球剂中。

可通过多种方法对注射制剂消毒，包括通过细菌截留过滤器的过滤作用，或通过使用之前混入能溶解或分散于无菌水或其它无菌注射基质中的消毒固体组合物形式的消毒剂。

除C5a类似物和任何其它活性成分外，悬浮液可以含有悬浮剂如乙氧基化异硬脂基醇，聚氧乙烯山梨醇和山梨酯，微晶纤维素，偏氢氧化铝，膨润土，琼脂，黄蓍胶和其混合物。

直肠或阴道给药的组合物一般是栓剂形式，它可以通过混合本发明肽和合适的非刺激赋形剂或载体如可可脂，聚乙二醇或室温下是固体但体温时是液体的栓剂蜡混合，因此在直肠或阴道腔内溶化并释放受体拮抗剂。

眼科制剂，眼用软膏，粉末和溶液也包括在本发明范围内。

可以根据标准技术制备本发明C5a类似物和二聚物的特异性多克隆和单克隆抗体。通过注射C5a类似物-载体蛋白质结合物到动物，例如兔，山羊，绵羊或马中，产生抗C5a类似物抗体来产生多克隆抗体。参见，例如A.Johnstone和R.Thorpe，Immunochemistry in Practice，Blackwell Scientific Publications.Oxford(1982)。根据公开于Kohler和Milstein，Nature 256：495-97(1975)中公开的技术，可以制备本发明C5a类似物的特异性单克隆抗体。也参见Peters，J.H.，(eds)Monodonal Antibodies，Springer Verlag Berlin，Heidelberg，Germany(1992)。这些C5a类似物的特异性多克隆和单克隆抗体也基本上不具有与人C5a交叉反应活性。术语“基本上不具有交叉反应活性”指抗C5a类似物抗体具有非常低(可忽略)的与人C5a的交叉反应活性，因此本发明C5a类似物测定在生物样品中检测不到内源产生的C5a的干扰。

本发明C5a类似物特异性抗体特别用于检测和定量事先用相同C5a类似物给药的受治疗者体内的循环C5a类似物以及调整，例如，中和，循环C5a类似物的活性。能根据应用抗体的标准免疫技术测定循环C5a类似物。通常由受治疗者身上采取体液或组织样品，然后在适合使类似物和抗体之间可检测地生成免疫复合物的条件下，与对受治疗者给药的那种C5a类似物的特异性抗体反应。这种免疫复合物的生成表示样品中存在这种类似物。优选在该种测定中使用血浆或血清样品。但是也可以使用象例如PMNL’s某些血细胞组织。可以用本领域公知的各种方法测定反应的存在和/或反应程度，例如放射免疫测定法，酶免疫测定法，荧光免疫测定法，荧光显微术等等。适合的定性和定量免疫测定方法公开于J.Butler，Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay，CRC Press(1991)。

检测循环C5a类似物的测定一般用来监控治疗期间类似物的水平。另外，本发明抗体能有益地用于药物组合物，来调整或中和循环C5a类似物的活性。所用抗体的量将是类似物给药量的等摩尔量。可以对受治疗者非经肠给药本发明组合物。在急症情况下，静脉内给药是特别优选的。该抗体可以与药用赋形剂，如盐水或Ringer’s溶液一起配制成可注射形式单位剂量。

本发明将参照下面详细的实施例做进一步的说明。提供这些实施例只为说明的目的，除非其他说明并不起限制作用。实施例1编码人C5a的基因合成

人C5a基因用寡核苷酸偶联而合成，这种合成基因的密码子使用为大肠杆菌中最佳表达设计。合成方法在图1中说明。它需要聚合5个N-末端残基由Thr变为Met的片段，因为AUG密码子比任何其它的密码子能给出更高的翻译起始频率。片段1编码SD序列和合成基因的ATG起始密码子。片段2-5编码C5a基因。寡核苷酸的合成：寡核苷酸通过固相亚磷酰胺方法在Gene Assembler(Pharmacia)上合成。通过用浓NH₄OH在55℃保温16小时，将全部的合成的寡核苷酸从固相载体上切割下来并去保护。然后寡核苷酸用制备凝胶电泳纯化。所用内烯酰胺浓度从寡核苷酸长度多于70个碱基时的10％至长度少于40个碱基寡核苷酸时的20％间变化。寡核苷酸在紫外灯下可见，并且从凝胶上切除主要的高分子量片段。胶条在试管中用玻璃棒破碎，并通过在3.0ml 0.1M，pH7.5的碳酸氢三乙胺(TEAB)中在37℃保温16小时提取DNA。

用离心法去除凝胶残余物，在SepPak C-18柱(Waters Associates)上进行色谱分离寡核苷酸。用10ml乙腈，5ml含30％乙腈的50mM TEAB和10ml25mM TEAB连续洗涤，将柱预平衡。将寡核苷酸上柱，用10ml 25mM TEAB冲洗，并用5ml含50％乙腈的35.5mM TEAB从柱上洗脱。收集级分，在260nm吸收测定的含寡核苷酸的样品在真空离心蒸发浓缩器(SpeedVac)(Savant)中干燥。寡核苷酸退火和偶联：退火前，每一寡核苷酸在5’端磷酸化。激酶反应混合物含有1μg寡核苷酸，总体积为40μl，含12mM MgCl₂，1mM DTT(二硫苏糖醇)和2mM ATP的77mM pH7.5的TRIS。通过加入10单位T4多聚核苷酸激酶起动反应，并使其在37℃进行40分钟。向每一激酶反应中加入10μl无菌水并加入48μl互补寡核苷酸，在加热器中在78℃混合并放置。关闭加热器，使混合物冷却至30℃。然后样品再放于第二加热器中在68℃加热器分钟，再关闭加热器，使混合物冷却至26℃。退火的基因片段用来在噬菌体M13mp18(NewEngland Biolabs)中装配基因。在M13mp18中装配C5a编码基因的策略需要三个连接反应循环。

合适的基因片段连接到M13mp18的每一连接反应后，用连接的M13 DNA转化大肠杆菌JM101。由重组体克隆分离M13噬菌体后进行构建的序列分析。最终C5a被克隆到M13mp18中，得到M13mp18/C5a(1-74)。接着C5a(1-74)基因亚克隆到pB-6载体上得pB-6/C5a(1-74)，其中pB-6载体由质粒pTZ19R和pKK223-3衍生(两者皆购自Pharmacia)，参见图2。实施例2C5a基因的定点诱变

使用寡核苷酸体外诱变系统方法2(Amersham)，含M13mp18/C5a(1-74)和诱变寡核苷酸的C5a的单链DNA，进行定点诱变。按照生产者提供的方法，用诱变寡核苷酸ACGGTGCTTCTGTTAACA(SEQ ID NO.6)进行C5a中Cys27Ser突变。用双脱氧DNA序列测定分析4块噬斑确定正确的Cys27Ser突变。由正确突变体克隆中的一个分离双链DNA并且PstI和BamHI限制酶切。含有突变的230bp片段亚克隆到pB-6载体上。所得质粒pB-6/C5a(1-74，C27S)，再通过双脱氧方法测定序列以证明突变。实施例3C5a基因的盒式诱变

