CN1800398A - 李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因及其专用检测引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因及其专用检测引物。该基因是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)序列表中SEQID №：2的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1或SEQ ID№：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。其专用检测引物是由序列表中SEQ ID №：5和SEQ ID №：6或是由序列表中SEQ ID №：7和SEQ ID №：8组成的引物对。本发明建立了李属坏死环斑病毒的RT－PCR等分子生物学检测的技术体系，为该病害的检验检疫提供了强有力的技术支持，具有较高的实际应用价值。

Description

李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因及其专用检测引物

技术领域

本发明涉及李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因及其专用检测引物。

背景技术

李属坏死环斑病毒(PNRSV)寄主范围广，传播方式多样，它可以侵染樱桃、桃、杏、李等核果类果树，引起严重的危害。检测该病害的传统方法是通过用植物汁液摩擦接种草本指示植物或是将待检测植物的接穗嫁接到木本指示植物上，然后再依据指示植物上的症状反应来对病害做出鉴定。但上述传统的生物学检测方法存在着一些明显不足，如需要占用较大的空间、花费时间长、并且指示植物的症状表现易受环境因素的影响等。

RT-PCR方法同样具有简便、快速、准确等优点，并且可以通过对扩增得到的序列进行分析，了解病毒株系的分子特征。

发明内容

本发明的目的是提供李属坏死环斑病毒外壳蛋白(cp)基因。

本发明所提供的李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因，名称为PNRSV-cp，来源于李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1或SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：1由643个碱基组成，其编码序列为自5’端第3位至641位，编码具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列的蛋白质，编码李属坏死环斑病毒外壳蛋白的部分氨基酸残基序列。序列表中的SEQ ID №：2由675组成，其编码序列为自5’端第第1位至672位，编码具有序列表中SEQ ID №：4的氨基酸残基序列的蛋白质。

李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因PNRSV-cp的编码蛋白(PNRSV-cp)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：3；

2)序列表中的SEQ ID №：4；

3)将序列表中SEQ ID №：3或SEQ ID №：4的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且构成李属坏死环斑病毒外壳的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：3由213个氨基酸残基组成，SEQ ID №：4由224个氨基酸残基组成。

含有本发明基因PNRSV-cp的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增PNRSV-cp中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一对上述李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因的专用检测引物。

本发明所提供的上述李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因的专用检测引物，是由序列表中SEQ ID №：5和SEQ ID №：6或是由序列表中SEQ ID №：7和SEQ ID №：8组成的引物对组成的引物对。

序列表中的SEQ ID №：5由20个碱基组成，序列表中的SEQ ID №：6由20个碱基组成；序列表中的SEQ ID №：7由29个碱基组成，序列表中的SEQ ID №：8由27个碱基组成。

本发明提供了李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因及其专用检测引物。该引物可用于李属坏死环斑病毒的RT-PCR检测，该检测方法具有简便、快速、准确以及能同时检测大量样品的优点。此外，用表达本发明基因获得的蛋白免疫动物而获得的抗血清也可用于李属坏死环斑病毒的检测。本发明建立了李属坏死环斑病毒的RT-PCR等分子生物学检测的技术体系，为该病害的检验检疫提供了强有力的技术支持，具有较高的实际应用价值。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为RT-PCR扩增的河北昌黎桃树病叶中PNRSV cp基因片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为携带有河北昌黎桃树病叶中PNRSV cp基因片段的阳性克隆质粒的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为携带有河北昌黎桃树病叶中PNRSV cp基因片段的阳性克隆质粒的酶切和PCR鉴定结果

图4为RT-PCR扩增的北京樱桃病叶中PNRSV cp基因片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图5为携带有北京樱桃病叶中PNRSV cp基因片段的阳性克隆质粒的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图6为携带有北京樱桃病叶中PNRSV cp基因片段的阳性克隆质粒的酶切和PCR鉴定结果

图7为携带有重组质粒pET-PNRSVCP的重组子经IPTG诱导后的总蛋白的SDS-PAGE和Western blot检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由上海博亚生物公司完成。

