CN111537716B - 一种捻转血矛线虫早期感染诊断试剂盒 - Google Patents

一种捻转血矛线虫早期感染诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于捻转血矛线虫感染的早期诊断抗原及其应用。本发明鉴定出一种可用作该寄生虫感染的诊断性抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。该抗原可以对感染捻转血矛线虫7天后的宿主血清中的抗体进行特异性识别，能在排出虫卵前11‑13天进行诊断，对确诊动物及时驱虫可有效避免虫卵对环境和牧场的污染，从而减少动物感染。本发明利用该抗原建立了间接ELISA检测方法，具有敏感性高、特异性强、稳定性好、操作简便等优点，在牛、羊、鹿、骆驼等反刍动物捻转血矛线虫病的防控中具有较好的应用前景。

Description

一种捻转血矛线虫早期感染诊断试剂盒
技术领域
本发明属于兽医免疫学和分子生物学技术领域，涉及一种动物寄生虫病的血清学诊断方法。
背景技术
捻转血矛线虫是牛、羊、鹿、骆驼等反刍动物一种最为常见的消化道寄生虫，寄生于反刍动物第四胃，以宿主血液为营养。动物感染后出现贫血、消瘦、水肿、腹泻等症状，可致幼龄动物特别是羔羊大批死亡，死亡率高达30％以上；成年动物死亡率较低，但感染后生长缓慢、饲料报酬降低，造成巨大的经济损失而常常不被发现。捻转血矛线虫病呈世界性分布，国内各地均有报道，一些牧区羊群感染率甚至高达70-80％。随着我国大力发展牛羊等草食动物及相关产业，捻转血矛线虫病的危害与其造成的经济损失日益明显与严重。
已有一个商品化的疫苗用于捻转血矛线虫病的预防，但因其抗原来源于纯化的虫体蛋白、生产成本高，国内基本无应用，仅在澳大利亚部分牧场使用。目前，该病依然依赖苯并咪唑、左旋咪唑、伊维菌素等3类药物进行预防和治疗，然而不规范的用药加速了捻转血矛线虫耐药性虫株的产生和蔓延。短期内新疫苗和新药研发很难有突破性进展，因此，准确快速的诊断该病、选择恰当的药物尽早治疗、避免感染后期成虫产生虫卵污染草场和圈舍，这对该病的防控具有非常重要的作用，同时也是将该病损失降至最低的最为有效措施。
目前，捻转血矛线虫病的诊断主要根据临床症状评估和粪便学检查结果进行，国外有报道使用ELISA方法进行该病的诊断，但其与其他多种寄生虫有交叉反应，特异性较差。根据临床症状进行诊断虽比较方便简单，但需要专业技术人员，且通常只有在感染严重时其临床症状才会变得明显，不适用于轻度感染。粪便学检查方法目前应用最为广泛，但需要在感染后3周左右方能在粪便中检测到虫卵，很难用于早期感染的诊断。剖检法能够进行准确诊断，但需要处死动物，成本很高，很难推广。现有的诊断方法均存在一些不足，因此，建立新的适用于动物早期感染和轻度感染的诊断技术和方法十分迫切和必要。
本发明基于Western blot与ELISA检测技术的诸多优点，以捻转血矛线虫Mt12重组蛋白为包被抗原，验证了捻转血矛线虫Mt12蛋白具有潜在的早期诊断价值并建立了捻转血矛线虫间接ELISA检测方法，对该方法的敏感性、特异性稳定性进行了分析，并将该检测方法应用于临床血清样本的检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12的应用。
本发明的又一目的是提供一种捻转血矛线虫早期感染诊断试剂盒。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12在制备捻转血矛线虫感染诊断试剂中的应用,所述的捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12的氨基酸序列如SEQ ID NO.4。
作为本发明的一种优选，捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12在制备捻转血矛线虫感染的分子生物学诊断或血清学诊断试剂盒中的应用。
作为本发明的进一步优选，捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12在制备捻转血矛线虫感染的ELISA试剂盒中的应用。
其中，所述的捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12优选通过以下方法制备：提取捻转血矛线虫总RNA，反转录合成cDNA的第一条链，以该cDNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行RT-PCR扩增，获得的产物经验证后插入pET32a的BamHⅠ和HindIII酶切位点间得到含有Mt12基因的重组表达质粒pET32a-Mt12；将该质粒转化大肠杆菌进行诱导表达并分离纯化获得所述的捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12。
