CN103160519B - 金黄色葡萄球菌肠毒素b免疫制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）免疫制剂SEB2-HSP65，它是通过对SEB基因进行了改造，构建了SEB2基因，并将其与热休克蛋白HSP65的基因融合，获得了核心基因片段SEB2-HSP65，利用SEB2-HSP65基因表达的重组融合蛋白；重组蛋白SEB2不具有结合TCR细胞受体的能力，从而解决了现有的SEB免疫制剂产生大量炎症因子的问题，HSP65增强了重组蛋白SEB2的免疫原性，SEB2-HSP65重组融合蛋白作为免疫制剂免疫动物，不需要任何免疫佐剂，就能产生效价较高的抗体，可以使动物抵抗5×LD₅₀SEB毒素攻击，且保护率可达到100%。该融合蛋白具备较大的开发利用价值。

Description

金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫制剂及其制备方法和药物的用途。 

背景技术

葡萄球菌可分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌。引起食物中毒的主要是金黄色葡萄球菌产生的肠毒素。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）广泛存在于空气、土壤、水及物品。在人和家畜的体表及与外界相通的腔道，检出率也相当高。葡萄球菌的抗原结构较复杂，细胞壁经水解后，用沉淀法可得到两种抗原成分，即蛋白质抗原和多糖类抗原。蛋白质抗原主要为葡萄球菌A蛋白（Staphylococcus protein A,简称SPA），是一种表面抗原，从人分离到的菌株均有SPA，来自动物的少见。90%以上的金黄色葡萄球菌有此抗原，因而只具有种的特异性而无型的特异性。SPA的分子质量为13000-42000μ，它能与人及哺乳动物血清中IgG的Fc片断发生非特异性结合。多糖类抗原为存在于细胞壁上的半抗原，是该菌的一个重要抗原，有型特异性。其抗原决定簇为磷壁酸中核糖醇单位，此抗原可用于该菌的分型。金黄色葡萄球菌采取噬菌体分型共分5个群。金黄色葡萄球菌在生长繁殖过程中还产生多种毒素和酶，其中主要有溶血毒素、肠毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、DNA酶、耐热性核酸酶和透明质酸酶等。 

在无芽孢的细菌中，葡萄球菌的抵抗力最强。在干燥的浓汁中可生存数月，湿热80℃、 

30min才能将其杀死。耐盐性强，在含盐7.5%-15%的培养基上能生长，但对燃料较敏感，如培养基中加入5×10^-6龙胆紫液可抑制其生长。对磺胺类药物敏感性较低，红霉素、链霉素、氯霉素及四环素较敏感。肠毒素的耐热性强，食物中毒素煮沸120min方能破坏，故一般的消毒及烹调不能破坏。低温下2个月以上失去毒力，可抵抗0.3%福尔马林达48h，pH3-10不被破坏，但在0.915mg/L氯溶液中3min即可破坏。

金黄色葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal entertoxin B SEB）是一种单体蛋白，它的分子质量是28366Da，等电点pI为8.6。对于每个蛋白质的一级结构和氨基酸序列是不一样的。金黄色葡萄球菌肠毒素B的氨基酸数量是238。SEB毒素蛋白有大量的赖氨酸(13.4%)和天冬氨酸(10.1%)带负电的残基有36个(天冬氨酸+谷酰胺)带正电的残基(精氨酸+赖氨酸)是37个。SEB的原子数量是3922个,其与原子组成成分碳1269个,氢1932个,氮324个,氧387个,硫10个。一分子的SEB的三维结构包含两个区域，这些区域是通过6个残基延伸的loop连接；一区（30-120），二区（127-239）。一个长的α-螺旋跨过两个区域的分子中心。区域一包含一个β-圆柱体（包含β1，β2，β3，β4，β5股）和三个螺旋（α2，α3，和α5）。 

一区发现了大量的可溶性狂犬病残基。通过不同的β回转，β1与β2股和β2与β3两个半胱氨酸残基（半胱氨酸93和半胱氨酸113）在β圆柱体的上方形成一个的二硫化物键。两个半胱氨酸残基之间的序列形成一个能移动的、可溶的loop。 

SEB的二区和其他微生物的超抗原是不一样的。它包含逆向平行的β折叠（β6-β12股）包着处于中心的α螺旋，β6股逆向平行β7，β7平行β12；β9逆向平行β12和β10。最近有关报道了二区可能结合p85蛋白质。N端尾部（残基1到20）在二区的表面。残基14到17 在二区的顶部形成一个310-螺旋回转（作为α1螺旋被标记）。葡萄球菌核酸中发现了OB-折叠，并在一些毒素和无关序列的非毒素蛋白质中出现。在蛋白质进化的过程中关于OB-折叠提出了很多观点。OB折叠在超抗原进化过程中是否结合二氧化碳分子仍然没有阐明。尽管这样，一个半乳糖类似物即半乳糖神经酰胺（半乳糖α1-4半乳糖β1-1神经酰氨）已经被证明作为SEB受体起到重要作用。SEB结合MHC的亲和力很高（K_d-10^-6），它能结合小鼠的T细胞Vβ3，7，8.1，8.1，8.3，和17。根据SEB的拓扑异构和突变研究，T-细胞受体结合部位被SEB区域1和区域2形成的浅槽包围。SEB分子中α5螺旋，面对着结合MHC分子的邻近位点。 

SEB是一种热稳定蛋白。由于最开始过快的加热，在高温条件下会造成SEB活性的减弱。当毒素在PH7.3，100℃，加热5min，它的活性损失少于50%。SEB会抵抗变性剂的变性作用，比如尿素和盐酸胍。 

