HUT75990A - C5a receptor antagonists having substantially no agonist activity - Google Patents

C5a receptor antagonists having substantially no agonist activity Download PDF

Info

Publication number
HUT75990A
HUT75990A HU9601538A HU9601538A HUT75990A HU T75990 A HUT75990 A HU T75990A HU 9601538 A HU9601538 A HU 9601538A HU 9601538 A HU9601538 A HU 9601538A HU T75990 A HUT75990 A HU T75990A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
analog
human
antibody
seq
analogue
Prior art date
Application number
HU9601538A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9601538D0 (en
Inventor
William C Boyar
Nicholas G Galakatos
Jane V Peppard
Oostrum Jan Van
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ciba Geigy Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of HU9601538D0 publication Critical patent/HU9601538D0/hu
Publication of HUT75990A publication Critical patent/HUT75990A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Description

A találmány tárgyát — anafilatoxin vagy agonista aktivitást lényegében nem mutató, C5a receptor antagonista — polipeptid humán C5a analógok, az analógok származékai és az analógok vagy származékok dimer formái, valamint fenti polipeptideket kódoló DNS molekulák és az analógok előállítására irányuló módszerek képezik. A C5a analógokat tartalmazó gyógyszer-készítményeket terápiásán használják a C5a-közvetítette betegségek és gyulladásos állapotok kezelésében emlősökben, és olyan gyulladások megelőzésére vagy csökkentésére, amelyeket gyulladást okozó vagy meglevő gyulladásos állapotot súlyosbító események külön-külön idéznek elő. Továbbá közzétesznek C5a analógokra, az analógok származékaira és az analógok és származékok dimer formáira spe2 cifikus antitesteket, amelyek lényegében nem mutatnak keresztreaktivitást humán C5a-val. Az antitesteket a keringésben levő C5a analógok vagy származékaik meghatározására használják ugyanúgy, mint a C5a receptor antagonista aktivitás in vivő módosítására, például semlegesítésére.
^KÖZZÉTÉTELI zPFI nÁlVIV
62.401/PA
S.B.G. &
NemzMöz^ELDANY
Szabadalmi Iroda
H-1062 Budapest, Andrássy ut
Telefon: 34-24-950, Fax. 34-24 fU.·. ,.J'. :H:-L J·1 é; l, : ύ I- í<?
kit
C5a receptor antagonisták, .aroe 1 ye-k—lényegében - nem—.rendelkeznek-.
cffonista aktivitással
CIBA-GEIGY AG, BÁZEL, CH
Feltalálók:
VAN OOSTRUM Jan, FLÜH, CH
BOYAR William, C., NEW PROVIDENCE, NJ, US
GALAKATOS Nicholas G., SUMMIT, NJ, US
PEPPARD Jane V., VERONA, NJ, US
A bejelentés
Elsőbbséoe:
napj a: 1995. 0 6
1993. 12 .
06. (08/162,591), US
A nemzetközi bejelentés száma: PCT/IB94/00359
A nemzetközi közzététel száma: WO 95/16033 ····
C5a receptor antagonisták, amelyek lényegében nem rendelkeznek agonista aktivitással
A találmány az immunológia területére vonatkozik, és még kifejezettebben a komplement-közvetítette betegségek és gyulladást okozó állapotok kezelésére emlősökben.
A gyulladás sérüléssel kiváltott, helyileg fellépő védekező mechanizmus, amely mind az ártalmas szer, mind a sérült szövet lebontására, hígítására vagy elzárására szolgál. Történések komplex sorozatát foglalja magában, beleértve az ütőerek, kapillárisok és a kis vénák kitágítását megnövekedett vérrendszeri permeábilítással, megnövekedett vérárammal és folyadékok és plazmafehérjék kiizzadásával. Ezeket a folyamatokat gyakran követi a leukociták adhéziója az erek belső hámrétegéhez, a sejteknek ezt követően a környező szövetekbe történő beáramlásával.
A komplement rendszerről — az idegen anyagokkal szembeni fő immunológiai védekező mechanizmusról — kimutatták, hogy befolyásol minden egyes, a gyulladást keltő válaszhoz tartozó faktort.
A komplement általában olyan fehérjék halmazát tartalmazza, amelyek mikroorganizmusok és más antigének kiküszöbölését végzik a szövetekből és a vérből. Ezt a feladatot a komplement komponensek egyedül, vagy antitestekkel vagy komplement receptorokat kifejező sejtekkel együttesen oldják meg. Még kifejezettebben, a rendszer körülbelül 30 plazmafehérjéből, az azoknak megfelelő sejt receptorokból és néhány membránt szabályozó fehérjéből áll [Kinoshita, Immunology Today 12, 291-300 (1991)]. A komplement rendszer aktiválása — például antigén-antitest komplexekkel vagy bakteriális felszíni szerkezetekkel a komplement összetevők
..·· ·· proteolitikus hasításának és a fehérjék felsorakozásának olyan megsokszorozott kaszkádját idézi elő, amely végül az idegen test lebontásához és megsemmisítéséhez vezet [Muller-Eberhard, Annu. Rév. Biochem. 57, 321-347 (1988)].
Néhány biológiailag aktív peptid a komplement rendszer aktiválásával jön létre. A C5a egy 74 aminosavat tartalmazó glikoprotein 11000 molekulatömeggel, amely a C5 — a komplementnek C5 konvertázzal nyert ötödik komponense — N-terminális végének proteolitikus hasításával jön létre [Nilsson et al . , J. Immunoi. 114, 815-822 (1975)]. A C5a biológiai sajátságai egyformán kiterjednek a sejtek és szövetek sokaságára, beleértve mind az akut, mind a krónikus gyulladásos folyamatokat [Hugli, CRC Crit. Rév. Immunoi. 321-366 (1981)]. Ezeknek a tulajdonságoknak nagy része kedvező immunológiailag. A C5a-ról azt találták, hogy a gazdaszervezet védekezési mechanizmusát közvetíti válaszként különböző patológiás állapotokra. A C5a részt vesz az általában gyulladásos válasszal járó specifikus biológiai funkciók széles választékában, úgymint simaizom összehúzódásban, a vérrendszer permeábilitásának növekedésében, a humán bőrbe oltva kiütés és tágulat képződésben, az emlős sejtekből történő hisztamin elengedésben, és az oxidatív kitörés kiváltásában és lizoszómális enzimek kiengedésében a polimorfonukleáris leukocitákból (polymorphonuclear leukocytes = PMNLs). A C5a mérhető válaszokat stimulál minden keringő fehér vérsejtből, beleértve a bazofileket, eozinofileket, monocitákat és neutrofileket [Hugli CRC Crit. Rév. Immunoi. _1, 321-366 (1981); Bautsch et al. , Immunbioi. 185, 41-52 (1992)]. A C5a-t továbbá potenciális kémia• · • ·
ilag vonzó anyagnak találták [Fernandez et al. , J. Immunoi. 12 0, 109-115 (1978)]. Ez a fehérje sarkalatos stimulusa a PMNL-ek vonzásának, úgymint fagocita sejteknek a gyulladás helyére.
A komplement jótékony hatású amennyiben egy megfelelő cél ellen, úgymint támadó mikroorganizmusok vagy daganatsejtek ellen irányul, de tisztán patogén potenciál, ha nem megfelelően aktiválódik. Például az anafilatoxinokat — például a C5a-t — okozati vagy súlyosbító faktorként összefüggésbe hozták néhány gyulladást keltő betegség, úgymint felnőtt légzési elégtelenség szindróma (aduit respiratory distress syndrome) és reumás izületi gyulladás (rheumatoid arthritis) patogenezisével [Bautsch et al. , Biochem. J. 2 8 8, 261-265 (1992); Haslett et al . , J. Immunoi
142, 3510-3517 (1989)]. C5a rendellenes jelenlétét mutatták ki a szövetekben, különösen reumás izületi gyulladásban, idült izületi gyulladásos csontbetegségben (osteoarthritis-ben), pszoriázisban és nem-kardiális pulmonáris ödémában szenvedő betegeknél [Hammerschmidt, J. Amer. Med. Soc. 244, 199- (1980)]. A
C5a-t találták a gyulladást okozó leukociták mozgósítását és stimulációját és az antitest termelődés növekedését magában foglaló kiegészítő aktivitások folytán létrejövő, komplement aktivációval keletkező legfontosabb gyulladást keltő közvetítőnek [ Mollison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 6, 292-296 (1986)] .
A gyulladás in vivő farmakológiai kontrolljáról feltételezik, hogy a kemotaxis modulációjának függvénye. Három szintet ismertek fel, amelyeknél gátlás történhet. Ezek a következők, 1) a kemotaxis stimulációira adott leukocita válasz elnyomása; 2) a • · • ·
kemotaxin keletkezés megakadályozása; és 3) a kemotaxinok inaktiválása. Továbbá, mivel a C5a különböző funkcióit számos humán sejt — úgymint neutrofilek, eozinofilek és monocita származék sejtek — membránjában talált specifikus C5a receptorokhoz való kötődése által gyakorolja, a C5a-közvetítette kemotaxis gátlása, és különösen a C5a receptor antagonisták tervezése jelentős figyelmet keltett.
A 4,772,584 számú amerikai szabadalmi leírás sztreptokokkuszok A csoportjából izolált olyan polipeptideket mutat be, amelyek gátolják a C5a kötődését az PMNL-ekhez hat aminosavból álló peptidnek a C5a C-terminálisáról történő lehasífásával. A 4,692,511 számú amerikai szabadalmi leírás olyan C5a antagonista polipeptid receptorról számol be, amely egy olyan nélkülözhetetlen core tetrapeptidet, Tyr-Asp-Gly-Ala -t (1. számú szekvenciavázlat) vagy Asp-Gly-Ala-Tyr -t (2. számú szekvenciavázlat), vagy core tripeptidet, Asp-Gly-Ala -t tartalmaz, amely C5a blokkoló aktivitást mutat.
Az 5,190,922 számú amerikai szabadalmi leírás, a WO/90/09162 és 92/11858 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentések olyan különböző oligopeptideket hoznak nyilvánosságra, amelyek
C5a receptorokhoz kötődnek és értelemszerűen módosítják az anafilatoxin aktivitást. Azonban ezek közül a molekulák közül néhányról kimutatták, hogy szignifikáns agonista aktivitást megtartanak [ Mollison et al. , „C5a Structural Requirements fór Neutrophil Receptor Interaction in Progress in Inflammation
Research and Therapy, Birkhauser Verlag, Basel p.17-21 (1991);
Kawai et ai. , J. Med. Chem. 35, 220-223 (1992); Kawai et al. , J.
Med. Chem. 34, 2068-2071 (1991) és Or et al., J. Med. Chem. 35,
402-406 (1992)] . Ezért továbbra is nagy szükség van olyan hatásos és terápiásán hatékony C5a,.. receptor antagonistára, amely agonista aktivitástól lényegében mentes.
A találmány tárgyát egy vonatkozásban a humán C5a polipeptid analógjai — amelyek C5a receptor antagonisták és lényegében nem mutatnak anafilatoxin vagy agonista aktivitást —, az analógok származékai, és az analógok vagy származékok dimer formái képezik. A polipeptideket (azaz az analógokat és azok származékait) kódoló DNS molekulák, plazmidok, vektorok és a DNS molekulákkal transzformált gazdasejtek, és a C5a analógok elkészítésére szolgáló módszerek szintén a találmány tárgyát képezik.
C5a analógot, annak származékát vagy dimer formáját tartalmazó gyógyszer-készítményeket előnyösen használunk fel az emlősökben C5a-közvetítette gyulladást keltő állapotok és betegségek kezelésére szolgáló eljárásokban, és ilyen gyulladás megakadályozására megelőzésként.
A találmány tárgyát egy másik vonatkozásban a C5a analógokra és azok származékaira specifikus antitestek képezik, amelyek lényegében nem mutatnak kereszt-reaktivitást a humán C5a-val. Az antitesteket a keringésben levő C5a analógok és származékok kimutatására vagy mennyiségi meghatározására használjuk az alanyokban (akiknek előzőleg ugyanezeket beadtuk) ugyanúgy, mint a
C5a analógok és származékok aktivitásának in vivő módosítására, például semlegesítésére.
Az ábrák rövid leírása
Az 1. egy folyamatábra, amely a humán C5a-t kódoló szintet!···· kus gén szintézisét szemlélteti oligonukleotid kapcsoláson keresztül .
A 2. ábra a pB-6/C5a plazmid térképe.
Az előnyben részesített kiviteli alakok leírása
A találmány szerinti C5a polipeptid analógok olyan C5a receptor antagonisták, amelyek lényegében nem rendelkeznek agonista aktivitással. A „C5a receptor kifejezés alatt a szakmában a humán vörösvérsejtek — úgymint PMNL-ek és monocita sejtek — felületének azon helyeit értjük, amelyekhez a C5a, annak C5a-desArg lebomlási terméke és az instant antagonisták kötődnek [ 5,177,190 számú amerikai szabadalmi leírás; Oppermann et al., J. Immunoi.
151(7), 3785-3794 (1993)] . A C5a a humán szérumban egy B típusú karboxipeptidáz enzim segítségével enzimesen C5a-desArg-gá alakul át, és ez a fő fiziológiás végtermék az emberben [ Chenoweth et al ., Mól. Immunoi. 17, 151-161 (1980)] .
Az „antagonista kifejezés alatt azt értjük, hogy a közzétett polipeptidek a C5a inhibitorai. Ez azt jelenti, hogy megakadályozzák a C5a kötődését a C5a receptorhoz. Bár nem szándékunk ragaszkodni semmiféle különleges elmélethez, úgy véljük, hogy a
C5a analógok a C5a kompetitív inhibitorai, amelynek következtében ezek a C5a-val versengenek a C5a receptorhoz történő kötődésért .
Az instant C5a analógok antagonizmusának mértéke meghatározharó IC50-ként a Seligmann által közzétett kalcium-emelkedés meghatározással [ Seligmann et al., Agents and Actions 21, 375-378 (1987)], amelyet részleteiben a 7. példában írunk le. Az IC50-et avval a C5a analóg koncentrációval definiáljuk, amely 50%-ban gátolja a C5a receptort hordozó PMNL-ek általi intracelluláris kalcium ion mobilizációt 100 pM humán C5a-nak történő kitétel után. A találmány szerinti C5a receptor antagonisták körülbelül 2,0 x 10 6 M-nál nem nagyobb IC50-et mutatnak a Seligmann és társai által közzétett kalcium-emelkedés meghatározásnál.
A „lényegében nem létező anafilatoxin aktivitás vagy a „lényegében nem létező agonista aktivitás szókapcsolatok azt jelentik, hogy a C5a analóg (innentől fogva váltakozva használjuk a C5a receptor anatagonistával) kötődése a receptorhoz nem eredményez olyan endogén szignál transzdukciós eseményt, amely végül általában — a C5a-nak receptorához való kötődése által előidézett — anafilatoxin kiváltotta gyulladással kapcsolatos fiziológiai válaszokhoz vezet, úgymint fagocita sejtek aktiválása, simaizom összehúzódás, a vérrendszer permeábilitásának növekedése és gyulladást keltő közvetítők, például hisztaminok, prosztaglandinok, tromboxánok, leukotriének, interleukin ((IL-1, IL-6 és IL-8) nagymértékű keletkezése [Hugli et al., CRC Crit.