用EcoRI和HindIII限制酶切质粒pB-6/C5a(1-74，C27S)或pB-6/C5a(1-74)，并在也用相同酶限制酶切的载体pWCB中亚克隆，分别得到含编码C5a(1-74，C27S)基因的质粒pWCB112，和含编码C5a(1-74)基因的pWCB100。然后这些质粒用于盒式诱变中制备一系列新基因。用于盒式诱变的寡核苷酸用Applied Biosystems 381A DNA合成仪，根据生产商的指导，用固相亚磷酰胺化学法制备。

含大约60μg pWCB112的10μl TE与6μl 60U PVvu和3μl 60UHindHI(New England Biolabs)和10μl 10×高盐缓冲液(1M NaCl，0.5M Tris/HCl，pH7.5，0.01M MgCl₂，10mM DTT)和71μl ddH₂O，总体积100μl的溶液混合。该溶液在37℃保温16小时。这样线性化的大约4.5kb的载体通过使用1％琼脂糖凝胶的制备电泳纯化，接着由切除的琼脂糖凝胶切条上电洗脱DNA片段。回收的DNA片段转移到Eppendorf试管中，加入1ml无水乙醇，该试管在微量离心机中以14000rpm离心10分钟。真空干燥DNA沉淀，接着将其溶解于40μl TE缓冲液(pH7.4的10mM Tris，HCl，含1mMEDTA)，得pWCB112/A。

单链寡核苷酸35bp-序列，

5’CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCTA3’(SEQ ID NO.7)。和39bp-序列5’AGCTTAGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG3，(SEQ ID NO.8)，用制备电泳在8％聚丙烯酰胺凝胶上纯化。电泳后用紫外灯照射显示寡核苷酸，并且将合适的片段从凝胶上切割下来。凝胶切片在一试管中用玻璃棒破碎，通过在pH7.5的3.0ml 0.1M TEAB缓冲液中在37℃保温16小时提取DNA。离心去除凝胶残留物，并通过在SepPak C-18柱(WatersAssociates)上进行色谱分离寡核苷酸。用10ml乙腈，5ml含35％乙腈的50mMTEAB和10ml 25mM TEAB连续冲洗将柱子预平衡。将寡核苷酸上柱，用10ml25mM TEAB冲洗，用5ml含50％乙腈的35.5mM TEAB从柱中洗脱。

收集级分，在260nM吸收测定的含寡核苷酸的那些级分在真空离心蒸发浓缩器中(Savant)干燥。通过混合等量的每种核苷酸和含有含0.01m MgCl₂的0.05MTris/HCl，pH7.6的Klenow缓冲液，将样品在95℃加热10分钟，然后在2小时期间内冷却至室温，实现35和39bp寡核苷酸退火生成双链DNA，连接到限制载体pWCB112/A中。使用载体3倍过量的插入片段，用1μl，2U T4 DNA；连接酶(BRL)将双链DNA连接到限制的载体pWCB112上。反应在4℃进行17个小时。

应用基本上相同的技术，只是使用不同的寡核苷酸，以及或者pWCB100或pWCB112，制备多种分子。列于下文的表2。表2由C5a(1-74)或C5a(1-74，C27S)基因的盒式诱变制备的C5a类似物。C5a类似物编号使用的寡核苷酸序列和被编码的C5a类似物1. C5a(1-64，C27S，N64C)

CTGCGTGCTTGCTA(SEQ.ID.NO.9)

AGCTTAGCAAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.10)2. C5a(1-65，C27S，I65C)

CTGCGTGCTAACTGCTA(SEQ.ID.NO.11)

AGTTAGCAGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.12)3. C5a(1-66，C27S，S66C)

CTGCGTGCTAACATCTGCTA(SEQ.ID.NO.13)

AGCTTAGCAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.14)4. C5a(1-67，C27S，H67C)

CTGCGTGCTAACATCTCTTGCTA(SEQ.ID.NO.15)

AGCTTAGCAAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.16)5. C5a(1-68，C27S，K68C)

CTGCGTGCTAACATCTCTCACTGCTA(SEQ.ID.NO.17)

AGCTTAGCAGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.18)6. C5a(1-69，C27S，D69C)

CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAATGCTA(SEQ.ID.NO.19)

AGCTTAGCATTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.20)7. C5a(1-70，C27S，M70C)

CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACTGCTA(SEQ.ID.NO.21)

AGCTTAGCAGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.22)8. C5a(1-71，C27S，Q71C)

CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCTA(SEQ.ID.NO.23)AGCTTAGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.24)9. C5a(1-72，C27S，L72C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCAATGCTA(SEQ.ID.NO.25)AGCTTAGCATTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ ID.NO.26)10. C5a(1-73，C27S，G73C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCAACTGTGCTAS(SEQ.ID.NO.27)

AGCTTAGCACAGTTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.28)11. C5a(1-74，C27S，Q71C)

CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCCTGGGTCGTTA(SEQ.ID.NO.29)AGCTTAACGACCCAGGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.30)12. C5a(1-73，C27S，Q71C)

CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCCTGGGTTA(SEQ.ID.NO.31)

AGCTTAACCCAGGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.32)13. C5a(1-72，C27S，Q71C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCCTGTA(SEQ.ID.NO.33)AGCTTACAGGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.34)14. C5a(1-74，R74C)CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCAACTGGGTTGCTA(SEQ.ID.NO.35)AGCTTAGCAACCCAGTTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.36)15. C5a (1-71，C27S)

CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCAATA(SEQ.ID.NO.37)AGCTTATTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.38)16. C5a(1-71，C27S，Q71D)

CTGCGTCCTAACATCTCTCACAAAGACATGGACTA(SEQ.ID.NO.39)AGCTTAGTCCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.40)17. C5a(1-71，C27S，Q71S)

CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTCTTA(SEQ.ID.NO.41)AGCTTAAGACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.42)18. C5a(1-71，C27S，Q71H)

CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCACTA(SEQ.ID.NO.43)AGCTTAGTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.44)19. C5a(1-71，C27S，Q71R)

CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCGTTA(SEQ.ID.NO.45)AGCTTAACGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.46)20. C5a(1-71，C27S，Q71L)

CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCTGTA(SEQ.ID.NO.47)AGCTTACAGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.48)21. C5a(1-71，C27S，H67F，Q71C)

CTGCGTGCTAACATCTCTTTCAAAGACATGTGCTA(SEQ.ID.NO.49)