金葡菌SEB属于超抗原，不需要APC的加工处理，以完整的蛋白质分子直接与MHC II类分子的α1结构域和TCR的β链V区结合，从而刺激T细胞活化增殖，释放大量细胞因子。SEB与MHC II类分子(HLA-DR1)形成的复合物，发生在MHC II类分子的α1结构域和SEB分子的N末端结构域之间。金葡菌SEB和HLA-DR1间的主要作用是金葡菌SEB的谷氨酸(Glu) 67和HLA-DR1的赖氨酸(Lys)39间形成的盐桥，SEB疏水端的侧链与HLA-DR1的α1螺旋和β片层间的非极化区域相互作用。金葡菌SEB发生相互作用的TCRVβ残基是：骨架区2(FR2)的组氨酸(His)47，互补决定区2(CDR2)的酪氨酸(Tyr)50，丙氨酸(Ala)52，甘氨酸(Gly)53，丝氨酸(Ser)54和苏氨酸(Thr)55，骨架区3的谷氨酸(Glu)56，赖氨酸(Lys)57，酪氨酸(Tyr)65，赖氨酸(Lys)66和丙氨酸(Ala)67，和高变区的脯氨酸(Pro)70，丝氨酸(Ser)71。与Vβ相互作用的SEB残基是：结构域1的天冬氨酸(Asn)60，酪氨酸(Tyr)90和酪氨酸(Tyr)91。结构域2的苏氨酸(Thr)18，甘氨酸(Gly)19，亮氨酸(Leu)20，谷氨酸(Glu)22，天冬氨酸(Asn)23，酪氨酸(Tyr)26，苯丙氨酸(Phe)176和谷氨酸(Glu)210。TCRα链在维持TCR-SEB-MHC复合物稳定性方面发挥着重要作用。因此，TCRβ链-SEB、SEB-TCRα和MHCβ链-TCRα链这三部分决定了整个TCR-SEB-MHC复合物的稳定性。 

SEB中毒的两种主要途径是口服和呼吸。3.5ugSEB通过口服途径的摄入就会引起呕吐。吸入的SEB也具有有很强的毒性，只有30ng就能引起发烧，呼吸不适（比如，咳嗽，呼吸困难，胸骨后不适和胸部疼痛），和胃肠道病症。严重的中毒会导致肺部水肿，成人窘迫呼吸症（ARDS）和死亡。SEB还能引发毒素休克综合征，它的表现有高热、脱皮、高血压、休克和其他症状。由金葡菌SEB引起的毒素休克综合症的病死率可达50%，而与流感并发的金葡菌SEB感染其死亡率可达90%以上，这使得金葡菌SEB成为一种潜在的生化武器。金葡菌SEB引起毒素休克综合征主要是由于金葡菌SEB进入机体后，其超抗原的结合引起单个核细胞活化，导致广泛的细胞因子释放。在中毒性休克中，死亡率和细胞因子主要取决于TCRαβT细胞，早期由TCRαβT细胞释放的TNFα对死亡的发生起了重要的作用。 

金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是一类单链的具有高免疫原性，分子量为23-29KDa的蛋白毒素。这类毒素是食物中毒和中毒性休克的主要原因。活化的淋巴细胞产生了大量的致炎症因子导致中毒性休克。细胞因子的水平的提高还不能确定与食物中毒有关。然而，通过口服SEB毒素的小鼠的肠道淋巴组织发现了Vβ8⁺T细胞。肠毒素作为重要的毒力因素使得金黄色葡萄球菌在各种生态位中存活和繁殖。所以肠毒素作为显著的疫苗应用于有关葡萄球菌的感染。 

有些疫苗显示，通过免疫小鼠和非人类灵长类动物，有效地提高了肠毒素的致命剂量。反复口服SEB甲醛类毒素对由口服SEB引发的内在疾病，并没有非常有效的治疗。但是通过口服天然SEB的催吐或者催吐以下范围内的剂量，在一周内都能降低同源毒素的攻击。这种短暂的调节并不是由抗体调节的，很可能与活化的淋巴细胞有关。一些文献记载了关于小鼠口服或者鼻吸，带有或者没有粘膜类佐剂的霍乱毒素的重组弱毒SEB疫苗。这种疫苗可以通过ELISA评定抗体效价，这种疫苗最终使腹膜和粘膜的致命剂量提高。 

发展SEB免疫检测系统过程中，有效的特异性和高亲和性抗体的研究是主要瓶颈。任何一个SEB的免疫学检测系统都需要特异性和高亲和性的抗体，但是SEB作为超抗原它产生低滴度的多克隆抗体。如果SEB被其它少量杂蛋白污染会产生非特异性的抗血清，从而影响抗体的特性。用传统的方法产生的SEB多克隆抗体，不适合用于高纯度的SEB抗原免疫得到地特异性和高灵敏度的单抗。相比较而言，杂交瘤技术被用来产生SEB的单克隆抗体。但是经过长时间杂交瘤克隆子会丧失抗体分泌的能力。近年来，重组DNA和基因扩增技术的出现， 

使得通过噬菌体展示技术克隆出理想的抗体基因成为可能。这种无限增殖的抗体基因，提供了利用细菌培养的单链可变片段（ScFv）技术的可行性。可以用基因重组技术改造ScFv抗体分子的基因，提高抗体的特异性和亲和性。

检测食物中的金黄色葡萄球菌引发大规模疾病，其检测含量一般为0.1-0.2ug/100g的食物。根据与肠毒素反应的单抗，研究金黄色葡萄球菌肠毒素的检测方法。其中一种方法是凝胶扩散。用个人纯化的肠毒素和凝胶沉淀反应中的肠毒素作为抗原免疫兔，产生的多克隆抗体具有很高的特异性能够达到0.1-0.5μg/ml。反向被动乳胶凝集（RPLA）方法比凝胶扩散方法更灵敏。当乳胶包着的抗体颗粒与肠毒素接触时能够发生凝集作用。用RPLA方法可以检测出引起中毒的食物中的肠毒素。但是酶联免疫反应(ELISA)通常取代RPLA方法检测少量的肠毒素。ELISA是先通过抗体与毒素结合形成抗体-肠毒素复合物，再与酶标记抗体孵育偶联。酶标记底物反应产生的颜色与样品中的肠毒素含量成比例。因此，从食物中粗提和纯化的样品都可以应用ELISA检测。结合抗体的主要吸附剂有聚苯乙烯球，微孔板和导管。ELISA的灵敏度通常小于1ng/g食物。抗体与非特异性抗原发生反应，由于食物加热造成的不灵敏，会影响ELISA最后的定性分析。但是Western blotting可以克服这些主要问题，因为Western产生的可溶性的变性毒素，仍然具有生物活性，并能与抗体发生反应。最灵敏的检测方法是T细胞增殖实验，这种方法能够测定肠毒素作为超抗原的能力。但是这种方法没有特异性，因为任何样品中的肠毒素都能诱导T细胞的增殖。所以，还需要进一步进行ELISA实验确定肠毒素。这些免疫学方式都有一个缺点，就是需要很长时间，有可能是好几个小时甚至几天。根据免疫学实验方法的生物传感器技术，可以作为快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法。生物传感器的灵感度和检测的限度与ELISA是一样的，但它所需完成的评定时间只需要几分钟。生物传感根据受体固表面产生的抗体与溶解的再生分析物发生作用，抗原和抗体之间的生物学反应转化成电信号，然后进行分析。生物传感技术通常有两个普遍的检测方法。其中一个方法是根据表面消散波，它被用作测定光学波导管表面的抗原抗体反应，产生折光率的变化。另一种则是根据表面胞质团共振（SPR），它是通过测定吸收光的波长或者光衍射。ELISA存在的主要问题是，抗体与未知抗原的交叉反应和由于加热食物造成的灵敏度降低，这也在生物传感器技术中存在。导光纤维的生物传感系统包括一个二级荧光标记抗体可以用来检测SEB与SEA和SED的交叉反应。与ELISA相比生物传感系统不方便，它们需要复杂的仪器进行测定。 

