CN111551750A - 猪星状病毒间接elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，预先包被的ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白(pGEX‑4T‑1‑cap‑1蛋白)作为包被抗原。试验证明，本发明猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，能准确灵敏地检测猪血清中的性抓个病毒抗体，从而对样品进行定性判断。而且，样品前处理过程简单，耗时少，敏感性好，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。综上，本发明对解决大批量样品的猪星状病毒现场检测技术具有重要的现实意义。

Description

猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明属于猪星状病毒检测技术领域，尤其涉及一种猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒。

背景技术

近年来在国内外的养殖场中，猪星状病毒(porcine astrovirus，PAstV)常与其他肠道病毒混合感染引起仔猪腹泻，并造成不小的经济损失。PAstV Capside可以刺激机体产生免疫应答，是研究检测诊断试剂的首选蛋白。

猪星状病毒的诊断较为常见的方法有流行病学、分子诊断及病毒分离诊断等，但这些方法中有的诊断时间较长，有的检测结果不理想，有的不便于临床大量检测。ELISA方法具有快速定性和定量、灵敏度高、适用范围广、结果判定客观、成本低和可同时进行数千份样品的检测等优点。目前，国内外并没有关于猪星状病毒相关ELISA检测试剂盒的产品报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作简单的星状病毒间接ELISA检测试剂盒，以便于实现猪星状病毒的批量、快速血清学检测。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，预先包被的ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白作为包被抗原。

猪星状病毒Capside保守区蛋白由序列表SEQ.ID.No.1的基因碱基序列编码或者具有SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

上述猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，还包括标准阴性血清、标准阳性血清、辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗猪IgG、洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、底物液、终止液。

洗涤液和稀释液均为PBST洗涤液；包被液为PH9.6 Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液；封闭液为5％胎牛血清；底物液为TMB显色液；终止液为2mol/L的硫酸溶液。

洗涤液和稀释液均为PBST洗涤液，按以下进行配制：将准确称量的8g NaCl、0.2gKCl、2.9g Na₂HPO₄.12H₂O和0.2g KH₂PO₄充分溶解在800mL去离子水中，然后将pH值调节到7，然后加去离子水定容至1L，再加入500μL Tween-20；

包被液为pH9.6 Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，按以下进行配制：将1.59g Na₂CO₃和2.93gNaHCO₃加水充分溶解后，将pH调到9.6后，加去离子水定容为1L，即得；

底物液为TMB显色液，包括TMB显色A液和B液，使用前进行1：1配制。

包被抗原按以下方法进行制备：根据猪星状病毒全长感染性克隆质粒为模板，利用设计合成的特异性引物对猪星状病毒I型Capsid基因保守区进行PCR扩增，并将目的基因回收连接到pGEX-4T-1质粒中，经鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况；亲和层析法分离纯化得到目的蛋白pGEX-4T-1-cap-1蛋白。

特异性引物包括序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列。

预先包被的ELISA反应板按以下方法进行制备：取100μl用包被液稀释至工作浓度的包被抗原加入ELISA反应板的反应孔中，37℃包被2h，用100μl封闭液37℃封闭2小时；工作浓度为200μg/孔。

针对目前现有猪星状病毒诊断检测存在的问题，发明人设计并制备了一种猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，预先包被的ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白(pGEX-4T-1-cap-1蛋白)作为包被抗原。其分析原理是：酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入稀释好的待测样品(血清)，样品中的capside抗体能够通过抗原抗体反应给合到固相上，再加入酶标二抗，当样品中的针对pGEX-4T-1-cap-1蛋白的抗体浓度高的时候，结合的抗体就越多，结合的酶标二抗体就越多，用洗涤液洗涤后加入显色液，显色反应就越深，用酶标仪检测的OD值越高，表明待测样品中的capside抗体含量越高，当反应的OD值高于临界值时，就判定为阳性；反之，则为阴性。

