CN110221060A - 一种用于早期诊断捻转血矛线虫感染的抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于早期诊断捻转血矛线虫感染的抗原及其应用。本发明鉴定出一种可用作该寄生虫感染的诊断用抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该抗原可以对感染捻转血矛线虫14天后的宿主血清中的抗体进行特异性识别，能在排出虫卵前4‑6天进行确诊，避免了虫卵对环境和牧场的污染，这对捻转血矛线虫病的防控具有重要意义。本发明利用该抗原建立了间接ELISA检测方法，具有敏感性高、特异性好、操作简单、诊断速度快、在进行大规模检测中具有经济方便等优点，在牛、羊、鹿、骆驼等反刍动物捻转血矛线虫病的诊断和防治中具有良好的应用前景。

Description

一种用于早期诊断捻转血矛线虫感染的抗原及其应用

技术领域

本发明属于兽医生物技术和分子生物学技术领域，涉及一种用于早期诊断捻转血矛线虫感染的抗原及其应用。

背景技术

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是牛、羊、骆驼、鹿等反刍动物的一种重要消化道寄生虫，以宿主血液为营养，引起动物贫血及贫血综合征，可致动物特别是羔羊大批死亡，死亡率高达30％以上。该病呈世界性分布，国内各地均有报道，一些牧区羊群感染率甚至高达70～80％。随着我国大力发展牛羊等草食动物及相关产业，捻转血矛线虫病的危害与其造成的经济损失日益明显与严重。

该寄生虫生活史简单，牛羊等反刍动物通过食入含有第三期幼虫的饲草而感染。第三期幼虫进入宿主的第四胃，附着在胃黏膜上并开始饲食，感染2天后发育为第四期幼虫，约在感染后9-11天后发育为第五期幼虫，15天后发育为性成熟成虫，感染后18-20天开始排出虫卵，25-35天为其产卵高峰，虫卵随粪便排出，在适宜的条件下发育为第三期幼虫。该病主要依赖化学药物来治疗，虽有一个商品化的疫苗上市，但其生产成本高，市场使用范围十分有限，进行准确诊断、及时治疗对该寄生虫病防控意义重大。

目前，捻转血矛线虫病的诊断主要使用粪便学检查、观察临床症状以及动物剖检，这些方法均具有一定的缺点。粪便学检查方法但很难通过虫卵形态直接判断是否为捻转血矛线虫感染，此外该方法需在感染该寄生虫20多天以后才能检出虫卵，发现感染时牧场已被虫卵污染，动物感染强度较低时容易出现漏检。根据察临床症状诊断对专业知识和临床经验要求高，出现贫血症状的病因很多，有些阴性感染症状不显著，这都会对该病的诊断带来困难。剖检方法诊断准确性高，但需要在动物死亡后进行，而临床上只有在感染严重时才会发生，此时，需选择可疑动物进行剖检，该方法会给养殖者带来较大的经济损失。

ELISA((enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技术于1971年由Weerman和Engvail等人建立，即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术，该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等。建立捻转血矛线虫血清学诊断方法，发挥ELISA检测方法灵敏、特异、简便等优点，对解决上述传统诊断方法的缺陷具有重要意义。目前，尚无用于捻转血矛线虫感染的ELISA早期诊断用抗原的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于捻转血矛线虫感染的早期诊断抗原。

本发明的另一目的是提供该抗原的应用。

本发明提供了一种用于早期检测捻转血矛线虫感染的抗原，可通过如下技术方案实现：

一种用于早期诊断捻转血矛线虫感染的抗原HcADRM，所述的抗原HcADRM由282个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的抗原在制备检测捻转血矛线虫感染的试剂中的应用。

所述的试剂优选ELISA试剂。

一种用于检测反刍动物捻转血矛线虫病或捻转血矛线虫感染的试剂盒，含有本发明所述的抗原HcADRM。

所述的抗原HcADRM优选将pET-28a(+)重组HcADRM质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并用IPTG诱导蛋白表达，经纯化得到HcADRM蛋白。

所述的试剂盒优选ELISA试剂盒。

所述的ELISA试剂盒优选还包含纯化的抗原重组HcADRM包被的酶标板，抗原的包被量为278.75ng/孔。

所述的ELISA试剂盒还包含封闭液、酶标抗体、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液和终止液。