免疫佐剂是一种非特异性的免疫增强剂，其本身不具备免疫原性，但是可以增强机体对 

与其共同注入体内的抗原的免疫应答。疾病种类的增多和病原体基因的变异引起的大规模流行病考验着畜牧工作者，传统的疫苗因低保护性和安全性而逐渐淘汰，安全性高的新型疫苗投入研究，如亚单位疫苗、重组疫苗和合成多肤疫苗等，但此类疫苗免疫原性较弱，原有的免疫佐剂已不能满足需要，开发高活性而副作用低的新型免疫佐剂的研究日益迫切。

高效免疫佐剂热休克蛋白：热休克蛋白Heat Shock Proteins（HSP）生物体（或细胞）在不良环境因素作用下所产生的一组特殊的蛋白质，它能保护机体（或细胞）不受或少受伤害。现已证实HSP普遍存在于从细菌到人的整个生物界。目前已发现的HSP已有10多种，按相对分子量以及同源程度可分为HSP100，HSP90，HSP70，HSP65,HSP60小分子HSP和泛素等,热休克蛋白家族是迄今为止发现最为保守的家族。目前认为HSP65是主要的伴侣蛋白之一。其作用是与新生，未折叠，错折叠或聚集的蛋白质相结合，使某些蛋白质聚集物解离，加速正确的肽键折叠和重折叠，促进蛋白质复性；维持某些肽链的伸展状态以利其跨膜转位，在线粒体，内质网等不同的区域内发挥作用，加速抗原的提呈；保护蛋白质免受TNF，NK细胞攻击，同时还促进体内某些变性蛋白的降解和清除，减轻体内炎性反应；重新激活某些酶的作用，以维护细胞的功能和存在。 

 HSP65在天然免疫和适应性免疫中也起到重要作用。HSP65通过模式识别受体（PRR）传递信号给天然免疫系统，激活效应细胞产生免疫应答。HSP65还具有结合并呈递抗原肽的作用，HSP抗原肽复合物能够激活CD8+T细胞特异性免疫应答，这种特异性识别作用是由CD91 受体介导的。热休克蛋白的免疫学特性在动物实验和临床研究中已获得了一定的成功。另外，HSP65通过抗凋亡，抗炎及分子伴侣作用机制对炎症反应综合症中（SIRS）病理损害起到保护作用。它可以在单核巨噬细胞及中性粒细胞因子和炎性介质水平，成为预防和治疗SIRS及其他危重病的新措施。 

弗氏佐剂：弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂两种，可根据不同的免疫需求来应用，弗氏完全佐剂通常用于初始免疫，以后的加强免疫中只用弗氏不完全佐剂，抗原与佐剂的体积一般各占50%，最终所形成的混合物是典型的“油包水”乳胶混合体。弗氏佐剂属于含油佐剂，是目前应用最为广泛的实验用佐剂，它的优势在于具有较强的免疫增强效应，包括细胞免疫和体液免疫，虽然这类佐剂在提高抗体效价的幅度和免疫持久性方面，远优于铝佐剂，但产生不良反应严重，注射后常引起肉芽肿和无菌化脓，油长期储留于组织中不能及时代谢，易引起过敏反应，因此，此类佐剂只用于动物实验。 

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种金黄色葡萄球菌肠毒素B基因SEB2，金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫制剂基因SEB2-HSP65及其免疫制剂SEB2-HSP65。 

一种金黄色葡萄球菌肠毒素B基因SEB2，它包括序列表SEQ ID NO.3所示的碱基序列。 

金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫制剂的核心基因片段SEB2-HSP65，它是由SEB2和热休克蛋白基因HSP65融合而成； 

其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫制剂SEB2-HSP65，它是由核心基因片段SEB2-HSP65表达的； 

其核甘酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

预防金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌肠毒素B感染的疫苗，它是上述的免疫制剂SEB2-HSP65。 

本发明人针对SEB蛋白毒素结合MHC分子和TCR细胞受体，从而产生大量炎症因子，利用了SEB稳定性好，耐热性高，具有促细胞分裂的作用；以及对SEB结构和功能的认识—SEB从金黄色葡萄球菌产生的肠毒素作为超抗原，引起机体产生免疫应答。关于SEB机理的研究主要应用于抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病和抗移植排斥反应。我们通过基因工程的方法改造SEB的基因，并与热休克蛋白HSP65的基因结合。其核心区SEB2-HSP65碱基序列如序列表中SEQ ID NO.5。重组蛋白具有如下特点： HSP65调节SEB正确折叠和空间构象，减弱目的蛋白在体内的降解能力，从而增强目的蛋白的免疫原性，HSP65能与一些免疫细胞受体相结合并降低目的蛋白毒性。改造的目的蛋白SEB2刺激机体产生免疫应答，主要作用于产生MHC分子的受体细胞，而不作用TCR受体细胞，产生的抗体或者免疫细胞能与抗原反应，降低SEB的毒性，我们成功地构建了原核重组表达质粒pET28a-SEB2-HSP65，通过表达获得免疫制剂。 