实施例1、河北昌黎桃树PNRSV感病样品的RT-PCR检测

称取采自河北昌黎的桃树病叶0.1g，使用Sangon公司的TRIZOL试剂盒并按试剂盒的说明书进行操作，提取上述植物材料的总RNA。将提取物溶解于30μl经DEPC处理的ddH₂O中，-70℃保存备用。然后用RT-PCR的方法对上述病样进行检测，具体方法如下：

1)根据GenBank中的PNRSV的外壳蛋白(cp)基因的核苷酸序列(GenBank号：AF013285、AF013286、AF013287、AF034989、AF034990、AF034991)设计引物，正向引物自5’端对应于PNRSV的cp基因的第13-32位碱基，反向引物与PNRSV的cp基因的自5’端第636-655位碱基反向互补，引物序列如下：

P1(正向引物)5’-TTTGCAATCATACCCACGCT-3’(序列表中的SEQ ID №：5)；

P2(反向引物)5’-TCATCGACCAGCAAGACATC-3’(序列表中的SEQ ID №：6)。

2)以上述染病植物材料的总RNA为模板，反转录合成cDNA序列，反转录体系均为：ddH₂O(2.5μl)，M-MLV RT 5×缓冲液(Promega公司，2.0μl)，dNTPs(鼎国公司，每种10mM，1.0μl)，反转录引物P2(0.5μl)，Ribonuclease Inhibitor HPRI(TaKaRa，40u/μl，0.5μl)，总RNA(3.0μl)，M-MLV反转录酶(Promega公司，0.5μl)。反转录条件为：42℃水浴1h。

3)然后以上述合成的cDNA产物为模板，在引物P1和引物P2的引导下，PCR扩增PNRSV的cp基因片段，PCR反应体系为：ddH₂O(22.1μl)，10×PCR缓冲液(TaKaRa公司，3.0μl)，dNTPs(鼎国公司，每种10mM，0.6μl)，引物P1(1.0μl)，引物P2(1.0μl)，模板(即步骤2)的反转录产物，2.0μl)，Taq DNA聚合酶(Takara公司，2.5u/μl，0.5μl)。PCR反应条件为：先94℃ 3min；然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 10min。反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测(电泳缓冲液为0.5×TAE)，电泳结束后将凝胶在10μg/mL溴化乙锭中染色15-20min，用Alpha凝胶成像仪观察并记录结果，结果如图1(泳道M为DNA Marker，泳道1为PPV cp基因的RT-PCR产物，泳道2为ToRSV cp基因的RT-PCR产物，泳道3为河北昌黎桃树病叶PNRSV cp基因的RT-PCR产物)，泳道1的PPV cp基因和泳道2的ToRSV cp基因的扩增方法如下：

扩增ToRSV cp基因所用的引物为(根据GenBank中的ToRSV的cp基因的核苷酸序列(GenBank号：AF135407、AF135408、AF135409、AF135410、AF135411、AF135412、AF135413、AF135414)设计引物，正向引物自5’端对应于ToRSV的cp基因的第362-380位碱基，反向引物与ToRSV的cp基因的自5’端第1327-1346位碱基反向互补)，引物序列为：

ToRSV-F(正向引物)：5’-GACGTCTGTGTGGTCATGG-3’

ToRSV-R(反向引物)：5’-CCAACAAGTGGTTGCACTGT-3’

扩增ToRSV cp基因所用的模板是以提取自接种了ToRSV的昆诺藜叶片的总RNA，ToRSV-R作为引物，按照实施例1中的步骤2)进行反转录得到的。

扩增PPV cp基因所用的引物为(根据GenBank中的PPV的cp基因的核苷酸序列(GenBank号：X81078、X81082、X57975、X57976、X81084、X81080、X81076)设计引物，正向引物自5’端对应于PPV的cp基因的第275-294位碱基，反向引物与PPV的cp基因的自5’端第835-856位碱基反向互补)，引物序列为：