AGCTTAGCACATGTCTTTGAAAGAGATGTTAGCACGCAG(SEQ.ID.NO.50)

类似物10-20是激动剂，不在本发明范围中。它们是为了对比的目的。类似物No.8二聚物形式的制备在下文实施例5c中进行了说明。它被称为类似物No.22。

编码C5a类似物No.21多核苷酸的完整核苷酸序列列于下面表3。表3

GAA-TTC-CCA-CTC-AAA-ATA-AGG-AGG-AAA-AAA-AA

ECOR1

ATG-CTG-CAG-AAG-AAA-ATC-GAA-GAA-ATC-GCT

START

GCT-AAG-TAC-AAA-CAC-TCT-GTT-GTT-AAA-AAA

TGC-TGC-TAC-GAC-GGT-GCT-TCT-GTT-AAC-AAC

HPA1

GAC-GAA-ACT-TGC-GAA-CAG-CGT-GCT-GCT-CGT

ATC-TCT-CTG-GGC-CCG-CGT-TGC-ATC-AAA-GCA

APA1

TTC-ACT-GAA-TGC-TGC-GTT-GTT-GCT-TCT-CAG

PVU11

CTG-CGT-GCT-AAC-ATC-TCT-TTC-AAA-GAC-ATG

TGC-TAA-GCT-T(SEQ.ID.NO.51)

HIND111

但本领域熟练技术人员懂得，由于基因编码的简并性，能制得很多多核苷酸编码相同的C5a类似物。参见例如Watson等，Recombinant DNA，2nd Ed.，Freeman，N.Y.(1993)。实施例4C5a和C5a类似物在大肠杆菌中的表达

为进行表达，表1所列C5a类似物的合成基因亚克隆到pWCB载体上，pWCB是改变的表达载体pKK223-3(Pharmacia)，其BamHI位点缺失且PvuII位点变为PvuI位点，并含有异丙基-硫-β-D-半乳糖(IPTG)诱导的tac/启动子，和氨苄青霉素抗性基因。大肠杆菌菌株LCIQ是公开于Goff等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 81：6647-6651(1984)中的菌株LC137(lon，htpR)的衍生物。其含有来自DH5αF’IQ(BRU实验室)编码lacIQ的F’因子，并且是表达质粒的宿主。含有合适表达质粒的E.coli LCIQ在30℃在LB肉汤中生长，直至达到OD₅₅₀为1。用2.5mM终浓度的IPTG将培养物诱导3小时。离心收集细胞在使用前在-80℃下保存。实施例5aC5a和C5a类似物的重折叠和纯化

实施例4的冷冻E.coli细胞糊状物等份在含6M盐酸胍的缓冲液(5∶1 v∶w，缓冲液∶细胞糊状物)中解冻之后，从其中分离重组蛋白质。然后超声处理使细胞破碎，产物用含有或者1mM半胱氨酸和1mM脱氨酸或1mM还原/氧化谷胱甘肽的pH8.0，50mM Tris/HCl缓冲液透析过夜以促进复性作用。然后透析液通过加入6N HCl酸化至pH3。离心去除沉淀物，上清液在100，15微米，DeltaPak C18，反相HPLC柱(Waters)上，用存在0.1％TFA的水中的25％至35％乙腈的线性梯度纯化30分钟，在大约28％乙腈处由柱上洗脱出主要洗脱峰，收集并冻干。该级分含有重组C5a类似物的谷胱甘肽加合物(表中类似物5、7、8、9和21的加合物)，或C5a类似物的半胱氨酸加合物(表1中类似物No.8的加合物)。

大约0.002mmol C5a类似物半胱氨酸加合物的基因产物溶解在50ml pH7.4的Tris缓冲液中。加入0.02mmol DTT。4小时后，大约80％C-末端Cys-Cys连接被转化为自由的半胱氨酸，并在C4，15微米，300，反相柱(Alltech)上用存在0.1％ TFA的水中的25至35％乙腈线性梯度纯化产物30分钟。冻干在大约29％乙腈处洗脱的含有产物的级分，然后在真空干燥下在4℃储存。实施例5bC5a和C5a类似物的重折叠和纯化

实施例4的冷冻细胞E.coli糊状物等份在含有6M盐酸胍的缓冲液(5∶1 v∶w，缓冲液∶细胞糊状物)中解冻后，从其中分离重组蛋白质。然后通过超声作用将细胞破碎，产物用含有1mM还原的/0.01mM氧化的谷胱甘肽的pH7.4，100mM Tris/HCl缓冲液稀释20倍。4小时后，溶液通过加入6N HCl，酸化至pH3。离心去除沉淀物，上清液在100，15微米DeltaPak C18，反相柱(Waters)上，用存在0.1％ TFA的25至35％乙腈的线性梯度纯化30分钟。收集在大约30％乙腈处由柱上出来的主要洗脱峰，并冻干。这样分离的C5a类似物具有含还原的巯基的C-末端半胱氨酸。实施例5c生成C5a类似物的二聚物

在其C末端区含有游离巯基的C5a类似物从单体形式转变为二聚体形式。

根据实施例5b，用溶解在pH7.4，100mM Tris/HCl中的1mM还原的/0.01mM氧化的谷胱甘肽混合物，使实施例4从冷冻的E.coli糊状物等份分离重组体蛋白质重折叠。4小时后，加入6N HCl将溶液酸化至pH3。离心去除所得沉淀物，上清液吸收在用pH7.0，25mM缓冲液平衡的SP-Spherodex离子交换柱上。用pH7.0，25mM Tris冲洗柱子后，用含0.75M NaCl的pH7.0，25mMTris将C5a类似物从柱上洗脱下来。将部分纯化的C5a类似物用甲酸调至pH3.0，用蒸馏水稀释，得到传导率为大约45mS/cm的蛋白质溶液，并将其吸收在用含有0.6M NaCl，pH3.5，50mM甲酸平衡过的SP-High Performance离子交换柱上。用pH3.5，50mM甲酸缓冲液中0.6-1.0M NaCl线性梯度将C5a类似物从柱上洗脱下来。收集在大约0.725M NaCl处从柱上洗脱的主峰。这样分离的C5a类似物具有含还原的巯基的C-末端半胱氨酸。用25％氨水溶液调节pH7.0，并储存该溶液，使分子转化为其二聚物形式。pH7.0，蛋白质浓度大约0.3-0.6mg/ml并在4-8℃储存，转化作用至少是80％，在两天内完成。C5a类似物的二聚物形式最终在DeltaPak C18，100，15微米，反相HPLC柱(Waters)上，用存在0.1％ TFA的25％至40％乙腈线性梯度纯化30分钟。收集在大约33％乙腈处的柱的主要洗脱峰并冻干。这样得到的分子是E.coli表达系统制备的C5a类似物的二聚物。实施例6受体结合测定

