CN1840202A - 用于预防反刍动物捻转血矛线虫病的dna疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有预防和治疗反刍动物捻转血矛线虫病作用的DNA疫苗捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)保护性隐蔽抗原基因H11部分编码区的重组真核质粒载体的DNA疫苗。具体而言，本发明还提供了3种重组真核质粒，这3种重组真核质粒中分别插入了捻转血矛线虫(H.contortus)保护性隐蔽抗原基因H11的3段不同位置部分编码区，即H11－1、H11－2或H11－3。本发明提供了包含所述3种重组真核质粒其中之一的DNA疫苗。另外，本发明还提供了包含这3种重组真核质粒载体混合物的DNA疫苗。本发明所述疫苗包含有多个T细胞免疫应答元件，能够有效地预防和治疗反刍动物捻转血矛线虫病。

Description

用于预防反刍动物捻转血矛线虫病的DNA疫苗

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及一种具有预防和治疗反刍动物捻转血矛线虫病作用的DNA疫苗。具体而言，本发明涉及一种包含其中插入了捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)保护性隐蔽抗原基因H11部分编码区的重组真核质粒载体的DNA疫苗。

背景技术

捻转血矛线虫病是由圆线目毛圆科血矛属的捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)引起的一种寄生虫病。病原寄生于宿主第四胃，偶见小肠中，以宿主血液为其营养来源。感染牛、羊、鹿、牦牛、骆驼等反刍动物，引起贫血及贫血综合征，严重的可致动物，特别是羔羊大批死亡，死亡率高达30％以上。该病呈世界性分布，国内各地均有报道，尤其在一些牧区此病在羊群中流行严重，感染率可达70-80％以上。

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物的一种重要消化道寄生虫。目前主要采用化学药物治疗，虽取得了一定的效果，但药物残留和环境污染严重。抗药性虫株的出现和蔓延，使得传统的化学治疗受到了严重挑战，这给畜牧业生产带来了极大的经济损失，应用免疫学方法防治该病十分迫切和必要。捻转血矛线虫病呈界性分布，我国许多地方均有发生，随着我国农业产业结构的调整，许多地方将反刍动物饲养作为支柱产业来发展，因此，研制有效的疫苗预防该病已经成为重要课题。

目前，研究相继发现了多种具有较好的免疫保护作用的捻转血矛线虫天然抗原，例如，H11、H-gal-GP、H45(P1)、P52/46、15/24Kd ES和Hc-sL3。其中H11是寄生阶段捻转血矛线虫小肠微绒毛上皮细胞中的一种跨膜糖蛋白，分子量为110kDa，该抗原对不同年龄段动物均有保护作用，而且对抗药性虫株、不同地理分离株具有交叉保护作用。

但是包括H11在内的这些抗原在虫体内的含量极低，分离纯化过程复杂而烦琐，难以商品化生产。研究又发现该抗原的重组表达产物无论是原核表达产物还是真核表达产物，其免疫效果均不理想。Munn等使用十二烷基磺酸钠(SDS)、SDS和二硫苏糖醇(DTT)处理H11，改变H11的天然构象，再分别免疫绵羊，发现虫卵减少率均明显低于天然构象的H11。其中原因尚不完全明了。

核酸疫苗是近几年发展起来的一种新型疫苗，因其操作简便，既具有重组亚单位疫苗的安全性，又具有减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的高效、持续性的优点，成为当今疫苗研究的热点之一。DNA疫苗在体内可模拟天然抗原的构象，以MHCI和MHCII途径进行抗原递呈，不但引起体液免疫应答反应，而且可引起机体细胞免疫应答反应。因此，开发出具有预防和治疗作用的DNA疫苗具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种具有预防或治疗反刍动物捻转血矛线虫病作用的免疫调节型的DNA疫苗。

本发明提供了一种制备具有预防或治疗反刍动物捻转血矛线虫病作用的免疫调节型DNA疫苗的方法。

另外，本发明还提供了所述DNA疫苗的用途。

本发明是部分地建立在本发明人的下列发现之上：含有捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)保护性隐蔽抗原基因H11部分编码区的重组真核质粒载体能够为反刍动物提供针对捻转血矛线虫的有效免疫保护；将3段不同位置的捻转血矛线虫保护性隐蔽抗原基因H11部分编码区分别插入真核质粒载体，然后将3种重组真核质粒的混合物免疫接种动物，能够提供更好的免疫保护。