Western Blot方法证明了重组蛋白SEB2-HSP65可以刺激机体产生相应抗体。ELISA试验证明它的抗体效价高，结合天然毒素能力强。最后制作的水肿或者淋巴细胞肿大的病例切片说明细胞具有免疫能力，并能降低蛋白毒性。由于HSP65具有能与多种免疫细胞受体结合，这样使SEB2-HSP65能介导多种免疫细胞或者器官的调节作用。 

本发明提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）免疫制剂SEB2-HSP65，它是通过对SEB基因进行了改造，构建了SEB2基因，并将其与热休克蛋白HSP65的基因融合，获得了核心基因片段SEB2-HSP65，利用SEB2-HSP65基因表达的重组融合蛋白；重组蛋白SEB2不具有结合TCR细胞受体的能力，从而解决了现有的SEB免疫制剂产生大量炎症因子的问题，HSP65增强了重组蛋白SEB2的免疫原性，SEB2-HSP65重组融合蛋白作为免疫制剂免疫动物，不需要任何免疫佐剂，就能产生效价较高的抗体，可以使动物抵抗5×LD₅₀ SEB毒素攻击，且保护率可达到100%。该融合蛋白具备较大的开发利用价值。 

附图说明

图1为PCR扩增SEB1电泳结果；其中：1.DNA marker DL2000；2.SEB1 PCR产物； 

图2为pET28a-SEB1双酶切鉴定结果；其中1.DNA marker DL2000；2. Nde和EcoR双酶切质粒pET28a-SEB1；

图3为PCR扩增SEB2部分序列电泳结果；其中1.DNA marker DL2000；2.SEB2部分序列 PCR产物；

图4为pET28a-SEB2双酶切鉴定结果；其中1. DNA marker DL2000  2. Nde和EcoR双酶切质粒pET28a-SEB2；

图5 pET28a-SEB2-HSP65双酶切鉴定结果；其中1. EcoR I和Nde双酶切质粒pET28a-SEB2-HSP65； 2. EcoR I和Hind双酶切质粒pET28a-SEB2-HSP65 ；3.Hind和Nde双酶切质粒pET28a-SEB2-HSP65；4. 对照质粒，Marker： DNA marker DL2000 ；

图6 SEB1蛋白表达形式鉴定：其中1. 20℃诱导表达菌超声破碎后的上清，2. 20℃诱导表达菌超声破碎后的沉淀，3. 37℃诱导表达菌超声破碎后的上清，4. 37℃诱导表达菌超声破碎后的沉淀，5.37℃诱导的表达菌，6.37℃未诱导的表达菌，7.蛋白质Marker；

图7 SEB2-HSP65重组蛋白表达形式鉴定：1.37℃诱导的表达菌，2. 37℃未诱导的表达菌，M.蛋白质Marker，3. 37℃诱导表达菌超声破碎后的沉淀，4. 37℃诱导表达菌超声破碎后的上清，5. 37℃未诱导的表达菌，6. 20℃诱导表达菌超声破碎后的沉淀，37℃诱导表达菌超声破碎后的上清；

图8为SEB1蛋白经纯化后最终的SDS电泳：1.最终纯化的目的蛋白，M.蛋白质Marker；

图9 为SEB2-HSP65重组蛋白经纯化后最终的SDS电泳：1、2、3、4.为SEB2-SHP65重组蛋白在DEAE层析柱不同梯度洗脱的样品，梯度分别为100%、100%-90%、90%-75%、75%，M。蛋白质Marker。

具体实施方式

实施例1：SEB1基因扩增与pET28a载体连接 

通过蛋白数据库检索SEB的氨基酸并翻译成DNA序列，为其设计扩增引物，上游引物标为P1，下游引物标为P2。并在SEB1片段N端引入NdeⅠ酶切位点和C端引入EcoRⅠ酶切位点。以（含有SEB全基因序列SEQ ID NO.1,由大连宝生物科技有限公司合成）为模板，P1和P2为引物进行扩增反应，得到的PCR产物标为SEB1；

P1（31bp）：5′CATGCATATGGAAAGCCAGCCGGATCCGAAA 3′含NdeI酶切位点；

P2（23bp）：5′GCGAATTCTCATTTTTTGGTGGTCAGATACACTTC 3′含EcoRI酶切位点；

用常规方法扩增基因片断；进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图1.所示，可见到大小约为700bp的目的基因，与预期的大小相符；

将载体质粒pET28a大片段和PCR扩增的目的基因双酶切后纯化回收的PCR产物用T₄ DNA连接酶连接，得到重组质粒pET28a-SEB1，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，含kan抗性的普通琼脂平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养；用质粒回收试剂盒提取质粒，用限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定，并进行序列的测定。可见质粒经双酶切后在700bp上有目的基因带（见图2），SEB1其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示.证明SEB1全基因已经连接到载体上，成功的构建了重组质粒pET28a-SEB1。

实施例2：重组质粒pET28a-SEB2-HSP65的连接 

根据该基因的序列设计了两端带有酶切位点的引物来扩增目的基因；上游引物标为P3，下游引物标为P4；并在SEB N端引入NdeⅠ酶切位点和C端引入EcoRⅠ酶切位点；以（含有SEB全基因序列SEQ ID NO.1,由大连宝生物科技有限公司合成）为模板，P3和P4为引物进行扩增反应，得到的PCR产物标为SEB2；

P3（34bp）：5′CATGCATATGAGCATTGATCAGTTTCTGTATTTT  3′含NdeⅠ酶切位点；

P4（26bp）：5′GCGAATTCATCGCCCGGCGCCGGCAT 3′含EcoRⅠ酶切位点；

用常规PCR方法扩增得到SEB2的基因片断，琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3.所示，可见到大小约为500bp的目的基因，与预期大小相符；

将载体质粒pET28a大片段和PCR扩增的目的基因双酶切后纯化回收的PCR产物用T₄ DNA连接酶连接，得到重组质粒pET28a-SEB2，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，含kan抗性的普通琼脂平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养。提取质粒，用限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定，并进行序列的测定。可见质粒经双酶切后有500bp目的基因带（见图4），SEB2其碱基序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