一种检测捻转血矛线虫感染的ELISA试剂盒，包含包被捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12的ELISA板。
所述的捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12优选通过以下方法制备：提取捻转血矛线虫总RNA，反转录合成cDNA的第一条链，以该cDNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物进行RT-PCR扩增，获得的产物经验证后插入pET32a的BamHⅠ和Hind III酶切位点间得到含有Mt12基因的重组表达质粒pET32a-Mt12；将该质粒转化大肠杆菌进行诱导表达并分离纯化获得所述的捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12。
本发明建立在下列发现之上：
ELISA是一种省时、简便、安全的血清学检测方法，而ELISA和Western Blot技术的结合被视为提高免疫诊断敏感性的有效途径。Mt12作为捻转血矛线虫排泄分泌抗原的组成成分、其免疫功能、免疫诊断潜力等均未被报道。
本发明具有以下优点和效果：
1.目前资料报道的捻转血矛线虫抗体检测ELISA技术异性差，该发明基于Mt12抗原建立的间接ELISA具有高度的特异性和稳定性。
2.粪便学检查需在动物感染后21天左右才能进行诊断，
3.方法能在感染后7天做出准确诊断，具有早期诊断的优点。
4.基于该抗原建立的ELISA诊断技术具有操作简便、所需时间短、不需要特殊仪器等优点，所需试剂价格便宜，几乎所有实验室都能进行操作。
附图说明
图1为Mt12基因的PCR扩增
M：分子量标准DL2000；1：:Mt12的PCR产物。
图2为pET32a-Mt12双酶切鉴定
M:DNA标准分子量；1:重组质粒pET-32a/Mt12的BamHⅠ、HindⅢ双酶切片段。
图3为BL21-pET32a-Mt12的诱导表达
M：分子量标准；1：1:诱导5h后的空载菌体蛋白；2～7：BL21-pET32a-Mt12诱导0～6h。
图4为重组蛋白Mt12的亲和层析纯化结果
M:DNA标准分子量；1:纯化前的Mt12；2:纯化后的Mt12。
图5为Mt12重组蛋白山羊血清的Western blot结果
DPI:感染后的天数；横坐标数字1-5代表人工感染的5只山羊；纵坐标数字0-103代表感染后的天数。
具体实施方式
基础材料：
1.捻转血矛线虫虫株：本实验室分离、鉴定、保存。
2.实验动物：5只杂交山羊，4-6月龄，购于江苏省盱眙县某农场，饲养于南京农业大学动物房内。
3.PCR引物：上、下游引物(F、R)序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所列。
4.工具酶与试剂：制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ、DNA Marker(DL2000Plus、DL5000Plus)和
Figure BDA0002523897650000041
Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒均购于南京诺唯赞生物科技有限公司；/>
Figure BDA0002523897650000042
Reagent购于ThermoFisher生物科技公司；质粒少量提取试剂盒与琼脂糖凝胶回收试剂盒为美国E.Z.N.A.TM公司产品，BCA蛋白定量分析试剂盒为美国Thermo公司产品；HisTrapTMFF蛋白亲和层析柱购自美国GE公司，DAB显色试剂盒，HRP标记的兔抗山羊IgG均购于上海碧云天生物科技公司；异丙醇、氯仿等其他试剂均为国产分析纯试剂。
5.临床检测样品：江苏省南京市不同羊场随机选取51只山羊，分别采集其血清、粪便与皱胃样品。
6.主要仪器设备：PCR扩增仪(TaKaRa公司)，台式冷冻离心机(Eppendorf)、电压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、超声破碎仪(宁波新芝科研仪器研究所)；凝胶成像系统、蛋白电泳系统、半干转印系统及酶标仪(Bio-Red)。
实施例1.诊断用抗原Mt12的制备
1.1合成引物