本发明使用的是具有免疫原性的H11基因，该基因编码的蛋白抗原H11是寄生阶段捻转血矛线虫小肠微绒毛上皮细胞中的一种跨膜糖蛋白，分子量为110kDa。研究发现蛋白抗原H11对不同年龄动物均有一定的保护作用，将母羊血清抗体和初乳抗体转移至新生羔羊(5周龄)体内，结果发现5周龄羔羊获得保护力，可以抵抗3000只第3期幼虫的攻击。H11对7～9周龄的羔羊同样具有保护作用。其次，H11对不同地理分离株具有交叉保护性。

在本申请的一个具体实施方案中，设计出覆盖保护性抗原基因H11的开放阅读框的3对引物(P1：5’ATA CCGCGGATGACGTCGCAGGGGAG-3’和P1’：5’-CGC TCTAGAAGAGCATATTGTGTCA-3’；P2：5’ATA CCGCGGCCAGAGGCAAAGAAGA-3’和P2’：5’-TTC TCTAGACCGTTCACCACAAAGGGA-3’；以及P3：5’-ATA CCGCGGACATGGTTGAGAAGAGA-3’和P3’：5’-GGC TCTAGAAAGGTGGCTTTCTTGA-3’)

用这三个引物对扩增出保护性抗原基因H11的三段部分编码区H11-1、H11-2和H11-3，分别具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

因此，一个方面，本发明提供了3段不同位置的保护性隐蔽抗原基因H11部分编码区，即H11-1、H11-2和H11-3，分别具有如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

另一个方面，本发明提供了一种具有预防和治疗反刍动物捻转血矛线虫病作用的免疫调节型的DNA疫苗，该疫苗包含其中插入了捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)保护性隐蔽抗原基因H11部分编码区的重组真核质粒载体。

在一个具体实施方案中，提供了一种重组DNA疫苗，其中包含其中插入了H11-1(SEQ ID NO：1)的重组真核质粒载体。

在一个具体实施方案中，提供了一种重组DNA疫苗，其中包含其中插入了H11-2(SEQ ID NO：2)的重组真核质粒载体。

在一个具体实施方案中，提供了一种重组DNA疫苗，其中包含其中插入了H11-3(SEQ ID NO：3)的重组真核质粒载体。

在一个优选实施方案中，提供了一种一种具有预防和治疗反刍动物捻转血矛线虫病作用的DNA疫苗，其中包括上述3种重组真核质粒载体的混合物，即含H11-1的重组真核质粒载体、含H11-2的重组真核质粒载体和含H11-3的重组真核质粒载体，简称为pcDNA-H11-1+2+3。

在一个特别优选的实施方案中，3种重组真核质粒载体的混合比例为1：1：1。

本发明所述DNA疫苗使用真核质粒表达载体作为结构框架，所述真核质粒载体除具有表达载体基本元件，在限制性酶切位点处插入了目的基因。本领域已知的任一种真核质粒载体都可用于本发明，例如，包括但不限于pcDNA3.0、pcDNA3.1、pVAX1.0和pcDNA4/His Max。在本发明的一个具体优选的实施方案中，所述的真核质粒载体为pcDNA4/His Max(购自美国Invitrogen公司)。

在本发明的第二个方面，提供了一种生产捻转血矛线虫(Eimeria tenella)免疫调节型DNA疫苗的方法，简而言之，包括下列步骤：

1)PCR扩增捻转血矛线虫保护性抗原基因H11的部分编码区设计覆盖H11基因完整开放阅读框的三个引物对，通过PCR扩增手段，克隆得到H11基因的3段部分编码区，即，H11-1、H11-2和H11-3；DNA疫苗重组真核质粒及相应基因工程菌的构建

2)利用分子生物学常规的重组方法，制备出含含H11-1、H11-2或H11-3的重组真核质粒，然后用其转化宿主菌(例如，大肠杆菌JM109株)，筛选后获得重组基因工程菌；

3)基因工程菌的发酵及DNA疫苗重组真核质粒的大规模分离纯化，获得3种含H11-1、H11-2或H11-3的3种重组真核质粒，即为含H11-1、H11-2或H11-3的DNA疫苗；以及任选地还包括