根据该基因的序列设计了两端带有酶切位点的引物来扩增目的基因；上游引物标为P5，下游引物标为P6；并在HSP65 N端引入EcoRⅠ酶切位点和C端引入HindШ酶切位点；以（含有HSP65全基因序列 由吉林大学白求恩医学院 王丽颖教授惠赠）为模板，P5和P6为引物进行扩增反应，得到的PCR产物标为HSP65； 

P5（31bp）：5′GCGAATTCATGGCCAAGACAATTGCGTACGA  3′含EcoRⅠ酶切位点；

P6（31bp）：5′CCCAAGCTTTTAGAAATCCATGCCACCCATGTC  3′含HindШ酶切位点；

用常规PCR方法扩增得到HSP65的基因片断，琼脂糖凝胶电泳分析。试剂盒回收目的片断。将pET28a-SEB2质粒和目的基因片段HSP65分别用EcoRⅠ和Hind双酶切后纯化，回收目的片断用T₄DNA连接酶连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，含kan抗性的琼脂平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养。提取质粒，得到重组质粒pET28a-SEB2-HSP65，用三组双酶切；NdeⅠ和EcoRⅠ、EcoRⅠ和Hind、NdeⅠ和Hind鉴定，并进行序列测定。可见质粒经双酶切后有500bp、1650bp、2150bp目的基因带（见图5），SEB2-HSP65其碱基序列如序列表SEQ ID NO.5所示，证明HSP65基因已经连接到载体上，成功的构建了重组质粒pET28a-SEB2-HSP65。

实施例3：SEB1蛋白和SEB2-HSP65重组蛋白表达产物的SDS-PAGE结果 

将重组质粒pET28a-SEB1和pET28a-SEB2-HSP65分别转化表达菌-大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果显示：重组蛋白SEB1和SEB2-HSP65分别在30KD和80KD左右处各有一明显表达带，大小与理论值相符；见图6和7；

将SEB1蛋白表达菌裂解液上清和沉淀同时做SDS-PAGE电泳，结果显示，SEB1蛋白绝大多数在上清中，沉淀中相应位置也存在少量目的蛋白，认为是可溶性表达，见图6。

将SEB2-HSP65重组蛋白表达菌裂解液上清和沉淀同时做SDS-PAGE电泳，蛋白绝大多数在沉淀中，认为是包涵体，见图7。 

实施例4：SEB1蛋白的纯化步骤 

将SEB1毒素蛋白的BL21（DE3）表达菌接种于含有卡那霉素的5ml液体培养基，培养9小时。取1.5ml接种于含有卡那霉素的1L LB液体培养基中，37℃，250r/min培养，当OD值达到0.6~0.8时，加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导，于37℃，诱导表达4h。4℃，4000r/min离心，菌体用20mmol/l Tris.cl、pH8.0重悬，超声波破碎，离心，去沉淀，上清保存于4℃。上清用10%-60%饱和硫酸铵盐析。然后用20mmol/l Tris.cl、pH 7.5溶解，去沉淀，上清用于进行蛋白纯化。

 将制备的蛋白上清液先进行SP（SP Sepharose 4 fast flow）阳离子层析柱纯化。用5倍柱床体积的20mmol/l Tris.cl、pH 7.5平衡,0.8ml/min上样，继续平衡2h，以20mmol/l Tris.cl和0.5mol/l Nacl、pH7.5进行0-100%梯度洗脱，收集目的蛋白，0.1N NaOH洗柱，水洗，0.1%NaN₃封柱。 

第二步层析用chelating(Chelating Sepharose 4 fast flow)金属鳌合层析铜（Cu²⁺）柱纯化，用5倍柱床体积的20mmol/l Tris.cl和0.5mol/l Nacl、pH7.5平衡，0.5ml/min上样，继续平衡6小时，用20mmol/l Tris.cl、0.5mol/l Nacl和40mmol/l咪唑洗脱，再用20mmol/l Tris.cl、0.5mol/l Nacl和200mmol/l咪唑洗脱，收集目的蛋白， 0.1M EDTA洗柱，0.1N NaoH在位清洗，水洗，0.1M CuSO₄再生层析柱，水洗，20%乙醇封柱。 

将纯化的蛋白用20mM Tris.cl 4℃透析、过夜。Thrombin酶切体系（20ml）；16ml蛋白液、6μl thrombin、4ml thrombin cleavage buffer，20℃水浴16h。酶切后蛋白液加入咪唑使终浓度达8mM，用Chelating(Chelating Sepharose 4 fast flow)金属鳌合层析铜（Cu²⁺）柱进行纯化，流川液用20mmol/l Tris.cl、pH 7.5透析、过夜。透析过的蛋白液用DEAE（DEAE Sepharose 4 fast flow）阴离子层析柱进行纯化，用20mmol/l Tris.cl、pH 7.5平衡，0.8ml/min上样，继续平衡2h，20mmol/l Tris.cl和0.5mol/l Nacl，pH7.5进行0-100%梯度洗脱，收集目的蛋白，0.1N NaOH洗柱，水洗，0.1% NaN₃封柱；见图8。 

纯化的蛋白液加入灭菌甘油，于-80℃保存。 

实施例5：SEB2-HSP65重组蛋白的纯化步骤 

将SEB2-HSP65重组蛋白的BL21（DE3）表达菌接种于含有卡那霉素的5ml液体培养基中，37℃摇床培养9小时。取1.5ml接种于含有卡那霉素的1L LB液体培养基中，37℃，250r/min培养，当OD值达到0.6~0.8时，加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导，于37℃，诱导表达4h。

菌液在4℃条件下，4000r/min离心10min，菌体用20mmol/l Tris.cl、pH8.0重悬，然后超声波破碎，离心，去上清，沉淀用0.5% Triton洗一遍，去上清。用1M尿素洗两遍，沉淀用20mmol/l Tris.cl 和6M尿素溶解，离心，去沉淀，上清用于进行蛋白纯化。 