进行试验测定C5a和C5a受体拮抗剂对C5a受体的亲和性。按照Rollins等，J.Biol.Chem.263：520-526(1988)的说明，并根据Braunwalder等，Mol.Immunol.29(11)，1319-1324(1992)中说明的进行改进的方法测定[125I]BH-标记的C5a与PMNL膜的结合，[125I]BH-标记的C5a按照Harris等，J.Receptor Res.11：115-128(1991)的描述制备。PMNLs重新悬浮于Hanks平衡盐溶液中，该溶液中无Ca⁺⁺和Mg⁺⁺，且含有pH7.3，10mM HEPES，2.5mM MgCl₂，100单位/ml DNAse，0.1mM PMSF，10μg/ml抑蛋白酶肽(aprotonin)和10μg/ml亮抑蛋白酶肽(leupeptin)，然后在氮气涡流容器(nitrogen cavitation bomb)中在100psi，4℃平稳20分钟。抽到含25mMEDTA和上述蛋白酶抑制剂的3体积0.5M KHCO₃中后，用镊子去除胶状材料并将混合物以400xg在4℃离心10分钟。所得上清液以50000xg在4℃离心60分钟。将由代表200×10⁶个细胞等份中得到的沉淀在-70℃保存。为进行结合研究，这些膜以20×10⁶个细胞/ml当量再悬浮于含1mM CaCl₂，5mM MgCl₂，0.1mM PMSF，0.1％杆菌肽和0.5％ BSA的pH7.3，50mM HEPES中，用相同缓冲液再稀释1∶75后，向含有50μl[125I]BH-C5a(比放射性2200Ci/mmol，终浓度4.0PM)，和50μl缓冲液或C5a类似物的一式二份试验试管中加入400μl这种悬浮液，在各种浓度下测定抑制剂性质。

在10mM未标记C5a存在下测定非特异结合。加入PMNL膜起动结合反应，并在4℃持续120分钟。通过使用Cell Harvester(Brandel，Gaithersburg，MD)，过0.05％ PEI(聚乙烯亚胺)预处理90分钟的GF/C玻璃纤维滤膜(Whatman)的真空过滤作用被分离开被结合的和未被结合的放射活性。用3×5ml pH7.4冰冷却的5mM Tris缓冲液冲洗滤膜，并在多孔Gamma计数器(Genesys)上计数。用非线性回归方法，RS/1(Bolt，Beranek and Newman，Boston)分析数据，并用IC₅₀值表达。按照应用Cheng-Presoff等式以Ki值的形式给出下面表4中的结果。参见上文Braunwalder等人的文献。表4C5a类似物受体结合研究

C5a类似物受体结合

Ki(nM)

9谷胱甘肽 1.85

8谷胱甘肽 1.7

7谷胱甘肽 7.2

8Cys 2.8

9 0.9

8 0.2

7 0.4

15^* 3.0

16^* 8.5

17^* 7.5

18^* 0.15

19^* 0.35

20^* 0.035

21 0.1

22 0.04

C5a 0.0035^*＝激动剂；左栏中序号指表1中的序号。

这些结果证明本发明C5a类似物用纳摩尔Kis竞争性地取代了野生型C5a。本发明C5a类似物具有对C5a受体的亲和性，如在上文Braunwalder等人文献中公开的竞争性取代测定中测定的Ki少于大约1.0×10^-8M，优选少于大约2.0×10^-9M，且更优选小于大约1.0×10^-10M(应用放射配体，[125I]Bolton-Hunter标记的C5a)。实施例7C5a诱导Ca⁺⁺升高

重组体人C5a溶解在含0.01％ Tween-20的Hanks缓冲液中，并在这种缓冲液中制备所有的C5a储存稀释剂。fura-2的乙酸甲酯(fura 2AM，MolecularProbes)溶解在DMSO中。嗜中性白细胞通过在6％ hetastarch(HESPAN，Dupont，Waukegan，IL)中沉降从人外周血中纯化出来，然后进行对流淘析，如Chapman-Kirkland等，J.Immunol.Meth. 142：95-104(1991)中所说明的。纯化的细胞(2×10⁶/m)与0.2μM fura-2AM混合，并在没有钙或镁的HEPES缓冲的Hanks溶液中在37℃保温30分钟。测定前15分钟，将细胞悬浮液转移到带搅拌棒的弯管中并加入1mM的钙。搅拌下将细胞悬浮液在37℃保温。细胞纯化5小时内终止测定，并且周期性地获得标准受控应答，以确保在实验期间细胞应答不发生变化。用SLM 8000分光荧光计(SLM-Aminco Instruments，Urbana，IL)测定荧光量。将弯管放于荧光仪中，得到10秒基线后，加入将要测定其拮抗剂性质的C5a受体拮抗剂，测定340nm/380nm(510nm发射)荧光激发比的任何变化。加入类似物后40秒，加入攻击剂量的C5a至100pM终浓度，测定激发比产生的变化。

IC₅₀值作为拮抗剂效力的量度。这些值被定义为减少50％的100pMC5a攻击剂量的钙上升反应所需的C5a类似物的浓度。EC₅₀值用作激动剂效力的量度。EC₅₀被定义为引起减少50％由类似物产生的最大钙上升反应的C5a类似物的浓度。结果引于下面表5。表5对C5a类似物C5a诱导的钙上升的研究类似物钙上升(nm)

IC₅₀ EC₅₀

(拮抗剂) (激动剂)9谷胱甘肽 1000 NM(测得)8谷胱甘肽 2000 NM7谷胱甘肽 2000 NM8半胱氨酸 105 NM9 43 NM8 14 NM7 54 NM15 NM 9016 NM 31017 NM 12018 NM 15019 NM 4020 NM 7521 6 NM22 10 NMC5a NM 0.07

C5a类似物No.7被试验至浓度为1.0×10⁶M。C5a类似物No.8被试验至浓度为3.0×10^-6M，类似物No.9被试验至浓度为1.5×10⁶M，类似物No.21被试验到浓度为8.0×10^-7M。在所有情况下都没有测得激动剂活性。上面表2中统一分析的结果证明本发明类似物作为C5a竞争性抑制剂起作用。证明本发明类似物C-末端应该是未复合的半胱氨酸残基或通过二硫键与另一本发明C5a类似物复合的半胱氨酸残基，才能实现最高效力。实施例8兔皮肤炎症模型