Mt12蛋白UniProt登录号(U6P1M9)，GenBank对应的ORF序列无信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3,氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，是由309个氨基酸组成的一种捻转血矛线虫排泄分泌抗原，能与山羊体内的外周血单个核细胞(PBMCs)结合。
1.2捻转血矛线虫总RNA的提取
应用Inviotrgen TRIzol说明书方法进行成虫总RNA的提取，具体步骤如下：
(1)挑取0.3g捻转血矛线虫放入经DEPC水处理过的匀浆器中，研磨虫体。待虫体研磨较充分后加入TRIzol试剂1mL，冰上充分研磨(冰上研磨时间大于30min)；
(2)将研磨好的虫体转移至无RNA酶的离心管中，静置5min或者4℃离心12000rpm取上清；
(3)把上清再转移至新的离心管中，加入200uL经4℃预冷的氯仿，震荡30s乳化后静置5min；
(4)4℃离心机12000rpm离心15min，将上层水相小心转移至新的离心管中；加入遇冷的异丙醇，上下颠倒震荡1min后静置10min；
(5)4℃离心机12000rpm离心10min舍弃上清；
(6)用1mLDEPC水配制的75％乙醇重悬沉淀，4℃离心机12000rpm离心10min舍弃上清；
(7)重复一次步骤(6)后在风机下晾干离心管促使残留乙醇挥发，用30uL55℃的DEPC水溶解RNA；
(8)测定RNA纯度与浓度后，立即进行反转录或-80℃保存。
1.3cDNA的合成
将上步提取合格的虫体总RNA，进行cDNA链的合成。以捻转血矛线虫总RNA为模板，应用反转录试剂盒合成cDNA的第一条链。
1.4Mt12的基因RT-PCR扩增
以cDNA为模板，采用以下反应体系进行RT-PCR：cDNA模板2.0μL，10×PCR Buffer5μL，MgCl2(25mM)5μL，上游引物P1(10pM)2μL，下游引物P2(10pM)2μL，LA Taq酶(5U/μL)0.5μL，补加灭菌超纯水至50μL，充分混匀，于PCR仪上95℃预变性1min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，72℃延伸10min。
1.5Mt12基因的克隆(见图1)
取上述获得的RT-PCR产物25μl，1％琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下切下目的条带处琼脂糖凝胶，用大连宝生物公司的胶回收试剂盒回收纯化目的片段，方法参照说明书。取纯化的PCR产物与pMD19-T载体连接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆菌，提取质粒，用BamHⅠ和Hind III双酶切鉴定，阳性克隆进行序列测定和分析。
1.6Mt12基因的表达(见图2)
分别用BamHⅠ和Hind III双酶切克隆质粒载体pMD19-T-Mt12和pET32a，回收目的基因和pET32a大片段，按照合适比例进行连接，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21，提取质粒，用Hind III和BamHⅠ双酶切鉴定。氨基酸序列如SEQ ID NO.4。
1.7表达产物的纯化
1.7.1包涵体蛋白的准备(见图3)
使用1mM浓度的IPTG诱导在1L LB培养基中培养的Mt12表达菌，8000r/min离心5min收集菌体，使用约40mlPBS重新悬浮菌体，600W超声强度，工作1s，间隔3s，破碎30min。破碎后的悬液10000r/min离心20min，取沉淀弃上清，沉淀即为包涵体。向包涵体中加入20mlElutionBuffer，使用大号注射器充分吹吸悬浮，4℃过夜溶解包涵体，包涵体大部分溶解后10000r/min离心20min，弃沉淀取上清去除未溶解的杂质，0.45μm滤膜过滤后样品制备完毕。
1.7.2重组蛋白的亲和层析纯化(见图4)
按照0.5ml/min的流速使蛋白样品缓缓流过保存于4℃20％乙醇中的His Tag亲和层析柱(1ml×3串联)，使用5倍柱体积Binding Buffer清洗柱子。按照2ml/min的流速使用5-10倍柱床体积的Binding Buffer洗涤层析柱。再按照0.5ml/min的流速使用ElutionBuffer洗脱目的蛋白。
实施例2.诊断抗原Mt12的Western Blot分析
2.1山羊感染捻转血矛线虫不同时期血清的制备