所述的阴性对照血清为未感染捻转血矛线虫山羊血清；所述的阳性对照血清为感染捻转血矛线虫山羊血清。

所述的酶标抗体优选HRP标记兔抗山羊IgG抗体。

一种用于检测感染捻转血矛线虫的间接ELISA检测方法，优选包含如下步骤。

抗原包被：将捻转血矛线虫ADRM蛋白用包被液稀释至优选工作浓度加入酶标板中(100μl/孔)，37℃孵育1小时后4℃过夜,以洗涤缓冲液TBST洗涤。

封闭：采用TBST稀释的5％BSA以每孔100μl进行封闭，37℃孵育1小时后用TBST洗涤，拍干。

血清作用条件：将待测阳性和阴性血清用TBST溶液1:50稀释，每孔加入100μl，37℃孵育2小时后用TBST洗涤，拍干。

酶标二抗作用条件：兔抗山羊IgG/HRP用TBST溶液1:4000稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1小时后用TBST洗涤，拍干。

底物显色：每孔加入100μl的TMB底物显色液，室温避光作用10分钟。

终止反应：每孔加入100μl的终止液终止反应，酶标仪测定OD₄₅₀。

阴阳临界值的确定：检测76份阴性山羊血清和32份阳性血清并将检测结果运用统计学软件MedCalc v15.8进行交互式点图和ROC曲线分析，确定最适的阴阳临界值，当OD₄₅₀在0.352以上时判定为阳性。

本发明的有益效果：

1.解决了山羊捻转血矛线虫诊断中存在的早期诊断、精确诊断、检出时间短和对感染后期无法检出的缺点，rHC-ADRM抗原适用于捻转血矛线虫不同感染阶段的检测。本发明rHC-ADRM可用作该寄生虫感染的诊断用抗原，该抗原可以对感染捻转血矛线虫14天后的宿主血清中的抗体进行特异性识别，能在排出虫卵前4-6天进行确诊，避免了虫卵对环境和牧场的污染，这对捻转血矛线虫病的防控具有重要意义。

2.应用该诊断抗原制备间接ELISA法试剂，具有检测敏感性高，特异性好，操作简单，诊断速度快，在进行大规模检测中具有经济方便等优点，在牛、羊、鹿、骆驼等反刍动物捻转血矛线虫病的诊断和防治中具有良好的应用前景。

附图说明

图1重组蛋白的纯化：M.蛋白质标准分子量，1.纯化前表达于包涵体rHC-ADRM，2.纯化后的rHC-ADRM。

图2重组蛋白rHC-ADRM Western blot分析：

A.重组蛋白rHC-ADRM最早诊断时间和持续时间，M为DNA标准分子Marker，1-5分别为自然感染捻转血矛线虫5只山羊，0、7、14、21、35、49、63、85和103为感染捻转血矛线虫后的天数。

B.重组蛋白rHC-ADRM交叉反应性，M为DNA标准分子Marker，1-4分别为肝片吸虫感染阳性血清、旋毛虫感染阳性血清、弓形虫感染阳性血清、捻转血矛线虫感染阳性血清。