在雄性重2.5-3.0kg的新西兰白兔身上进行所有实验。将兔背部的毛刮净，用不同颜色标记指明40-50个皮肤点。不同刺激物(即，C5a，C5a类似物，C5a+C5a类似物，载体对照物，等)使用无菌一次性26号0.5英寸针头和1.0cc结核菌素注射器真皮内注射，0.1ml/位点。在安死术前大约45分钟，一式六份I.D.注射给药。单独的C5a以50ng/位点的剂量注射，C5a受体拮抗剂以不同浓度用与C5a相同剂量共注射。在安死术之前20分钟，1.0ml生理盐水中18-36uCi[125I]-标记的牛血清白蛋白通过边缘耳静脉导入系统循环。45分钟时，用I.V.过量的戊巴比妥钠使兔安乐死。通过心脏穿刺术得到5.0ml外周血，以2000rpm离心10分钟，收集1.0ml血浆，用作测定血浆中125I量的参考。兔死后，取其背部皮肤用大头针别在木制解剖板上。皮肤主要脉管中的血液用手挤压至周围部分。这一过程减少皮肤位点间的变化并且减少背景放射活性。借助15mm木制镗孔刀具和小锤在皮肤上打孔取出炎症损伤组织，并保存在12×75mm聚苯乙烯试管中。然后用Gamma计数仪(Genesys)分析注射位点的放射活性含量。由血管渗出并位于炎症位点的[125I]牛血清白蛋白(BSA)的量被发现与血管渗透性的增强程度成正比。C5a类似物的ID₅₀值是减少50％由50ngC5a在相同位点共注射产生的放射活性的C5a类似物的剂量。

发现C5a类似物No.8(表1中)具有70ng/位点的ID₅₀，而在175ng/位点剂量时不引起前炎症反应。这一结果证明这种类似物是体内拮抗剂，并且不具有体内激动剂性质。实施例9兔体内C5a诱导的中性白细胞减少

所有的实验在重2.5-3.0kg雄性新西兰白兔身上进行。用10mg/kg甲苯噻嗪和50mg/kg氯胺酮结合肌内给药使兔麻醉。25号蝶形导管插入耳侧静脉用来输液。从中心耳动脉将每一血样(0.2ml)采集到装有25号5/8英寸针头，并装有7.5％ EDTA为抗凝剂的塑料注射器中。立即将血样压至含10微升7.5％ EDTA的微离心管中。得到初动脉血样(#1)，此后立即静脉内输注(浓缩药丸注射)载体或实施例8 C5a类似物。20秒钟后，得到第二血样(#2)，此后20秒后静脉内输注0.2ml 100ng C5a。20秒后，取第三血样(#3)。30分钟后，进行第二轮血样(#4)-20秒-C5a-输注-20秒-血样(#5)操作。血样用自动血液分析(Technicon H^*1)应用兔血软件评价。比较载体处理的和C5a类似物处理的动物体内由C5a引起的嗜中性白细胞数的减少(每毫升的数目)(由比较血样#3与#2和#5与#4而确定的C5a诱导中性白细胞减少)。C5a类似物没有改变基线嗜中性细胞数正常值；即C5a类似物不具有激动剂(类C5a)性质。与载体处理的兔相比，C5a类似物处理兔体内C5a诱导白细胞减少明显被抑制(P＞0.05)，在40秒和30分钟C5a激发时间间隔时分别达67％和41％。这些结果证明系统给药C5a类似物的药效。实施例10C5a类似物与+肽H-Ile-Ser-Phe-Lys-Asp-Met-Gln-Leu-Gly-Arg-OH(SEQ ID NO.52)的比较受体结合与C5a诱导钙升高。

制备五种C5a类似物(表2中No.5、7、8、9和10)，并进行C5a受体结合与C5a受体钙升高测定，并且与Or等，J.Med.Chem. 35：402-406(1992)中表I(No.14)公开的合成+肽相比较。这些实验的结果见下面表6。表6

化合物受体结合 Ca⁺⁺升高

K_i(nM) IC₅₀(nM)EC₅₀(nM)

类似物5 0.06 84

″7 0.35 859

″8 0.04 51

″9 0.15 621

″10 0.03 0.6

C5a(1-74) 0.0035 0.07

十肽 5,000 2058

这些结果证明被试验的本发明C5a类似物与该+肽相比具有大于14000-10000倍的受体亲和力。上面数据还证明本发明C5a类似物是基本上不具有激动剂活性的C5a受体拮抗剂，而该+肽具有明显的激动剂活性。实施例11制备C5a(1-71，C27S，O71C)的特异性多克隆抗体制备抗原

采用购自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL USA)的ImiectImmunogen EDC结合药盒，按照生产商的说明将1mgC5a(1-71，C27S，Q71C)结合到2mg Keyhole Limpet血蓝素上。加入3500cpm ¹²⁵I-C5a(NewEngland Naclear，Boston，M.A.)跟踪结合作用效力。结合物终体积为2.25ml，含0.34mgC5a(1-71，C27S，Q71C)(0.15mg/ml)和大约0.9mg/mlKLH。抗C5a(1-71，C27S，O71C)抗血清的产生

用0.5ml弗氏完全佐剂(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)将C5a(1-71，C27S，Q71C)结合物匀浆化。由Millbrook Farms(Amberst，MA)购得的雌性新西兰白兔在肩胛部在两个位点(每一位点用0.2ml匀浆物)进行皮下注射。21天后重复该程序。用弗氏不完全佐剂(Sigma〕再进行注射；总共55天后进行第三次注射，第126天时第四次注射。每次注射后3和5星期之间从兔身上取血样(大约30ml)，使其凝固，移取血清。用于抗体吸附的肽固定化

应用购自Pierce Chemical Co.的Imject Immunogen EDC结合药盒，将C5a(1-71，C27S，Q71C)或C5a(1mg)结合到2mg牛血清白蛋白(BSA)中，并且¹²⁵I-C5a跟踪结合效力。如上文所述。C5a(1-71，C27S，Q71C)/BSA终体积为2.25ml，含0.25mg/mlC5a(1-71，C27S，Q71C)；对于C5a/BSA，终体积为2.25ml，含0.32mg/mlC5a。两种结合物含有大约0.9mg/mlBSA。

两种肽结合物用碳酸钠缓冲至pH8.6的0.2M碳酸氢钠透析。对于每种结合物，通过加入戊二醛至1％ v/v终浓度并在20℃保温15分钟而活化。2ml用相同缓冲液预冲洗的AH(氨基己基)-琼脂糖凝胶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)凝胶在缓冲液中充分洗涤去除戊二醛，然后加入结合物溶液，并在20℃保温1小时，从凝胶上洗去未偶联蛋白质，保留的结合位点通过用20ml 0.2MN-甘氨酰甘氨酸在4℃保温过夜而封闭。将凝胶装入0.5cm×10cm玻璃柱，并用含0.1％叠氮化钠的pH7.2的Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(PBS-A)充分洗涤。亲和层析