该试剂盒涉及星状病毒衣壳蛋白作为星状病毒唯一的结构蛋白，不仅是病毒刺激受感染机体产生保护性免疫反应的主要因素，也是该病毒的抗原蛋白。发明人前期研究表明，在猪星状病毒衣壳蛋白序列中，1aa-419aa区间相对保守，对其进行抗原表位预测，发现1aa-150aa存在抗原表位的可能性较高，因此选取该蛋白相对保守的1aa-150aa片段进行扩增，克隆表达猪星状病毒衣壳蛋白保守区片段并建立相应的间接ELISA检测方法能够更特异、灵敏地判断是否存在猪星状病毒感染和定量感染后引起的抗体滴度，可以为猪星状病毒的血清学早期诊断提供一种快速准确的方法。

试验证明，本发明猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，能准确灵敏地检测猪血清中的性抓个病毒抗体，从而对样品进行定性判断。而且，样品前处理过程简单，耗时少，敏感性好，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。综上，本发明对解决大批量样品的猪星状病毒现场检测技术具有重要的现实意义。

附图说明

图1是cap-1扩增结果图，图中：M是DL1000 DNA Marker；1-3是cap-1片段；4是阴性对照。

图2是重组质粒的酶切鉴定结果图，图中：M是DL5000 DNA Marker；1是pGEX-4T-1-cap-1重组质粒；2是pGEX-4T-1空载。

图3是重组蛋白表达结果图，图中：M是Marker；1是pGEX-4T-1-cap-1重组蛋白；2是pGEX-4T-1空载。

图4是重组蛋白表达形式确定结果图，图中：M是Marker；1是pGEX-4T-1-cap-1诱导上清；2是pGEX-4T-1-cap-1诱导沉淀。

图5是重组蛋白纯化结果图，图中：M是Marker；1是流穿液；2是洗涤液；3是洗脱液。

图6是重组蛋白透析后WB验证结果图，图中：M是Marker；1是透析后蛋白；2是pGEX-4T-1空载对照。

具体实施方式

一、材料和方法

菌株和质粒：猪星状病毒全长感染性克隆质粒、pGEX4T-1表达载体质粒由广西大学动物科学技术学院传染病与分子免疫学实验室制备并保存，

SeamLessCloningand Assembly Kit和Trans5a、BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

试剂：PrimeSTAR Max酶、DL2000Marker和限制性内切酶BamH I、购自大连宝生物制品有限公司；质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；IPTG、蛋白上样缓冲液、蛋白Marker购自碧云天生物技术公司。

二、重组表达质粒pGEX-4T-1-cap-1的构建及鉴定

根据已知的保守区序列，结合表达载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点，运用Vazyme公司开发的CE Design V1.04引物设计软件，设计扩增保守区片段的特异性引物，引物序列如表1。

表1引物序列

上、下游各引入BamHI酶切位点，引物由华大基因公司合成。

以本实验室前期构建的猪星状病毒全长质粒为模板扩增衣壳蛋白保守区基因。反应程序：98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸45s；共35个循环。扩增后取PCR产物5μl于1％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，PCR产物大小与目的条带大小一致。PCR产物用小量胶回收试剂盒回收纯化。

将PCR回收产物与pGEX-4T-1载体连接，转化大肠杆菌DH5α，构建重组质粒。挑取阳性克隆，用带氨苄青霉素抗性的LB培养基扩增培养。按质粒提取试剂盒(plasmidMiniprepKit)说明书提取质粒，对重组质粒进行PCR及双酶切鉴定，阳性质粒命名为pGEX-4T-1-cap-1，送华大基因生物工程公司测序，测序结果用DNAstar软件进行比对，测序结果显示无突变。之后进行酶切鉴定，结果见图2。实验结果表明目的片段已插入到质粒中且酶切位点无突变产生，提取的质粒为阳性质粒，可进一步用于重组蛋白的表达。