Rév. Immunoi. 1, 321-326 (1981) és PCT WO 92/10205 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés] . E sajátság mértékének mérése szintén megkapható a Seligmann és munkatársai szerinti kalcium-emelkedés meghatározás (lásd fent) felhasználásával, amelyet szintén a 7. példában írunk le. EC50 az agonista aktivitás mérése. A találmány céljainak értelmében az ECS0 érték az a C5a analóg koncentráció, amely ugyanezen C5a analóg okozta maximális válasz 50%-át eredményezi. Az instant C5a analógok agonista aktivitását nem mutattuk ki legalább körülbelül 8,0 x
-? -6
M, és előnyösen legalább körülbelül 3,0 x 10 M koncentra9 » · · cióig ugyanabban a kalcium-emelkedés meghatározásban. A találmány szerinti C5a analógok azok, amelyeknél az EC50 nem mérhető a
Seligmann szerinti kalcium-emelkedés meghatározással legalább körülbelül 8,0 x 10 M, és előnyösen legalább körülbelül 3,0 x 10 6 M C5a analóg koncentrációkig, mivel nem mutatható ki válasz a meghatározásnál.
C5a egy 74 aminosavból álló polipeptid, amelynek a szekvenciáját Fernandez és munkatársai tárták fel [ J. Bioi. Chem. 253,
6955-6964 (1978)] . A levezetett nukleotid-szekvenciák alapján létrehozott szintetikus géneket Mandecki és munkatársai cikkében [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3543-3547 (1985)] és a 4, 937, 189 számú amerikai szabadalmi leírásban (Davidow és munkatársai) hozták nyilvánosságra. A Fernandez cikkében feltárt C5a aminosav-szekvencíát és a Davidow és munkatársai által leírt, megfelelő szintetikus nukleotid-szekvenciát az alábbiakban, az 1.
táblázatban tesszük közzé.
1 . táblázat 1 2 3 4 5 6 7 8 8 10
EcoRI Thr Leu Gin Lys Lys Ile Glu Glu Ile Alá
(3. számú szekvencia)
AATTCT ATG ACT CTG CAA AAG AAG ATC GAA GAA ATC GCT
GA 1 TAC TGA GAC GTT TTC TTC TAG CTT CTT TAG CGA
(4. számú szekvencia)
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Alá Lys Tyr Lys His Ser Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr
GCT AAG TAC AAG CAC TCC GTC GTT AAG AAG TGT TGT TAC
CGA TTC ATG TTC GTG AGG CAG CAA TTC TTC ACA ACA ATG
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
Asp Gly Alá Cys Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gin
GAT GGT GCA TGC GTC AAC AAC GAC GAA ACC TGT GAA CAA
CTA CCA CGT ACG CAG TTG TTG CTG CTT TGG ACA CTT GTT
37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49
Arg Alá Alá Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile Lys
CGA GCT GCT CGT ATT TCT CTG GGC CCT CGC TGT ATC AAG
GCT CGA CGA GCA TAA AGA GAC CCG GGA GCG ACA TAG TTC
50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62
Alá Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Alá Ser Gin Leu Arg
GCT TTC ACT GAA TGT TGT GTT GTC GCT TCC CTA CTG CGC
CGA AAG TGA CTT ACA ACA CAA CAG CGA AGG GTT GAC CCG
63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74
Alá Asn Ile Ser His Lys. Asp Met Gin Leu Gly Arg stop
Hi
GCT AAC ATT TCT CAC AAG GAC ATG CAA CTC GGC CGC TAA .
CGA TTG TAA AGA GTG TTC CTG TAC GTT GAG CCG GCG ATT
• ·
Váratlanul és meglepően felfedeztük, hogy néhány humán C5a analóg — amelyeket a szintetikus C5a génnek a humán C5a C-terminális régióját, azaz a 64-74. aminosavakat (innentől fogva váltakozva használjuk a ,,C5a(l-74) jelöléssel), kódoló része mutagenezisével állítottunk elő — a C5a-tól drámaian különböző tulajdonságokkal rendelkezik. Ez azt jelenti, hogy ezek kiváló antagonista sajátságokat mutatnak és lényegében nem rendelkeznek agonista aktivitással. A találmány szerinti C5a analógokat kimondottan a C5a(l-74) C-terminális régiójának két módosításában vagy mutációjában kifejezve definiáljuk. A C5a(l-74) 64-74. aminosavai :
Ν' -Asn-Ile-Ser-His-Lys-Asp-Met-Gin-Leu-Gly-Arg-C'
65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 (5. számú szekvencia)
Először, legalább Leu(72)-ig csonkítjuk, azaz a Gly (73) és
Arg(74) maradékok eltávolításával. Másodszor, legalább egy ciszteint helyettesítünk be a régióba oly módon, hogy a polipeptid C-terminális aminosavja (azaz a C-vég) cisztein legyen, és hogy a C-terminális cisztein tiol (-SH) csoportja redukált formában van (azaz szabad tiol csoporttal rendelkezik), vagy olyan formában, amely képes spontán átalakulni vagy könnyen átalakítható szabad tiol csoporttá.
Egy előnyben részesített kiviteli alakban 2-6 C-terminális aminosavval csonkítjuk a C5a(1-74)-et. Ilyenformán, ha az N-terminális 63 aminosavból álló régiót érintetlenül hagyjuk és csak egy ciszteint helyettesítünk be, a megfelelő kiviteli alakokat a következők szerint jelölhetjük: C5a (1-72,Leu72Cys), C5a(l-71, • · • · · ·
Gln71Cys), C5a(1-70,Met7OCys), C5a(1-69,Asp69Cys) és C5a(l-68,
Lys68Cys). Egy előnyösebb kiviteli alakban a csonkolt C-terminális tartalmazza a Met70, Gln71 vagy Leu72 részeket, amely megfelel a három előzőleg jelölt kiviteli alaknak. Egy még előnyösebb kiviteli alak a C5a(1-71,Gln71Cys).
A C-terminális régió tovább csonkolható N-terminálisan
Lys(68)-ig, amely megfelelne a C5a(1-67,His67Cys), C5a(l-66,
Ser66Cys), C5a (1-65,Ile65Cys) és C5a(1-64,Asn64Cys) jellemzően jelölt kiviteli alakoknak, biztosítva, hogy az eredményül kapott
C5a analóg mutatja az előzőekben említett szükséges antagonista — 6 sajátságot (körülbelül 2,0 x 10 M-nál nem nagyobb IC50-et) és lényegében nem rendelkezik anafilatoxin vagy agonista aktivitássál (legalább körülbelül 3,0 x 10 M C5a analóg koncentrációig nem mérhető ECS0) . A szakmai gyakorlatban ez alatt azt értjük, hogy a humán C5a „analógok nem foglalják magukban a C5a-ra vagy a C5a receptor helyeire specifikus antitesteket.
Az itt leírt humán C5a analógok származékai a találmány oltalmi körébe tartoznak. Ezek felölelnek olyan módosulatokat, mint pontmutációkat, helyettesítéseket (szubsztitúciókat), betoldásokat (addiciókat) és kivágásokat (deléciókat) a 63 aminosavból álló N-terminális régióban (a C5a(l-74) 1-63. aminosavjai [ Carney et al. , Protein Science 2, 1391-1399 (1993)] ) és további aminosav helyettesítéseket az így mutációt szenvedett Cterminális régióban. A módosítások típusa és kiterjedése általában nem fontos addig, amíg az eredményezett származék megmarad lényegében agonista aktivitással nem rendelkező C5a antagonistának, ahogyan azt fent definiáltuk. Például a Cys27 maradék a C5a(l-74) N-terminális régiójában kicserélhető, például szerin maradékra annak érdekében, hogy az újrahajtogatás nehézségeit minimálisra csökkentsük. Tehát egy előnyösebb kiviteli alakban a C5a analóg származék jelölése C5a(l71,Cys27Ser,Gln71Cys) . Az N-vég is kicserélhető egy Met maradékra helyettesítéssel vagy betoldással, hogy lehetővé tegyük a C5a analógot kódoló gén kifejeződését különböző gazdasejtekben. Egy példa a C-terminális régió további módosításaira Phe maradék behelyettesítése natív His helyére a C5a(l-74) 67. helyzetében.
Tehát, a legelőnyösebb kiviteli alakban a C5a analóg származék jelölése C5a(1-71,Cys27Ser,His67Phe,Gln71Cys).
A találmány szerinti C5a analógokat (innentől kezdve együttesen értjük alatta az analógokat és azok származékait) elkészíthetjük számos standard eljárással. Például előállíthatjuk közvetlen kémiai szintézissel. Elkészíthetjük azokat a polipeptideket kódoló DNS molekuláknak, azaz szintetikus géneknek alkalmas gazdasejtekben történő kifejezésével is. Ezek a —
C5a analógok aminosav-szekvenciáiból levezethető — DNS molekulák pedig előállíthatok ismert technikák segítségével. A DNS-ek kémiailag szintetizálhatok az alábbi, a C5a-t kódoló gén kémiai szintézisét nyilvánosságra hozó irodalmakban leírtak szerint [Narang, Tetrahedron 3 9, 3-22 (1983); EPA 146, 785 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés; Mandecki et al . ,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3543-3547 (1985)] . A DNS molekula fragmentumai előállíthatok kémiailag, amelyeket azután enzimesen kötünk össze egymással [ Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, Vol.l, Chapter 8, Wiley, NY (1990)] .
A találmány szerinti C5a analógokat kódoló DNS-eket előállíthatjuk C5a-t kódoló ismert szintetikus vagy természetes gének — úgymint amelyeket például Fernandez, Mandecki és Davidson közzétettek — mutagenezisével [Ausubel et al.,(lásd fent); Maniatis et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vol.II, Chapter
15, Cold Spring Harbor, NY (1989); Mollison et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 8 6, 292-296 (1989)] . Továbbá, a DNS-eket elkészíthetjük PCR technikákkal [ Innis et al., PCR Protocols,
Academic Press, San Diego, CA (1990)] .
A találmány szerinti C5a analógokat kódoló DNS molekulákat működőképesen kapcsoljuk ismert szabályozó szekvenciákkal, például promóterrel, enhancer-rel, 3' -nem-transzlált szekvenciákkal és 5' -transziáit szekvenciákkal, például szignál- és vezérszekvenciákkal, és utána a géneket kifejezni képes gazdasejtekbe transzformáljuk a szakmában jegyzett technikák szerint. Ezután a transzformált gazdasejteket az antagonistát kódoló gén kifejeződésére alkalmas körülmények között tenyésztjük. A tipikus gazdasejtek felölelnek prokariótákat, úgymint E. coli-t és Bacillust, például Bacillus subtilist; és eukariótákat, úgymint fonalas gombákat, például Aspergillus nigert, élesztőket, például
Saccharomyces cerevisiae-t, Pichia pastorist és Yarrowia lipolytica-t; baculovirus/rovar sejtkultúrákat [ Summers et al. ,
A Manual of Methods fór Baculovirus Vectors and Insect Cell
Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station (1987)] ; emlős sejtvonalakat; és növényeket [ J. Vandekerckhove et al., Bio/Technology 7, 929-932 (1989)] .
Általában a C5a-nak E. coli-tan történő kifejezésére szolgáló • ·* eljárások alkalmazhatók a C5a analóg gén kifejezésére [Mandecki,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3543-3547 (1985); Mollison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 292-296 (1989); és Bautsch et al., Immunobioi. 185, 41-52 (1992)] . Mind a megfelelő szabályozó szekvenciák, úgymint promoter (például T7 polimeráz, UV5D, trp vagy lac) , riboszóma kötő hely, mind a transzkripciós stop helyeket tartalmazó alkalmas plazmid vektorok, például pKK223-2, kiválasztása a szakmai gyakorlat szintjén belül van. Az E. coli-ban történő kifejezés optimalizálása céljából célszerű a DNS molekulát E. coli által előnyben részesített kódonok felhasználásával szintetizálni [ Guoy et al. , Nucleic Acids Rés.
10, 7055-7074 (1982)] és meghagyni néhány restrikciós endonukleáz helyet a szintetizált DNS jellemzésének és a DNS szekvencia esetleges mutagenezisének megkönnyítésére. Ez a megközelítés lehetővé teszi a C5a analóg közvetlen kifejeződését egy ATG iniciációs kódonnak a fehérje szintézishez történő bevezetésével, közvetlenül upstream a polipeptid első aminosavját kódoló triplethez. Továbbá, olyan E. coli törzsek, például Ion, amelyekből hiányzik valamelyik, a vad típusú sejtekben jelen levő proteáz, megnövekedett fehérje hozam előnyét nyújtják [ Franké et al., Meth. Enzymol. 162, 653-658 (1988)] .
A C5a analógot kódoló szintetikus gének általában kifejezhetek élesztőben a következő ismert eljárásokkal [ lásd például: Romanos et al. , Yeast g, 423-488 (1992); Section IV of Goeddel (Ed.) Meth. Enzymol. 185, 231-484 (1990); Davidow et al., fent;
és a 4,775,622 számú amerikai szabadalmi leírást] . Az élesztőben törrerő kifejezés optimalizálása céljából célszerű a DNS moleku• · • · * · lát az élesztő által előnyben részesített kódonok felhasználásával elkészíteni, különösen Arg-Arg párok elkerülésével, amelyek az endogén KEX2 proteázok célpontjai. Glutamin alkalmazása Nvégként metioninnal ellentétben megkönnyíti a proteolitikus leválást a szignál-szekvenciáról, például alfa-faktor szignálszekvenciáról. Továbbá előnyös bármilyen potenciális glikozilációs hely eltüntetése, úgymint az instant C5a receptor antagonisták különböző kiviteli alakjainál az Asp a 64. helyzetben .
A találmány szerinti C5a analógot kódoló gén kifejezését emlős sejtekben ismert eljárások szerint végezhetjük el [ lásd „Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells, Chapter 16, in:
Maniatis et al., fent] . Jellemző módszert tesznek közzé Berg és munkatársai a humán sejtekben való kifejezésre [ BioTechniques
14(6), 972-978 (1993)] . Az alkalmas humán sejtek magukban foglalják az általánosan hozzáférhető sejtvonalakat, úgymint HeLa
S3 (ATCC CCL2.2) és HEK293 (ATCC CRL1573). A CHO sejtekben történő kifejezést például Asselbergs és munkatársai hozzák nyilvánosságra [ Fibrinolysis 7, 1-14 (1993)] . Az alkalmas hörcsög sejtvonalak közé tartozik a CH0-K1 (ATCC CCL61), BHK (ATCC
CRL6281), BHK-21 (ATCC 6281, CCL10 és CRL8544). Jellegzetes majom sejtek a CV-1 (ATCC CCL70), COS-7 (ATCC CRL1650) és VERŐ sejtek (ATCC CCL81) . Alkalmas egér sejtvonal a C127 (ATCC 1804) .
Előnyben részesített sejtvonalak a DHFR-minus CHO sejtvonalak, ahogyan Uriaub és munkatársai bemutatják [ Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 77, 4216-4220 (1980)] . Szérumtól független sejtvonalak előnyösebbek [ lásd Kurano et al., Bio/Technologv 16, 245-258 • 9 · · ι *7 · · · ♦ · • ·*· / «·«···****** (1990)] . Emlős gazdaszervezetekben a C5a analógok glikozilált vagy nem-glikozilált formái állíthatók elő.