来自用C5a(1-71，C27S，Q71C)免疫的兔的血清以2ml/hr的流速通过C5a/BSA柱。收集由柱中出现的被吸附的抗血清。柱子用0.05M磷酸钠缓冲至pH7.2且含0.1％叠氮钠的0.5M NaCl充分冲洗。用3M硫氰酸铵去除结合抗体。使用线内分析紫外监测仪在280nm读数测定洗脱抗体，并且最大偏差0.2OD。在头两次血清走柱过程中收集洗脱的抗体并立即用PBS-A透析，然后超滤浓缩至大约1mg/ml。对每批血清重复几次这一步骤。当测定不到蛋白质从C5a柱上洗脱下来时，血清被认为是被吸附了。

然后被吸附的抗血清通过C5a(1-71，C27S，Q71C)免疫吸附柱。结合的抗体用3M硫氰酸铵洗脱并立即进行PBS-A透析，然后浓缩至大约1mg/ml。实施例12a测定结合C5a(1-71，C27S，Q71C)的标记抗体的制备

从C5a柱上洗脱下来的抗-C5a(1-71，C27S，Q71C)抗体(即与C5a交叉反应的抗体)与碱性磷酸酶结合：向5mg(5000单位)碱性磷酸酶(Type VI)-T，Sigma Chemical Co.)中加入1.4mg在1ml PBS中的抗体。加入Gluteraldehyde至终浓度0.2％ v/v。混合物在20℃保温90分钟，然后在4℃用PBS-A透析过夜。将缓冲液换成含1mM氯化镁，pH8.0的0.05M Tris缓冲液，在4℃透析过夜。实施例12b通过ELISA技术测定结合的C5a(1-71，C27S，Q71C)

特别纯化的0.57mg/ml的兔抗-C5a(1-71，C27S，Q71C)在pH8.6，0.1M硼酸钠/硼酸中稀释至1∶500。ELISA平板(Maxisorp，Nunc，Naperville，IL)用100μl/孔这种溶液包被，在20℃进行4小时。平板冲洗三次去除未结合物质。向孔中加入100μl，用PBS-A+1％BSA(PBS/BSA)合适地稀释的C5a(1-71，C27S，Q71C)或C5a(1-71，C27S，Q71C)的标准制剂的样品，在20℃进行4小时。加入以1∶3000的比例溶在100μl PBS/BSA中标记的抗体，并在4℃保温过夜。冲洗平板，然后加入酶底物(对于碱性磷酸酶，是pH9.8 1mg/ml 10％：v/v二乙胺中的磷酸对硝基苯酯(Sigma.ChemicalCo.))。黑暗中显色在20℃进行，大约5小时，平板用Biomek 1000(BeckmanInstruments，CA，USA)在405nm读数。

用上述相同条件，绘制C5a(1-71，C27S，Q71C)的标准曲线(未给出数据)。实施例12c亲和纯化特异抗-C5a(1-71，C27S，Q71C)的特异性

用100μl包被缓冲液中，1μg/孔C5a(1-71，C27S，Q71C)或C5a在包被微滴定平板，在20℃进行4小时。冲洗平板，100μl PBS./BSA中吸附在C5a上后从C5a(1-71，C27S，Q71C)洗脱下来的抗体的系列稀释液加入到平板的孔中。在20℃保温4小时后，再冲洗平板。兔抗体的结合用山羊抗兔/辣根过氧化物酶(Pierce Chemical Co.)以1∶1000在PBS/BSA中的稀释度，以100μl/孔测定。与第二抗体一起在20℃保温4小时后，冲洗平板，并用2，2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉)-6磺酸二铵盐ABTS底物(Pierce ChemicalCo.)证明Horseradish过氧化物活性。进行30分钟后显色，在405nm处读数。实施例13测定兔血浆样品中C5a(1-71，C27S，Q71C)

从两个被麻醉兔(#1和#2)身上取血样，装入肝素涂层的试管中，然后对两只兔静脉注射C5a(1-71，C27S，Q71C)。30分钟间隔后采集血样。然后再注射C5a(1-71，C27S，Q71C)，并且在30分钟后又取血样。这一过程又重复4次。样品被离心去除血细胞，移取血浆并在-20℃储存直至用于ELISA。

样品在PBS/BSA中稀释，并对实施例11作出的标准曲线将样品在ELISA分析中定量测定。然后测定循环C5a(1-71，C27S，Q71C)随时间的增长。在注射C5a(1-71，C27S，Q71C)之前，在由两只兔身上取的样中不能测得活性，证明抗体的特异性。这一结果还证明，该抗体不具有与兔C5a的交叉反应活性，C5a(1-71，C27S，Q71C)不是兔体内自然存在的物质。实施例14兔循环中C5a(1-71，C27S，Q71C)与标准C5a(1-71，C27S，Q71C)的比较：使用特异抗-C5a(1-71，C27S，Q71C)抗体作为C5a(1-71，C27S，O71C)的解毒剂

使用#2兔最后一次时间点上得到的血浆样品(由实施例13得到)进行一系列二倍稀释，并将得到的曲线的斜率与标准曲线斜率相比较。两个曲线斜率是平行的，表明在兔体内循环的C5a(1-71，C27S，Q71C)仍然保持其抗原性质，并且在ELISA中以相同的方式被识别为标准C5a(1-71，C27S，Q71C)。这一结果也表明如果需要从循环作用中去除C5a(1-71，C27S，Q71C)，则该类似物将被这一抗体中和。实施例15制备单克隆抗C5a(1-71，C27S，Q71C)抗体

在BALB/C小鼠体内，用被Kohler和Milstein(Nature 256：495-497(1975))建立的标准方法，进行单克隆抗体的制备。使用相同的C5a(1-71，C27S，Q71C)抗原(与KLH偶联)的制剂免疫小鼠。用C5a(1-71，C27S，Q71C)/BSA和C5a/BSA进行通过融和免疫鼠脾细胞和杂交瘤系P3/NSI/1-Ag4-1(ATCC TIB18)而产生的单克隆细胞系的筛选。在用多克隆兔抗血清进行的与之直接平行方法中，那些只与C5a(1-71，C27S，Q71C)反应而不与C5a反应的抗体被用作特异性单克隆抗-C5a(1-71，C27S，Q71C)抗体。识别两者的抗体被用作测定抗体，并用碱性磷酸酶标记。

本说明书中提及的所有公开物和专利申请是为指导与本发明相关的本领域熟练技术人员。所有这些公开物和专利申请在此引入作为参考，正如每一公开物和专利申请被特别和各个指明引入作为参考。

这里所说明的本发明的各种改变对本领域熟练技术人员来说是显而易见的。这种改变也落在权利要求书的范围之内。

序列表(1)一般情报：(i)申请人：

(A)姓名：CIBA-GEIGY AG

(B)街道：Klybeckstr. 141

(C)城市：Basel

(E)州：Switzerland

(F)邮编(ZIP)：4002

(G)电话：+41 61 69 11 11

(H)电传：+41 61 696 79 76

(I)电报：962 991(ii)发明名称：基本上没有激动剂活性的C5a受体拮抗剂(iii)序列数目：52(iv)计算机可读形式：

(A)媒体类型：Floppy盘

(B)计算机：IBM PC compatible

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(vi)优先权数据：

(A)申请号：US 08/162，591

(B)申请日：06-DEC-1993(2)SEQ ID NO：1的情报：(i)序列特征：

(A)长度：4个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列说明：SEQ ID NO：1：

Tyr Asp Gly Ala

1(2)SEQ ID NO：2的情报：(i)序列特征：

(A)长度：4个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性 (ii)分子类型：肽(xi)序列说明：SEQ ID NO：2：