三、重组蛋白的诱导表达、纯化与鉴定

将重组质粒pGEX-4T-1-cap-1转化大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆菌，接种于LB培养基。于37℃摇床200r/min振荡培养过夜，按1:100的比例接种至5ml LB培养基中。培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导表达6h后收菌。将1.5ml菌液离心，取沉淀，加入40μl 1％SDS和10μl蛋白上样缓冲液，振荡混匀后，沸水煮5min，稍离心，取上清10μl进行10％SDS-PAGE分析，结果见图3。按照GST蛋白纯化试剂盒操作说明提纯蛋白，结果见图4。使用电转印仪将SDS胶面蛋白转移至PVDF硝酸纤维素膜。5％脱脂奶粉PBST封闭液37℃封闭3h，然后将膜装入内有GST标签一抗(1：5000稀释)的无菌小塑料袋中，孵育结合1h，用TBST室温摇床上脱色，洗3次，每次5min。再加入二抗(1：50000稀释，羊抗鼠IgG-HRP购自Proteintech公司)，室温孵育结合50min，然后用TBST在摇床上洗3次，每次5min。ECL显色，结果见图5。

图3至图5的实验结果表明，含有阳性重组载体的大肠杆菌在IPTG诱导下表达，不同诱导时间的产物经SDS-PAGE检测，在大约43KD处可见表达条带，与预期蛋白大小相一致，而空载体菌诱导后，没有出现此蛋白条带纯化的蛋白为所要表达的目的蛋白。

四、抗原最适包被浓度及待检血清最适稀释度的确定

(1)抗原包被：将采用GST柱纯化的蛋白用0.05M碳酸盐包被液按照100ng/孔、200ng/孔、400ng/孔、800ng/孔梯度稀释，每孔加入稀释液100μl，4℃过夜包被。

(2)封闭：将4℃过夜的96孔板取出，拍干液体，用PBST洗液100μl/孔洗3次，拍干液体，加入5％脱脂乳封闭液，37℃封闭2h。

(3)加入待检血清样品：取出板子，拍干液体，用PBST洗液100μl/孔洗3次，拍干液体，将阴阳性血清用PBST洗液按照1：50、1：100、1：200、1：400、1：800比例稀释，100μl/孔，37℃孵育1h。

(4)加酶标二抗：将酶标板从温箱中取出，用PBST洗涤3次，每次2min。将HRP标记的山羊抗猪IGg二抗用PBST洗液按照1：5000稀释，37℃孵育1h。

(5)加底物液：用PBST洗涤3次，每次2min。加入显色液，100μl/孔，37℃避光显色15min。

(6)加终止液：加入配制好的终止液，50μl/孔。终止后10min内测定OD450吸光值。

实验结果显示，最佳血清稀释度为1：50，抗原的最佳稀释度为200ng/孔。

五、最适抗原包被条件的确定

采用最佳包被浓度和最佳血清稀释度，以37℃包被1h、37℃包被2h、37℃包被4h及4℃包被过夜4中不同条件包被重组蛋白，用猪星状病毒阳性血清和阴性血清进行iELISA测定，确定抗原的最佳包被条件为37℃包被2h。

六、酶标二抗最佳工作浓度的确定

采用最佳抗原包被浓度、最佳包被条件及最佳血清稀释度，将山羊抗猪IgG-HRP以1：5000、1：10000、1：15000、1：2000的比例稀释，确定酶标二抗的工作浓度为1：5000。

七、间接ELISA阴性和阳性临界值的确定

取本实验室保存的20份猪血清(已知猪星状病毒抗体阴性)进行iELISA检测。每份样品重复2孔，结果取其平均值，计算样本OD_450nm值的平均值和标准方差(s)，根据统计学原则，判定样品OD450≥X+3SD判定样品为阳性，当OD450≤X+2SD判定样品为阴性，中间值为可疑样品。

实验结果显示，求的平均值为0.209，标准差s为0.029，确定检测样品OD450值≥X+3SD＝0.296判定样品为阳性，当OD450≤X+2SD＝0.267判定样品为阴性，中间值为可疑样品。

八、符合率和重复性试验

选取40份已知为PAstV阴阳性血清(实验室保存)，用建立的间接ELISA方法，进行检测，其中20份阴性、20份阳性。经测定OD450值发现，20份阳性样品中19份显示阳性，1份为可疑样品。20份阴性样品全部为阴性。结合统计学知识，计算符合率为97.5％。