A transzformált E. coli sejtekből izolált C5a analógokat renaturáljuk — hogy felvegyék biológiai aktivitásukat, amelyben a C-terminális cisztein redukált formában van, azaz szabad tiol csoportot tartalmaz — előnyösen egy megfelelő egylépéses eljárás alkalmazásával. Váratlanul fedeztük fel, hogy a denaturált C5a analóg kezelése egy redox párral, ahol a redukálószer és az oxidálószer moláris aránya legalább körülbelül 100:1 és körülbelül
500:1 közé esik, biológiailag aktív C5a analógot eredményez, amely C-terminális ciszteint tartalmaz redukált formában. Ez az arány körülbelül 10-50-szer nagyobb, mint az ismert arányok (redukált és oxidált szulfhidril vegyületek előnyben részesített
10:1 arányát teszik közzé Builder és munkatársai a 4,620,948 számú amerikai szabadalmi leírásban a 17. bek. 43-45 sorában).
Az eljárásnak megfelelően, a transzformált E. coli sejteket a C5a analóg termelésének előidézéséhez kielégítő körülmények között történő tenyésztés után összekevertük egy denaturáló- és oldószerrel — például 6M guanidin-HCl-dal — denaturált C5a analóg előállítására, tetszőlegesen további, bármilyen ismert széttörési technikával, úgymint szonifikálással (French Press vagy
Dyno Mill) . Az így összekevert vagy széttört, a denaturált C5a analógot tartalmazó sejteket azután megfelelő körülmények között összekevertük egy redox párral — amelyben a redukálószer/oxidálószer moláris aránya legalább körülbelül 100:1 és körülbelül
500:1 közé esett — renaturált, biológiailag aktív C5a analóg előállítása céljából. Az alkalmas redox párok közé tartozik a • · »··· e*
99 cisztein/ /cisztin és a redukált glutation/oxidált glutation. A szakmai gyakorlat szerint egyéb redox párok is használhatók.
Előnyben részesített a glutation redox pár. A megfelelő körülmények 6,5-7,5 pH értékeket ölelnek fel, előnyösen 7,4-et. A keveréket szobahőmérsékleten annyi ideig hagyjuk állni, amely elegendő a maximális fehérje kitermeléshez. Az előnyben részesített időtartam körülbelül 1/2 órától körülbelül 4 óráig terjed.
Ilyenformán ez a módszer kiküszöböli a nehezen kezelhető anyagok — beleértve a baktérium sejtekből származó testeket (azaz a kifejezett fehérje oldhatatlan tömegét) — izolálásának szükségességét és azt követően a C-terminális cisztein tiol csoportjának redukciój át.
Egy másik lehetőség szerint a C5a analógok renaturálhatók standard újrahajtogatási és tisztítási sémák szerint, ahogyan azt például Builder és munkatársai a 4,620,948 számú amerikai szabadalmi leírásban közzéteszik. Ezen eljárásokat követően a Cterminális cisztein addukt formájában, például Cys-Cys vagy Cysglutation formában lesz jelen. Emiatt az adduktot később redukálni kell, hogy szabad tiol csoportot kapjunk. Felfedeztük, hogy a közzétett C5a analógok adduktjai szintén olyan C5a receptor antagonisfaként működnek, amelyek lényegében nem mutatnak itt definiáltak szerinti agonista aktivitást, és ezért a találmány oltalmi körébe tartoznak. A további redukció azonban szükséges az előnyben részesített kiviteli alakok elkészítéséhez, amennyiben ezeket a standard renaturációs technikákat alkalmaztuk .
A renaturációt követően a C5a analógokén a kívánt mértékben tisztíthatjuk. A jellegzetes tisztítási sémák tartalmazzák az ultraszűrést, diaszűrést, gélelektroforézist, kromatográfiás eljárásokat, úgymint ioncserés kromatográfiát, méretkizárásos kromatográfiát, HPLC-t, reverz fázisú HPLC-t, a Sephadex-szel való kezelést, dialízist, affinitás kromatográfiát stb. A szakmai gyakorlat értékelése szerint a tisztítási sémák kombinációja alkalmazható .
C-terminális cisztein maradékkal rendelkező C5a analógok oxidálhatok dimerek képzése céljából standard technikák szerint.
Dimerek előállításához a megfelelő monomerek (analógok) C-terminális cisztein maradékainak tiol (-SH) csoportjait oxidáljuk diszulfid kötést létrehozva. A „dimer kifejezés homodimereket és heterodimereket ölel fel.
A találmány szerinti C5a analógok és ezek dimerjei felhasználhatók olyan ártalmas állapotok vagy betegségek kezelésében és/vagy megelőzésében, amelyekben a komplement rendszer és még inkább a C5a és anafilatoxin érintve van. Ezek terápiásán akkor a leghatékonyabbak, ha bármilyen olyan emlős betegnek, különösen embereknek adják be, amely C5a-közvetítette szöveti lebomlás és halál magas kockázatával néz szembe. Ezek általában azok az állapotok vagy betegségek, úgymint gyulladást keltő rendellenességek, ahol C5a keletkezik a szérumban proteolitikusan. A C5a analóg terápiára fogékony jellegzetes állapotok közé tartozik a nem fertőzéses tüdőgyulladás (pneumonitis), felnőtt légzési elégtelenség szindróma (aduit respiratory distress syndrome = ARDS), ismeretlen eredetű tüdő fibrózis (idiopathic pulmonary fibrosis), tüdőgyulladás vagy -károsodás, krónikus előrehaladott disz-cisztikus fibrózis, gyapotpor belégzése okozta tüdőártalom (byssinosis), azbeszt által okozott gyulladás, szívizom elhalás (myocardial infarction), szívizom elhalást követő gyulladás, isémiás szívkárosodás, májcirrózis (hepatic cirrhosis), elsődleges epecirrózis (primary biliary cirrhosis inflammation), idült májgyulladás, hasnyálmirigy-gyulladás (pancreatitis), vérzéses hasnyálmirigy-gyulladás (haemorrhagic pancreatitis), gyulladást keltő bélbetegség, vastagbél-gyulladás (colitis), isémiás agykárosodás, agyvelőgyulladás (encephalitis) , koponyaideg károsodás agyhártyagyulladásban (cranial nerve damage in meningitis) , agyhártyagyulladás, uveagyulladás (uveitis), Purtscher-féle retinopathia, immunkomplex-közvetítette glomerulonephritis, vesekéreg elhalás (renal cortical necrosis), köszvény, érgyulladás (vasculitis), szérum betegség, angio-ödéma, myasthenia gravis, szisztémás lupus erythematosis, reumás izületi gyulladás (rheumatoid arthritis), hólyagos bőrbetegség, hiperérzékenység, pszoriázis, endotoxin sokk, generalizált fertőzés (sepsis), számos trauma és az égések. Szintén felhasználhatók terápiásán olyan betegek kezelésére, akik transzpiantatum kilökődéstől szenvednek, immunszuppressziv kezelésben vagy kiadós vértranszfúzióban részesülnek, gyógyászati gépekre tett betegeknél és azoknál, akiknél hemodialízist vagy leukoferezist követően a tüdőműködés zavarát tapasztalják.
Az analógok és dimerjeik további felhasználhatósággal bírnak, mint megelőző (profilaktikus) szerek, különösen az újra történő átáramoltatás (reperfúzió) előidézte állapotokban — például isémiát követő újra átáramoltatásnál — és gyógyászati eszközökkel • · való keringéses érintkezésnél (circulatory contact) ugyanúgy, mint transzplantátumok kilökődésének elhárításában. Ebben az esetben a C5a analógot alkalmasan a — tudottan gyulladást okozó vagy már meglévő gyulladásos állapotot súlyosbító — esemény előtt vagy lényegében vele egyidőben adjuk be.
A találmány szerinti C5a analógokat és dimerjeiket beadhatjuk bármilyen, a fehérje típusú gyógyszerek számára terápiásán hatásos úton, például a gyomor-bél rendszeren kívül (parenteralis) , orron át (intranasalis), végbélen keresztül (rectalis) vagy az arcba (buccalis), olyan egységnyi adagokba formulázva, amelyek a szokásos nem-toxikus gyógyászatilag elfogadható hordozókat, adjuvánsokat és vivőanyagokat tartalmazzák kívánalom szerint. A „gyomor-bél rendszeren kívüli kifejezés felöleli az olyan szállítási módokat, mint a bőr alá (subcutan), intravénásán, izomba (intramuscular), szegycsonton át (intrasternal) és artériába történő injektálási és infúziós technikákat.
A találmány szerinti C5a analógok (és dimerek) adagjai változhatnak az egyes beteg számára megkívánt terápiás válasz elérése érdekében. Ez függ például az egyes antagonista aktivitásától, a beadás módjától, az éppen kezelt állapot komolyságától ugyanúgy, mint a beteg egés'zségügyi kondició j ától. A terápiásán hatásos adagolási mennyiség meghatározása egy adott állapotra és betegre a szakma gyakorlati szintjén van. Általában testtömeg kg-ra és napra vonatkoztatva körülbelül 1 pg és 100 mg közötti adagokat adunk be naponta az emlős gazdaszervezetnek. Az előnyben részesített adagolási szint 0,1 mg/kg-20 mg/kg közé esik testtömeg kg-ra vonatkoztatva naponta. A C5a analógot hosszabb • · · · időn keresztül, egyetlen folyamatos adagban adjuk be a betegnek. A teljes hatásos adag azonban elosztható többszöri adagokra, például kettő vagy négy egymástól elkülönülő adagra naponta, amennyiben szükséges.
A találmány szerinti C5a analógokat (és dimereket) formulázhatjuk készítményekbe, felhasználva mind az ismert gyógyászatilag elfogadható alkotórészeket, mind az elkészítés módszereit [ Remington et al., Pharmaceutical Sciences 15th Ed. Mack Pub.
(Easton, PA) (1975)] . A parenterális beadásra alkalmas készítmények magukban foglalnak gyógyászatilag elfogadható steril vizes vagy nemvizes oldatokat, diszperziókat, szuszpenziókat vagy emulziókat ugyanúgy, mint felhasználás előtt közvetlenül steril injektálható oldatokká, vagy diszperziókká újraalakítható steril porokat. Jellegzetes példák az alkalmas vizes és nemvizes hordozókra, hígítókra, oldószerekre vagy vivőanyagokra a víz, etanol, polcolok, például glicerin, propilénglikol, polietilénglikol és ezek megfelelő keverékei, növényi olajok, például olíva olaj és injektálható szerves észterek, úgymint etil-oleát. A folyékonyság különböző eszközökkel tartható fenn, beleértve a bevonóanyagok —úgymint lecitin — használatát, a szükséges részecskeméret fenntartását (diszperziók esetében) és felületaktív anyagokat.
A készítmények tartalmazhatnak adjuvánsokat is, úgymint tartósítószereket, nedvesítő szereket, emulgeálószereket, diszpergáló szereket, baktérium- és gombaellenes szereket, úgymint parabént, klorobutanolt, fenolt és szorbinsavat, izotóniás szereket, úgymint cukrokat, nátrium-kloridot, vagy az abszorpci23 ót késleltető szereket, úgymint alumínium-monosztearátot és zselatint. A C5a receptor antagonisták beépíthetők lassú vagy hoszszantartó elengedő vagy célzott szállító rendszerekbe, úgymint polimer mátrixokba, liposzómákba és mikroszférákba.
Az injektálható készítmények számos eszközzel sterilezhetők, beleértve a baktériumokat visszatartó szűrőn keresztül való szűrést, vagy sterilizáló szerek beépítését olyan steril szilárd készítményekbe, amelyek steril vízben vagy más steril injektálható közegben oldhatók fel közvetlenül felhasználás előtt.
A szuszpenziók a C5a analógon és bármilyen más aktív alkotórészen kívül tartalmazhatnak szuszpendáló szereket, úgymint etoxilált izosztearil-alkoholokat, polioxi-etilén-szorbitot és szorbit-észtereket, mikrokristályos cellulózt, alumínium-metahidroxidot, bentonitot, agar-agart, tragacant gumit és ezek keverékeit.
A végbélen vagy hüvelyen keresztül beadásra szánt készítmények rendszerint kúpok, amelyeket előállíthatunk a találmány szerinti polipeptideknek alkalmas, nem-irritáló kötőanyagokkal vagy hordozókkal, úgymint kakóvajjal, polietilénglikollal vagy egy olyan kúpviasszal történő összekeverésével, amely szobahőmérsékleten szilárd, testhőmérsékleten viszont folyékony és ezért megolvad a végbél vagy a hüvely üregében és kiengedi a receptor antagonistát.
Szem kezelésére szolgáló készítmények, szemkenőcsök, porok és oldatok szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.
A találmány szerinti C5a analógokra és dimerekre specifikus poliklonális és monoklonális antitestek előállíthatók standard technikák szerint. Például poliklonális antitestek keletkeznek nagy mennyiségben C5a analóg-hordozó fehérje konjugátum állatba — például nyulakba, kecskékbe, birkákba vagy lovakba — történő injektálásával, anti-C5a analóg antitestek szintjének megemelése céljából [A. Johnstone és R. Thorpe, Immunochemistry in
Practice, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1982)] . A találmány szerinti C5a analógokra specifikus monoklonális antitestek előállíthatok a Kohler és Milstein által közzétett [ Natúré 256, 495-497 (1975) technikák szerint [ lásd még Peters
J.H., Monoclonal Antibodies, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, Germany (1992)] . A C5a analógokra specifikus poliklonális és monoklonális antitestek lényegében szintén nem mutatnak keresztreaktivitást a humán C5a-val. A „lényegében nem mutat keresztreaktivitást kifejezés alatt azt értjük, hogy az anti-C5a analóg antitestek rendkívül alacsony, elhanyagolható keresztreaktivitást mutatnak a humán C5a-val úgy, hogy biológiai mintákban nem mutatható ki endogén úton termelődött C5a által okozott interferencia az instant C5a analógok meghatározására szolgáló analízissel.
A találmány szerinti, C5a analógokra specifikus antitestek különösen alkalmasak a keringésben levő C5a analógok kimutatására és mennyiségi meghatározására olyan alanyban, amelynek előzőleg beadtuk ugyanezt, ugyanúgy, mint a keringésben levő C5a analógok aktivitásának szabályozásában, például semlegesítésében. A keringésben levő C5a analóg kimutatható olyan standard immunológiai technikákkal, amelyek antitesteket használnak fel. Általában folyadék vagy szövet mintát veszünk az alanytól és utána re25 agáltatjuk a C5a analógra specifikus antitesttel — amelyet előzőleg beadtunk az alanynak — az analóg és az antitest közötti immunkomplex kimutatható képződését biztosító alkalmas körülmények között. Egy ilyen immunkomplex kialakulása jelzi az analóg jelenlétét a mintában. Ilyen meghatározásoknál előnyben részesítjük plazma vagy szérum minták használatát. Azonban szövet is felhasználható, úgymint bizonyos vérsejtek, például PMNL-ek. A reakció megléte és/vagy mértéke meghatározható a szakmában ismert módszerek számos változatával, úgymint radioimmun-, enzim immun-, fluoreszcens immunmeghatározással, fluoreszcens mikroszkópiával és hasonlókkal. Mennyiségileg és minőségileg alkalmas immunológiai meghatározási módszereket mutat be J. Butler, Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, CRC Press (1991) könyve.
A keringésben levő C5a analóg kimutatására szolgáló meghatározásokat jellemzően az analóg kezelés alatti szintjének nyomon követésére alkalmazzuk. Ezenkívül a találmány szerinti antitestek előnyösen használhatók gyógyszer-készítményben a keringésben levő C5a analóg aktivitásának szabályozására vagy semlegesítésére. A felhasznált antitest mennyisége molárisán egyenértékű a beadott analóg mennyiségével. A készítmények beadhatók az alanynak parenterálisan. Előnyben részesítjük az intravénás beadást, különösen vészhelyzetben. Az antitesteket injektálható egységnyi adagokba formulázzuk gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal — úgymint só- vagy Ringer-féle oldattal — összekapcsolva.