4)将步骤3)获得的含H11-1、H11-2或H11-3的3种重组真核质粒按一定比例混合得到一种疫苗，即pCDA-H11-1+2+3，例如混合比例为1∶1∶1。

在本发明的第三个方面是本发明所述的捻转血矛线虫(Eimeria tenella)免疫调节型DNA疫苗的用途。用纯化后的包含插入了H11-1、H11-2或H11-3的重组真核质粒的DNA疫苗，或者用包含所述3种重组真核质粒混合物的DNA疫苗直接免疫动物后，通过每克粪便指数、卵囊减少率、盲肠病变记分和抗线虫指数等多项试验指标发现，3种包含单一所述重组真核质粒的DNA疫苗以及包含所述三种重组真核质粒混合物的DNA疫苗都具有很好的免疫保护效果(其中后者保护效果更为显著)。因此，本发明所述的DNA疫苗可用于制备预防或治疗反刍动物捻转血矛线虫病的药物制剂。

本发明所述的DNA疫苗可以与药物学上常用的载体和/或佐剂配制用于预防和治疗反刍动物线虫病的药物组合物。

附图说明

图1为DNA疫苗pcDNA-H11-1(或pcDNA-H11-2或pcDNA-H11-3)的结构示意图。

图2为H11基因设计引物的策略图。

图3为重组质粒pMD18T-H11-1(或pMD18T-H11-2或pMD18T-H11-3)构建流程图。

图4为重组质粒pET-H11-1(或pET-H11-2或pET-H11-3)的构建流程图。

图5图示的为重组质粒pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3诱导表达后SDS-PAGE电泳结果。在图7的A和B中：M均为蛋白质标准分子量，第1泳道均为pET28b(+)；A中的第2-9泳道依次分别为pET28-H11-1诱导后第0、1、2、3、4、5、6和7小时的取样；B中的第2-9泳道依次分别为pET28-H11-2诱导后第0、1、2、3、4、5、6和7小时的取样。在图7的C中：M为蛋白质标准分子量，第1和2泳道分别为pET28-H11-1的上清和包含体，第3和4泳道分别为pET28-H11-2的上清和包含体，第5和6泳道分别为pET28-H11-3的上清和包含体。

图6为重组质粒pPICZaB-H11-1、2或3的构建流程图。

图7为DNA疫苗pcDNA-H11-1、2或3的构建流程图。

图8为RT-PCR检测DNA疫苗pcDNA-H11-1、2或3在肌肉中的转录。

M为DNA标准分子量；1、3、5分别为PBS免疫组注射部位肌肉；2、4、6分别为pcDNA-H11-3、2、1免疫组注射部位肌肉。

图9为Western-印迹检测pcDNA-H11-1、2、3DNA疫苗在肌肉中的表达图。

A1、A2分别以PBS、pcDNA-H11-1+2+3免疫山羊的肌肉为抗原，大鼠抗H11抗体为一抗。

B1、B2分别以pET28-H11-1和pET28-H11-2重组蛋白为抗原，pcDNA-H11-1+2+3免疫山羊的血清为一抗。

C1、C2分别以pET28-H11-1和pET28-H11-2重组蛋白为抗原，PBS免疫山羊的血清为一抗。

图10为DNA疫苗免疫后山羊体内抗H11抗体水平曲线图。

图11攻虫后山羊排出捻转血矛线虫卵曲线图。

图12为DNA疫苗免疫组和PBS对照组山羊被毛、眼结膜等部位健康状况比较图。

实施例

基础材料：真核表达载体pcDNA4/His Max，pPICZαB(美国Invitrogen公司产品)；pMD18-T(大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司)；pET-28a，b，c(+)(美国Novagen公司产品)。

实施例1.H11基因的制备：

1.引物的设计和合成

根据GenBank中公开的捻转血矛线虫H11基因的核苷酸序列，应用Primer Premier5软件设计3对引物，如下所示：

P1  5’-ATA CCGCGGATGACGTCGCAGGGG AG-3，

P1’5’-CGC TCTAGAAGAGCATATTGTGTCA-3’；

P2  5’-ATA CCGCGG CCAGAGGCAAAGAAG A-3’，

P2’5’-TTC TCTAGACCGTTCACCACAAAGGG A-3’；

P3  5’-ATA CCGCGGACATGGTTGAGAAGAGA-3’，

P3’5’-GGC TCTAGA AAGGTGGCTTTCTTGA-3’。

设计策略如图2所示，3对引物覆盖H11的开放阅读框。这三对引物中均为在上游引物5’端引入酶切位点SacII，下游引物的5’端引入酶切位点XbaI(如下划线部分所示)，用于构建表达载体。