Asp Gly Ala Tyr

1(2)SEQ ID NO：3的情报：(i)序列特征：

(A)长度：74个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列说明：SEQ ID NO：3：Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser1 5 10 15Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu

20 25 30Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile

35 40 45Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn

50 55 60Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg65 70(2)SEQ ID NO：4的情报：(i)序列特征：

(A)长度：239碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：4：AATTCTATGA CTCTGCAAAA GAAGATCGAA GAAATCGCTG CTAAGTACAA GCACTCCGTC 60GTTAAGAAGT GTTGTTACGA TGGTGCATGC GTCAACAACG ACGAAACCTG TGAACAACGA 120GCTGCTCGTA TTTCTCTGGG CCCTCGCTGT ATCAAGGCTT TCACTGAATG TTGTGTTGTC 180GCTTCCCAAC TGCGCGCTAA CATTTCTCAC AAGGACATGC AACTCGGCCG CTAAAAGCT 239(2)SEQ ID NO：5的情报：(i)序列特征：

(A)长度：11个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列说明：SEQ ID NO：5：

Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg

1 5 10(2)SEQ ID NO：6的情报：(i)序列特征：

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(B)类型：核酸

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(A)长度；35碱基对

(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：9：CTGCGTGCTT GCTA 14(2)SEQ ID NO：10的情报：(i)序列特征：

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：11：CTGCGTGCTA ACTGCTA 17(2)SEQ ID NO：12的情报：(i)序列特征：

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(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：12：AGCTTAGCAG TTAGCACGCA G 21(2)SEQ ID NO：13的情报：(i)序列特征：

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(B)类型：核酸

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(C)链：单链

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(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：28：AGCTTAGCAC AGTTGCATGT CTTTGTGAGA GATGTTAGCA CGCAG 45(2)SEQ ID NO：29的情报：(i)序列特征：

(A)长度：44个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：29：CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCCTGGGTC GTTA 44(2)SEQ ID NO：30的情报：(i)序列特征：

(A)长度：48个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：30：AGCTTAACGA CCCAGGCACA TGTCTTTGTG AGAGATGTTA GCACGCAG 48(2)SEQ ID NO：31的情报：(i)序列特征：

(A)长度：41个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：31：CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCCTGGGTT A 41(2)SEQ ID NO：32的情报：(i)序列特征：

(A)长度：45个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：32：AGCTTAACCC AGGCACATGT CTTTGTGAGA GATGTTAGCA CGCAG 45(2)SEQ ID NO：33的情报：(i)序列特征；

(A)长度：38个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：33：CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCCTGTA 38(2)SEQ ID NO：34的情报；(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：34：AGCTTACAGG CACATGTCTT TGTGAGAGAT GTTAGCACGC AG 42(2)SEQ ID NO：35的情报：(i)序列特征：

(A)长度：44个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：35：CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CAACTGGGTT GCTA 44(2)SEQ ID NO；36的情报：(i)序列特征：

(A)长度：48个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：36：AGCTTAGCAA CCCAGTTGCA TGTCTTTGTG AGAGATGTTA GCACGCAG 48(2)SEQ ID NO：37的情报：(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：37：CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CAATA 35(2)SEQ ID NO：38的情报：(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：38：AGCTTATTGC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO：39的情报：(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：39：CTGCGTCCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG GACTA 35(2)SEQ ID NO：40的情报：(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：40：AGCTTAGTCC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO：41的情报：(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：41：CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TCTTA 35(2)SEQ ID NO：42的情报：(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：42：AGCTTAAGAC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO：43的情报：(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：43：CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CACTA 35(2)SEQ ID NO：44的情报：(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：44：AGCTTAGTGC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO：45的情报：(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：45：CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CGTTA 35(2)SEQ ID NO：46的情报：(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：46：AGCTTAACGC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO：47的情报：(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：47：CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CTGTA 35(2)SEQ ID NO：48的情报：(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：48：AGCTTACAGC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO：49的情报：(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：49：CTGCGTGCTA ACATCTCTTT CAAAGACATG TGCTA 35(2)SEQ ID NO：50的情报：(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：50：AGCTTAGCAC ATGTCTTTGA AAGAGATGTT AGCACGCAG 39(2)SEQ ID NO：51的情报：(i)序列特征：

(A)长度：252个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线性(xi)序列说明：SEQ ID NO：51：GAATTCCCAC TCAAAATAAG GAGGAAAAAA AAATGCTGCA GAAGAAAATC GAAGAAATCG 60CTGCTAAGTA CAAACACTCT GTTGTTAAAA AATGCTGCTA CGACGGTGCT TCTGTTAACA 120ACGACGAAAC TTGCGAACAG CGTGCTGCTC GTATCTCTCT GGGCCCGCGT TGCATCAAAG 180CATTCACTGA ATGCTGCGTT GTTGCTTCTC AGCTGCGTGC TAACATCTCT TTCAAAGACA 240TGTGCTAAGC TT 252(2)SEQ ID NO：52的情报：(i)序列特征：

(A)长度：10个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列说明：SEQ ID NO：52：

Ile Ser Phe Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg

1 5 10

Claims

1.人C5a肽类似物，其中所述类似物是基本上不具有激动剂活性的C5a受体拮抗剂。

2.权利要求1的人C5a类似物，其中所述类似物包含不同于相应人C5aC-末端区的C-末端区，因为它包含半胱氨酸残基，并且在其C-末端截短至少两个氨基酸残基。

3.权利要求1的人C5a类似物，以半胱氨酸残基为其C-末端。

4.权利要求2的人C5a类似物，其中所述半胱氨酸残基以加合物形式存在。

5.权利要求2的人C5a类似物，其长度为64至72个氨基酸。

6.权利要求2的人C5a类似物，其长度为68至72个氨基酸。

7.权利要求2的人C5a类似物，其长度为70至72个氨基酸。

8.权利要求2的人C5a类似物，其长度为71个氨基酸。

9.权利要求7的人C5a类似物，它是C5a(1-71， Gln71Cys)。

10.权利要求1中人C5a类似物的衍生物，其中所述衍生物是基本上不具有激动剂活性的C5a受体拮抗剂。

11.权利要求2中人C5a类似物的衍生物，其中所述衍生物是基本上不具有激动剂活性的C5a受体拮抗剂。

12.权利要求10的衍生物，它是C5a(1-71，His67Phe，Gln71Cys)。

13.权利要求10的衍生物，它是C5a(1-71，Cys27Ser，His67Phe，Gln71Cys)。

14.权利要求10的衍生物，它是C5a(1-71，Cys27Ser，Gln71Cys)