A találmányt a továbbiakban referenciaként a következő részletezett példákkal írjuk le. Ezek a példák csupán a szemléltetés célját szolgálják és nem jelentik az oltalmi kör korlátozását, ha más kikötés nincs.
1. példa
A humán C5a-t kódoló gén szintézise
A humán C5a gént oligonukleotid kapcsolással szintetizáltuk.
Ennek a szintetikus génnek a kódon használatát E. coli-Ean történő optimális kifejeződésre terveztük. A szintézis stratégiáját az 1. ábra szemlélteti. Ez öt fragmentum olyan N-terminális maradékainak kondenzációjával járt együtt, amelyben a treonint metioninra cseréltük, mivel az AUG kódon a transzlációs iniciáció sokkal nagyobb gyakoriságát eredményezi, mint bármely másik kódon. Az 1. fragmentum egy Shine-Delgarno szekvenciát kódol és a szintetikus gén ATG start kódonját. A 2-5. fragmentumok kódolják a C5a gént.
Oligonukleotid szintézis: az oligonukleotidokat egy gén-összeszerelő berendezésben (Gene Assembler, Pharmacia) szintetizáltuk a szilárd fázisú foszfor-amid módszerrel. A teljesen készre szintetizált oligonukleotidokat leválasztottuk a szilárd oszlopról és koncentrált NH4OH-val 16 órán át, 55 °C-on történő inkubálással deprotektáltűk. Az oligonukleotidokat ezután preparatív gélelektroforézissel tisztítottuk. Az akrilamid koncentráció a 70 bázisnál nagyobb oligonukleotidok esetében alkalmazott 10% és a a kevesebb, mint 40 bázis hosszúságúaknái alkalmazott 20% között változott. Az elektroforézist követően az oligonukleotidokat UV árnyékolással tettük láthatóvá és a legnagyobb molekulatömegű fragmentumot kivágtuk a gélből. A gél sze27 letet üvegbottal elporítottuk egy kémcsőben és a DNS-t 0,1 M trietil-ammónium-dikarbonát (TEAB) puffer pH 7,5, 3,0 ml-ében 16 órán át 37 °C-on inkubálva extraháltuk.
A gél maradékokat centrifugálással eltávolítottuk és az oligonukleotidokat SepPak C-18 oszlopokon (Waters Associates) kromatográfiásan izoláltuk. Az oszlopokat elő-ekvilibráltuk 10 ml acetonitril, 5 ml 30% acetonitril 50 mM TEAB-ben és 10 ml 25 mM TEAB oldatokkal váltakozva többször mosva. Az oligonukleotidokat felvettük, mostuk 10 ml 25 mM TEAB oldattal és 5 ml 50% acetonitril 35,5 mM TEAB-ben oldattal eluáltuk az oszlopról. Frakciókat gyűjtöttünk és — a 260 nm-en mért abszorbancia meghatározás alapján — az oligonukleotidokat tartalmazókat megszárítottuk egy SpeedVac (Savant) készülékben. Oligonukleotid lágyítás (annealing) és kapcsolás: A lágyítás előtt mindegyik oligonukleotidot foszforileztük az 5' végen. A kináz reakció-keverék 40 pl teljes térfogatban 1 pg oligonukleotidot és 12 mM MgCl2-ot, 1 mM DTT-t (ditiotreitolt) és 2 mM ATP-t tartalmazó 77 mM Tris puffért (pH 7,5) tartalmazott. A reakciót egység T4 polinukleotid kináz hozzáadásával indítottuk és hagytuk lezajlani 40 percig 37 °C-on. 10 pl steril vizet adtunk mindegyik kinázos reakcióhoz és pótlólagos oligonukleotidok 48 pl—ét adtuk hozzá, összekevertük és 78 cC-on hőkezelésnek vetettük alá. A hőkamrát kikapcsoltuk és a keveréket hagytuk lehűlni 30 C-ra. A mintákat ezután egy második hőkamrába tettük 68 °C-ra 10 percig, majd újra kikapcsoltuk a hőkamrát és a keveréket hagytuk lehűlni 26 °C-ra. Meglágyult gén fragmentumokat használtunk fel a génnek az M13mpl8 fágban (New England Biolabs) törté28 nő összeszereléséhez. A C5a-t kódoló génnek az M13mpl8 fágban történő összeszereléséhez három teljes ligációs reakció szükséges .
A megfelelő gén fragmentumoknak M13mpl8-ba történő minden egyes ligációs reakcióját követően E. coli JMlOl-et transzformáltunk a ligáit M13 DNS-sel. Az M13 fág izolálását a rekombináns kiónok közül a szerkezet szekvencia analízise követte. A végső C5a gént M13mpl8-ba klónoztuk, hogy megkapjuk az M13mpl8/C5a(1-74)-et. A C5a(l-74) gént ezt követően a pTZ19R és pKK223-3 plazmidokból (mindkettő a Pharmacia-tól) származó pB-6 vektorba szubklónoztuk, hogy megkapjuk a pB-6/C5a(1-74)-et. Lásd a 2. ábrát.
2. példa
A C5a gén irányított mutagenezise
Az oligonukleotid irányította in vitro Mutagenesis System
Version 2 (Amersham), a C5a-t tartalmazó Ml3mpl8/C5a(1-74) vektorból származó egyszálú DNS és egy mutagén oligonukleotid alkalmazásával irányított mutációt végeztünk. A C5a-ban a Cys27Ser mutációt végeztük el az ACGGTGCTTCTGTTAACA (6. számú szekvencia) mutagén oligonukleotid felhasználásával, az előállító által megadott eljárást követve. 4 plakkot analizáltunk di-dezoxi DNS szekvenálással a hibátlan Cys27Ser mutáció kimutatására. A hibátlan mutáns kiónok egyikéből kétszálú DNS-t izoláltunk és restrikciósán hasítottuk Pstl-gyel és BamHI-gyel. A mutációt tartalmazó 230 bp fragmentumot szubklónoztuk a pB-6 vektorba. Az eredményül kapott pB-6/C5a(1-74, C27S) plazmidot újra szekvenáltuk a di-dezoxi módszerrel a mutáció megerősítésére.
3. példa
A C5a gén kazetta-mutagenezise
A pB-6/C5a(1-74,C27S) vagy pB-6/C5a (1-74) plazmidokat restrikciósán hasítottuk EcoRI-gyel és HindlII-mal és szubklónoztuk a szintén ugyanezekkel az enzimekkel hasított pWCB vektorba, hogy megkapjuk külön-külön a C5a(1-74,C27S)-t kódoló gént tartalmazó pWCB112 és a C5a(l-74)-et kódoló gént tartalmazó pWCBIOO plazmidokat. Ezután a plazmidokat kazetta-mutagenezisben használtuk fel új gének sorozatának előállítására. A kazettamutagenezisben felhasznált oligonukleotidokat Applied Biosystem
381A DNS szintetizáló készülékkel állítottuk elő szilárd fázisú foszfor-amid eljárással a gyártó utasításai szerint.
Körülbelül 60 pg pWCB112-t tartalmazó 10 pl TE-t kevertünk össze 6 pl 60 E PvuII-t és 3 pl 60 E HindlII-at (New England
Biolabs) tartalmazó TE-vel és 10 pl 10 x só pufferrel (1 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M MgCl2, 10 mM DTT) és 71 pl kétszer desztillált vízzel 100 pl teljes térfogatra töltöttük fel. Ezt az oldatot 37 °C-on 16 órán át inkubáltuk. Az ilyenformán linearizált, körülbelül 4,5 kb vektort 1%-os agaróz gél felhasználásával preparatív elektroforézissel tisztítottuk, amelyet a
DNS fragmentumnak a kivágott agaróz gél szeletből való elektroelúciója követett. A visszanyert DNS fragmentumot Eppendorf csőbe vittük át, hozzáadtunk 1 ml abszolút etanolt és 10 percig
14000 rpm mellett centrifugáltuk Eppendorf centrifugában. A DNS pelletet vákuumban szárítottuk és ezt követően 45 pl TE puffer30 ben (1 mM EDTA-t tartalmazó 10 mM Tris-HCl pH 7,4) oldottuk, pWCB112/A-t kapva eredményül.
bp 5' CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCTA3' (7. számú szekvencia) és 39 bp 5' AGCTTAGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG3' (8.
számú szekvencia) hosszúságú egyszálú oligonukleotidokat tisztítottunk preparatív elektroforézissel 8%-os poliakrilamid gélen. Az elektroforézist követően az oligonukleotidokat UV árnyékolással tettük láthatóvá és a megfelelő fragmentumot kivágtuk a gélből. A gél szeletet üvegbottal elporítottuk egy kémcsőben és a DNS-t 0,1 Μ TEAB puffer pH 7,5, 3,0 ml-ében 16 órán át 37 5C-on inkubálva extraháltuk. A gél maradékokat centrifugálással eltávolítottuk és az oligonukleotidokat SepPak C-18 oszlopokon (Waters Associates) kromatográfiásan izoláltuk. Az oszlopokat elő-ekvilibráltuk 10 ml acetonitril, 5 ml 30% acetonitril 50 mM
TEAB-ben és 10 ml 25 mM TEAB oldatokkal váltakozva többször mosva. Az oligonukleotidokat felvettük, mostuk 10 ml 25 mM TEAB oldattal és 5 ml 50% acetonitril 35,5 mM TEAB-ben oldattal eluáltuk az oszlopról.
Frakciókat gyűjtöttünk és — a 260 nm-en mért abszorbancia meghatározás alapján — az oligonukleotidokat tartalmazókat megszárítottuk egy SpeedVac (Savant) készülékben. A 35 és 39 bp hosszúságú oligonukleotidoknak kettős szálú DNS képzéséhez történő lágyítását — a restrikciósán hasított pWCB112/A vektorba történő ligációhoz — mindegyik oligonukleotid egyenlő mennyiségeinek Klenow pufferrel (0,01 M MgCl2-ot tartalmazó 0,05 M TrisHCl pH 7,6) történő összekeverésével, a mintának 10 perc alatt 95 °C-ra való hevítésével és ezt követő 2 órás időtartam alatti ···· ,, ?1 szobahőmérsékletre történő visszahűtésével végeztük el. A kettős szálú DNS-t a restrikciósán hasított pWCB112 vektorba ligáltuk az inszertnek a vektorhoz képest 3-szoros fölöslegét alkalmazva, μΐ, 2 Ε T4 DNS ligáz (BRL) segítségével. A reakció 17 órán át futott 4 °C-on.
Alapvetően ugyanezt a technikát alkalmazva, számos molekulát készítettünk csupán csak eltérő oligonukleotidok és vagy pWCBIOO, vagy pWCB112 használatával. Ezeket az alábbi 2. táblázatban mutatjuk be.
·· · ·
Ί
2. táblázat
A C5a(l-74) vagy a C5a (1-74,C27S) gén kazetta-mutagenezisével előállított C5a analógok analóg száma a kódolt C5a analóg és az alkalmazott oligonukleotid-szekvenciák
1. C5a(1-64,C27S,N64C)
CTGCGTGCTTGCTA ( 9. számú szekvencia)
AGCTTAGCAAGCACGCAG (10. számú szekvencia)
2. C5a(1-65,C27S,I65C)
CTGCGTGCTAACTGCTA (11. számú szekvencia)
AGCTTAGCAGTTAGCACGCAG (12. számú szekvencia)
3. C5a (1-66,C27S,S66C) CTGCGTGCTAACATCTGCTA (13. számú szekvencia) AGCTTAGCAGATGTTAGCACGCAG (14. számú szekvencia)
4. C5a(1-67,C27S,H67C) CTGCGTGCTAACATCTCTTGCTA (15. számú szekvencia) AGCTTAGCAAGAGATGTTAGCACGCAG (16. számú szekvencia)
5. C5a (1-68,C27S,K68C) CTGCGTGCTAACATCTCTCACTGCTA (17. számú szekvencia)
AGCTTAGCAGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (18. számú szekvencia)
C5a(1-69,C27S,D69C) CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAATGCTA (19
AGCTTACGATTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (2 0
C5a(1-70,C27S,M70C) CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACTGCTA (21 számú szekvencia) számú szekvencia) számú szekvencia)
AGCTTAGCAGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (22. számú szekvencia) cia)
8. C5a(1-71,C27S,Q71C)
CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCTA (23. számú szekvencia)
AGCTTAGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (24. számú szekven33
9. C5a(1-72,C27S, L72C)
CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCAATGCTA (25. számú szekvencia)
AGCTTAGCATTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (26. számú szekvencia)
10. C5a(1-73,C27S,G73C)
CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCAACTGTGCTA (27. számú szekvencia) AGCTTAGCACAGTTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (28. számú szekvencia)
11. C5a(1-74,C27S,Q71C)
CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCCTGGGTCGTTA (29. számú szekvencia)
AGCTTAACGACCCAGGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (30. számú szekvencia)
12. C5a(1-73,C27S,Q71C)
CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCCTGGGTTA (31. számú szekvencia) AGCTTAACCCAGGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (32. számú szekvencia)
13. C5a(1-72,C27S,Q71C)
CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTGCCTGTA (33. számú szekvencia)
AGCTTACAGGCACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (34. cia)
14. C5a(1-74,R74C)
CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCAACTGGGTTGCTA (35. számú szekvencia)
AGCTTAGCAACCCAGTTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG számú szekven(36.
számú szekvencia)
15. C5a(1-71,C27S) CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCAATA (37. számú szekvencia)
AGCTTATTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (38. számú szekvencia)
16. C5a(1-71,C27S,Q71D) CTGCGTCCTAACATCTCTCACAAAGACATGGACTA (39. számú szekvencia)
AGCTTAGTCCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (40. számú szekvencia)
17. C5a(1-71,C27S,Q71S)
CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGTCTTA (41. számú szekvencia)
AGCTTAAGACATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (42. számú szekvencia)
18. C5a(1-71,C27S,Q71H)
CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCACTA (43. számú szekvencia)
AGCTTAGTGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (44. számú szekvencia)
19. C5a(1-71,C27S,Q71R)
CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCGTTA (45. számú szekvencia)
AGCTTAACGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (46. számú szekvencia)
20. C5a(1-71,C27S,Q71L)
CTGCGTGCTAACATCTCTCACAAAGACATGCTGTA (47 AGCTTACAGCATGTCTTTGTGAGAGATGTTAGCACGCAG (4 8 számú szekvencia) számú szekvencia)
21. C5a(1-71,C27S,H67F,Q71C)
CTGCGTGCTAACATCTCTTTCAAAGACATGTGCTA (49. számú szekvencia)
AGCTTAGCACATGTCTTTGAAAGAGATGTTAGCACGCAG (50. számú szekvencia)
A 10-20. számú analógok agonisták, és nem tartoznak a találmány oltalmi körébe. Összehasonlítás céljából vettük be azokat. A 8. számú analóg dimer formájának előállítását az 5c. példában írjuk le, alább. Ezt 22. számú analógként jelöljük.
A 21. számú analógot kódoló polinukleotid komplett nukleotidszekvenciáját az alábbi 3. táblázatban tesszük közzé.