2.捻转血矛线虫虫体总RNA的提取

挑取40条捻转血矛线虫成虫放入经DEPC处理过的匀浆器中，加Trizol试剂1ml，匀浆3分钟。将匀浆液转移至Eppendorf管中，室温放置5分钟，加200μl氯仿，涡悬振荡15秒。4℃，12000r/min离心15分钟，吸取上层水相转至新的Eppendorf管中，加入500μl异丙醇后于25℃沉淀30分钟。12000r/min离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗涤2次，晾干RNA沉淀，用50μl无RNA酶的水溶解沉淀。紫外分光光度计测定RNA的含量及纯度，-20℃保存备用。

3.RT-PCR扩增

以上述提取的捻转血矛线虫总RNA为模板，用oligo(dT)₁₅引物进行反转录，合成cDNA第一链，采用20μl反应体系：总RNA约1.0μg，oligo(dT)₁₅0.50μg，70℃变性10分钟后立即置冰水中冷却2分钟，然后加入5×RT反应缓冲液4.0μl，MgCl₂(25mmol/L)2.0μl，dNTP(10mmol/L)1.5μl，M-MLV反转录酶(200U/μl)1.0μl，RNasin(40U/μl)0.5μl，无RNase水补至20μl。将上述所有成分轻弹混匀，短暂离心后，42℃反应60分钟，然后95℃5分钟灭活反转录酶。反转录产物立即进行PCR或-20℃保存备用。

以反转录产物为模板，采用50μl体系进行PCR扩增，各反应成分如下：cDNA模板2.0μl，10×PCR反应缓冲液5.0μl，MgCl₂(25mmol/L)3.0μl，成对的上、下游引物(50pmol/μl)各2.0μl(即相应地分别加入P1和P1’、P2和P2’或者P3和P3’各2.0μl)，dNTP(2.5mmol/L)4.0μl，Taq酶(5U/μl)0.5μl，补加灭菌ddH₂O至50μl。将上述成分离心混合均匀后，于PCR仪上进行扩增，反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共30个循环；然后72℃延伸15分钟。

使用引物对P1和P1’、P2和P2’或者P3和P3’扩增得到的基因分别命名为H11-1、H11-2和H11-3。经测序表明，扩增得到的H11-1、H11-2和H11-3基因分别具有如SEQ ID NO：1中第484-1409位、SEQ ID NO：2中第484-1457位和SEQ ID NO：3中第484-1607位所示的核苷酸序列。

实施例2.DNA疫苗的制备

1.重组质粒pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2和pMD18-T-H11-3的构建(见图3)

取实施例1中获得的PCR产物50μl，1％琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下切下目的条带处琼脂糖凝胶，用大连宝生物公司的胶回收试剂盒回收纯化目的片段，方法参照说明书。取纯化的PCR产物与经SacII和XbaI酶切线性化的pMD18-T载体连接，反应体系如下：

PCR回收产物                    4.0μl

pMD18-T载体                    1.0μl

Ligation solution I            5.0μl

总体积                         10.0μl

将上述成分在薄壁eppendorf管中混合均匀后4℃连接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，提取质粒，用SacII和XbaI双酶切及测序等鉴定，确定为pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2和pMD18-T-H11-3。

2.重组质粒pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3的构建(见图4)

分别用BamHI和HindIII双酶切克隆质粒pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2、pMD18-T-H11-3和原核表达载体pET28b(+)，分别回收纯化H11-1、H11-2、H11-3和pET28b(+)酶切片段，T4连接酶连接，反应体系如下：

                       H11-1H       H11-2H      H11-3

双酶切回收的目的片段   7μl         l8μl       10μl

pET28b(+)载体回收片段  10μl        9μl        7μl

10×连接缓冲液         2μl         2μl        2μl

T₄DNA连接酶           1μl         1μl        1μl

                       20μl        20μl       20μl

先将目的片段与载体片段加入后，混合均匀，45℃作用5分钟，然后在冰上加入其他成分，短暂离心混匀，置16℃连接12h。连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，提取质粒，用BamHI和HindIII双酶切鉴定，确定为pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3重组载体。