将制备的蛋白上清液先进行DEAE（DEAE Sepharose 4 fast flow）阴离子层析柱纯化。用5倍柱床体积的20mmol/l Tris.cl、6M尿素pH 8.0平衡，0.8ml/min上样，继续平衡2h，20mmol/l Tris.cl、6M尿素pH 8.0和20mmol/l Tris.cl和0.5mol/l Nacl pH 8.0，0.3ml/min梯度洗脱，收集目的蛋白，0.1N NaOH洗柱，水洗，0.1% NaN₃封柱。再用chelating(Chelating Sepharose 4 fast flow)金属鳌合层析铜（Cu²⁺）柱纯化，用5倍柱床体积的20mmol/l Tris.cl、0.5mol/l Nacl、2M尿素pH8.0平衡，0.3ml/min上样，继续平衡3小时，再用20mmol/l Tris.cl、0.5mol/l Nacl、2M尿素pH8.0和20mmol/l Tris.cl、0.5mol/l Nacl、pH8.0，0.3ml/min梯度洗脱8小时。用20mmol/l Tris.cl、0.5mol/l Nacl、40mm咪唑PH8.0洗脱，再用20mmol/l Tris.cl、0.5mol/l Nacl、200mm咪唑pH8.0洗脱，收集目的蛋白，0.1M EDTA洗柱，0.1N NaOH在位清洗，水洗，0.1MCuSO₄再生，水洗，20%乙醇封柱。 

将纯化的蛋白用20mM Tris.cl 4℃透析、过夜。Thrombin酶切体系（20ml）；16ml蛋白液、6μl thrombin、4ml thrombin cleavage buffer，20℃水浴16h。酶切后蛋白液加入咪唑使浓度达8mM，用Chelating(Chelating Sepharose 4 fast flow)金属鳌合层析铜（Cu²⁺）柱进行纯化，流川液用20mmol/l Tris.cl、pH 8.0透析、过夜。透析过的蛋白液用DEAE（DEAE Sepharose fast flow）阴离子层析柱进行纯化，用20mmol/l Tris.cl、pH 8.0平衡，0.8ml/min上样，继续平衡2h，20mmol/l Tris.cl和0.5mol/l Nacl、pH8.0梯度洗脱，收集目的蛋白，见图9。 

纯化的蛋白液加入灭菌甘油，于-80℃保存。 

实施例6：关于免疫剂量的研究。 

1、用SEB2-HSP65重组蛋白作免疫制剂，皮下注射纯系昆明鼠。实验小鼠分为六组，第1组为空白对照，第二组为100ng组，第三组为1μg组，第四组为20μg组，第五组为100μg组，第六组为佐剂对照组，每2周免疫一次，共四次。最后一次免疫一周后，采血分离血清，测定抗体效价。 

2，抗体效价的测定，以纯化的SEB1为抗原。抗体为免疫小鼠后的尾静脉血，采血后，血液在37℃放置45min，10000g、4℃离心10min。血清于-20℃冻存。二抗为羊抗鼠辣根过氧化物酶。进行酶联免疫反应ELISA抗原捕捉实验，包被抗原：包被抗原SEB1 1.5μg/孔，血清稀释倍数依次为1：100～1：20000，并设空白对照组。二抗稀释倍数为1：1000。 

具体步骤如下；1抗原包被 用包被液将抗体稀释后，包被反应板，每孔100μL，4℃过夜。（包被液0.05M PH9.6：1.95g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，加水至1000mL ，4℃保存）。2洗涤 用洗涤液洗涤3次，每次1min，沥干（洗涤液0.01mol/L PH7.4 PBST：8g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KH₂PO₄，0.5mL Tween-20，加蒸馏水至1000mL）。3封闭 用2%人血清37℃封闭1h，洗涤上（保温液2%人血清白蛋白，0.05%PBST100mL）。4加入被检抗体，用保温液将被检抗体稀释后加入反应孔，每孔100μL，同时以无菌PBS作为阴性对照，置于37℃孵育1h（抗体被保温液稀释）。5洗涤4次，每次3min。6加入二抗 加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG，置于37℃孵育0.5h（二抗用保温液稀释）。7洗涤4次，每次3min。8显色 加入底物溶液每孔100μL，置室温暗处显色10 min（2.5mL 蒸馏水，1.025mL 0.1M柠檬酸，1.475mL 0.1M柠檬酸钠，2mg OPD，15μl H₂O₂。0.1M柠檬酸：5.2535g 柠檬酸，加水至250mL。0.1M柠檬酸钠：7.3525g 柠檬酸钠，加水至250mL）。9终止反应 加入终止液每孔50μL，静置5 min 

（终止液：88.9mL 蒸馏水，缓慢滴入11.1mL 浓硫酸）。10测定OD值 用490nm波长,测定各反应孔的OD值,结果见表1。

表1 重组蛋白SEB2-HSP65四次免疫后 

ELISA检测血清抗体效价结果

第一组

第二组

第三组

第四组

第五组

第六组

免疫剂量

PBS对照

100ng SEB2-HSP65

1μg SEB2-HSP65

20μg SEB2-HSP65

100μg SEB2-HSP65

1μg SEB1+佐剂

血清抗体效价

0

1：1024

1：4096

1：18000

1：20000

1：16000

由血清抗体测定结果可以看出，20μg SEB2-HSP65免疫组免疫效价达到1：18000，优于佐剂对照组，同时动物行为、饮食特征、体征未见任何异常。因此，确定20μg SEB2-HSP65为最佳免疫剂量。

实施例7：动物的攻毒实验 

用自行表达纯化的SEB1和购自军事医学科学院微生物与流行病的野生型SEB分别配合LPS腹腔注射成年纯系昆明鼠（25克体重，由长春生物制品研究所提供），测定其LD₅₀。分为9组，每组4只。

SEB半数致死量动物模型试验结果。 

SEB攻毒试验 

取纯系昆明鼠40只随机分为5组，每组8只，其中一组作为对照组，其余4组分别用20μg SEB2-HSP65重组融合蛋白作为免疫制剂，皮下注射免疫小鼠，每次间隔14天。小鼠经过四次免疫，在最后一次免疫一周后用不同剂量的野生型SEB+LPS进行攻毒试验，统计小鼠存活数量。

SEB攻毒试验结果 

由攻毒试验结果可以得出如下结论：构建表达的SEB2-HSP65重组融合蛋白作为免疫制剂，经过标准免疫程序免疫动物，产生的抗体效价较高，可以使动物抵抗5×LD50毒素攻击，且保护率可达到100%。因此，该融合蛋白具备较大的开发利用价值。

<110>   张婉茹

 

<120>   金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫制剂的制备方法和应用

 

<160>  7

 