• · . ······· « · · · · · *··#····*···
3. táblázat
GAA-TTC-CCA-CTC-AAA-ATA-AGG-AGG-AAA-AAA-AA
EcoRI
ATG-CTG-CAG-AAG-AAA-ATC-GAA-GAA-ATC-GCT start
GCT-AAG-TAC-AAA-CAC-TCT-GTT-GTT-AAA-AAA
TGC-TGC-TAC-GAC-GGT-GCT-TCT-GTT-AAC-AAC
Hpal
GAC-GAA-ACT-TGC-GAA-CAG-CGT-GCT-GCT-CGT
ATC-TCT-CTG-GGC-CCG-CGT-TGC-ATC-AAA-GCA
Apai
TTC-ACT-GAA-TGC-TGC-GTT-GTT-GCT-TCT-CAG
Pvull
CTG-CGT-GCT-AAC-ATC-TCT-TTC-AAA-GAC-ATG
TGC-TAA-GCT-T (51. számú szekvencia)
HindlII
A szakember azonban helyesen ítéli meg, hogy ugyanazon C5a analógot kódoló számos polinukleotid állítható elő a genetikai kód degenerációjának köszönhetően [Watson et al., Recombinant DNA, 2nd Ed. Freeman, NY (1993)] .
4. példa
A C5a és C5a analógok kifejezése E. coli-ban
A kifejeződés eléréséhez a 2. táblázatban közzétett C5a analógokat kódoló szintetikus géneket szubklónoztuk a módosított pKK223-3 (Pharmacia) expressziós vektorba, a pWCB vektorba, amelyben egy BamHI helyet kivágtunk és egy Pvull helyet Pvul-re cseréltünk és amely tartalmazta az izopropil-tio-B-D-galaktozid (IPTG) által indukálható tac promótert és egy ampicillin rezisz• · • · · · tencia gént. Az LCIQ E. coli törzs az LC137 törzsnek (Ion, htpR) származéka [ Goff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 66476651 (1984)] . Tartalmaz egy F' faktort kódoló lacIQ-t a
DHalfaF' IQ törzsből (BRL laboratories) és az expressziós plazmidok gazdaszervezete volt. A megfelelő expressziós plazmidot tartalmazó E. coli LCIQ törzset 30 °C-on, LB táptalajban 1 OD5S0 eléréséig tenyésztettük. A tenyészetet 3 órán keresztül 2,5 mM végső koncentrációjú IPTG-vel indukáltuk. A sejteket ezután centrifugálással kinyertük és felhasználásig -80 °C-on tároltuk .
5a. példa
A C5a és C5a analógok újrahajtogatása és tisztítása
Rekombináns fehérjét izoláltunk a 4. példából, a lefagyasztott E. coli sejtek masszájának kis részleteiből 6 M guanidinhidrokloridot tartalmazó pufferben (5:1 v:w, puffer:sejt massza) történő felengedtetés után. A sejteket szonifikálással feltártuk és a terméket egy éjszakán át 50 mM Tris-HCl pufferrel (pH 8,0) szemben dializáltuk, amely a renaturálódás elősegítésére vagy 1 mM ciszteint és 1 mM cisztint, vagy 1 mM redukált/oxidált glutationt tartalmazott. A dializátumot ezután 6 N sósav adagolásával pH 3-ra savanyítottuk. A csapadékot centrifugálással eltávolítottuk és a felülúszót DeltaPak C18, 100 Á, 15 mikron paraméterekkel rendelkező reverz fázisú HPLC oszlopon (Waters) tisztítottuk 25-35% acetonitril vízben lineáris gradiens alkalmazásával 0,1% TFA jelenlétében 30 percig. Az oszlopról körülbelül 28% acetonitrilnél eluált fő csúcsot összegyűjtöttük és liofileztük.
• · · ·
Ez a frakció tartalmazta a C5a analóg glutation adduktját (a 2. táblázatból az 5., 7., 8., 9. és 21. analógok adduktjait) vagy a C5a analóg cisztein adduktját (a 2. táblázatból a 8. analóg adduktját) .
A C5a analóg gén termék cisztein adduktjának körülbelül 0,002 mmól-ját oldottuk 0,1 M Tris puffer (pH 7,4) 50 ml-ében. 0,002 mmól DTT-t adtunk hozzá. 4 óra elteltével a C-terminális Cys-Cys kötéseknek körülbelül 80%-át szabad ciszteinekké alakítottuk át, és a terméket C4, 300 A, 15 mikron paraméterekkel rendelkező reverz fázisú oszlopon (Alltech) tisztítottuk 25-35% acetonitril vízben lineáris gradiens alkalmazásával 0,1% TFA jelenlétében 30 percig. A terméket tartalmazó frakciókat, amelyek körülbelül 29% acetonitrilnél eluáltak liofileztük és utána kiszárítva, vákuum alatt 4 °C-on tároltuk.
5b. példa
A C5a és C5a analógok újrahajtogatása és tisztítása
Rekombináns fehérjét izoláltunk a 4. példából, a lefagyasztott E. coli sejtek masszájának kis részleteiből 6 M guanidinhidrokloridot tartalmazó pufferben (5:1 v:w, puffer:sejt massza) történő felengedtetés után. A sejteket szonifikálással feltártuk és a terméket 20-szorosára hígítottuk 1 mM redukált/0,01 mM oxidált glutationt tartalmazó 100 mM Tris-HCl pufferrel (pH 7,4).
óra elteltével az oldatot 6 N sósav adagolásával pH 3-ra savanyítottuk. Az eredményül kapott csapadékot centrifugálással eltávolítottuk és a felülúszót DeltaPak C18, 100 A, 15 mikron reverz fázisú HPLC oszlopon (Waters) tisztítottuk 25-35% • · · · · · • · · · · • · · · acetonitril vízben lineáris gradiens alkalmazásával 0,1% TFA jelenlétében 30 percig. Az oszlopról körülbelül 30% acetonitrilnél eluált fő csúcsot összegyűjtöttük és liofileztük. Az ilyenformán izolált C5a analóg redukált tiol csoportot tartalmazó Cterminális ciszteinnel rendelkezett.
5c. példa
C5a analóg dimerek képzése
C-terminális régiójukban szabad tiol csoporttal rendelkező C5a analógokat alakítottunk át monomer formából (az 5b. példában leírtak szerinti újrahajtogatás után) dimer formává.
A rekombináns fehérjét a 4. példából a fagyott E. coli massza kis részleteiből izoláltuk, az 5b. példa szerint 1 mM redukált/0,01 mM oxidált glutation keveréket tartalmazó 100 mM TrisHCl puffer (pH 7,4) felhasználásával újrahajtogattuk. 4 óra elteltével az oldatot 6 N sósav adagolásával pH 3-ra savanyítottuk. Az eredményül kapott csapadékot centrifugálással eltávolítottuk és a felülúszót 25 mM pH 7,0 pufferrel ekvilibrált SPSpherodex ioncserélő oszlopon abszorbeáltuk. Az oszlop 25 mM Tris-szel pH 7,0 történt mosása után a C5a analógot 0,75 M NaClot tartalmazó 25 mM Tris pufferrel (pH 7,0) eluáltuk. A részlegesen tisztított C5a analóg pH-ját 3,0-ra állítottuk be hangyasavval és desztillált vízzel addig hígítottuk, amíg egy körülbelül 45 mS/cm konduktivitású fehérje oldatot kaptunk, és 0,6 M NaCl-ot tartalmazó 50 mM hangyasavval (pH 3,5) ekvilibrált SP-HP ioncserélő oszlopon abszorbeáltuk. A C5a analóg 0,6-1,0 M NaCl mM hangyasav pufferben (pH 3,5) lineáris gradiens alkalmazd• · • · · » ··········· sával eluált az oszlopról. Az oszlopról eluáló fő csúcsot körülbelül 0,725 M NaCl-nál gyűjtöttük. Az így izolált C5a analóg Cterminális cisztein maradéka redukált tiol csoporttal rendelkezett. A pH beállítása 7,0-re 25%-os vizes ammónia oldattal és az oldat tárolása a molekula dimer formájának kialakulását eredményezte. pH 7,0-nél, körülbelül 0,3-0,6 mg/ml fehérje koncentrációnál és 4-8 °C-on történő tárolásnál az átalakulás legalább 80%-ban lejátszódott 2 nap alatt. A C5a analóg dimer formáját végül DeltaPak C18, 100 Á, 15 mikron paraméterekkel rendelkező reverz fázisú HPLC oszlopon (Waters) tisztítottuk 25-40% acetonitril lineáris gradiens alkalmazásával 0,1% TFA jelenlétében 30 percig. Az oszlopról körülbelül 33% acetonitrilnél eluált fő csúcsot összegyűjtöttük és liofileztük. Az így izolált molekula az E. coli expressziós rendszer által termelt C5a analóg dimerje.
6. példa
A receptorhoz kötődés meghatározása
C5a-t és C5a receptor antagonistát vizsgáltunk C5a receptor125 hoz való affinitásuk szempontjából. [ I] BH-jelölésű C5a [ Harris et al., J. Receptor Rés. 11, 115-128 (1991)] kötődését mértük
PMNL membránokhoz Rollins és munkatársai leírása szerint [ J.
Bioi. Chem. 263, 520-526 (1988)] Braunwalder és munkatársai [Mól. Immunoi. 2 9(11), 1319-1324 (1992)] módosításaival. PMNLeket újra szuszpendáltunk Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldatban Ca++ és Mg++ nélkül, és amely 10 mM HEPES-t pH 7,3, 2,5 mM MgCl2ot, ml-enként 100 egység DN-áz I-t, 0,1 mM PMSF-et, 10 pg/ml aprotonint és 10 pg/ml leupeptint tartalmazott. Ezután ekvilibráltuk azokat 400 psi-nél 20 percig 4 °C-on egy nitrogén kavitációs bombában. 3 térfogatnyi, 25 mM EDTA-t és a fent felsorolt proteáz inhibitorokat tartalmazó 0,5 M KHCO3-ba történő felvétel után a gélszerű anyagot csipesszel eltávolítottuk és a keveréket 400 x g mellett 10 percig 4 °C-on centrifugáltuk. Az eredményül kapott felülúszót 50000 x g mellett 60 percig 4 °C-on centrifugáltuk. 200 x 10 sejtet reprezentáló kis részletekből a pelleteket -70 °C-on tároltuk. A kötődési vizsgálatokhoz ezeket a membránokat újra szuszpendáltuk 20 x 10 sejt/ml 1 mM CaCl2-ot, 5 mM MgCl2-ot, 0,1 mM PMSF-et, 0,1% bacitracint és 0,5% BSA-t tartalmazó 50 mM HEPES (pH 7,3) egyenértékben. További, ugyanazzal a pufferrel történő, 1:75 hígítás után ennek a szuszpenziónak
400 μΙ-ét adtuk olyan kettősfalú csövekbe, amelyek 50 μΐ 125 [ I] BH-jelölésű C5a-t (specifikus aktivitás 2200 Ci/mmól, végső koncentráció 4,0 pM) , és 50 μΐ puffért vagy az inhibitor sajátságokhoz különböző koncentrációban, tesztelésre szánt C5a analógot tartalmaztak.
Nem-specifikus kötődést határoztunk meg 10 nM nem-jelölt C5a jelenlétében. A kötődési reakció megkezdődött a PMNL membránok hozzáadásával és folytatódott 120 percig 4 °C-on. A kötött és szabad radioaktivitást vákuum szűréssel választottuk el — 90 percig 0,05% PEI-vel (polietilén-iminnel) előkezelt — GF/C üvegszálas szűrőn (Whatman), egy sejt leszedő (Cell Harvester,
Brandel Gaithersburg, MD) alkalmazásával. A szűrőket 3 x 5 ml jéghideg 5 mM Tris pufferrel (pH 7,4) mostuk és többforrású Gamma számlálóval (Genesys) számláltuk. Az adatokat az RS/1 nem41 ···· ··· · • · ·« β · « * · · ···· ·· · ·· · lineáris regresszió analízis programmal (Bolt, Beranek and Newman, Boston) analizáltuk és mint IC50 értékeket fejeztük ki. Az eredményeket alább a 4. táblázatban adjuk közre mint értékeket, felhasználva a Cheng-Presoff-féle kiegyenlítést [ Braunwalder et al., fent] .
4. táblázat
C5a analógok receptor kötési vizsgálatai
C5a analóg glutation glutation glutation
Cys
15*
16*
17*
18*
19*
0*
C5a *= agonista; a baloldali oszlop
Receptor kötés
1, 85
1.7 7,2
2.8 0,9 0,2 0,4 3,0
8.5
7.5 0,15 0,35 0, 035 0,1 0,04 0,0035 számai a 2. táblázatra utalnak
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti C5a analógok nanomoláris Κ±-νβ1 kompetitíven kiszorítják a vad típusú C5a-t.
A találmány szerinti C5a analógok a C5a receptorral szemben affinitással rendelkeznek, amelyet Kaként mértünk a Braunwalder * * ♦ « · · · ··*··«·*·« és munkatársai (lásd fent) által közzétett kompetitív kiszorítás 125 .
meghatározásban (Bolton-Hunter-féle [ I] jelölt C5a, radioligandum felhasználásával). A kisebb, mint körülbelül 1,0 x — 8 —9
M, előnyösen kisebb, mint körülbelül 2,0 x 10 M, és még előnyösebben kisebb, mint körülbelül 1,0 x 10 10 M.
7. példa
C5a kiváltotta Ca++ emelkedés
Rekombináns humán C5a-t oldottunk 0,01% Tween-20-at tartalmazó Hanks pufferben, és a C5a minden törzsoldatát ebben a pufferben készítettük el. A fura-2 (fura-2AM, Molecular Probes) acetoxi-metilészterét DMSO-ban oldottuk. Neutrofileket tisztítottunk humán perifériás vérből 6%-os heta-keményítőben (HESPAN, DuPont, Waukegan, IL) történő szedimentációval, amelyet számláló áramlásos elutriáció [ Chapman-Kirkland et al., J. Immunoi. Meth. 142, 95-104 (1991)] követett. A tisztított sejteket (2 x 106/ml)
0,2 μΜ fura-2AM-mel kevertük össze és 30 percig 37 °C-on inkubáltuk HEPES-sel pufferolt, kalcium és magnézium mentes Hanks-féle oldatban. A meghatározás előtt 15 perccel a sejtszuszpenziót keverővei ellátott küvettába vittük át és kalciumot adagoltunk 1 mM-ig. A sejtszuszpenziót keverés mellett inkubáltuk 37 °C-on. A meghatározásokat 5 órás sejttisztításon belülre időzítettük, és periodikusan jutottunk standard kontroll válaszhoz, biztosítva, hogy a sejt válaszok nem változtak a kísérlet ideje alatt. A fluoreszcencia mértékét SLM 8000 spektrofluorométer (SLM-Aminco
Instruments, Urbana, IL) segítségével határoztuk meg. A küvettákat behelyeztük a fluorométerbe és miután megkaptuk az alapvonalat 10 másodpercig, az antagonista sajátságokra vizsgálandó C5a i
• · · ··*· receptor antagonistákat tettük be és mértünk a 340 nm/380 nm fluoreszcencia gerjesztés arányban (510 nm emissziójában) bekövetkező bármilyen változást. Az analógok adása után 40 másodperccel C5a kihívó dózisát adtuk 100 pM végső koncentrációig és mértük a gerjesztési arányban eredményezett változást.
IC50 értékeket használtunk az antagonista potenciál mérésére. Ezeket az értékeket a 100 pM-os C5a kihívó dózis kalcium-emelkedés válaszának 50%-os csökkentéséhez szükséges C5a analóg koncentrációjaként definiáljuk. ECS0 értékeket használtunk az agonista potenciál mérésére. Az EC50 értéket azon C5a analóg koncentrációval definiáljuk, amely az analóg nyújtotta maximális kalcium-emelkedés válasz 50%-át eredményezi. Az eredményeket alábbi 5. táblázatban mutatjuk be.