图3基于rHC-ADRM间接ELISA的建立与优化：

A.重组抗原的最佳包被浓度(1:60、1:120、1:240、1:480、1:960)和血清最佳稀释浓度(1:25、1:50、1:100、1:200)的选择。

B.最佳封闭液及其浓度(2％、3％、4％、5％BSA和2％、3％、4％、5％脱脂牛奶)的选择。

C.酶标二抗(兔抗山羊IgG)最适反应时间(30min、60min、90min、120min)的选择。

D.血清最适反应时间(30min、60min、90min、120min)的确定。

E.酶标二抗(兔抗山羊IgG)最佳稀释浓度(1:2000、1:4000、1:8000)的选择。

F.TMB显色液最佳作用时间(5min、10min、15min)的确定。

图4 rHC-ADRM间接ELISA阴阳临界值的确定

A.ROC曲线分析，B.交互式点图分析，确定OD450值大于0.352为阳性，检测敏感性为93.7％，特异性为100％。

具体实施方式

基础材料：

1.捻转血矛线虫第三期幼虫(L3)：本实验室保存。

2.实验动物：4-6月龄的山羊购自南京某种羊场，实验过程中动物于网床饲养，粪便每天清理一次，环境严格消毒，动物自由采食和饮水。

3.质粒与菌种：大肠杆菌BL21，质粒pET28a(+)载体本实验室保存。

4.主要试剂：DB公司脱脂奶；生工公司BSA；博士德公司DAB显色试剂盒；Millipore公司0.45μm NC膜；其余试剂为自配。

5.主要仪器设备：冷冻台式离心机(Eppendorf centrifuge 5417R)；紫外可见分光光度计(Bio-Rad)；空气浴摇床(THZ，江苏太仓市实验设备厂)；紫外分析仪(WD-9304 C型，北京市六一仪器厂)；Bio-Rad PAGE系统、半干转系统；电热封口机；脱色摇床；Bio-rad凝胶成像系统；微量移液器(GILSON公司)。

实施例1

将健康山羊人工感染捻转血矛线虫第三期幼虫8000条，分别于感染后第7、15、40和60天采取山羊抗凝血，分离山羊外周血单个核细胞(PBMC)，利用免疫共沉淀技术和质谱技术进行分析，结果发现400多种捻转血矛线虫排泄分泌蛋白能与山羊的PBMC相结合，ADRM蛋白就是其中一种，且该蛋白在虫体感染山羊后第7天出现在宿主血液中，说明ADRM具有潜在的早期诊断价值。

实施例2

提取捻转血矛线虫成虫总RNA，合成cDNA模板，以Hc-ADRM-F：CCgaattcATGTTTTCTACATCCCGCTCTTCTC(EcoRⅠ，SEQ ID NO.3)和Hc-ADRM-R：ATctcgag TTAGCAGCCGGATCTCAGTG(XhoⅠ，SEQ ID NO.4)为引物PCR扩增Hc-ADRM片段，对所获取的HcADRM片段以及原核表达质粒pET-28a酶切，而后进行连接，转化及阳性克隆的鉴定，并送至金斯瑞生物科技有限公司测序，其中编码HC-ADRM抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3抗原rHC-ADRM的表达

将测序正确的Hc-ABHD阳性克隆，按1：100的比例接种于1 L含卡那霉素(100μg/mL)的液体LB培养基中。37℃180rpm震荡培养至对数期(OD600约为0.6)时，加入IPTG(工作浓度：1mM)。继续培养5h。诱导表达结束后，8000rpm低温离心10min，弃上清。PBS洗涤菌体2遍后，用上清Binding buffer重悬，反复冻融2-3遍，超声波破碎菌体。以4℃、8000rpm离心超声裂解物15min，收集上清。沉淀用30～40mL包涵体Binding buffer于4℃过夜溶解。进行上清和沉淀样品SDS-PAGE电泳分析，确定重组蛋白的表达主要分布于包涵体中。

实施例4.诊断抗原的纯化

(1)包涵体蛋白溶液于4℃8000rpm离心15min收集上清，使用孔径分别为0.45μm和0.22μm的滤器去除杂质。

(2)10倍纯化柱体积双蒸水清洗蛋白纯化柱。

(3)5倍纯化柱体积包涵体Binding buffer结合平衡蛋白纯化柱。

(4)包涵体蛋白溶液上柱，缓慢流出使其结合于镍柱。

(5)5倍纯化柱体积包涵体Binding buffer冲洗杂蛋白。

(6)5倍纯化柱体积包涵体Elution buffer洗脱目的蛋白。

(7)SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化效果，显示了与预期的融合蛋白分子量大小相符的单一蛋白带，大约35kDa。

(8)纯化后的包涵体蛋白依次置于含有6M、4M、2M、0M尿素的蛋白复性缓冲液中进行透析复性。

(9)复性后的包涵体蛋白在0.02M的PBS中于4℃透析2次每次12h。

(10)PEG8000浓缩蛋白，使用无菌的0.22μm滤器过滤后分装-20℃保存。纯化结果如图1所示。

实施例5 Western blot分析

选择健康山羊5只，分别人工感染捻转血矛线虫第三期幼虫(L3)8000条，于感染后不同时间(0、7、14、21、35、49、63、85和103天)采集血清，将山羊血清作为第一抗体与重组捻转血矛线虫HcADRM蛋白，进行免疫印迹，分析该抗原的最早检测时间和持续时间：