3.重组质粒pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3的诱导表达

将转化有pET-H11-1、pET-H11-2和pET-H11-3质粒的阳性克隆28℃振荡培养过夜，菌液再以1∶50稀释至含Kna⁺的LB培养液中，37℃继续培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，然后将终浓度1mMol/L IPTG进行诱导表达，分别收集0hr、1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr的菌液，菌体蛋白进行SDS-PAGE鉴定(见图5)。

4.重组质粒pPICZαB-H11-1、pPICZαB-H11-2和pPICZαB-H11-3的构建(见图6)

将pMD18-T-H11-1、pMD18-T-H11-2或pMD18-T-H11-3与表达载体pPICZαB分别用SacII和XbaI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后分别回收目的片段和载体片段，以合适的比例进行粘端连接(构建策略如图4-1)，反应体系如下：

                        H11-1H       H11-2H      H11-3

双酶切回收的目的片段    7μl         8μl        10μl

回收的pPICZαB载体片段  10μl        9μl        7μl

10×连接缓冲液          2μl         2μl        2μl

T₄DNA连接酶            1μl         1μl        1μl

                        20μl        20μl       20μl

16℃连接12小时。将连接产物分别转化新鲜制备的E.coli JM109感受态细胞，取经过冰浴、热休克及抗性复苏的菌液涂布于含ZeocinTM(25μg/ml)的低盐LB固体培养基平板上，于37℃温箱中倒置培养18～24h，提取质粒，用SacII和XbaI双酶切等鉴定，确定为pPICZαB-H11-1、pPICZαB-H11-2和pPICZαB-H11-3。

5.重组质粒pcDNA-H11-1、pcDNA-H11-2和pcDNA-H11-3的构建(见图7)

将pPICZαB-H11-1、pPICZαB-H11-2或pPICZαB-H11-3质粒与pcDNA4/HisMax质粒分别用XhoI和XbaI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后分别回收目的片段和载体片段，以合适的比例进行粘端连接，反应体系如下：

                             H11-1H     H11-2H     H11-3

双酶切回收的目的片段         7μl       8μl       10μl

pcDNA4/HisMax C片段          10μl      9μl       7μl

10×连接缓冲液               2μl       2μl       2μl

T₄DNA连接酶                 1μl       1μl       1μl

                             20μl      20μl      20μl

连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，提取质粒，用Xho I和XbaI双酶切确定获得即为pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2和pcDNA4/HisMax-H11-3DNA疫苗。

6.含三种重组真核质粒混合物的DNA疫苗的制备将上述操作得到的pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2和pcDNA4/HisMax-H11-3按1∶1∶1的比例混合，得到含这三种重组真核质粒混合物的DNA疫苗。

实施例3.DNA疫苗的动物保护性试验

1.试验动物接种

选择体重相当、无捻转血矛线虫感染、5’-7月龄健康山羊15只，随机分成3组，每组5只。第1组肌肉注射PBS。第2组肌肉注射3种重组真核质粒载体的混合物(pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3)。首次免疫后2周加强免疫一次。每次每只山羊注射1ml pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3(其中H11-1、2和3各100μg/ml)。在第2次免疫后14天，每只山羊感染10,000只捻转血矛线虫第三期幼虫。第3组山羊不免疫，也不攻击三期幼虫。

2.RT-PCR检测核酸疫苗的表达情况

第1次免疫后7天，局部麻醉山羊，取疫苗注射肌肉细胞提取RNA，最后用20μl经DEPC处理过的水溶解RNA沉淀。为防止质粒DNA污染，反转录前用无RNase的DNase处理肌肉RNA，进行RT-PCR。具体方法同实施例1所述。结果表明DNA疫苗在山羊肌肉细胞内获得了转录(见图8)。

3.Western印迹检测核酸疫苗的表达情况

于第2次免疫后7天，采取血清和疫苗注射部肌肉(局部麻醉)，制样、SDS-PAGE、电转移至硝酸纤维膜。PBS洗膜2次，0.2％丽春红染色，铅笔标记蛋白质标准分子量所在位置；PBS洗膜数次，至丽春红全部褪去，3％BSA(PBS)4℃过夜或37℃1小时；PBS洗膜数次，加大鼠抗H11抗体(3％BSA稀释)，37℃作用1小时；生理盐水洗膜数次，加羊抗大鼠IgG-HRP(3％BSA稀释)，37℃作用1小时；生理盐水洗膜，加底物显色，生理盐水漂洗，PBS终止反应，干燥NC膜，照相。

pET28-H11-1、pET28-H11-2或pET28-H11-3(实施例3第3步中构建)原核表达重组蛋白制样、SDS-PAGE、电转移至硝酸纤维膜后，以核酸疫苗第二次免疫2周后血清为一抗、兔抗山羊IgG-HRP为标记二抗进行Western印迹检测。结果发现DNA疫苗在肌肉细胞内获得了很好的表达，并刺激山羊产生抗H11抗体(见图9)。