5. táblázat
C5a kiváltotta kalcium-emelkedés vizsgálatok C5a analógokon analóg kalcium-emelkedés (nm) IC50 ec50
9 glutation (antagonista) 1000 (agonista) NM
8 glutation 2000 NM
7 glutation 2000 NM
8 Cys 105 NM
9 43 NM
8 14 NM
7 54 NM
15 NM 90
16 NM 310
17 NM 120
18 NM 150
19 NM 40
·· ·· ···· · · ···· ··· ·· • · · · · · · • · · · · ···· ·· · ·· ···
20 NM 75
21 6 NM
22 10 NM
C5a NM 0,07
NM = nem mérhető
g
A 7. számú C5a analógot 1,0 x 10 M koncentrációig, a 8. számú C5a analógot 3, 0 x 10 M koncentrációig, a 9. számú analógot
-7
1,5 x 10 M koncentrációig és a 21. számú analógot 8,0 x 10 M koncentrációig vizsgáltuk. Egyik esetben sem mutattunk ki agonista aktivitást. Az eredmények, amelyeket a 2. táblázatban közzétett adatokkal együttesen analizáltunk, azt sugallják, hogy a találmány szerinti analógok a C5a kompetitív inhibitoraiként működnek. Ezek azt bizonyítják, hogy a legmagasabb potenciál eléréséhez az analógok C-végének nem kötött ciszteinnek vagy olyan cisztein maradéknak kell lennie, amely diszulfid hídon keresztül kapcsolódik egy másik, találmány szerinti C5a analóggal.
8. példa
Nyúlbőr-gyulladás modell
Minden kísérletet 2,5-3,0 kg-os hím New Zealand White nyulakkal végeztünk. A nyulak hátát leborotváltuk és a bőrön 40-50 helyet megjelöltünk különböző színekkel. Különböző stimulusokat (azaz C5a-t, C5a analógot, C5a + C5a analógot, vivőanyag kontrollt stb.) injektáltunk a bőrbe 0,1 ml/hely koncentrációban steril, szabályozható, 26 osztásos, 0,5 inch méretű tű és 1,0 cc tuberkulin fecskendő felhasználásával. A bőrbe adott injekciókat hat példányban adtuk be, nagyjából 45 perccel az eutanizáció « · előtt. A C5a-t egyedül 50 ng/hely dózisban injektáltuk, és a C5a receptor antagonistákat különböző koncentrációkban a C5a ugyanazon dózisával együtt injektáltuk. Az eutanizáció előtt 20 perc125 cél 18-36 pCi [ I]-jelölésű marha szérum albumint 1,0 ml fiziológiás sóoldatban vittünk be a szisztémás keringésbe a fülhöz tartozó szélső vénán keresztül. 45 percnél a nyulat végleg elaltattuk nátrium-pentobarbitál intravénás túladagolásával. 5,0 ml perifériás vérmintát nyertünk kardiális punkcióval, 2000 rpm mellett 10 percig centrifugáltuk, és 1,0 ml plazmát gyűjtöttünk 125 és referenciaként használtuk a plazma I mennyiségének meghatározására. A halál beállta után kivágtuk a hát bőrét és feltűztük egy fából készült boncoló deszkára. A bőr fő erezetéből a vért kézzel a perifériák felé préseltük. Ez az eljárás mérsékelte a bőr részek közötti eltéréseket és csökkentette a háttér radioaktivitást. A gyulladásos léziókat ezután kilyukasztottuk a bőrből 15 mm-es dugófúró és kalapács segítségével és 12 x 75 mm-es polisztirén csövekben tároltuk. Az injekciós helyeket ezután radioaktív tartalmukra analizáltuk egy gamma számláló (Gamma
125
Counter, Genesys) alkalmazásával. A véredényekből kiizadt [ I] jelölésű marha szérum albumin (bovine serum albumine = BSA) — amely a gyulladásos helyekre lokalizálódott — mennyiségét közvetlenül arányosnak találtuk az erek áteresztőképessége (vascularis permeábilitás) fokozódásának mértékével. A C5a analóg IDS0 értéke ennek a C5a analógnak az a dózisa, amely az ugyanarra a helyre együtt injektált 50 ng C5a által előidézett radioaktivitásban 50%-os csökkenést okoz.
A 8. számú (a 2. táblázatban) C5a analógnál azt találtuk, hogy 70 ng/hely IDS0-nel rendelkezik, és nem okoz előzetes gyulladásos reakciót 175 ng/hely dózisban. Ez az eredmény azt mutatja, hogy az analóg in vivő antagonista és nem mutat agonista sajátságokat in vivő.
9. példa
C5a kiváltotta neutropénia nyálban
Minden kísérletet 2,5-3,0 kg-os hím New Zealand White nyulakkal végeztünk. A nyulakat elaltattuk 10 mg/kg xilazin és 50 mg/kg ketamin kombináltan, izomba történő beadásával. 25 osztásos pillangós katétert szúrtunk be az oldalsó fül vénába infúziókhoz. Minden egyes vérmintát (0,2 ml-t) a központi fül artériából egy 25 osztásos, 5/8 inch méretű tűvel ellátott műanyag fecskendőbe gyűjtöttünk és antikoagulánsként 7,5%-os EDTA-val egészítettük ki. A vért azonnal 10 pl 7,5%-os EDTA-t tartalmazó mikrocentrifuga csövekbe vittük át. Egy kezdeti artériás vérmintát (#1) vettünk és ezt követően azonnal vivőanyagot vagy a 8. példa szerinti C5a analógot adtuk be infúzióval intravénásán (bolus injection). 20 másodperccel később egy második vérmintát (#2) vettünk és ezután 20 másodperccel 0,2 ml térfogatban 100 ng C5a-t adtunk be infúzióval intravénásán (bolus injection). 20 másodperccel később egy harmadik vérmintát (#3) vettünk. 30 perccel később egy második sorozatot végeztünk: (#4) vérminta -20 másodperc -- C5a infúzió -- 20 másodperc -- (#5) vérminta. A vérmintákat automatizált hematológiás analízissel (Technicon
Η*1) értékeltük specifikusan nyúl vérre vonatkozó szoftver felhasználásával. A neutrofilek (neutrofil leukociták) millilite47 ···· ·· · ·· ··· renkénti számának C5a kiváltotta csökkenését (a #3-nak a #2 vérmintához, és az #5-nek a #4 vérmintához való viszonyításával meghatározott, C5a kiváltotta neutropéniát) összehasonlítottuk a vivőanyaggal kezelt és C5a analóggal kezelt állatoknál. A C5a analóg nem változtatta meg az alap neutrofil számot a normálishoz képest, azaz a C5a analóg nem mutatott agonista (C5a-hoz hasonló) tulajdonságokat. A C5a analóggal kezelt nyulakban a C5a kiváltotta neutropénia szignifikánsan gátolt volt (P>0,05) öszszehasonlítva a vivőanyaggal kezelt nyulak 67%-ával és 41%-ával a 40 másodperces és 30 perces C5a kihívási intervallumnál, külön-külön. Ezek az eredmények bizonyítják a C5a analógok módszeres beadásának hatékonyságát.
10. példa
C5a analógok összehasonlító receptor kötődése és C5a kiváltotta kalcium-emelkedés vizsgálata a H-Ile-Ser-Phe-Lys-Asp-Met-GlnLeu-Gly-Arg-OH (52. számú szekvencia) dekapeptiddel
Öt C5a analógot készítettünk (5., 7., 8., 9. és 10. számúakat a 2. táblázatból) és futtattunk C5a receptor kötési és C5a receptor kalcium-emelkedés analízisekben, és összehasonlítottuk az Or és munkatársai által közzétett szintetikus dekapeptiddel [I.
táblázat, 14. számú in: J. Med. Chem. 35, 402-406 (1992)] . Ennek a kísérletnek az eredményeit az alábbi 6. táblázatban mutatjuk be.
6. táblázat
Vegyület Receptor kötés Ca++ emelkedés
Λ 48 • • · · · • · · ·« · · • · · · · · • · · · • · · · · · ·
Κ± (nM) IC50(nM) EC50 (nM)
5. analóg 0,06 84
7. 0, 35 859
8. 0, 04 51
9. 0, 15 621
10. 0, 03 0, 6
C5a (1-74) 0,0035 0,07
dekapeptid 5000 2058
Ezek az eredmények megmutatják, hogy a vizsgált, találmány szerinti C5a analógok a receptorhoz 10000-14000-szer nagyobb kötődési affinitással rendelkeznek, mint a dekapeptid. A fenti adatok azt is mutatják, hogy a találmány szerinti C5a analógok olyan C5a receptor antagonista molekulák, amelyek lényegében nem mutatnak agonista aktivitást, miközben a dekapeptid szignifikáns agonista aktivitást mutat.
11. példa
C5a(1-71,C27S,Q71C)-re specifikus poliklonális antitestek előállítása
Antigén készítés:
C5a(1-71,C27S,Q71C) 1 mg-ját konjugáltuk 2 mg Keyhole Limpet féle hemocianinhoz (KLH) az Imject Immunogen EDC konjugációs kit (Pierce Chemical Co. , Rockford, IL, USA) felhasználásával, a gyártó utasításait követve. A konjugáció hatékonyságát 3500 cpm 125
I-jelölésű C5a (New England Nuclear, Boston, M.A.) hozzáadásával követtük. A konjugátum végső térfogata 2,25 ml, amely 0,34 mg C5a(1-71,C27S,Q71C)-t (0,15 mg/ml) és 0,9 mg/ml-nek becsült
KLH-t tartalmazott.
• · · ·
Anti- C5a(1-71,C27S,Q7IC) antiszérum előállítása:
C5a(1-71,C27S,Q71C) konjugátumot (0,5 ml-t) homogenizáltunk 0,5 ml Freund-féle komplett adjuvánssal (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) . Millbrook Farm-ról (Amherst, MA) beszerzett nőstény New Zealand White nyulakat oltottunk bőr alá (subcutan) két helyen (0,2 ml homogenizátummal helyenként) a lapocka (scapula) területén. 21 nap múlva megismételtük az eljárást. További injekciókat végeztünk Freund-féle inkomplett adjuváns (Sigma) felhasználásával; a harmadik injekciót teljes 55 nap eltelte után adtuk be, és egy negyediket a 126. napon. Minden injekció után a 3. és 5. hét között vért (körülbelül 30 ml-t) vettünk a nyulaktól, hagytuk megalvadni és eltávolítottuk a szérumot.
Peptid-rögzítés az antitest adszorpcióhoz:
C5a(1-71,C27S,Q71C)-t vagy C5a-t (1 mg-ot) konjugáltunk 2 mg marha szérum albuminhoz (BSA) az Imject Immunogen EDC konjugáci12 5 ős kit (Pierce Chemical Co.) és a hatékonyság követésére Ijelölésű C5a alkalmazásával, ahogyan azt fent leírtuk. A C5a(l71, C27S,Q71C)/BSA végső térfogata 0,25 mg/ml C5a(l71,C27S,Q71C) mellett 2,25 ml; a C5a/BSA végső térfogata 0,32 mg/ml C5a mellett volt 2,25 ml. Mindkét konjugátum 0,9 mg/ml-nek becsült BSA-t tartalmazott.
A két peptid konjugátumot nátrium-karbonáttal pH 8,6-ra pufferolt 0,2 M nátrium-hidrogénkarbonáttal szemben dializáltuk. Mindkét konjugátumhoz 2 ml — ugyanabban a pufferben előmosott — AH(aminohexil)-agaróz gélt (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) aktiváltunk 1% v/v végső koncentrációjú glutáraldehid hozzáadásával, 15 percig 20 °C-on inkubálva. A gélt alaposan mostuk puf• · • · · ·
ferben a glutáraldehid eltávolítása céljából, azután hozzáadtuk a konjugátum oldatokat és 20 °C-on 1 órát inkubáltuk. A nem kötődött fehérjét leöblítettük a gélről és a megmaradt kötő helyeket 20 ml 0,2 M glicil-glicinnel 4 °C-on egy éjszakán át tartó inkubálással blokkoltuk. A gélt 0,5 cm x 10 cm-es üveg oszlopba helyeztük és alaposan mostuk 0,1% nátrium-azidot tartalmazó Dulbecco-féle, pH 7,2 foszfát pufferes sóoldattal (PBS-A-val).
Affinitás kromatográfia:
A C5a(1-71,C27S,Q71C)-val immunizált nyulak szérumát a C5a/BSA oszlopon hajtottuk át 2 ml/óra áramlási sebességgel. Az oszlopról lekerülő abszorbeálódott antiszérumot összegyűjtöttük. Az oszlopot alaposan mostuk 0,05 M nátrium-foszfáttal pH 7,2-re pufferolt és 0,1% nátrium-azidot tartalmazó 0,5 M NaCl-dal. A megkötődött antitestet 3M ammónium-tiocianáttal távolítottuk el. Az eluáló antitestet egy in-line UV monitorral 280 nm-en és 0,2 OD maximális elhajlásra beállítva mutattuk ki. A szérum első két részletén az eluáló antitestet összegyűjtöttük és azonnal dializáltuk PBS-A-val szemben, azután ultraszűréssel körülbelül 1 mg/ml-re töményítettük. Ezt az eljárást néhányszor megismételtük minden szérum tételre. A szérumot akkor tekintettük abszorbeáltnak, ha a C5a oszlopról eluálva nem mutattunk ki több fehérjét.
Az abszorbeálódott antiszérumot ezután a C5a(1-71,C27S,Q71C) immunabszorbens oszlopon hajtottuk át. A megkötődött antitestet
3M ammónium-tiocianáttal eluáltuk és azonnal dializáltuk PBS-Aval szemben, utána körülbelül 1 mg/ml-re töményítettük.
12a. példa
Jelölt antitest készítése a megkötődött C5a(1-71,C27S, Q71C) kimutatására
A C5a oszlopról eluált anti-C5a(1-71,C27S,Q71C) antitestet (azaz a C5a-val kereszt-reakciót adó antitestet) konjugáltuk alkalikus foszfatázhoz: az antitest 1,4 mg-ját 1 ml PBS-ben adtuk 5 mg (5000 egység) alkalikus foszfatázhoz (Type VII-T, Sigma Chemical Co.) . Glutáraldehidet adtunk hozzá 0,2% v/v végső koncentrációig. A keveréket 20 °C-on 90 percig inkubáltuk, azután egy éjszakán át PBS-A-val szemben 4 °C-on dializáltuk. A puffért kicseréltük 1 mM magnézium-kloridot tartalmazó 0,05 M Tris-re pH 8,0, és egy éjszakán át 4 °C-on dializáltuk.
12b. példa
A megkötődött C5a(1-71,C27S,Q71C) kimutatása ELISA-val
Különlegesen tisztított nyúl anti-C5a(1-71,C27S,Q71C)-t 0,57 mg/ml-nél l:500-ra hígítottunk 0,1 M nátrium-borát/bórsav pH 8,6 pufferben. ELISA lemezeket (Maxisorp, Nunc, Naperville, IL) fedtünk be 100 μΙ/mélyedés mennyiségben ezzel az oldattal, 4 órán át °C-on. A lemezeket háromszor mostuk a meg nem kötődött anyag eltávolítására. A C5a(1-71,C27S,Q71C)-t vagy a C5a(1-71,C27S,
Q71C) standard preparátumait tartalmazó mintákat — PBS-A + 1%
BSA keverékében (PBS/BSA) megfelelően hígítva — adagoltuk 100 μΐ-enként a mélyedésekbe, 4 órára 20 °C-on. Jelölt antitestet adtunk 1:3000 hígításban 100 μί PBS/BSA-ban és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. A lemezeket mostuk és utána enzim szubsztrátot (az alkalikus foszfatáz számára p-nitrofenil-foszfátot (Sigma • ·
Chemical Co.), 1 mg/ml-t 10%-os v/v dietilaminban, pH 9,8) adtunk hozzá. A színkifejlődést 20 °C-on, sötétben, körülbelül 5 órán át hagytuk lejátszódni. A lemezeket 405 nm-en Biomek 1000 (Beckman Instruments, CA, USA) segítségével olvastuk le.