分别随机抽取3组同批次和不同批次包被的酶标板，对8份已知PAstV阴阳性的血清(4份阳性4份阴性)进行检测。经测定OD450值，结合统计学知识，计算变异系数在0.5％-4.8％之间，均不超过10％。说明建立的间接ELISA检测方法具有可重复性。

九、猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒

根据上述试验结果，为便于基层工作和实验室研究，按以下制备猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒：

(1)预先包被好的ELISA反应板：数量为5块，处理方法为：取100μl用包被液稀释至工作浓度的包被抗原加入ELISA板的反应孔中，37℃包被2h，用100μl封闭液37℃封闭2小时；包被液中，Na₂CO₃的浓度为1.59g/L，2.93g NaHCO₃的浓度为2.93g/L，制备方法为：将1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃加水充分溶解后，将pH调到9.6后(用1M的氢氧化钠溶液调整)，加去离子水定容为1L，即得；包被抗原为pGEX-4T-1-cap-1蛋白，工作浓度为200μg/孔，工作条件为37℃包被2h；封闭液为5％胎牛血清(体积分数)；

(2)PBST洗涤液：体积为60ml，同时也作为样品稀释液；体积为1L的25倍PBST洗涤液制备方法为：将准确称量的8g NaCl、0.2g KCl、2.9g Na2HPO4.12H2O和0.2g KH2PO4充分溶解在800mL去离子水中，然后将pH值调节到7(通过滴加1M盐酸的方式调节pH)，然后加去离子水定容至1L，再加入500μL Tween-20，即得；

(3)酶标二抗：体积为10μl，辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗猪IgG，工作浓度为1：5000，工作条件为：37℃孵育40min；

(4)终止液：体积为200ml，2mol/L的硫酸溶液；制备方法为：22.2mL的浓硫酸与177.8mL的去离子水混合，配制成2M的H₂SO₄溶液；

(5)显色液：体积为50ml的TMB显色液，包括TMB显色A液和B液，使用前进行1：1配制。

其中，包被抗原参照步骤二和步骤三按以下制备：从前期构建的猪星状病毒全长质粒作为模板，利用设计合成的特异性引物，对猪星状病毒衣壳蛋白保守区基因进行PCR扩增，并将目的基因回收连接到pGEX-4T-1载体转化，经鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况；亲和层析法分离纯化目的蛋白，再通过透析袋对蛋白进行透析去除谷胱甘肽，通过Western-blotting对蛋白进行鉴定，用紫外分光光度计测定纯化后的蛋白浓度。

应用上述猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒进行检测的方法如下：

(1)洗涤液与样品稀释液的准备；PBST洗涤液备用；

(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准阳性孔和标准阴性孔以及待测样品孔；将标准阳性血清、标准阴性血清和样品血清按1：50稀释后，在酶标包被板的反应孔内准确加样100μl，空白孔直接加100μl样品稀释液；加样时，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，加样后，轻轻晃动混匀；

(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育1小时；

(4)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加300μl洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

(5)酶标二抗的稀释：根据实验需要计算用量，用PBST将酶标二抗按1：5000稀释后备用，需现用现配；

(6)加入二抗：每孔加入100μl稀释好的酶标二抗，空白孔除外；

(7)温育：操作同(3)；

(8)洗涤：操作同(5)；

(9)显色：每孔先加入100μl TMB显色剂，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

(10)终止：每孔加50μl终止液，终止反应(此时蓝色立转黄色)；

(11)测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)；测定应在加终止液后15分钟以内进行；

结果判定：标准阳性血清OD450nm值大于1.0，标准阴性血清OD450nm值小于0.25时，实验结果判定为合格；反之，为不合格，需要重新检测；待测样品的OD450nm值大于0.296时为阳性，小于或等于0.267时为阴性。