15.包含人C5a第一和第二多肽类似物或其衍生物的二聚物，其中每一种所述类似物是基本上不具有激动剂活性的C5a受体拮抗剂，且具有C-末端半胱氨酸残基，其中所述第一和第二类似物的半胱氨酸残基是通过二硫键连接在一起的，而且其中所述第一和第二C5a类似物可以是相同的或不同的。

16.权利要求15的二聚物，其中每一所述第一和第二类似物的C-末端区不同于相应的人C5a的C-末端区，因为它被至少截短了两个氨基酸残基。

17.权利要求15的二聚物，其中每一所述第一和第二类似物是C5a(1-71，Cys27Ser，Gln71Cys)

18.编码权利要求1的人C5a类似物的DNA分子。

19.编码权利要求6的人C5a类似物的DNA分子。

20.编码权利要求8的人C5a类似物的DNA分子。

21.编码权利要求9的人C5a类似物的DNA分子。

22.编码权利要求10的人C5a类似物的衍生物的DNA分子。

23.编码权利要求13的人C5a类似物的衍生物的DNA分子。

24.编码权利要求14的人C5a类似物的衍生物的DNA分子。

25.重组DNA分子，包含与权利要求18的DNA分子可操作地连接的启动子，所述启动子能在给定宿主中起作用。

26.与给定宿主相容的重组体质粒，包含权利要求25的重组DNA分子。

27.与给定宿主相容的重组体载体，包含权利要求18的重组DNA分子。

28.用权利要求18的重组体DNA分子稳定地转化的重组体宿主。

29.权利要求28的重组体宿主，它选自细菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳动物和植物细胞。

30.权利要求28的重组体宿主，它是大肠杆菌。

31.权利要求1的人C5a类似物的特异性抗体，其中所述类似物与人C5a基本上不具有交叉反应活性。

32.权利要求31的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。

33.权利要求31的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

34.权利要求10的人C5a类似物衍生物的特异性抗体，其中所述抗体与人C5a基本上不具有交叉反应活性。

35.权利要求34的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。

36.权利要求34的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

37.权利要求14的衍生物的特异性抗体，其中所述抗体与人C5a基本上不具有交叉反应活性。

38.权利要求37的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。

39.权利要求37的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

40.权利要求15的C5a类似物或其衍生物的二聚物的特异性抗体，其中所述抗体与人C5a基本上不具有交叉反应活性。

41.权利要求17二聚物的特异性抗体，其中所述抗体与人C5a基本上不具有交叉反应活性。

42.用于治疗哺乳动物C5a介导疾病或炎症的药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1的C5a类似物和药用载体。

43.用于治疗哺乳动物C5a介导疾病或炎症的药物组合物，包含治疗有效量的权利要求10的C5a类似物衍生物，和药用载体。

44.用于治疗哺乳动物C5a介导疾病或炎症的药物组合物，含有治疗有效量的权利要求14的C5a类似物衍生物，和药用载体。

45.用于调整人C5a类似物体内活性的药物组合物，所述人C5a类似物是基本上不具有激动剂活性的C5a受体拮抗剂，

包含：调整类似物活性有效量的权利要求26的抗体和药用载体。

46.权利要求45的药物组合物，其中所述抗体的量能有效地基本上中和类似物体内活性。

47.治疗哺乳动物C5a介导疾病或炎症的方法，包括给需要治疗的哺乳动物施用权利要求42的组合物步骤。

48.治疗哺乳动物C5a介导疾病或炎症的方法，包括给需要治疗的哺乳动物施用权利要求43的组合物步骤。

49.治疗哺乳动物C5a介导疾病或炎症的方法，包括给需要治疗的哺乳动物施用权利要求44的组合物步骤。

50.减轻哺乳动物C5a介导炎症的方法，包括在补体激活引起或加重症状相关时，对哺乳动物施用足以减轻炎症的权利要求42的组合物的步骤。

51.减轻哺乳动物C5a介导炎症的方法，包括在补体激活引起或加重症状相关时，对哺乳动物施用足以减轻炎症的权利要求43的组合物的步骤。

52.减轻哺乳动物C5a介导炎症的方法，包括在补体激活引起或加重症状相关时，对哺乳动物施用足以减轻炎症的权利要求44的组合物的步骤。

53.调整需要的受治疗者人C5a类似物的活性的方法，所述人C5a类似物是基本上不具有激动剂活性的受体拮抗剂，包括步骤：

给受治疗者施用权利要求45的药物组合物。

54.中和需要的受治疗者人C5a类似物的活性的方法，所述人C5a类似物是基本上不具有激动剂活性的受体拮抗剂，包括步骤：

给受治疗者施用权利要求46的药物组合物。

55.在受治疗者体内测定人C5a类似物的定性或定量试验，所述人C5a类似物是基本上不具有激动剂活性的C5a受体拮抗剂，包括步骤：

由受治疗者体内采集组织或体液样品，和

在足以使抗体和类似物之间生成可检测免疫复合物的条件下，使样品与权利要求31的抗体接触，其中该免疫复合物的生成指征受治疗者体内该类似物的存在。

56.权利要求55的测定方法，进一步包括受治疗者体内类似物的定量步骤。

57.一种制备生物活性C5a类似物或其衍生物的方法，其中所述类似物是基本上不具有激动剂活性的C5a受体拮抗剂，包括步骤：

在适于引起DNA分子表达的条件下，培养用编码C5a类似物的DNA分子稳定转化的大肠杆菌细胞；

使这样培养的细胞与变性和增溶剂接触制备变性形式的C5a类似物；和

在合适的条件下，将这样变性的C5a类似物与含有还原剂和氧化剂的溶液混合，以制备生物活性形式的C5a类似物，还原剂对氧化剂重量摩尔比至少是大约100∶1。

58.权利要求57的方法，其中所述混合是在pH约6.5至约7.5时进行的。

59.权利要求57的方法，其中混合进行的时间是大约1/2小时至大约4小时。

60.权利要求57的方法，其中氧化还原对是还原的谷胱苷肽/氧化的谷胱苷肽。

61.权利要求57的方法，其中大肠杆菌细胞被编码C5a类似物衍生物C5a(1-71，Cys27Ser，Gln71Cys)的DNA分子稳定转化。

62.权利要求57的方法，其中大肠杆菌细胞被编码C5a类似物衍生物C5a(1-71，Cys27Ser，His67Phe，Gln71Cys)的DNA分子稳定转化。

63.权利要求57的方法，其中还原剂/氧化剂摩尔比为至少大约100∶1至大约500∶1。