4.ELISA检测抗体水平

于免疫前、首次免疫后14天、第二次免疫后10、16、24、29、38、47天采取血清。用矩阵法确定包被抗原和抗体(血清)稀释度。

用包被液稀释H11抗原至合适浓度，加入酶标板，每孔50μl，37℃1小时后4℃过夜。弃包被液，PBS-Tween20洗涤3-5次，加100μl封闭液，4℃过夜或37℃1小时。弃封闭液，PBS-Tween20洗涤3-5次，加待检血清(1∶1000稀释)50μl，37℃保温1小时。弃血清，PBS-Tween20洗涤3-5次，加酶标二抗50μl，37℃保温1小时。弃二抗，PBS-Tween20洗涤3-5次，加显色液100μl，避光反应5’-15分钟，每孔加100μl2M硫酸终止反应，酶标仪测量OD₄₉₀。

结果发现第二次免疫后10天抗体滴度达到较高水平，然而在二次免疫后16-29天时发现抗体滴度急剧下降到较低水平，之后又开始回升，并维持在一个较高水平(见图10)。t检验表明pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫组抗体水平极显著高于PBS对照组(P＜0.01)。

5.虫卵计数

捻转血矛线虫第三期幼虫感染后，分别于感染后第21、23、25、27、29、31和33天山羊直肠采集粪便，用于虫卵计数。

采用麦克马斯特氏法。称2克粪便于乳钵中，加水10ml，搅匀，再加饱和盐水50ml。混匀后，吸取粪液，注入记数室，置显微镜台上，静置1-2分钟。在镜下计数，刻度中的虫卵总数乘以200即为每克粪便中的虫卵数。虫卵减少率＝(1-实验组平均每克粪便数/对照组平均每克粪便数)×100％。

虫卵计数结果如表1。攻虫后21天，粪便中开始能检测到少量的捻转血矛线虫虫卵，随着时间推移，对照组和核酸疫苗免疫组每克粪便虫卵数(EPG)逐渐增加，而不免疫不感染组均未检测到捻转血矛线虫虫卵。

                                    表1  每克粪便虫卵数(×200)

攻虫后天数		21	23	25	27	29	31	33	平均	减少率
											第一组	XS	11.001.22	18.006.60	27.257.72	29.0010.43	31.0011.00	31.1312.38	36.759.11	26.308.35	-
第二组	XS	2.901.32	4.601.97	8.102.94	19.255.29	10.104.95	13.906.40	17.107.21	10.854.29	58.75
											第三组	X	0	0	0	0	0	0	0	0.00	-

图11是虫卵排出规律曲线。pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫组山羊虫卵排出数量明显(t检验差异极显著P＜0.01)少于PBS对照组，虫卵减少率达58.75％。单独用pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2或pcDNA4/HisMax-H11-3免疫组的山羊虫卵减少率虽然低于pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫组，但是虫卵排出数量也明显(t检验差异极显著P＜0.01)少于PBS对照组。

6.虫卵孵化率

于感染后第27、29、31天，直肠采集粪便，虫卵计数后，称重，捻磨后26℃培养4-6天，采用贝尔曼氏法^[5]分离三期幼虫，计数，计算虫卵孵化率。虫卵孵化率＝三期幼虫数/虫卵数×100％

pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫组虫卵平均孵化率为3.90％，PBS组平均孵化率为14.22％。核酸疫苗免疫后虫卵孵化率降低72.57％，t检验差异极显著(P＜0.01)。单独用pcDNA4/HisMax-H11-1、pcDNA4/HisMax-H11-2或pcDNA4/HisMax-H11-3免疫组的山羊虫卵排出数量虽然高于pcDNA4/HisMax-H11-1+2+3免疫组，但是也明显(t检验差异极显著P＜0.01)少于PBS对照组。