PPV-F：5’-ACAGAGACAGGGACGTCGAT-3’

PPV-R：5’-CTGCCTTCATCTGGATATGAGC-3’

扩增PPV cp基因所用的模板是以提取自桃树病叶的总RNA，以PPV-R作为引物，按照实施例1中的步骤2)进行反转录得到的。

采用博大泰克公司的DNA回收试剂盒回收并纯化长度约640bp的目的DNA片段。

4)将上述回收并纯化的目的片段与载体pMD 18-T进行连接，连接体系为：回收的目的DNA片段5.0μl，连接Solution I(TaKaRa公司)4.5μl，pMD 18-T(TaKaRa公司)0.5μl。16℃水浴反应12-24小时。然后将连接产物用热击转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，采用碱裂解法提质粒，并进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测(电泳缓冲液用0.5×TAE，电压5V/cm)，质粒的电泳结果如图2(泳道1为载体pMD 18-T，泳道2-6为所提取的可能携带有河北昌黎桃树病叶PNRSV cp基因RT-PCR产物的1-5号克隆的质粒)所示，电泳图中可以看出5号质粒大于pMD 18-T载体，表明目的片段可能已连接入载体中。再对5号重组质粒用限制性内切酶EcoR I和HindIII进行酶切鉴定，酶切体系为：ddH₂O 13.0μl，10×H缓冲液2.0μl，重组质粒4.0μl，EcoR I 0.5μl，HindIII0.5μl。酶切条件为：37℃水浴12-24小时。对上述酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。用PCR的方法做进一步鉴定，反应体系为：ddH₂O 25.9μl，10×PCR缓冲液(TaKaRa公司)3.0μl，dNTPs(鼎国公司，10mM每种)0.6μl，引物P1 1.0μl，引物P21.0μl，模板(质粒)0.2μl，Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司，2.5u/μl)，0.5μl。PCR反应条件与步骤3)中的相同。酶切和PCR验证结果如图3(泳道M为DNA Marker，泳道1为携带有河北昌黎桃树病叶PNRSV cp基因RT-PCR产物的阳性克隆的PCR检测结果，泳道2为河北昌黎桃树病叶PNRSV cp基因的RT-PCR产物，泳道3为携带有河北昌黎桃树病叶PNRSV cp基因RT-PCR产物的阳性克隆的酶切鉴定结果，泳道4为携带有河北昌黎桃树病叶PNRSV cp基因RT-PCR产物的阳性克隆质粒)所示，5号质粒经酶切得到了大小约341bp和273bp的酶切片段，PCR验证也得到了大小约为640bp的片段，酶切和PCR验证均与预期结果相符，表明目的片段已正确连入载体中。对含有5号质粒的大肠杆菌的测序结果表明，经PCR扩增，从昌黎感病桃树病叶中扩增的PNRSV的cp基因片段是具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列。对上述序列进行同源性分析，分析结果表明所扩增的DNA片段确实为PNRSV cp基因的片段，与GenBank中的PNRSV AF171株系的cp基因的相似性为99％。序列表中的SEQ ID №：1由643个碱基组成，其编码序列为自5’端第3位至第641位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列的蛋白质。

实施例2、北京樱桃病样中PNRSV CP基因的克隆

樱桃病叶的总RNA的提取方法同实施例1。

樱桃病样中PNRSV CP基因克隆的具体方法如下：

1)根据已发表的PNRSV的外壳蛋白(cp)基因的核苷酸序列(GenBank号：AF013285、AF013286、AF013287、AF034989、AF034990、AF034991)设计引物，正向引物自5’端第10-29位碱基对应于PNRSV的cp基因的第1-20位碱基，反向引物自5’端第10-27位碱基与PNRSV的cp基因的自5’端第655-672位碱基反向互补，引物序列如下：