序列表

<110> 广西大学

<120> 猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 453

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctagca agtctggcaa agatgtcact gtcaaggtcg aaaataacac cggccgtggc 60

aggagcagat cccgctctag atctcggtct agagccagga acaaaaatgt taaaattacc 120

atcaactcta aaccaggagc gaacggagga cagcgcagac ggggtaaacc tcagtctgat 180

aagcgtgtcc gtaatattgt caaacaacag cttgacaaat caggtgtcac aggtccaaaa 240

ccagcaatcc gtcaacgggc aacagcaacc cttggaacca ttggaagcaa ctccagtggg 300

aagacggagc tcgaggcatg cattctcacg aatcccgttc ttgtcaagga taacacgggg 360

aataacacgt ttggtccgat cgttgcttta ggagcgcagt attcgctatg gcgcatacgc 420

tacctacgcc tcaaatttac accaatggta tag 453

<210> 4

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Ser Lys Ser Gly Lys Asp Val Thr Val Lys Val Glu Asn Asn

1 5 10 15

Thr Gly Arg Gly Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ala

20 25 30

Arg Asn Lys Asn Val Lys Ile Thr Ile Asn Ser Lys Pro Gly Ala Asn

35 40 45

Gly Gly Gln Arg Arg Arg Gly Lys Pro Gln Ser Asp Lys Arg Val Arg

50 55 60

Asn Ile Val Lys Gln Gln Leu Asp Lys Ser Gly Val Thr Gly Pro Lys

65 70 75 80

Pro Ala Ile Arg Gln Arg Ala Thr Ala Thr Leu Gly Thr Ile Gly Ser

85 90 95

Asn Ser Ser Gly Lys Thr Glu Leu Glu Ala Cys Ile Leu Thr Asn Pro

100 105 110

Val Leu Val Lys Asp Asn Thr Gly Asn Asn Thr Phe Gly Pro Ile Val

115 120 125

Ala Leu Gly Ala Gln Tyr Ser Leu Trp Arg Ile Arg Tyr Leu Arg Leu

130 135 140

Lys Phe Thr Pro Met Val

145 150

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatctggttc cgcgtggatc catggctagc aagtctggca aa 42

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acccgggaat tccggggatc cctataccat tggtgtaaat ttgaggc 47

Claims (8)

1.一种猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，其特征在于：所述预先包被的ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白作为包被抗原。

2.根据权利要求1所述的猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述猪星状病毒Capside保守区蛋白由序列表SEQ.ID.No.1的基因碱基序列编码或者具有SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于还包括标准阴性血清、标准阳性血清、辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗猪IgG、洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、底物液、终止液。

4.根据权利要求3所述的猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液和稀释液均为PBST洗涤液；所述包被液为PH9.6 Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液；所述封闭液为5％胎牛血清；所述底物液为TMB显色液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

5.根据权利要求4所述的猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：

所述洗涤液和稀释液均为PBST洗涤液，按以下进行配制：将准确称量的8g NaCl、0.2gKCl、2.9g Na₂HPO₄.12H2O和0.2g KH₂PO₄充分溶解在800mL去离子水中，然后将pH值调节到7，然后加去离子水定容至1L，再加入500μL Tween-20；

所述包被液为pH9.6 Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，按以下进行配制：将1.59g Na₂CO₃和2.93gNaHCO₃加水充分溶解后，将pH调到9.6后，加去离子水定容为1L，即得；

所述底物液为TMB显色液，包括TMB显色A液和B液，使用前进行1：1配制。

6.根据权利要求1所述的猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述包被抗原按以下方法进行制备：根据猪星状病毒全长感染性克隆质粒为模板，利用设计合成的特异性引物对猪星状病毒I型Capsid基因保守区进行PCR扩增，并将目的基因回收连接到pGEX-4T-1质粒中，经鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况；亲和层析法分离纯化得到目的蛋白pGEX-4T-1-cap-1蛋白。

7.根据权利要求6所述的猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述特异性引物包括序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列。

8.根据权利要求7所述的猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述预先包被的ELISA反应板按以下方法进行制备：取100μl用包被液稀释至工作浓度的包被抗原加入ELISA反应板的反应孔中，37℃包被2h，用100μl封闭液37℃封闭2小时；所述工作浓度为200μg/孔。

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