7.成虫计数

感染三期幼虫后第35天，颈静脉放血致死山羊，收集第四胃，分离捻转血矛线虫，分别计数雌雄虫数目。成虫减少率＝(1-实验组平均成虫数/对照组平均成虫数)×100％。

结果发现PBS对照组平均每只山羊的雌虫、雄虫、成虫荷虫数分别为266、170.5、436.5，而核酸疫苗免疫组分别为82.8、55.8、138.6(表2)。t检验分析表明免疫组和对照组间差异极显著(P＜0.01)

                     表2  山羊第四胃内捻转血矛线虫成虫计数

分组	编号	雌虫	雄虫	总数	雌雄比
						PBS	12345	10401305109518101400	4808206801515765	15202125177533252165	2.631.681.611.191.83
平均		1330	852.5	2182.5	1.56
						pcDNA/H11-1+2+3	2122232425	440635255420320	305310255225300	745945510645620	1.442.051.001.861.07
平均		414	279	693	1.48
						雌虫减少率雄虫减少率成虫减少率		68.87％67.27％68.25％

捻转血矛线虫H11基因疫苗免疫山羊后，攻击第三期幼虫，结果发现与对照组相比，免疫组山羊排出虫卵减少58.75％、虫卵孵化率降低72.57％、成虫减少68.25％。PBS对照组攻虫后被毛粗乱、消瘦、精神萎靡不振(12图B)，眼结膜苍白，表现为贫血症状(12图C右)；而免疫组相对健康，如图12A和图12C左。

                        序列表

<110>南京农业大学

<120>用于预防反刍动物捻转血矛线虫病的DNA疫苗

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>926

<212>DNA

<213>捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)

<220>

<221>免疫保护性隐蔽抗原基因H11的部分编码区1(H11-1)

<222>(1)..(926)

<223>

<400>1

atgacgtcgc aggggagaac gcggacattg ctgaatctaa ctccaatccg tcttattgtc 60

gcattatttc tagtagctgc tgcagtcggc ctctctattg gtctcaccta ttactttact 120

cgcaaagcgt tcgatacctc agaaaagcca gggaaggatg atactggtgg caaggacaaa 180

gacaattctc cctctgcggc ggaactactc cttccaagta atataaaacc attgtcttac 240

gacttgacga tcaaaacata tctacctggt tatgtggact tcccaccgga gcaaaacctc 300

acattcgatg ggcgtgtgga aatatcaatg gttgtaattg agccaacaaa gagtatcgta 360

ctcaattcaa agaagatctc tgtaataccc caagaatgtg aactggtatc gggcgataaa 420

aaactcgaaa ttgaaagtgt aaaggagcac ccaagactgg aaaaggttga gtttcttatc 480

aaaagccaac tggaaaaaga tcaacaaatc ttgctcaagg tcggctacat cggtctcatc 540

agcaacagcc ttggtggaat ctaccagacc acttatacca ccccggatgg cacccctaag 600

atcgctgcag tttcacaaaa tgagcccata gatgctcgtc gaatggtacc atgcatggat 660

gaaccgaaat acaaagcaaa ctggaccgtt actgtcattc atccaaaagg cgccaaagcc 720

gtctcgaatg gaatcgaagt gaacggagat ggagagatca gtggtgattg gatcacatcg 780

aagttcttga ctactccacg gatgtcatcc tacttgttgg cagttatggt ttcagaattt 840

gaatacatcg aaggtgaaac aaagacgggt gttcggttcc gtatatggtc acgcccagag 900

gcaaagaaga tgacacaata tgctct                                      926

<210>2

<211>974

<212>DNA

<213>捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)

<220>

<221>免疫保护性隐蔽抗原基因H11的部分编码区2(H11-2)

<222>(1)..(974)