5只杂交山羊，4-6月龄，购于江苏省盱眙县某农场。饲养于南京农业大学动物房内。驱虫，通过粪检证实无寄生虫感染后，人工感染捻转血矛线虫三期幼虫(L3，8000个/只)。分别于感染前(阴性对照)和感染后7、14、28、35、49、61、80、103天采血并分离血清。
2.2重组蛋白的Western blot分析(见图5)
以山羊感染不同时期的血清作为一抗，对Mt12重组蛋白进行Western blot分析。Mt12在感染后的7天开始被检测到并持续至61天。但未感染捻转血矛线虫的山羊血清对该重组蛋白不识别。
(1)将目的蛋白进行SDS-PAGE电泳后，取出凝胶将需转印的区域裁剪好并用直尺量好胶的长和宽；
(2)将两张厚滤纸与PVDF膜按照蛋白胶的尺寸裁好，PVDF膜需放入无水甲醇中激活15秒；
(3)转印膜激活后，把膜和滤纸置于转膜缓冲液中平衡10min；在半干转印仪上，从上到下按照滤纸-蛋白胶-转印膜-滤纸的顺序叠放，使凝胶在负极PVDF膜在正极后轻轻挤压赶走每层间的气泡；
(4)进行恒流转印，电流＝蛋白胶的长(cm)×宽(cm)×2.5，转印时间为20-30min；
(5)转印结束后用TBST清洗转印膜，后用5％脱脂奶粉/5％BSA封闭，37℃2h；
(6)孵育一抗：封闭好后，按1：100用TBST稀释感染的山羊血清作一抗，阴性血清做对照，4℃冰箱孵育过夜；
(7)孵育二抗：一抗孵育过后TBST清洗3次每次10min，加入兔抗山羊IgG(1：4000用TBST稀释)，37℃避光孵育1h；
(8)二抗孵育结束后TBST清洗3次每次10min，用ECL曝光试剂盒曝光。
感染捻转血矛线虫山羊血清与Mt12的反应
Figure BDA0002523897650000071
实施例3.诊断抗原Mt12-ELISA的建立
3.1间接ELISA测定的基本实验步骤
3.1.1包被：将Mt12重组蛋白用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释后，按照100μL/孔，1.25μg/ml的蛋白量4℃包被ELISA板12h，12h后甩干内容物，向孔内加入洗涤液，静置5min后甩干并在吸水纸垫上拍打，再加洗涤液，反复洗涤3次。
3.1.2封闭：ELISA96孔板洗涤去残留的未结合包被蛋白后每孔加入200μL5％胎牛血清封闭液，37℃封闭2h，封闭完成后加入PBST洗涤5次，每次洗涤加入洗液后静置作用3min。
3.1.3一抗作用：每孔加样体积100μL，加入按照1：25比例稀释的样品血清，37℃作用1h，1h后加入PBST洗涤5次，每次洗涤加入洗液后静置作用3min。
3.1.4二抗作用：每孔加样体积100μL，加入按照1:8000比例稀释的酶标二抗，37℃作用1h，1h后加入PBST洗涤5次，每次洗涤加入洗液后静置作用3min。
3.1.5TMB显色：每孔加入100μLTMB显色底物，25℃室温静置10min后加入H2SO4终止液终止反应。
3.1.6测定OD450：预热酶标仪15min后使用450nm波长测定OD450并记录测定结果。
3.2ELISA阴阳性界限的确定
使用建立的Mt12间接ELISA方法对32份捻转血矛线虫已知阴性血清检测。对所得结果进行计算和分析得到32份样品的OD450nm的平均值(X)为0.26，标准差(SD)为5％。根据统计学原理，阳性临界值(X+3SD)＝0.4；阴性临界值(X+2SD)＝0.36；在二者之间(0.36<OD450<0.40)为假阴/阳性。
3.3特异性试验
分别以Mt12蛋白作为包被抗原应用上述建立的间接ELISA检测方法对肝片吸虫和细粒棘球蚴的阳性血清进行检测，结果显示没有出现交叉反应。
3.4重复性试验
3.4.1批内重复
对3份阳性(P)血清和3阴性(N)不同的山羊血清样品在96孔板上用同一批次纯化的Mt12重组蛋白建立的间接ELISA方法进行试验，可知样品的批内重复试验的变异系数均低于6.4％，平均变异系数为3.5％，表明所建立的Mt12重组蛋白间接ELISA检测方法有良好的批内重复性。
重组蛋白Mt12间接ELISA的批内重复试验
Figure BDA0002523897650000081
Figure BDA0002523897650000091
3.4.2批间重复
用不同批次纯化的重组蛋白包被96孔板，在最佳反应条件下用间接ELISA方法检测6份临床采集的山羊血清样品，对获得的OD450值进行统计学分析。得知以MT12为包被抗原的6份山羊血清样品的变异系数小于11.7％，说明不同批次纯化的重组蛋白的批间重复性良好。
Mt12纯化蛋白间接ELISA方法的批间重复性试验
Figure BDA0002523897650000092
实施例4.诊断抗原Mt12-ELISA的临床应用