<210>   1

<211>   714

<212>   DNA

<213>   人工

<400>    1

gaaagccagc cggatccgaa accggatgaa ctgcataaaa gcagcaaatt taccggcctg   60

atggaaaaca tgaaagtgct gtatgatgat aaccatgtga gcgcgattaa cgtgaaaagc   120

attgatcagt ttctgtattt tgatctgatt tatagcatta aagataccaa actgggcaac   180

tatgataacg tgcgcgtgga atttaaaaac aaagatctgg cggataaata taaagataaa   240

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cataacggca accagctgga taaatatcgc agcattaccg tgcgcgtgtt tgaagatggc   420

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gattatctga cccgccatta tctggtgaaa aacaaaaaac tgtatgaatt taacaacagc   540

ccgtatgaaa ccggctatat taaatttatt gaaaacgaaa acagcttttg gtatgatatg   600

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aaaatggtgg atagcaaaga tgtgaaaatt gaagtgtatc tgaccaccaa aaaa         714

 

 

 

<210>   2

<211>   735

<212>   DNA

<213>   人工

<400>    2

catgcatatg gaaagccagc cggatccgaa accggatgaa ctgcataaaa gcagcaaatt   60

taccggcctg atggaaaaca tgaaagtgct gtatgatgat aaccatgtga gcgcgattaa   120

cgtgaaaagc attgatcagt ttctgtattt tgatctgatt tatagcatta aagataccaa   180

actgggcaac tatgataacg tgcgcgtgga atttaaaaac aaagatctgg cggataaata   240

taaagataaa tatgtggatg tgtttggcgc gaactattat tatcagtgct attttagcaa   300

aaaaaccaac gatattaaca gccatcagac cgataaacgc aaaacctgca tgtatggcgg   360

cgtgaccgaa cataacggca accagctgga taaatatcgc agcattaccg tgcgcgtgtt   420

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gtatgatatg atgccggcgc cgggcgataa atttgatcag agcaaatatc tgatgatgta   660

taacgataac aaaatggtgg atagcaaaga tgtgaaaatt gaagtgtatc tgaccaccaa   720

aaaatgagaa ttcgc                                                    735

 

 

<210>   3

<211>   513

<212>   DNA

<213>   人工

<400>    3

catatgagca ttgatcagtt tctgtatttt gatctgattt atagcattaa agataccaaa   60

ctgggcaact atgataacgt gcgcgtggaa tttaaaaaca aagatctggc ggataaatat   120

aaagataaat atgtggatgt gtttggcgcg aactattatt atcagtgcta ttttagcaaa   180

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gaagatggca aaaacctgct gagctttgat gtgcagacca acaaaaaaaa agtgaccgcg   360

caggaactgg attatctgac ccgccattat ctggtgaaaa acaaaaaact gtatgaattt   420

aacaacagcc cgtatgaaac cggctatatt aaatttattg aaaacgaaaa cagcttttgg   480

tatgatatga tgccggcgcc gggcgatgaa ttc                                513

 

 

 

<210>   4

<211>   1635

<212>   DNA

<213>   人工

<400>    4

gaattcatgg ccaagacaat tgcgtacgac gaagaggccc gtcgcggcct cgagcggggc   60

ttgaacgccc tcgccgatgc ggtaaaggtg acattgggcc ccaagggccg caacgtcgtc   120

ctggaaaaga agtggggtgc ccccacgatc accaacgatg gtgtgtccat cgccaaggag   180

atcgagctgg aggatccgta cgagaagatc ggcgccgagc tggtcaaaga ggtagccaag   240

aagaccgatg acgtcgccgg tgacggcacc acgacggcca ccgtgctggc ccaggcgttg   300

gttcgcgagg gcctgcgcaa cgtcgcggct ggcgccaacc cgctcggtct caaacgcggc   360

atcgaaaagg ccgtggagaa ggtcaccgag accctgctca agggcgccaa ggaggtcgag   420

accaaggagc agattgcggc caccgcagcg atttcggcgg gtgaccagtc catcggtgac   480

ctgatcgccg aggcgatgga caaggtgggc aacgagggcg tcatcaccgt cgaggagtcc   540

aacacctttg ggctgcagct cgagctcacc gagggtatgc ggttcgacaa gggctacatc   600

tcggggtact tcgtgaccga cccggagcgt caggaggcgg tcctggagga cccctacatc   660

ctgctggtca gctccaaggt gtccactgtc aaggatctgc tgccgctgct cgagaaggtc   720

atcggagccg gtaagccgct gctgatcatc gccgaggacg tcgagggcga ggcgctgtcc   780

accctggtcg tcaacaagat ccgcggcacc ttcaagtcgg tggcggtcaa ggctcccggc   840

ttcggcgacc gccgcaaggc gatgctgcag gatatggcca ttctcaccgg tggtcaggtg   900

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cgcaaggtcg tggtcaccaa ggacgagacc accatcgtcg agggcgccgg tgacaccgac   1020

gccatcgccg gacgagtggc ccagatccgc caggagatcg agaacagcga ctccgactac   1080

gaccgtgaga agctgcagga gcggctggcc aagctggccg gtggtgtcgc ggtgatcaag   1140 

gccggtgccg ccaccgaggt cgaactcaag gagcgcaagc accgcatcga cgatgcggtt   1200

cgcaatgcca aggccgccgt cgaggagggc atcgtcgccg gtgggggtgt gacgctgttg   1260

caagcggccc cgaccctgga cgagctgaag ctcgaaggcg acgaggcgac cggcgccaac   1320

atcgtgaagg tggcgctgga ggccccgctg aagcagatcg ccttcaactc cgggctggag   1380

ccgggcgtgg tggccgagaa ggtgcgcaac ctgccggctg gccacggact gaacgctcag   1440

accggtgtct acgaggatct gctcgctgcc ggcgttgctg acccggtcaa ggtgacccgt   1500

tcggcgctgc agaatgcggc gtccatcgcg gggctgttcc tgaccaccga cgccgtcgtt   1560

gccgacaagc cggaaaagga gaaggcttcc gttcccggtg gcggcgacat gggtggcatg   1620

gatttctaaa agctt                                                    1635

 

 

 