<223>

<400>2

ccgcggccag aggcaaagaa gatgacacaa tatgctctga aatccggcat caaatgcata 60

gagttctacg aagatttctt tgatatcaaa tcccctctga agaaacaaga tgtgatcgcc 120

cttcctgatt tctcagcagg agccatggag aactggggcc tcatcactta cagagaaaac 180

tctttgttgt acgatgacag attctatgca ccgatgaata aacagcgaat tgctcgcatt 240

gttgctcatg agcttgctca tcagtggttt ggcgacttgg ttacgatgaa gtggtgggac 300

aacttgtggt tgaatgaagg tttcgcaaga ttcacagaat tcattggagc tggtcagata 360

actcaagatg acgccagaat gcggaactac ttcctgattg atgtacttga acgcgctttg 420

aaagctgatt cggtagcgtc gagccatcca ctttccttca gaattgacaa agctgcagaa 480

gttgaagaag cctttgatga tatcacatac gccaaaggag cttctgttct tactatgctg 540

agagccttga ttggagaaga aaaacataag cacgcagtat cgcagtacct caagaagttc 600

tcgtatagca atgcagaagc gacagatcta tgggcagttt tcgatgaagt tgtcactgac 660

gtcgagggtc cagacggcaa atctatgaga accacggaat tcgcaagtca gtggacgact 720

cagatgggct tcccagttat ttccgtagca gagtttaact cgactacttt gaaattaacg 780

caaagtcgat ataaggcgaa taaagatgct gtggagaaag agaagtaccg tcatccgaaa 840

tacggattta aatgggatat tccactgtgg tatcaggaag gcgataagaa ggagataaag 900

cgaacatggt tgagaagaga tgaaccgctt tacttgcatg taaatgatcc tggcgctccc 960

tttgtggtga acgg                                                   974

<210>3

<211>1124

<212>DNA

<213>捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)

<220>

<221>免疫保护性隐蔽抗原基因H11的部分编码区3(H11-3)

<222>(1)..(1124)

<223>

<400>3

acatggttga gaagagatga accgctttac ttgcatgtta gtgatgctgg cgctcccttt 60

gtggtgaacg cagaccgcta tggattttat cgacaaagtc atgacgctaa tggttggaaa 120

aagataatca agcagctcaa ggataatcat gaggcttaca gtccccggac aagaaatgcc 180

atcattagcg atgcgtttgc tgcggctgca actgacgcaa ttgagtatga gactgtattt 240

gaacttctga attatgccga aaaagaaacg gaatatctac cattagaaat cgcaatgtcg 300

gggatctctt cgattttgaa atacttcggt accgagccag aggcaaagcc agctcaagtg 360

tacatgatga acatattgaa accgatgtat gagaaaagca gtatcgaatt cattgccaat 420

aactacagaa atgacaagct gtttttccaa atcaacctcc aaaaagatgt cattgatatg 480

ttctgcgccc tcggatcgca agactgcagg aagaaatata aaaaactttt cgatgacgaa 540

gtcatgaaca aatgcaggga tggtcaagca gcaaccgaat gcgtaagaat cgccgctcct 600

ctccgatcaa gtgtttattg ttatggtgtg aaggaaggcg gtgattatgc tttcgacaag 660

gtgatggagc tttatacggc cgaaacactc gccctagaaa aagacttcct acgcctagca 720

ttgggatgtc ataaagatgt tactgctttg aaaggacttc tcttgcgggc tctggacagg 780

aattcgtcgt tcgtacgtat gcaggatatc ccaagtgctt tcaatgatgt agcagcaaat 840

cctatcggcg gagaattcat tttcaatttc cttattgaaa gatggccaga tatcattgaa 900

agtataggaa cgaagtacac atacgttgag aaagtgatac cagcctgcac ttcaggaatc 960

cgctcacaac agcagattga ccagctgaag aatctgcaga aaaatggcat gaacgctcgt 1020

caattcggtg cattcgataa agcaatcgaa cgagcacaaa atagggtgga ttggattaaa 1080

aaacatttcc aaaaattagc ggctttcttc aagaaagcca cctt                  1124

Claims (9)

1.一种用于预防和治疗反刍动物捻转血矛线虫病的DNA疫苗，其中包含插入了捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)保护性隐蔽抗原基因H11部分编码区的真核质粒载体。

2.权利要求1所述的DNA疫苗，其中所述的H11部分编码区具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的DNA疫苗，其中所述的H11部分编码区具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的DNA疫苗，其中所述的H11部分编码区具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

5.一种用于预防和治疗反刍动物捻转血矛线虫病的DNA疫苗，其中包括3种重组真核质粒载体，其中所述3种重组真核质粒载体其中分别插入了捻转血矛线虫保护性隐蔽抗原基因H11的3个不同位置部分编码区分别具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列。

6.权利要求5所述的DNA疫苗，其中所述3种重组真核质粒载体的混合比例为1∶1∶1。

7.权利要求1-6所述的DNA疫苗，其中所述的真核质粒载体为pcDNA4/His Max。

8.权利要求1-7中任一项所述的DNA疫苗在制备用于预防和治疗反刍动物捻转血矛线虫病的药物中的用途。

9.权利要求8所述的用途，其中所述的反刍动物为山羊。

Images