在江苏省南京市不同羊场随机选取51只山羊，采集其血清、粪便和皱胃样品。对这些样品分别进行虫卵计数、皱胃成虫计数和间接ELISA检测，比较三种诊断方法结果。皱胃剖检显示阳性样品为10份，阴性样品为41份。基于Mt12蛋白建立的ELISA方法检测到山羊感染捻转血矛线虫的阳性样品10份，40份样品为阴性，1份样品为假阴/阳性；Mt12重组蛋白建立的间接ELISA检测结果与剖检结果相比符合率为98％。
血清间接ELISA、粪便虫卵计数和皱胃剖检结果
Figure BDA0002523897650000093
Figure BDA0002523897650000101
Figure BDA0002523897650000111
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种捻转血矛线虫早期感染诊断试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcggatcca tgacgcataa cacacacg 28
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccaagcttt tagcattttt gatatttaac ct 32
<210> 3
<211> 930
<212> DNA
<213> 捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)
<400> 3
atgacgcata acacacacgc gtcctcgaat gctactgatg acgaaaaatc cagtgagccg 60
aaatgtaatc catttggcac gcggtatttg actgatgaga ctcgtgtgtg ggactacaac 120
gcatgggata acgtggagtg gagtgatgaa atgcgcaagg acgctgctcg tatcgttgaa 180
gctcagaaac aagaagctgt tgacggctca aaggcgaaag agctgatcag cacacctgag 240
aagcaatggg atgcgtttta ttcacagcac agcaacaatt tcttcaagga tcgtcgatgg 300
ctgctgaagg agtttccaga gttggacatg aataactacc cagagggatc tactgtacga 360
gttctcgagg tcggttgcgg tgtgggcaat acttcgtttc cattgctgga gtgggacaca 420
catcacagaa tgttccttta tagctgtgac tattccgctg tagcggtaaa ggtgttgaaa 480
gaacatgaga aatacgatgg atcgaggata tcaggatttg tctgggatat cacaaaagat 540
gcaccagaag ctgctccggc aaaagaatcc ttggattttg ttgtctgtat atatgtgttg 600
tccgcgatac atccgtcaat ggttcgacag gcgatcgata atcttgtgag ccttctcaag 660
ccaggaggaa tgctgctgct caaagattac ggtcgattcg atcttacaca acttcgattc 720
aagaaatgtc gatacattga tgagaatctg tattgtagag gcgatggtac tttagtgtac 780
tttttcaata atgacgaatt ggatttgcta cttcggtcag caggactcgt taaaagagca 840
aattttgttg atagacgctt gattgttaat agagcgaaac atgtgaagat gtatagacag 900
tggttgcagg ttaaatatca aaaatgctaa 930
<210> 4
<211> 309
<212> PRT
<213> 捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)
<400> 4
Met Thr His Asn Thr His Ala Ser Ser Asn Ala Thr Asp Asp Glu Lys
1 5 10 15
Ser Ser Glu Pro Lys Cys Asn Pro Phe Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Asp