A fent leírtakkal azonos körülményeket alkalmazva szerkesztettük meg a C5a(1-71,C27S,Q71C) standard görbéjét (adatokat nem mutatunk).
12c. példa
Az affinitás kromatográfiával tisztított specifikus anti-C5a(1-71,C27S,Q71C) spécificitása
C5a(1-71,C27S,Q71C)-t vagy C5a-t használtunk mikrotiter lemezek befedésére 1 pg/mélyedés mennyiségben 100 pl bevonó pufferben 4 órán át 20 °C-on. A lemezeket mostuk és a C5a-n történő abszorpció után C5a(1-71,C27S,Q71C)-ról eluált antitest hígítási sorozatait készítettük el a lemez mélyedésekbe 100 pl PBS/BSAban. 4 órás 20 °C-on történő inkübálás után a lemezeket újból mostuk. A nyúl antitest kötődését mélyedésenként 100 pl kecske anti-nyúl/torma-peroxidáz (Pierce Chemical Co.) 1:1000 PBS/BSAban segítségével mutattuk ki. A második antitesttel való 4 órás 20 °C-on történő inkübálás után a lemezeket mostuk, és a tormaperoxidáz aktivitást 2,2' -azino-di(3-etil-benzotiazolin)-6-szulfonsav diammónium sója, ABTS szubsztrát (Pierce Chemical Co.) segítségével mutattuk ki. 30 perces kifejlesztés után a színt
405 nm-en olvastuk le.
13. példa ·:Χ·
C5a(1-71,C27S,Q71C) mérése nyúl-plazma mintákban
Vérmintát vettünk heparinnal bélelt csövekbe két elaltatott nyúlból (#1 és #2), amelyekbe ezután intravénásán C5a(1-71,C27S, Q71C)-t injektáltunk. További 30 perces intervallum után vért vettünk. További C5a(1-71,C27S,Q71C)-t injektáltunk és újból vért vettünk 30 perc után. Ezt további 4 alkalommal ismételtük. A mintákat centrifugáltuk a vérsejtek eltávolítása céljából, és a plazmát az ELISA-ban történő felhasználásig -20 °C-on tároltuk.
A mintákat PBS/BSA-ban hígítottuk és az ELISA tesztben a 11. példában létrehozott standard görbével szemben mennyiségileg meghatároztuk. Ezután meghatároztuk a keringésben levő C5a(l-71, C27S,Q71C) megnövekedését az időben. Nem tudtunk aktivitást kimutatni a két nyúlból a C5a (1-71,C27S,Q71C)-val történő injektálás előtt vett mintákban, bizonyítva az antitest specificitását. Az eredmények azt is bizonyítják, hogy az antitest nem mutat kereszt-reaktivitást a nyúl C5a-val, és hogy a C5a(1-71,C27S, Q71C) nem természetesen előforduló vegyület nyulakban.
14. példa
A nyúl keringésében levő C5a(1-71,C27S,Q71C) összehasonlítása standard C5a(1-71,C27S,Q71C)-val: specifikus anti-C5a(1-71,C27S,
Q71C) antitest felhasználása C5a(1-71,C27S,Q71C) ellenszereként
A #2 nyúlból az utolsó időpontban (13. példából) vett plazma mintát kétszeres sorozat hígításoknak vetettük alá és a kapott görbe lefutását összehasonlítottuk a standard görbe lefutásával.
A két lefutás párhuzamos volt, jelezve, hogy a nyúlban keringő
C5a(1-71,C27S,Q71C) még megtartotta antigén sajátságait és ugyanúgy felismerhető az ELISA tesztben, mint a standard C5a(l71, C27S,Q71C) . Ez az eredmény is azt jelzi, hogy az analógot neutralizálná ez az antitest, ha szükségessé válna a C5a(l71,C27S, Q71C) eltávolítása a keringésből.
15. példa
Monoklonális anti-C5a(1-71,C27S,Q71C) előállítása
Monoklonális antitestek elkészítését végeztük el BALB/c egerekben a Kohler és Milstein [Natúré 256, 495-497 (1975)] által kifejlesztett standard eljárások felhasználásával. A C5a(l-71, C27S,Q71C) antigén ugyanazon elkészítését (KLH-hoz kapcsolva) alkalmaztuk az egerek immunizálására. Az immunizált egerekből származó lépsejtek és a P3/NSI/l-Ag4-l (ATCC TIB 18) hibridoma sejtvonal fúziójával létrejött monoklonális sejtvonalak screenelését
C5a (1-71,C27S,Q71C)/BSA és C5a/BSA felhasználásával végeztük el. A poliklonális nyúl antiszérummal végzett eljárással közvetlen párhuzamban, azokat az antitesteket, amelyek csak C5a(1-71,C27S, Q71C)-val reagáltak C5a-val nem, specifikus monoklonális antiC5a(1-71,C27S,Q71C) antitestekként alkalmaztuk. Azokat, amelyek mindkettőt felismerték, felderítő antitestekként használtuk és alkalikus foszfatázzal jelöltük meg.
Minden ebben a specifikációban említett publikáció és szabadalmi leírás jelzi annak a szakmai gyakorlatnak a jártassági szintjét, amelyre ez a találmány vonatkozik. Mindezeket a publikációkat és szabadalmi leírásokat referenciaként építettük be ide az egyes publikációk vagy szabadalmi leírások részletes is55 mertetése helyett.
Az itt leírt találmány különböző módosításai a gyakorlott szakember számára nyilvánvalóak. Az ilyen módosítások szándékunk szerint a mellékelt igénypontok oltalmi körébe tartoznak.
i
SZEKVENCIAVÁZLATOK
1. számú szekvencia
A szekvencia típusa: aminosav
A szekvencia hossza: 4 aminosav
Topológia: lineáris
A molekula típusa: peptid
Az 1. számú szekvencia leírása:
Tyr Asp Gly Alá
2. számú szekvencia
A szekvencia típusa: aminosav
A szekvencia hossza: 4 aminosav
Topológia: lineáris
A molekula típusa: peptid
A 2. számú szekvencia leírása:
Asp Gly Alá Tyr
3. számú szekvencia
A szekvencia típusa: aminosav
A szekvencia hossza: 74 aminosav
Topológia: lineáris
A molekula típusa: fehérje
A 3. számú szekvencia leírása:
Thr Leu Gin Lys Lys Ile Glu Glu Ile Alá Alá Lys Tyr Lys His Ser
10 15
Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Alá Cys Val Asn Asn Asp Glu
25 30 ··
Thr Cys Glu 35 Gin Arg Alá Alá Arg 40 Ile Ser Leu Gly
Lys Alá Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Alá Ser Gin
50 55 60
Ile Ser His Lys Asp Met Gin Leu Gly Arg
65 70
• · • · · · · ·· · • ··· · · • · · · ···· ·· · ·· ·
Pro Arg Cys Ile
Leu Arg Alá Asn
4. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 239 bázispár Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: kettős szálú A 4. számú szekvencia leírása:
AATTCTATGA CTCTGCAAAA GAAGATCGAA GAAATCGCTG CTAAGTACAA
GCACTCCGTC 60
GTTAAGAAGT GTTGTTACGA TGGTGCATGC GTCAACAACG ACGAAACCTG
TGAACAACGA
120
GCTGCTCGTA TTTCTCTGGG CCCTCGCTGT ATCAAGGCTT TCACTGAATG
TTGTGTTGTC
180
GCTTCCCAAC TGCGCGCTAA CATTTCTCAC AAGGACATGC AACTCGGCCG CTAAAAGCT 239
5. számú szekvencia
A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia hossza: 11 aminosav Topológia: lineáris
A molekula típusa: peptid Az 5. számú szekvencia leírása:
• ·
Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gin Leu Gly Arg 15 10 ·· «·
6. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 18 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 6. számú szekvencia leírása:
ACGGTGCTTC TGTTAACA 18
7. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 35 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 7. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCTA 35
8. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 39 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusá: egyszálú
A 8. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGCAC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39
9. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 14 bázispár Topoló.gia: lineáris
A molekula száltipusa: egyszálú A 9. számú szekvencia leírása:
• · · ·
CTGCGTGCTT GCTA 14
10. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 18 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 10. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGCAA GCACGCAG 18
11. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 17 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 11. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACTGCTA 17
12. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 21 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 12. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGCAG TTAGCACGCA G 21
13. számú szekvencia
Ϊ A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 20 bázispár
I í
·· · • « · ·
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 13. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTGCTA 20
14. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 24 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 14. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGCAG ATGTTAGCAC GCAG 24
15. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 23 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 15. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTTG CTA 23
16. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 27 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 16. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGCAA GAGATGTTAG CACGCAG ·· ····
17. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 26 bázispár Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú A 17. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CTGCTA
18. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 30 bázispár Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú A 18. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGCAG TGAGAGATGT TAGCACGCAG
19. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 29 bázispár Topológia: lineáris
A molekula száltípusa': egyszálú A 19. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAATGCTA
20. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 33 bázispár Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú A 20. számú szekvencia leírása:
• · · · · ·· ·· ·· ··: .· í :
···· ♦(· · te φφφ
AGCTTACGAT TTGTGAGAGA TGTTAGCACG CAG 33
21. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 32 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 21. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACTGC TA 32
22. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 36 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 22. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGCAG TCTTTGTGAG AGATGTTAGC ACGCAG 36
23. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 35 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 23. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCTA 35
24. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 39 bázispár c · • · · · • · · · · · · • · · · · ···· ·· · ·· ···
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 24. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGCAC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39
25. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 38 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 25. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CAATGCTA 38
26. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 42 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 26. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGCAT TGCATGTCTT- TGTGAGAGAT GTTAGCACGC AG 42
27. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 41 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 27. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CAACTGTGCT A
28. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 45 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 28. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGCAC AGTTGCATGT CTTTGTGAGA GATGTTAGCA CGCAG 45
29. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 44 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 29. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCCTGGGTC GTTA 44
30. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 48 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa': egyszálú
A 30. számú szekvencia leírása:
AGCTTAACGA CCCAGGCACA TGTCTTTGTG AGAGATGTTA GCACGCAG 48
31. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 41 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 31. számú szekvencia leírása:
« · • · ·
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCCTGGGTT A 41
32. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 45 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 32. számú szekvencia leírása:
AGCTTAACCC AGGCACATGT CTTTGTGAGA GATGTTAGCA CGCAG 45
33. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 38 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 33. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TGCCTGTA 38
34. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 42 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 34. számú szekvencia leírása:
AGCTTACAGG CACATGTCTT TGTGAGAGAT GTTAGCACGC AG 42
35. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 44 bázispár ·· ·· ···· • · · · · · • · · · * * · · • · · · · · ·
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú A 35. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CAACTGGGTT GCTA 44
36. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 48 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 36. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGCAA CCCAGTTGCA TGTCTTTGTG AGAGATGTTA GCACGCAG 48
37. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 35 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 37. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CAATA 35
38. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 39 bázispár Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú A 38. számú szekvencia leírása:
AGCTTATTGC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG
39. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 35 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 39. számú szekvencia leírása:
CTGCGTCCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG GACTA 35
40. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 39 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 40. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGTCC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39
41. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 35 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 41. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG TCTTA 35
42. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav A szekvencia hossza: 39 bázispár Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú A 42. számú szekvencia leírása:
• · ·«· · · • · · · « * · · · * ·
AGCTTAAGAC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39
43. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 35 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 43. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CACTA 35
44. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 39 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 44. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGTGC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39
45. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 35 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltrpusa: egyszálú
A 45. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CGTTA 35
46. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 39 bázispár • * > « · • · ·
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 46. számú szekvencia leírása:
AGCTTAACGC ATGTCTTTGT GAGAGATGTT AGCACGCAG 39
47. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 35 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 47. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTCA CAAAGACATG CTGTA 35
48. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 39 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 48. számú szekvencia leírása:
AGCTTACAGC ATGTCTTTGT' GAGAGATGTT AGCACGCAG 39
49. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 35 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 49. számú szekvencia leírása:
CTGCGTGCTA ACATCTCTTT CAAAGACATG TGCTA
50. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 39 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 50. számú szekvencia leírása:
AGCTTAGCAC ATGTCTTTGA AAGAGATGTT AGCACGCAG 39
51. számú szekvencia
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia hossza: 252 bázispár
Topológia: lineáris
A molekula száltípusa: egyszálú
A 51. számú szekvencia leírása:
GAATTCCCAC GAAGAAATCG TCAAAATAAG GAGGAAAAAA AAATGCTGCA GAAGAAAATC 60
CTGCTAAGTA TCTGTTAACA CAAACACTCT GTTGTTAAAA AATGCTGCTA CGACGGTGCT
120 ACGACGAAAC TGCATCAAAG TTGCGAACAG CGTGCTGCTC GTATCTCTCT GGGCCCGCGT
180
CATTCACTGA TTCAAAGACA ATGCTGCGTT GTTGCTTCTC AGCTGCGTGC TAACATCTCT
240
TGTGCTAAGC TT
252
52. számú szekvencia
A szekvencia típusa: aminosav A szekvencia hossza:10 aminosav Topológia: lineáris ····
A molekula típusa: peptid
A 52. számú szekvencia leírása:
Ile Ser Phe Lys Asp Met Gin Leu Gly Arg

Claims (59)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. A humán C5a polipeptid analógja, amelyben a nevezett analóg agonista aktivitást lényegében nem mutató C5a receptor antagonista .
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti humán C5a analóg, amelyben a nevezett analóg tartalmaz egy olyan C-terminális régiót, amely abban tér el a humán C5a megfelelő C-terminális régiójától, hogy rendelkezik cisztein maradékkal és C-terminusa legalább két aminosav maradékkal csonkolt.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti humán C5a analóg, amely cisztein maradékkal rendelkezik a C-terminuson.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti humán C5a analóg, amelyben a nevezett cisztein maradék addukt formájában van.
    5. sav A 2 . hossz igénypont :úságú. szerinti humán C5a analóg, amely 64-72 amino- 6. A 2 . igénypont szerinti humán C5a analóg, amely 68-72 amino- sav hosszúságú. 7 . A 2 . igénypont szerinti humán C5a analóg, amely 70-72 amino- sav hosszúságú. 8 . A 2 . igénypont szerinti humán C5a analóg, amely 71 aminosav
    hosszúságú.
  5. 9. A 8. igénypont szerinti humán C5a analóg, amely C5a(l-71,
    Gln71Cys).
  6. 10. Az 1. igénypont szerinti humán C5a analóg származéka, amelyben a nevezett származék agonista aktivitást lényegében nem mutató C5a receptor antagonista.
  7. 11. A 2. igénypont szerinti humán C5a analóg származéka, amely74 ·· · · ben a nevezett származék agonista aktivitást tató C5a receptor antagonista.
  8. 12. A 10. igénypont származéka, amely
    Gln71Cys).
  9. 13. A 10. igénypont származéka,
    71,Cys27Ser,His67Phe, Gln71Cys).
  10. 14. A 10. igénypont származéka, amely lényegében nem muC5a(1-71,His67Phe, amely C5a (1C5a (1-71,Cys27Ser,
    Gln71Cys).