P3：5’-CCGAAGCTTATGGTTTGCCGAATTTGCAA-3’(序列表中的SEQ ID №：7)；

P4：5’-TTGCTCGAGGATCTCAAGCAGGTCCTC-3’(序列表中的SEQ ID №：8)。

2)以所提取的樱桃病叶中的总RNA为模板，进行反转录，以获得PNRSV CP基因的cDNA。反转录的方法同实施例1中的步骤2)。

3)然后以上述合成的cDNA产物为模板，在引物P3和引物P4的引导下，PCR扩增PNRSV的cp基因，PCR反应体系与实施例1中步骤3)中相同，PCR反应条件为：先94℃ 3min；然后94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 50s，共35个循环；然后72℃ 10min。北京樱桃病叶PNRSV CP基因的RT-PCR结果见图4(泳道M为Lambda DNA/HindIII+EcoR I DNA Marker，泳道1为北京樱桃病叶PNRSV CP基因的RT-PCR产物)。采用博大泰克公司的DNA回收试剂盒回收并纯化目的片段。

4)将上述回收并纯化的目的片段与载体pMD 18-T进行连接，连接体系为：回收的目的片段5.0μl，连接Solution I(TaKaRa)4.5μl，pMD 18-T(TaKaRa)0.5μl。16℃水浴反应12-24小时。然后将两种连接产物用热击转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，采用碱裂解法提质粒，并进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(电泳缓冲液用0.5×TAE，电压5V/cm)，质粒的电泳结果如图5(泳道1为载体pMD 18-T，泳道2-8分别为携带有北京樱桃病叶PNRSV RT-PCR产物的2-8号阳性克隆的质粒)。电泳图中可以看出5、7、8号质粒大于pMD 18-T载体，表明目的片段可能已连接入载体中。再对重组质粒用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行酶切鉴定，酶切体系及条件同实施例1中的步骤4)。采用引物P3和P4用PCR的方法做进一步鉴定，PCR反应体系反应条件与实施例1中步骤3)中相同。酶切和PCR验证结果如图6(泳道M为Lambda DNA/HindIII+EcoR I DNA Marker，泳道1-3分别为携带有北京樱桃病叶PNRSV RT-PCR产物的5、7、8号阳性克隆的PCR鉴定结果，泳道4-6分别为携带有北京樱桃病叶PNRSV RT-PCR产物的5、7、8号阳性克隆的酶切鉴定结果，泳道7为北京樱桃病叶PNRSV RT-PCR产物)所示，7号质粒经酶切得到了大小约400bp和275bp的酶切片段，PCR验证也得到了大小约为670bp的片段，酶切和PCR验证均与预期结果相符，表明目的片段已正确连入载体中。对含有7号质粒的大肠杆菌的测序结果表明，经PCR扩增，从北京感病樱桃病叶中扩增到了的PNRSV的cp基因的完整序列，该片段具有序列表中SEQ ID№：2的核苷酸序列。对上述序列进行同源性分析，分析结果表明所扩增的DNA片段确实为PNRSV cp基因，与GenBank中PNRSV的AF157和AF158株系的cp基因的相似性均为99％。序列表中的SEQ ID №：2由675个碱基组成，其编码序列为自5’端第1位至第672位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：4的氨基酸残基序列的蛋白质。

实施例3、PNRSV-cp蛋白的鉴定

用下述方法对实施例2获得的PNRSV-cp蛋白基因进行鉴定，具体过程包括以下步骤：

一、PNRSV-cp的原核表达及检测

1)樱桃病样中PNRSV cp基因的RT-PCR扩增

按照实施例1中的方法提取樱桃病叶的总RNA，参照实施例2中的步骤1)、2和3)RT-PCR扩增PNRSV cp基因。

2)PNRSV-cp原核表达表达载体的构建

用DNA回收试剂盒回收并纯化步骤1)扩增的目的片段，将其用限制性内切酶HindIII和Xho I酶切后，与经相同酶双酶切的质粒载体pET-22b(+)(Novagen公司)用T₄DNA连接酶(TaKaRa公司)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性重组子，提质粒进行测序，测序结果表明扩增到了序列正确的PNRSV-cp，将构建正确的含有PNRSV-cp的原核表达载体命名为pET-PNRSVCP。

