CN112979768B

CN112979768B - 检测鸡滑液囊支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用

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Publication number: CN112979768B
Application number: CN202110186875.5A
Authority: CN
Inventors: 李书光; 沈志强; 李峰; 程立坤; 苗立中; 杨立芳; 赵家磊
Original assignee: Shandong Lvdu Bio Sicience & Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Lvdu Bio Sicience & Technology Co ltd
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2041-02-08
Also published as: CN112979768A

Abstract

本申请公开了一种检测鸡滑液囊支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用。所述抗原组合物包括第一抗原，所述第一抗原的氨基酸序列包括SEQ IDNo.3所示序列。所述抗原组合物还包括第二抗原，所述第二抗原的氨基酸序列包括SEQ ID No.2所示序列。所述抗原组合物还包括第三抗原，所述第三抗原的氨基酸序列包括SEQ ID No.1所示序列。以本发明的抗原组合物做为ELISA法的包被抗原，对临床样本血清型的检出率明显高于现有的进口试剂盒。

Description

检测鸡滑液囊支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，检测鸡滑液囊支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

滑液囊支原体(别名：滑液支原体)感染最早报道于1954年，发病鸡群主要表现滑膜炎；滑液囊支原体的发病日龄一般在30日龄左右，病鸡出现羽毛蓬乱，精神沉郁，采食量下降，无法站立。有的鸡群在15日龄～20日龄也会发病，应该与母源抗体和垂直传播有关。滑液囊支原体的膜蛋白包含可变表面脂蛋白和血凝素蛋白，具有逃避宿主免疫应答的特性。血凝素蛋白是机体针对滑液囊支原体的主要免疫应答目标，但是滑液囊支原体每次感染过程中会在转录水平上对血凝素蛋白的表达进行调控，严重干扰了机体正常免疫应答效应的发挥，从而实现了免疫逃避。自2010年，南方的三黄鸡出现严重的滑液囊支原体感染后，北方的蛋鸡自2013年以来，也开始大规模出现滑液囊支原体的感染，成为困扰蛋鸡和种鸡的一个重要疾病。为了该病的防控，采取了较多的措施，包括鸡舍条件的改善、抗生素的使用及弱毒活疫苗的免疫等，但是都没有取得理想的效果。

滑液囊支原体抗体的检测方法主要有玻片凝集法和ELISA法等，玻片凝集法相对简单，一般实验室都可以开展这项工作。但是，鸡毒支原体和滑液囊支原体存在一部分共同抗原，使用玻片凝集法时容易出现一定程度的干扰。ELISA检测方法目前有美国爱德士公司和以色列Biogal公司的产品。在实验室应用过程中，国内流行的菌株免疫的SPF鸡，以及国内发病鸡群的血清学调查过程中，使用进口的检测方法抗体阳性率低，不能有效开展疫苗的抗体评价。出现该问题的主要原因，可能是检测试剂盒的包被抗原成分单一，滑液囊支原体在感染免疫逃避过程中某些蛋白表达水平降低，造成目标蛋白的抗体弱，而导致现有商品化试剂盒在检测中出现假阴性的情况。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测鸡滑液囊支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用。本发明利用反向疫苗学技术，筛选滑液囊支原体独有的蛋白，并开展了蛋白的反应原性、反应特异性、有效组合对临床样本的检测试验，形成了一种用于检测滑液囊支原体抗体的有效抗原及组合，该抗原或抗原组合可以用于ELISA等抗体检测的试剂盒中，提高滑液囊支原体的检出率。

一方面，本申请提供了一种用于特异性检测鸡滑液囊支原体抗体的抗原组合物，包括第一抗原，

所述第一抗原的氨基酸序列包括SEQ ID No.3所示序列、或与SEQ ID No.3所示序列的同源性在80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上且功能与SEQ ID No.3所示序列相同或相近的序列。

在上述抗原组合物中，还包括第二抗原，所述第二抗原的氨基酸序列包括SEQ IDNo.2所示序列，或与SEQ ID No.2所示序列的同源性在80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上且功能与SEQ ID No.2所示序列相同或相近的序列；优选的，所述第一抗原和所述第二抗原的质量比为1：(1-3)，更优选，1：(1.5-2.5)，更优选，1：2；