配置12％SDS-PAGE蛋白胶，重组蛋白样品每孔上样15ul，待溴酚蓝至分离胶底部时关闭电源，将聚丙烯酰胺凝胶取出，转印至硝酸纤维素膜(NC膜)。用TBST漂洗后将NC膜置入5％的脱脂牛奶中37℃孵育1h，使用感染不同天数(0、7、14、21、35、49、63、85、103)的捻转血矛虫山羊的血清作为一抗，37℃孵育2h；TBST漂洗3遍、每次5～10min；加入HRP标记兔抗山羊IgG抗体，37℃孵育1h；TBST漂洗5遍、每次5～10min；使用DAB避光显色。结果如图2A。结果显示，rHC-ADRM抗原与感染14天时山羊血清发生特异性结合反应并持续到103天，而0天和7天无特异性结合反应。

为了检测重组蛋白的特异性，以感染捻转血矛线虫的阳性血清为阳性对照western blot检测该抗原与阳性弓形虫、旋毛虫和肝片形吸虫血清的反应情况，结果如图2B。结果显示重组蛋白只与感染捻转血矛线虫阳性血清反应，表明该抗原具有很好的特异性。

可见，rHC-ADRM抗原用于山羊捻转血矛线虫诊断具有检出时间短和特异性强的优点，能用于山羊捻转血矛线虫的早期诊断、精确诊断。

实施例6.rHC-ADRM间接ELISA方法的建立

将实施例4中纯化保存的重组蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法，首先使用棋盘滴定法确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释倍数，以及最佳反应条件(图3)。

(1)抗原包被：将捻转血矛线虫重组HcADRM蛋白用碳酸钙包被溶液稀释至优选工作浓度(278.75ng/孔)加入酶标板中(100μl/孔)，37℃孵育1小时后4℃过夜,以洗涤缓冲液TBST洗涤。

(2)封闭：采用TBST稀释的5％BSA以每孔100μl进行封闭，37℃孵育1小时后用TBST洗涤3遍每次3min，拍干。

(3)血清作用条件：将待测阳性和阴性血清用TBST溶液1:50稀释，每孔加入100μl，37℃孵育2小时后用TBST洗涤3遍每次3min，拍干。

(4)酶标二抗作用条件：兔抗山羊IgG/HRP用TBST溶液1:4000稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1小时后用TBST洗涤5遍每次3min，拍干。

(5)底物显色：每孔加入100μl的TMB底物显色液，室温避光作用10分钟；

(6)终止反应：每孔加入100μl的终止液终止反应，酶标仪测定OD450。

(7)阴阳临界值的确定：选择通过临床鉴定和粪检确定的76份山羊阴性血清和32份感染捻转血矛线虫的阳性血清进行间接ELISA检测，检测结果运用统计学软件MedCalcv15.8进行交互式点图和ROC曲线分析，确定最适的阴阳临界值，分析结果显示rHC-ADRMELISA检测敏感性为93.7％，特异性为100％，当OD450在0.352以上时判定为阳性(图4)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种用于早期诊断捻转血矛线虫感染的抗原及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 282

<212> PRT

<213> 捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)