20 25 30
Glu Thr Arg Val Trp Asp Tyr Asn Ala Trp Asp Asn Val Glu Trp Ser
35 40 45
Asp Glu Met Arg Lys Asp Ala Ala Arg Ile Val Glu Ala Gln Lys Gln
50 55 60
Glu Ala Val Asp Gly Ser Lys Ala Lys Glu Leu Ile Ser Thr Pro Glu
65 70 75 80
Lys Gln Trp Asp Ala Phe Tyr Ser Gln His Ser Asn Asn Phe Phe Lys
85 90 95
Asp Arg Arg Trp Leu Leu Lys Glu Phe Pro Glu Leu Asp Met Asn Asn
100 105 110
Tyr Pro Glu Gly Ser Thr Val Arg Val Leu Glu Val Gly Cys Gly Val
115 120 125
Gly Asn Thr Ser Phe Pro Leu Leu Glu Trp Asp Thr His His Arg Met
130 135 140
Phe Leu Tyr Ser Cys Asp Tyr Ser Ala Val Ala Val Lys Val Leu Lys
145 150 155 160
Glu His Glu Lys Tyr Asp Gly Ser Arg Ile Ser Gly Phe Val Trp Asp
165 170 175
Ile Thr Lys Asp Ala Pro Glu Ala Ala Pro Ala Lys Glu Ser Leu Asp
180 185 190
Phe Val Val Cys Ile Tyr Val Leu Ser Ala Ile His Pro Ser Met Val
195 200 205
Arg Gln Ala Ile Asp Asn Leu Val Ser Leu Leu Lys Pro Gly Gly Met
210 215 220
Leu Leu Leu Lys Asp Tyr Gly Arg Phe Asp Leu Thr Gln Leu Arg Phe
225 230 235 240
Lys Lys Cys Arg Tyr Ile Asp Glu Asn Leu Tyr Cys Arg Gly Asp Gly
245 250 255
Thr Leu Val Tyr Phe Phe Asn Asn Asp Glu Leu Asp Leu Leu Leu Arg
260 265 270
Ser Ala Gly Leu Val Lys Arg Ala Asn Phe Val Asp Arg Arg Leu Ile
275 280 285
Val Asn Arg Ala Lys His Val Lys Met Tyr Arg Gln Trp Leu Gln Val
290 295 300
Lys Tyr Gln Lys Cys
305

Claims (3)

1.捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12在制备捻转血矛线虫感染诊断试剂中的应用,所述的捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12的氨基酸序列如SEQ ID NO.4;所述的捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12通过以下方法制备：提取捻转血矛线虫总RNA，反转录合成cDNA的第一条链，以该cDNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物进行RT-PCR扩增，获得的产物经验证后插入pET32a的BamHⅠ和Hind III酶切位点间得到含有Mt12基因的重组表达质粒pET32a-Mt12；将该质粒转化大肠杆菌进行诱导表达并分离纯化获得所述的捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12在制备捻转血矛线虫感染的分子生物学诊断或血清学诊断试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，捻转血矛线虫甲基转移酶12型蛋白Mt12在制备捻转血矛线虫感染的ELISA试剂盒中的应用。
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