  11. 15. A humán C5a első és második polipeptid analógjait vagy azok származékait tartalmazó dimer, amelyben a nevezett analógok mindegyike agonista aktivitást lényegében nem mutató C5a receptor antagonista és C-terminális cisztein maradékkal rendelkezik, és amelyben a nevezett első és második analóg cisztein maradékai egymással diszulfid hídon keresztül kapcsolódnak, és továbbá amelyben a nevezett első és második C5a analóg azonos vagy különböző lehet.
  12. 16. A 15. igénypont szerinti dimer, amelyben a nevezett első és második analógok mindegyikének C-terminális régiója eltér a humán C5a megfelelő C-terminális régiójától abban, hogy Cterminusa legalább két aminosav maradékkal csonkolt.
  13. 17. A 15. igénypont szerinti dimer, amelyben a nevezett első és második analógok mindegyike C5a(1-71,Cys27Ser,Gln71Cys).
  14. 18. DNS molekula, amely az 1. igénypont szerinti humán C5a analógot kódolja.
  15. 19. DNS molekula, amely a 6. igénypont szerinti humán C5a analógot kódolja.
  16. 20. DNS molekula, amely a 8. igénypont szerinti humán C5a analó• · got kódolja.
  17. 21. DNS molekula, amely a 9. igénypont szerinti humán C5a analógot kódolja.
  18. 22. DNS molekula, amely a 10. igénypont szerinti humán C5a analóg származékot kódolja.
  19. 23. DNS molekula, amely a 13. igénypont szerinti humán C5a analóg származékot kódolja.
  20. 24. DNS molekula, amely a 14. igénypont szerinti humán C5a analóg származékot kódolja.
  21. 25. Rekombináns DNS molekula, amely egy adott gazdaszervezetben funkcionálni képes promótert a 18. igénypont szerinti DNS molekulához működőképesen hozzákapcsolva tartalmaz.
  22. 26. A 25. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmazó rekombináns plazmid, amely összeegyeztethető egy adott gazdaszervezettel .
  23. 27. A 18. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmazó rekombináns vektor, amely összeegyeztethető egy adott gazdaszervezettel .
  24. 28. Rekombináns gazdaszervezet, amely stabilan transzformálva van a 18. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulával.
  25. 29. A 28. igénypont szerinti rekombináns gazdaszervezet, amelyet baktérium, élesztő, gomba, rovar, emlős és növényi sejteket tartalmazó csoportból választunk ki.
  26. 30. A 28. igénypont szerinti rekombináns gazdaszervezet, amely
    E. coli.
  27. 31. Az 1. igénypont szerinti humán C5a analógra specifikus antitest, amelyben a nevezett antitest lényegében nem mutat kereszt• · · « reaktivitást a humán C5a-val.
  28. 32. A 31. igénypont szerinti antitest, amelyben a nevezett antitest poliklonális.
  29. 33. A 31. igénypont szerinti antitest, amelyben a nevezett antitest monoklonális.
  30. 34. A 10. igénypont szerinti humán C5a analóg származékra specifikus antitest, amelyben a nevezett antitest lényegében nem mutat kereszt-reaktivitást a humán C5a-val.
  31. 35. A 34. igénypont szerinti antitest, amelyben a nevezett antitest poliklonális.
  32. 36. A 34. igénypont szerinti antitest, amelyben a nevezett antitest monoklonális.
  33. 37. A 14. igénypont szerinti származékra specifikus antitest, amelyben a nevezett antitest lényegében nem mutat keresztreaktivitást a humán C5a-val.
  34. 38. A 37. igénypont szerinti antitest, amelyben a nevezett antitest poliklonális.
  35. 39. A 37. igénypont szerinti antitest, amelyben a nevezett antitest monoklonális.
  36. 40. A 15. igénypont szerinti, C5a analóg vagy annak származékai által képzett dimerre specifikus antitest, amelyben a nevezett antitest lényegében nem mutat kereszt-reaktivitást a humán C5aval.
  37. 41. A 17. igénypont szerinti dimerre specifikus antitest, amelyben a nevezett antitest lényegében nem mutat keresztreaktivitást a humán C5a-val.
  38. 42. Gyógyszer-készítmény, amely felhasználható C5a-közvetítette • · · betegség vagy gyulladást keltő állapot kezelésében emlősben, és amely az 1. igénypont szerinti C5a analóg terápiásán hatásos mennyiségét és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
  39. 43. Gyógyszer-készítmény, amely felhasználható C5a-közvetítette betegség vagy gyulladást keltő állapot kezelésében emlősben, és amely a 10. igénypont szerinti C5a analóg származék terápiásán hatásos mennyiségét és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz .
  40. 44. Gyógyszer-készítmény, amely felhasználható C5a-közvetítette betegség vagy gyulladást keltő állapot kezelésében emlősben, és amely a 14. igénypont szerinti C5a analóg származék terápiásán hatásos mennyiségét és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz .
  41. 45. Gyógyszer-készítmény, amely felhasználható a — lényegében agonista aktivitással nem rendelkező, C5a receptor antagonista — humán C5a analóg in vivő aktivitásának szabályozásában, és amely tartalmaz:
    egy 31. igénypont szerinti antitestet az analóg aktivitásának szabályozásához hatásos mennyiségben, és gyógyászatilag elfogadható hordozót.
  42. 46. A 45. igénypont szerinti gyógyszer-készítmény, amelyben a nevezett antitest mennyisége hatásos ahhoz, hogy az analóg in vivő aktivitását lényegében semlegesítse.
  43. 47. Eljárás C5a-közvetítette betegség vagy gyulladást keltő állapot kezelésére emlősben, azzal jellemezve, hogy magában foglalja a 42. igénypont szerinti készítmény — emlős számára, annak szüksége szerint történő — beadásának lépését.
    • ·
  44. 48. Eljárás C5a-közvetítette betegség vagy gyulladást keltő állapot kezelésére emlősben, azzal jellemezve, hogy magában foglalja a 43. igénypont szerinti készítmény — emlős számára, annak szüksége szerint történő — beadásának lépését.
  45. 49. Eljárás C5a-közvetítette betegség vagy gyulladást keltő állapot kezelésére emlősben, azzal jellemezve, hogy magában foglalja a 44. igénypont szerinti készítmény — emlős számára, annak szüksége szerint történő — beadásának lépését.
  46. 50. Eljárás C5a-közvetítette gyulladás csökkentésére emlősben, azzal jellemezve, hogy magában foglalja a 42. igénypont szerinti készítmény emlős számára történő beadásának lépését — a komplement aktivációt okozó vagy súlyosbító eseményekre vonatkoztatott — a gyulladás csökkentéséhez elegendő időn belül.
  47. 51. Eljárás C5a-közvetítette gyulladás csökkentésére emlősben, azzal jellemezve, hogy magában foglalja a 43. igénypont szerinti készítmény emlős számára történő beadásának lépését — a komplement aktivációt okozó vagy súlyosbító eseményekre vonatkoztatott — a gyulladás csökkentéséhez elegendő időn belül.
  48. 52. Eljárás C5a-közvetítette gyulladás csökkentésére emlősben, azzal jellemezve, hogy magában foglalja a 44. igénypont szerinti készítmény emlős számára történő beadásának lépését — a komplement aktivációt okozó vagy súlyosbító eseményekre vonatkoztatott — a gyulladás csökkentéséhez elegendő időn belül.
  49. 53. Eljárás a — lényegében agonista aktivitással nem rendelkező, C5a receptor antagonista — humán C5a analóg aktivitásának szabályozására egy alanyban annak szükséglete szerint, azzal jellemezve, hogy magában foglalja:
    ··· a 45. igénypont szerinti gyógyszer-készítmény alany számára történő beadásának lépését.
  50. 54. Eljárás a — lényegében agonista aktivitással nem rendelkező, C5a receptor antagonista — humán C5a analóg aktivitásának semlegesítésére egy alanyban annak szükséglete szerint, azzal jellemezve, hogy magában foglalja:
    a 46. igénypont szerinti gyógyszer-készítmény alany számára történő beadásának lépését.
  51. 55. Minőségi vagy mennyiségi analízis a — lényegében agonista aktivitással nem rendelkező, C5a receptor antagonista — humán C5a analóg meghatározására egy alanyban, azzal jellemezve, hogy magában foglalja a következő lépéseket:
    az alanyból történő szövet vagy folyadék minta kinyerését, és a mintának a 31. igénypont szerinti antitesttel — az antitest és az analóg közötti immunkomplex, amely jelzi az analóg jelenlétét az alanyban, kimutatható kialakulását megengedő körülmények között — történő érintkeztetését.
  52. 56. Az 55. igénypont szerinti meghatározás, azzal jellemezve, hogy továbbá magában foglalja az analógnak az alanyban történő mennyiségi meghatározási lépését.
  53. 57. Eljárás biológiailag aktív C5a analóg vagy származékának előállítására, amelyben a nevezett analóg C5a receptor antagonista, amely lényegében nem mutat agonista aktivitást, azzal jellemezve, hogy magában foglalja a következő lépéseket:
    a C5a analógot kódoló DNS molekulával stabilan transzformált
    E. coli sejtek tenyésztését a DNS molekula kifejeződéséhez megfelelő körülmények között;
    ·· ···· az így tenyésztett sejtek érintkeztetését denaturáló és oldószerrel a C5a analóg denaturált formájának előállítására; és az így denaturált C5a analóg összekeverését egy redukáló- és oxidálószert legalább körülbelül 100:1 móltömeg arányban tartalmazó oldattal, a C5a analóg biológiailag aktív formájának keletkezéséhez megfelelő körülmények között.
  54. 58. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett keverést körülbelül 6,5-7,5 pH értéken végeztük.
  55. 59. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett keverést körülbelül 1/2 órától körülbelül 4 órás időtartamig végeztük.
  56. 60. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redox pár redukált glutation/oxidált glutation.
  57. 61. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az
    E. coli sejtek a C5a(1-71,Cys27Ser,Gln71Cys) C5a analóg származékot kódoló DNS molekulával stabilan transzformáltak.
  58. 62. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E. coli sejtek a C5a(1-71,Cys27Ser,His67Phe,Gln71Cys) C5a analóg származékot kódoló DNS molekulával stabilan transzformáltak.
  59. 63. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukálószer/oxidálószer mólaránya legalább körülbelül 100:1 és
    500:1 közé esik.
HU9601538A 1993-12-06 1994-11-16 C5a receptor antagonists having substantially no agonist activity HUT75990A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16259193A 1993-12-06 1993-12-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9601538D0 HU9601538D0 (en) 1996-07-29
HUT75990A true HUT75990A (en) 1997-05-28

Family

ID=22586301

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9601538A HUT75990A (en) 1993-12-06 1994-11-16 C5a receptor antagonists having substantially no agonist activity

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP0733107A1 (hu)
JP (1) JPH09506258A (hu)
CN (1) CN1142854A (hu)
AU (1) AU698919B2 (hu)
BR (1) BR9408265A (hu)
CA (1) CA2176825A1 (hu)
FI (1) FI962319A (hu)
HU (1) HUT75990A (hu)
IL (1) IL111792A0 (hu)
MX (1) MXPA99008669A (hu)
NO (1) NO962348L (hu)
NZ (1) NZ274917A (hu)
TW (1) TW429262B (hu)
WO (1) WO1995016033A1 (hu)
ZA (1) ZA949647B (hu)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837499A (en) * 1993-12-06 1998-11-17 Ciba-Geigy Corporation DNA encoding C5A receptor antagonists having substantially no agonist activity and methods of expressing same
EP0832223A1 (en) * 1995-06-05 1998-04-01 Novartis AG C5a RECEPTOR ANTAGONISTS HAVING SUBSTANTIALLY NO AGONIST ACTIVITY AND METHODS FOR PREPARATION
BR9607139A (pt) * 1995-12-13 1997-11-25 Northern Telecom Ltd Sistemas de telecomunicações de dados com pacote digital e voz celular integrado e processos para sua operação
AUPO755097A0 (en) 1997-06-25 1997-07-17 University Of Queensland, The Receptor agonist and antagonist
TWI767415B (zh) * 2020-11-18 2022-06-11 中國醫藥大學 自動化血液分析系統及自動化血液分析方法
CN113150106B (zh) * 2021-04-26 2022-08-16 华中农业大学 来源于补体成分C5a的抗菌肽及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0305615A1 (en) * 1987-09-03 1989-03-08 Immunetech Pharmaceuticals, Inc. Peptide antagonists for the C5a anaphylatoxin
DE3785967T2 (de) * 1986-04-28 1993-12-02 Cetus Corp Monoklonale Antikörper gegen C5A und DES-ARG74-C5A, ihre Herstellung und ihre Verwendung.

Also Published As

Publication number Publication date
NO962348D0 (no) 1996-06-05
FI962319A0 (fi) 1996-06-03
ZA949647B (en) 1995-06-06
BR9408265A (pt) 1996-12-10
NZ274917A (en) 1998-03-25
FI962319A (fi) 1996-06-03
CN1142854A (zh) 1997-02-12
CA2176825A1 (en) 1995-06-15
AU8002594A (en) 1995-06-27
MXPA99008669A (es) 2004-09-01
IL111792A0 (en) 1995-01-24
HU9601538D0 (en) 1996-07-29
NO962348L (no) 1996-08-05
WO1995016033A1 (en) 1995-06-15
TW429262B (en) 2001-04-11
EP0733107A1 (en) 1996-09-25
AU698919B2 (en) 1998-11-12
JPH09506258A (ja) 1997-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6995933B2 (ja) インターロイキン２３受容体の経口ペプチド阻害剤および炎症性腸疾患を処置するためのそれらの使用
CA2372821C (en) Antimicrobial theta defensins and methods of using same
NO332460B1 (no) Renset humant NOGO protein, fusjon- eller kimaert protein, isolert nukleinsyre, kloningsvektor, rekombinant celle, fremgangsmate for fremstilling av proteinet, samt anvendelse av proteinet for fremstilling av et medikament for behandling.
KR20010015711A (ko) 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호화하는 ｃＤＮＡ 및그들의 용도
US5807824A (en) C5A receptor antagonists having substantially no agonist activity
US5783421A (en) DNA encoding novel polypeptide having Factor Xa inhibitory activity
US6573244B1 (en) Previns as specific inhibitors and therapeutic agents for Botulinum toxin B and Tetanus neurotoxins
HUT75990A (en) C5a receptor antagonists having substantially no agonist activity
US5182262A (en) Calmodulin binding peptide derivatives of non-erythroid alpha spectrin
EP0832223A1 (en) C5a RECEPTOR ANTAGONISTS HAVING SUBSTANTIALLY NO AGONIST ACTIVITY AND METHODS FOR PREPARATION
US5837499A (en) DNA encoding C5A receptor antagonists having substantially no agonist activity and methods of expressing same
US8524862B2 (en) Muteins of C5a anaphylatoxin and methods of inhibiting C5a
EP0696198B1 (en) Novel polypeptide having factor xa inhibitory activity
US7176280B2 (en) Isolated polypeptides and compositions from the venom of P. transvaalicus and methods of use
US6277822B1 (en) Family of peptides known as xenoxins
WO1998019692A1 (en) Nucleotide and amino acid sequences of a d2-2 gene associated with brain tumors and methods based thereon
EP1311283A2 (en) Omega-conopeptides
KR20130032787A (ko) 심혈관 질환 예방 및 치료용 펩타이드 및 이의 용도
JPH06279496A (ja) ハムスター脳ナトリウム利尿ペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVARTIS AG, CH

DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal