CN100445743C

CN100445743C - 检测本地旋毛形线虫抗体的重组原核表达检测抗原及制备方法

Info

Publication number: CN100445743C
Application number: CNB2005100105841A
Authority: CN
Inventors: 宋铭忻; 郑宝亮; 路义鑫; 李冬梅; 韩周; 马广鹏; 武嘉男
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2005-11-30
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2025-11-30
Also published as: CN1811431A

Abstract

本发明提供的是一种检测本地旋毛形线虫抗体的重组原核表达蛋白抗原及其制备方法。本产品可作为检测本地旋毛形线虫抗体的间接-ELISA及Dot-ELISA方法的检测抗原，也可作为预防本地旋毛形线虫感染的基因工程亚单位疫苗。本产品制备过程包括：(1)设计扩增TNPG基因的特异性引物；(2)通过PCR扩增获得TNPG基因片段；(3)对TNPG基因进行克隆、测序鉴定；(4)将TNPG基因定向亚克隆至pET-30a原核表达载体；(5)TNPG基因在大肠杆菌的诱导表达；(6)TNPG基因表达蛋白的亲合层析纯化。

Description

检测本地旋毛形线虫抗体的重组原核表达检测抗原及制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种检测本地旋毛形线虫抗体的TNPG基因重组原核表达检测抗原蛋白以及它的制备方法。

背景技术

旋毛虫病(Trichinellosis)是由旋毛虫的成虫和幼虫感染人或动物后引起的一种重要人兽共患线虫病，世界各地都有发生，本地毛形线虫(Trichinella nativa)是其病原体之一。该病主要因食了生的或未煮熟的含旋毛虫包囊的猪肉或其它动物肉而引起，因心肌炎、肺炎等而引起人的死亡。由于旋毛虫的感染宿主很多，旋毛虫病的流行范围广泛和传播途径复杂，因此使这一严重威胁人类身体健康，并对畜牧业(尤其是养猪业)、肉食品工业和外贸出口等造成巨大经济损失的人畜共患病迄今不仅尚未得到有效控制，反而出现流行范围进一步扩大和发病率逐步升高之趋势。

因旋毛虫虫体很小，长期以来，旋毛虫病的诊断主要靠宰后取膈肌压片镜检或用人工胃蛋白酶消化肌肉后收集虫体检测，虽然比较直观，但十分繁琐，检出率低，且无法进行生前诊断，给动物的检疫工作带来困难。人的旋毛虫病确诊也主要靠取腓肠肌压片镜检，不但病人痛苦，而且因摘取组织的局限性，往往不易检出在感染早期及轻度感染者体内的幼虫。

发明内容

本发明目的在于提供一种检测本地旋毛形线虫抗体的重组原核表达检测抗原及制备方法，检测本地毛形线虫抗体时稳定性好、灵敏度高、可实现工业化生产、成本低的原核表达检测抗原及其制备方法。

本发明一种检测本地旋毛形线虫抗体的重组原核表达检测抗原，其特征是：它是本地旋毛形线虫在生长过程中，排泄分泌的一种主要保护性抗原49ku的基因重组原核表达蛋白，TNPG基因含有951碱基，编码316个氨基酸残基，在原核表达时TNPG基因与表达载体pET-30a得到融合表达，融合蛋白的分子量大小为40.8KU。

本发明的检测本地旋毛形线虫抗体的TNPG基因重组原核表达检测抗原，其氨基酸序列共316个氨基酸残基：

MATDDTEWFLLFKPVGQLKAKIISPANAGWASDGANMNTD3GHALVQTLAEWMGPILDDMTALGYSNTPPKSTITSQTTSSKGILMFGNETTDGFWLLHTFERAFPNSVAWSWPSKFTSEGHMALCLSISEDNVPLIVPALQYQEVVIYFGQVSSEKATEFADLTSLIDGSLPTITPPLWNQQTITTLNSGLSAGVYSKTSSSRLEMYGSFLTKVMVVNMRIWAVTDNTLQTTCGGKIKFVKVVKSPVTIDGTQNDRSKDKSQWAVIDDKPVFCFTTNGYSTKQRTVAGSATCITQQVVSNLFATSAANFIPCPYS

本发明制备方法，其制备过程包括：

(1)设计扩增TNPG基因的特异性引物；

(2)通过PCR扩增获得TNPG基因片段；

(3)对TNPG基因进行克隆、测序鉴定；

(4)将TNPG基因定向亚克隆至pET-30a原核表达载体；

(5)TNPG基因在大肠杆菌的诱导表达；

将重组表达质粒pET-30a-TNPG转化大肠杆菌BL21，进行诱导表达。

(6)TNPG基因表达蛋白的亲合层析纯化

(6-1)待纯化样的制备

离心收集表达细菌：离取沉淀，用PBS(1mol/L，pH7.4)洗涤3次，沉淀用PBS溶液重悬起；

裂解菌体获取上清可溶性蛋白与包涵体沉淀：菌体进行超声处理30min，强度30％，超生15s，停止10s，冰浴进行。以4℃，13000rpm离心30min，取沉淀悬于适量PBS(1mol/L，pH7.4)，同上超生离心取沉淀，沉淀悬于适量8M脲中，同上超生，4℃，13000rpm离心30min，取上清。

(6-2)表达蛋白的亲合层析纯化包括

①用ddH₂O洗5个柱体积；

②用5个柱体积的8M脲平衡柱

③样品上柱，上柱前样品用0.22μm滤器过滤出去大颗粒，取离心上清过柱。

④用8M脲洗一个柱体积，收集洗脱液；

⑤用1M NaCl、8M脲洗一个柱体积，收集洗脱液；

⑥用8M脲洗一个柱体积，收集洗脱液；

⑦用500mM咪唑、4M脲洗适量体积，收集洗脱液；

⑧将⑦收集的洗脱液，用PEG(MW 6000)浓缩至适当体积。

⑨将上步的浓缩液用20mM Tris·HCl(pH8.0)4℃透析48h，每6h换液一次，之后用5mM Tris·HCl(pH8.0)4℃透析24h，每六小时换液一次。

(7)表达蛋白含量的测定

采用紫外线吸收法定量蛋白质。将待检样品稀释后，同时测定该蛋白质溶液在λ260nm和λ280nm处的OD值，同时用稀释液作为空白对照，按下列公式计算蛋白含量：

(1.46×A280 0.74×A260)×稀释倍数＝(mg)/ml蛋白含量

TNPG基因纯化蛋白的质量浓度为≥2.9mg/ml。

具体实施方式

本发明是本地旋毛形线虫在生长过程中，排泄分泌的一种主要保护性抗原49ku的基因重组原核表达蛋白，TNPG基因含有951碱基，编码316个氨基酸残基，在原核表达时TNPG基因与表达载体pET-30a得到融合表达，融合蛋白的分子量大小为40.8KU。

本发明产品本地毛形线虫TNPG基因重组原核表达蛋白氨基酸序列为(共316个氨基酸残基)：

本发明的产品制备过程：

(1)设计扩增本地毛形线虫TNPG基因的特异性引物；

(2)通过PCR扩增获得TNPG基因片段；

(3)对TNPG基因进行克隆、测序鉴定；

(4)将TNPG基因定向亚克隆至pET-30a原核表达载体；

(5)TNPG基因在大肠杆菌的诱导表达：

将重组表达质粒pET-30a-TNPG转化大肠杆菌BL21，进行诱导表达。

(6)TNPG基因表达蛋白的亲合层析纯化

(6-1)待纯化样的制备

离心收集表达细菌：5000rpm离取沉淀，用PBS(1mol/L，pH7.4)洗涤3次，离心沉淀菌体；

裂解菌体获取包涵体沉淀：加入原培养体积1/10的50mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA缓冲液，重悬细菌沉淀，同时加入溶菌酶至0.1mg/ml和1/10体积的1％Triton，冰浴中超生至不再粘稠，4℃13000rpm离心15min，沉淀包涵体。

包涵体的裂解：获得的不溶性包涵体沉淀部分用包涵体洗涤液A(20％蔗糖，0.85％NaCl，50mmol/L Tris，pH8.0，10mmo1/L EDTA，1％TritionX-100)洗涤1次，超声处理10min，强度30％，超生15s，停止10s，冰浴中进行，4℃13000rpm离心取沉淀，再用包涵体洗涤液B(10％蔗糖，20mmol/L Tris，pH8.0，10mmol/L EDTA)洗涤1次，同上超生离心取沉淀，将沉淀悬于适量8M脲中，同上超生离心取上清。

(6-2)表达蛋白的亲合层析纯化包括

①用ddH₂O洗5个柱体积；

②用5个柱体积的8M脲平衡柱

④用8M脲洗一个柱体积，收集洗脱液；

⑤用1M NaCl、8M脲洗一个柱体积，收集洗脱液；

⑥用8M脲洗一个柱体积，收集洗脱液；

⑦用500mM咪唑、4M脲洗适量体积，收集洗脱液；

(7)表达蛋白的复性：将上步的洗脱液用20mM Tris-HCl(pH8.0)4℃透析48h，每6h换液一次，之后用5mM Tris-HCl(pH8.0)4℃透析24h，每六小时换液一次，将目的蛋白用PEG(MW 6000)浓缩至适当体积。

(8)表达蛋白含量的测定

采用紫外线吸收法定量蛋白质。将待检样品适当稀释后，同时测定该蛋白质溶液在λ260nm和λ280nm处的OD值，同时用稀释液作为空白对照，按下列公式计算蛋白含量：

(1.46×A280 0.74×A260)×稀释倍数＝(mg)/ml蛋白含量

TNPG基因纯化蛋白的质量浓度为2.9mg/ml。

本发明TNPG基因重组原核表达检测抗原，是利用基因工程技术，在本地毛形线虫(Trichinella nativa)主要抗原性基因TNPG完整基因片段(自ATG至TAA)进行克隆的基础上，将其与原核表达载体pET-30a连接，成功转化大肠杆菌BL21表达系统进行诱导、表达的基因工程产品。该蛋白的表达形式是TNPG-BL21融合蛋白，表达的融合蛋白的分子量为40.8Ku，将产品设计为融合表达一是考虑便于纯化，二是能增加表达蛋白的免疫原性。该基因编码蛋白是非糖基化蛋白，因此，经原核表达系统表达后的产品经Western blot、Dot-ELISA进行鉴定后均表明具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。

采用本发明的方法生产的产品可用于：

①本产品可作为检测本地毛形线虫抗体的间接-ELISA及Dot-ELISA方法的检测抗原。

②可作为预防本地毛形线虫感染的基因工程亚单位疫苗。

本发明的产品优点体现在：

①由于该检测抗原是TNPG基因重组原核表达蛋白，并非病原体，因此应用该检测抗原进行检测时绝无散寄生虫危险。

②作为ELISA抗原检测本地毛形线虫抗体，其检测灵敏度高，特异性强，无交叉反应。

③生产工艺先进、性能稳定，生产成本低，产品付加值高，适合工厂化生产，市场应用前景广。

序列表

<110>东北农业大学

<120>检测本地旋毛形线虫抗体的重组原核表达检测抗原及其制备方法

<140>

<160>1

<210>1

<211>316

<212>RNA

<213>本地旋毛形线虫(Trichinella nativa)

<220>

<221>HELIX

<222>(7)...(20)

<400>1

Met Ala Thr Asp Asp Thr Glu Trp Phe Leu Leu Phe Lys Pro Val Gly

1 5 10 15

Leu Leu Lys Ala Lys Ile Ile Ser Pro Ala Asn Ala Gly Trp Ala Asn

20 25 30

Asp Gly Ala Asn Met Asn Thr Asp Ser Gly His Ala Leu Val Gln Thr

35 40 45

Leu Ala Glu Trp Met Gly Pro Ile Leu Asp Asp Met Thr Ala Leu Gly

50 55 60

Tyr Ser Asn Thr Pro Pro Lys Ser Thr Ile Thr Ser Gln Thr Thr Ser

65 70 75 80

Ser Lys Gly Ile Leu Met Phe Gly Asn Glu Thr Thr Asp Gly Phe Trp

85 90 95

Leu Leu His Thr Phe Glu Arg Ala Phe Pro Asn Ser Val Ala Trp Ser

100 105 110

Trp Pro Ser Lys Phe Thr Ser Glu Gly His Met Ala Leu Cys Leu Ser

115 120 125

Ile Ser Glu Asp Asn Val Pro Leu Ile Val Pro Ala Leu Gln Tyr Gln

130 135 140

Glu Val Val Ile Tyr Phe Gly Gln Val Ser Ser Glu Lys Ala Thr Glu

145 150 155 160

Phe Ala Asp Leu Thr Ser Leu Ile Asp Gly Ser Leu Pro Thr Ile Thr

165 170 175

Pro Pro Leu Trp Asn Gln Gln Thr Ile Thr Thr Leu Asn Ser Ala Leu

180 185 190

Ser Thr Val Val Tyr Ser Lys Thr Ser Ser Ser Arg Leu Glu Met Tyr

195 200 205

Gly Ser Phe Leu Ala Lys Val Met Val Val Asn Met Arg Ile Trp Ala

210 215 220

Val Thr Asp Asn Thr Leu Gln Thr Thr Cys Gly Gly Lys Ile Gly Phe

225 230 235 240

Val Lys Val Val Lys Ser Pro Val Thr Ile Asp Gly Thr Gln Asn Asp

245 250 255

Arg Ser Lys Asp Lys Ser Gln Trp Ala Val Ile Asp Asp Lys Pro Val

260 265 270

Phe Cys Phe Thr Thr Asn Gly Tyr Ser Thr Lys Gln Arg Thr Val Ala

275 280 285

Gly Ser Ala Thr Cys Ile Thr Gln Gln Val Val Ser Asn Leu Phe Ala

290 295 300

Thr Ser Ala Ala Asn Phe Ile Pro Cys Pro Tyr Ser

305 310 315

Claims

1、一种检测本地旋毛形线虫抗体的重组原核表达检测抗原的制备方法，其制备过程包括：

(1)设计扩增TNPG基因的特异性引物；

(2)通过PCR扩增获得TNPG基因片段；

(3)对TNPG基因进行克隆、测序鉴定；

(4)将TNPG基因定向亚克隆至pET-30a原核表达载体；

(5)TNPG基因在大肠杆菌的诱导表达；

将重组表达质粒pET-30a-TNPG转化大肠杆菌BL21，进行诱导表达；

(6)TNPG基因表达蛋白的亲合层析纯化

(6-1)待纯化样的制备

离心收集表达细菌：离取沉淀，用1mol/L、pH7.4的PBS洗涤3次，沉淀用PBS溶液重悬起；

裂解菌体获取上清可溶性蛋白与包涵体沉淀：菌体进行超声处理30min，强度30％，超声15s，停止10s，冰浴进行，以4℃，13000rpm离心30min，取沉淀悬于适量1mol/L、pH7.4的PBS，同上超声离心取沉淀，沉淀悬于适量8M脲中，同上超声，4℃，13000rpm离心30min，取上清；

(6-2)表达蛋白的亲合层析纯化包括

①用ddH₂O洗5个柱体积；

②用5个柱体积的8M脲平衡柱

③样品上柱，上柱前样品用0.22μm滤器过滤出去大颗粒，取离心上清过柱；

④用8M脲洗一个柱体积，收集洗脱液；

⑤用1M NaCl、8M脲洗一个柱体积，收集洗脱液；

⑥用8M脲洗一个柱体积，收集洗脱液；

⑦用500mM咪唑、4M脲洗适量体积，收集洗脱液；

⑧将⑦收集的洗脱液，用MW 6000的PEG浓缩至适当体积；

⑨将上步的浓缩液用20mM、pH8.0的Tris·HCl，4℃透析48h，每6小时换液一次，之后用5mM、pH8.0的Tris·HCl，4℃透析24h，每6小时换液一次；

(7)表达蛋白含量的测定

采用紫外线吸收法定量蛋白质，将待检样品稀释后，同时测定该蛋白质溶液在λ260nm和λ280nm处的OD值，同时用稀释液作为空白对照，按下列公式计算蛋白含量：

(1.46×A280-0.74×A260)×稀释倍数＝(mg)/ml蛋白含量TNPG基因纯化蛋白的质量浓度为≥2.9mg/ml。