3)PNRSV-cp的原核表达及SDS-PAGE检测

将pET-PNRSVCP转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经筛选挑取阳性单菌落于3mL LB液体培养基中(含氨苄青霉素60μg/mL)，37℃振动培养12-24小时后，用新鲜LB液体培养基(含氨苄青霉素60μg/mL)按1∶100比例进行稀释，再振荡培养至OD₆₀₀值达到0.4-1.0，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续于37℃培养6-8h。培养结束后，离心收集菌体，加入1/10体积的上样缓冲液，振荡悬浮，100℃煮沸5min，进行12％ SDS-PAGE检测(浓缩胶电压为8V/cm，分离胶为15V/cm)，电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色1h，再室温摇床上脱色3h，结果如图7所示(泳道M为蛋白分子量标准，泳道1为携带有重组质粒pET-PNRSVCP的重组子经IPTG诱导后的总蛋白，泳道2为携带有空载体pET-22b(+)的重组子经IPTG诱导后的总蛋白)，表明阳性重组子经诱导表达后获得了分子量大小为29.0KD的蛋白，与预期结果相符。

4)诱导表达产物的Western blot检测及纯化

对步骤3)获得的诱导表达产物进行Western blot检测(方法参照：Towbin H.E.Electrophore transfer of protein from polyacrylamide gels to nitrocellulosesheets：procedure and some application.Proc natl acad sci USA，1979，76：4350-4354)，以PNRSV的抗体(BIOREBA公司)为一抗，以碱性磷酸酯酶标记的A蛋白(Sigma公司)为二抗，用NBT/BCIP显色，并参照Hager等的方法(Hager D.A.，BurgessR.R.Elution of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel，removal of sodium dodecyl sulfate and renaturation of enzymatic acitivity.Analytical Biochemistry.1980，109：76-86)对凝胶染色，如图7所示(泳道M为蛋白分子量标准，泳道3为携带有重组质粒pET-PNRSVCP的重组子经IPTG诱导后的总蛋白的Western blot分析结果)，切下29.0KD的目标条带，按1∶1的比例(W/V)加入PBS缓冲液(8g NaCl，0.2g KCl，1.97g Na₂HPO₄·12H₂O，0.24g KH₂PO₄，定容至1L，pH7.4)于冰浴中研磨，12000g离心10min，取上清，-20℃保存。用紫外分光测定法测定回收蛋白含量，方法为；测定回收产物在260nm和280nm处的吸光值，再根据公式：蛋白质浓度(mg/mL)＝1.45OD₂₈₀-0.74OD₂₆₀计算即可。结果用上述方法表达的蛋白浓度为0.274mg/mL，表明PNRSV-cp在大肠杆菌中获得大量表达。

二、抗血清的制备及其效价测定

对实验兔耳静脉取血2mL，制备少量正常血清作为阴性对照。向步骤一经表达、纯化的PNRSV-cp表达产物中加入等体积的福氏不完全佐剂进行乳化，免疫一只德国大白兔，共分五次进行免疫注射：第一次肌肉注射结合皮下注射，第二次肌肉注射结合皮下注射，第三、四次耳静脉注射(纯化的蛋白不加佐剂)，第五次肌肉注射，每次免疫剂量为0.1mg，每隔5d注射一次。最后一次注射7d后静脉少量采血测定效价，然后每周耳静脉大量取血约20mL，共取三次，将制备的抗血清加入0.02％的叠氮化钠，-20℃保存。将采集抗血清进行一系列(稀释倍数依次为：128、256、512、1024)稀释后，以PNRSV感病的樱桃叶片汁液作为抗原包板，以健康的樱桃叶片汁液为对照，用ACP-ELISA方法测定抗血清的效价，结果抗血清稀释1024倍后仍能表现明显的阳性反应，同时与健康的樱桃叶片汁液没有明显的血清学反应，表明本发明所获得的PNRSV-cp基因确实为PNRSV的cp基因，其编码蛋白可用于李属坏死环斑病毒的检测。