<210>   5

<211>   2199

<212>   DNA

<213>   人工

<400>    5

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat   60

atgagcattg atcagtttct gtattttgat ctgatttata gcattaaaga taccaaactg   120

ggcaactatg ataacgtgcg cgtggaattt aaaaacaaag atctggcgga taaatataaa   180

gataaatatg tggatgtgtt tggcgcgaac tattattatc agtgctattt tagcaaaaaa   240

accaacgata ttaacagcca tcagaccgat aaacgcaaaa cctgcatgta tggcggcgtg   300

accgaacata acggcaacca gctggataaa tatcgcagca ttaccgtgcg cgtgtttgaa   360

gatggcaaaa acctgctgag ctttgatgtg cagaccaaca aaaaaaaagt gaccgcgcag   420

gaactggatt atctgacccg ccattatctg gtgaaaaaca aaaaactgta tgaatttaac   480

aacagcccgt atgaaaccgg ctatattaaa tttattgaaa acgaaaacag cttttggtat   540

gatatgatgc cggcgccggg cgatgaattc atggccaaga caattgcgta cgacgaagag   600

gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg   660

ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac   720

gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc   780

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gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc gagggcctgc gcaacgtcgc ggctggcgcc   900

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gcggtcctgg aggaccccta catcctgctg gtcagctcca aggtgtccac tgtcaaggat   1260

ctgctgccgc tgctcgagaa ggtcatcgga gccggtaagc cgctgctgat catcgccgag   1320

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tcggtggcgg tcaaggctcc cggcttcggc gaccgccgca aggcgatgct gcaggatatg   1440

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gacctgtcgc tgctaggcaa ggcccgcaag gtcgtggtca ccaaggacga gaccaccatc   1560

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gccggtggtg tcgcggtgat caaggccggt gccgccaccg aggtcgaact caaggagcgc   1740

aagcaccgca tcgacgatgc ggttcgcaat gccaaggccg ccgtcgagga gggcatcgtc   1800

gccggtgggg gtgtgacgct gttgcaagcg gccccgaccc tggacgagct gaagctcgaa   1860

ggcgacgagg cgaccggcgc caacatcgtg aaggtggcgc tggaggcccc gctgaagcag   1920

atcgccttca actccgggct ggagccgggc gtggtggccg agaaggtgcg caacctgccg   1980

gctggccacg gactgaacgc tcagaccggt gtctacgagg atctgctcgc tgccggcgtt   2040

gctgacccgg tcaaggtgac ccgttcggcg ctgcagaatg cggcgtccat cgcggggctg   2100

ttcctgacca ccgacgccgt cgttgccgac aagccggaaa aggagaaggc ttccgttccc   2160

ggtggcggcg acatgggtgg catggatttc taaaagctt                          2199

 

 

<210>   6

<211>   713

<212>   PRT

<213>   人工

<400>   6

Gly Ser His Met Ser Ile Asp Gln Phe Leu Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr

1                5                   10                 15

Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn Val Arg Val Glu

            20                   25                 30

Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp Lys Tyr Val Asp

        35                   40                  45        

Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys Tyr Phe Ser Lys Lys Thr

     50                   55                 60

Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp Lys Arg Lys Thr Cys Met Tyr

65                   70                 75                   80

Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gln Leu Asp Lys Tyr Arg Ser

                 85                  90                  95

Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu Leu Ser Phe Asp

            100                 105                 110   

Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp Tyr Leu

        115                 120                 125

Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr Glu Phe Asn Asn

    130                  135                140     

Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn Glu Asn Ser

145                 150                 155                 160

Phe Try Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Glu Phe Met Ala Lys

                165                  170                 175 

Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu Arg Gly Leu

             180                 185                190

Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro Lys Gly Arg

        195                 200                 205  

Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Try Gly Ala Pro Thr Ile Thr Asn Asp

    210                 215                  220             

Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro Tyr Glu Lys

225                 230                  235                240

Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr Asp Asp Val

                245                 250                 255

Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln Ala Leu Val

            260                  265                270

Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro Leu Gly Leu

        275                 280                 285   

Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu Thr Leu Leu

    290                 295                 300

Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala Ala Thr Ala

305                  310                315                 320

Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala

                325                 330                 335

Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu Glu Ser Asn

            340                 345                 350 

Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys

        355                  360                365

Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gln Glu Ala

    370                 375                 380           

Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr

385                 390                 395                 400

Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly Ala Gly Lys

                405                 410                 415

Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr

            420                 425                 430

Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val Ala Val Lys

        435                 440                 445    

Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln Asp Met Ala

    450                 455                 460          

Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly Leu Thr Leu

465                 470                 475                 480   

Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys Val Val Val

                485                 490                 495

Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp Thr Asp Ala

            500                 505                 510

Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu Asn Ser Asp

        515                 520                 525

Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala

    530                  535                540          

Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu Val Glu Leu

545                 550                 555                 560

Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala

                565                 570                 575

Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln

            580                 585                 590

Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr

        595                 600                 605

Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln Ile

    610                 615                 620

Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys Val Arg

625                 630                 635                 640

Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly Val Tyr Glu

                645                 650                 655

Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val Thr Arg Ser

            660                 665                  670    

Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu Thr Thr Glu

        675                 680                 685

Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser Val Pro Gly

    690                 695                 700        

Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe

705                 710

 

<210>   7

<211>   233

<212>   PRT

<213>   人工

<400>   7

Gly Ser His Met Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His

1                5                   10                  15    

Lys Ser Ser Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr

            20                   25                  30

Asp Asp Asn His Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe

         35                  40                  45    

Leu Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn

     50                  55                  60             

Tyr Asp Asn Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys

65                   70                  75                  80    

Tyr Lys Asp Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln

1                5                   10                  15

Cys Tyr Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp

                 85                   90                 95

Lys Arg Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn

            100                 105                  110 

Gln Leu Asp Lys Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly

        115                  120                125           

Lys Asn Leu Leu Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr

     130                135                 140           

Gln Glu Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys

145                 150                 155                 160

Leu Tyr Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe

                165                 170                 175

Ile Glu Asn Glu Asn Ser Phe Try Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly

            180                 185                 190   

Asp Lys Phe Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys

        195                 200                 205        

Met Val Asp Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys

    210                 215                 220            

Lys Glu Phe Glu Leu Arg Arg Gln Ala 

225                 230

Claims (1)

1.金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫制剂的核心基因片段SEB2-HSP65，它是由SEB2和热休克蛋白基因HSP65融合而成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示。