<400> 1

Met Phe Ser Thr Ser Arg Ser Ser Gln Gly Gly Ser Ser Ser Gly Asn

1 5 10 15

Leu Val Glu Phe Lys Ala Gly Arg Ser Phe Leu Gln Pro Ala Thr Ala

20 25 30

Pro Asn Lys Lys Lys Val Val Ala Asp Lys Thr Lys Gly Gln Val Phe

35 40 45

Ile Lys Gln Ser Asn Asp Gln Leu Met His Phe Cys Trp Lys Asn Arg

50 55 60

Glu Thr Gly Ala Val Val Asp Asp Leu Ile Ile Phe Pro Gly Asp Thr

65 70 75 80

Glu Phe Lys Glu Val Lys Gly Cys Pro Asp Gly Lys Val Tyr Met Leu

85 90 95

Lys Phe Lys Thr Ser Asp Glu Arg Arg Leu Phe Trp Ile Gln Asp Gly

100 105 110

Asn Ala Asp Ala Asp Lys Asp Leu Cys Lys Lys Val Asn Asp Ala Leu

115 120 125

Asn Lys Pro Pro Thr Thr Arg Ala Ser Ala Arg Gly Gly Ser Ser Glu

130 135 140

Arg Ser Thr Gly Gly Leu Ser Thr Ala Asn Leu Ala Gly Leu Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Glu Leu Gly Ala Leu Gly Gly Leu Asp Gln Pro Gln Leu Met

165 170 175

Gln Leu Leu Gln Phe Met Asn Gln Gly Ser Ser Asp Ser Pro Ser Leu

180 185 190

Val Pro Gln Thr Pro Ser Gly Gly Asn Ser Glu Arg Gly Ala Ser Gly

195 200 205

Asn Ala Pro Lys Val Ser Ala Ser Glu Leu Thr Gln Leu Gln Thr Leu

210 215 220

Leu Gly Gly Leu Arg Ala Pro Gly Gly Ala Gly Gly Ser Ser Ser Asp

225 230 235 240

Arg Gln Val Ala Ile Glu Leu Ser Asp Val Ile Ala Gly Gly Gln Val

245 250 255

Val Glu Thr Ala Lys Asn Asn Ala Glu Ala Cys Gly Arg Thr Arg Ala

260 265 270

Pro Pro Pro Pro Pro Leu Arg Ser Gly Cys

275 280

<210> 2

<211> 849

<212> DNA

<213> 捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)

<400> 2

atgttttcta catcccgctc ttctcaggga ggttcctcca gtggaaacct tgtggagttc 60

aaggccgggc gctcttttct ccaacctgca accgccccaa ataaaaagaa ggtagttgct 120

gacaaaacca agggacaagt cttcatcaag caatcaaatg atcagctcat gcatttctgt 180

tggaaaaaca gggaaacagg cgcggtggtt gatgacctta tcatctttcc gggtgacact 240

gagttcaagg aggtgaaagg atgtcccgat ggcaaagttt acatgttgaa gttcaaaact 300

tctgatgagc gtcgactttt ctggatccag gatggcaatg cggatgctga caaggatctc 360

tgtaagaagg taaacgatgc tctcaataag ccgccaacca ctcgtgctag tgctcgagga 420

ggctcttcgg aaagatctac tggaggatta tcaacggcta atttagcggg cctcagcggc 480

agtgaggaac tgggtgcgct tggagggctt gatcagccgc aactgatgca gcttctacaa 540

ttcatgaacc aagggagttc tgactcacca tcgctagtac ctcagacgcc ttcaggtggt 600

aattccgaac gtggagcttc aggaaacgca cccaaagtct ctgcctctga acttacacag 660

cttcaaactt tgcttggagg gctgagagcc ccaggtggtg caggagggag ttcatcagat 720

cgccaggtgg cgattgagct gagtgatgta atagctgggg gacaggtagt cgaaacagca 780

aaaaacaacg cagaagcttg cggccgcact cgagcaccac caccaccacc actgagatcc 840

ggctgctaa 849

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgaattcat gttttctaca tcccgctctt ctc 33

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atctcgagtt agcagccgga tctcagtg 28

Claims (9)

1.一种用于早期诊断捻转血矛线虫感染的抗原HcADRM，其特征在于：所述的抗原氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的抗原在制备检测捻转血矛线虫感染的试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的试剂为ELISA试剂。

4.一种用于检测反刍动物捻转血矛线虫病或捻转血矛线虫感染的试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的抗原。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒为ELISA试剂盒。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的ELISA试剂盒还包含纯化的权利要求1所述的抗原包被的酶标板，抗原的包被量为278.75ng/孔。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的ELISA试剂盒还包含封闭液、酶标抗体、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液和终止液。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述的阴性对照血清为未感染捻转血矛线虫山羊血清；所述的阳性对照血清为感染捻转血矛线虫山羊血清。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述的酶标抗体为HRP标记兔抗山羊IgG抗体。