                          序列表

<160>8

<210>1

<211>643

<212>DNA

<213>李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus)

<400>1

tttgcaatca tacccacgct ggtggatgcc gttcttgcaa gaagtgccat ccgaatggag     60

ctctggtccc actcagggct caacagaggg ctgtgaataa cccgaataga aacccgaata    120

gggcttcgag tggtatcgga ccagtggtcc gaccacaacc ggtcgtgaag accatttgga    180

ccgtgagagg tccgaatgta cctccccgaa ttcctaaggg gtttgtggca catagtcacc    240

gagaggtgac gacgacagag gtggtgaagt acttgagcat cgacttcacg accactctcc    300

ctcagttgat gggtcaaaat ttgaccctat tgactgttat agtccgaatg aactctatga    360

gttcgaatgg ttggattggg atggtggagg actataaggt ggaacaacct gatggtccga    420

atgccctgtc taggaagggg ttcttgaagg accaaccgag aggttggcag ttcgaacctc    480

cttccgattt agatttcgac acttttgcgc gtacgcatcg tgtcgttatc gaattcaaga    540

ccgaagtgcc cgctggggcc aaggtcttgg ttagggattt gtacgtagtg gtaagtgatt    600

taccacgagt gcaaattccg actgatgtct tgctggtcga tga                      643

<210>2

<211>675

<212>DNA

<213>李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus)

<400>2

atggtttgcc gaatttgcaa tcatacccac gctggtggat gccgttcttg caagaagtgc    60

catccgaatg atgctctggt cccactcagg gctcaacaaa gggctgcgaa taacctgaat    120

aggaacccga ctaaggtttc gagcggtata ggacctgcgg tccgaccgca accggtcgtg    180

aagaccactt ggaccgtgag gggtccgaat gtgcctcccc gaattcccaa gggttatgga    240

gcacataatc accgagaggt gatgacgaca gaggcagtga agtacttgag tattgacttc    300

acgaccactc tccctcagtt gatgggtcag aatttgacct tattaactgt tatagtccga    360

atgaactcta tgagttcgaa tggttggatt gggatggtgg aggactataa ggtggatcaa    420

cctgatggtc cgaatgcctt gtctaggaag gggttcttga aggaccaacc gagaggttgg    480

cagtccgaac ctccctccga tttagatttc gacaactttg cgcgtacgca tcgtgtcctc    540

atcgaattca agaccgaagt ggccgctggg gccaaggtct tggttaggga tttgtacgta    600

gtggtaagtg atttaccacg agtgcaaatt ccgactgatg tcttgctggt cgatgaagac    660

ctgcttgaga tctag                                                     675

<210>3

<211>213

<212>PRT

<213>李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus)

<400>3

Cys Asn His Thr His Ala Gly Gly Cys Arg Ser Cys Lys Lys Cys His

1               5                   10                  15

Pro Asn Gly Ala Leu Val Pro Leu Arg Ala Gln Gln Arg Ala Val Asn

            20                  25                  30

Asn Pro Asn Arg Asn Pro Asn Arg Ala Ser Ser Gly Ile Gly Pro Val

        35                  40                  45

Val Arg Pro Gln Pro Val Val Lys Thr Ile Trp Thr Val Arg Gly Pro

    50                  55                  60

Asn Val Pro Pro Arg Ile Pro Lys Gly Phe Val Ala His Ser His Arg

65                  70                  75                  80

Glu Val Thr Thr Thr Glu Val Val Lys Tyr Leu Ser Ile Asp Phe Thr

                85                  90                  95

Thr Thr Leu Pro Gln Leu Met Gly Gln Asn Leu Thr Leu Leu Thr Val

            100                 105                 110

Ile Val Arg Met Asn Ser Met Ser Ser Asn Gly Trp Ile Gly Met Val

        115                 120                 125

Glu Asp Tyr Lys Val Glu Gln Pro Asp Gly Pro Asn Ala Leu Ser Arg

    130                 135                 140

Lys Gly Phe Leu Lys Asp Gln Pro Arg Gly Trp Gln Phe Glu Pro Pro

145                 150                 155                 160

Ser Asp Leu Asp Phe Asp Thr Phe Ala Arg Thr His Arg Val Val Ile

                165                 170                 175

Glu Phe Lys Thr Glu Val Pro Ala Gly Ala Lys Val Leu Val Arg Asp

            180                 185                 190

Leu Tyr Val Val Val Ser Asp Leu Pro Arg Val Gln Ile Pro Thr Asp

        195                 200                 205

Val Leu Leu Val Asp

    210

<210>4

<211>224

<212>PRT

<213>李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus)

<400>4

Met Val Cys Arg Ile Cys Asn His Thr His Ala Gly Gly Cys Arg Ser

1               5                   10                  15

Cys Lys Lys Cys His Pro Asn Asp Ala Leu Val Pro Leu Arg Ala Gln

            20                  25                  30

Gln Arg Ala Ala Asn Asn Leu Asn Arg Ash Pro Thr Lys Val Ser Ser

        35                  40                  45

Gly Ile Gly Pro Ala Val Arg Pro Gln Pro Val Val Lys Thr Thr Trp

    50                  55                  60

Thr Val Arg Gly Pro Asn Val Pro Pro Arg Ile Pro Lys Gly Tyr Gly

65                  70                  75                  80

Ala His Asn His Arg Glu Val Met Thr Thr Glu Ala Val Lys Tyr Leu

                85                  90                  95

Ser Ile Asp Phe Thr Thr Thr Leu Pro Gln Leu Met Gly Gln Asn Leu

            100                 105                 110

Thr Leu Leu Thr Val  Ile Val Arg Met Asn Ser Met Ser Ser Asn Gly

        115                 120                 125

Trp Ile Gly Met Val Glu Asp Tyr Lys Val Asp Gln Pro Asp Gly Pro

    130                 135                 140

Asn Ala Leu Ser Arg Lys Gly Phe Leu Lys Asp Gln Pro Arg Gly Trp

145                 150                 155                 160

Gln Ser Glu Pro Pro Ser Asp Leu Asp Phe Asp Asn Phe Ala Arg Thr

                165                 170                 175

His Arg Val Leu Ile Glu Phe Lys Thr Glu Val Ala Ala Gly Ala Lys

            180                 185                 190

Val Leu Val Arg Asp Leu Tyr Val Val Val Ser Asp Leu Pro Arg Val

        195                 200                 205

Gln Ile Pro Thr Asp Val Leu Leu Val Asp Glu Asp Leu Leu Glu Ile

    210                 215                 220

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

tttgcaatca tacccacgct                                                 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

tcatcgacca gcaagacatc                                                 20

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ccgaagctta tggtttgccg aatttgcaa                                       29

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ttgctcgagg atctcaagca ggtcctc                                         27

Claims (10)

1、李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1或SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因，其特征在于：所述基因为序列表中的SEQ ID №：1或SEQ ID №：2。

3、权利要求1所述的李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因的编码蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：3；

2)序列表中的SEQ ID №：4；

3)将序列表中SEQ ID №：3或SEQ ID №：4的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且构成李属坏死环斑病毒外壳的蛋白质。

4、根据权利要求3所述的李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因的编码蛋白，其特征在于：所述蛋白具有序列表中SEQ ID №：3或SEQ ID №：4的氨基酸残基序列。

5、含有权利要求1所述基因的表达载体。

6、含有权利要求5所述表达载体的转基因细胞系。

7、含有权利要求5所述表达载体的宿主菌。

8、权利要求1所述的李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因的专用检测引物，是由序列表中SEQ ID №：5和SEQ ID №：6或是由序列表中SEQ ID №：7和SEQ ID №：8组成的引物对。

9、权利要求8所述的李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因的专用检测引物在检测李属坏死环斑病毒中的应用。

10、权利要求3所述的李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因的编码蛋白在检测李属坏死环斑病毒中的应用。

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