和/或，所述抗原组合物还包括第三抗原，所述第三抗原的氨基酸序列包括SEQ IDNo.1所示序列，或与SEQ ID No.1所示序列的同源性在80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上且功能与SEQ ID No.1所示序列相同或相近的序列，

优选的，所述抗原组合物中所述第一抗原和所述第三抗原的质量比为1：(6-16)，更优选，1：(9-13)，更优选，1：11。

另一方面，本申请提供了一种用于特异性检测鸡滑液囊支原体抗体的抗原，所述抗原为以上所述第一抗原、或权利要求2中所述第二抗原或所述第三抗原。

另一方面，本申请提供了一种多核苷酸，其能够编码以上所述鸡滑液囊支原体抗体的抗原组合物或所述抗原。

在上述多核苷酸中，编码所述第一抗原的多核苷酸序列包括SEQ ID No.6所示序列，或与SEQ ID No.6所示序列的同源性在80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上的序列，或以上序列的互补序列，

优选的，编码所述第二抗原的多核苷酸序列包括SEQ ID No.5所示序列，或与SEQID No.5所示序列的同源性在80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上的序列，或以上序列的互补序列，

编码所述第二抗原的多核苷酸序列包括SEQ ID No.4所示序列，或与SEQ ID No.4所示序列的同源性在80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％以上的序列，或以上序列的互补序列。

另一方面，本申请还提供了含有以上任一所述多核苷酸的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞。

另一方面，本申请还保护以上任一所述抗原组合物、所述抗原、所述多核苷酸、或所述表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞在制备鸡滑液囊支原体检测产品中的应用，

优选的，所述鸡滑液囊支原体检测的方法为ELISA法，也可为其它方法如免疫胶体金法，

优选的，所述鸡滑液囊支原体检测的靶标为鸡滑液囊支原体抗体，所述鸡滑液囊支原体抗体包括多克隆抗体或单克隆抗体，更优选的，所述多克隆抗体来自动物体液，更优选，所述多克隆抗体来自动物血液，更优选，血清。

另一方面，本申请还提供了一种特异性检测鸡滑液囊支原体抗体的ELISA试剂盒，包括包被抗原，所述包被抗原为以上任一所述抗原组合物或所述第一抗原。

在上述试剂盒中，当所述包被抗原为所述第一抗原时，所述第一抗原的包被浓度为0.5-3.5μg/ml，优选，1.5-2.5μg/ml，更优选，2.0μg/ml；

当所述包被抗原包括所述第一抗原和所述第二抗原时，所述第一抗原的包被浓度为0.4-1.0μg/ml，优选，0.5-0.8μg/ml，更优选，0.6-0.7μg/ml，所述第二抗原的包被浓度为0.8-2.0μg/ml，优选，1.0-1.6μg/ml，更优选，1.3-1.4μg/ml，

当所述包被抗原包括所述第一抗原和所述第三抗原时，所述第一抗原的包被浓度为0.5-1.2μg/ml，优选，0.6-1.0μg/ml，更优选，0.8-0.9μg/ml，所述第三抗原的包被浓度为5.5-13.2μg/ml，优选，6.6-11.0μg/ml，更优选，8.8-10.0μg/ml，

当所述包被抗原包括所述第一抗原、所述第二抗原和所述第三抗原时，所述包被抗原中所述第一抗原的包被浓度为0.5-1.5μg/ml，优选，0.8-1.2μg/ml，更优选，1.0μg/ml，所述包被抗原中所述第二抗原的包被浓度为1.0-3.0μg/ml，优选，1.6-2.4μg/ml，更优选，2.0μg/ml，所述包被抗原中所述第三抗原的包被浓度为5.5-16.5μg/ml，优选，8.8-13.2μg/ml，更优选，11.0μg/ml。

在上述试剂盒中，还包括用于固定所述包被抗原的固相载体(一般为聚苯乙烯、或聚氯乙烯材质，如试纸条中的PVC板或ELISA板的反应孔的内壁等)、和/或酶标二抗(所述二抗为葡萄球菌A蛋白或免疫血清IgG，所述免疫血清IgG为免疫球蛋白，所述免疫球蛋白可为兔抗鸡IgG、羊抗鸡IgG、和/或鼠抗鸡IgG；所述酶标二抗使用的标记酶可为辣根过氧化物酶)、和/或包被缓冲液、和/或样品稀释液、和/或封闭液、和/或阳性对照、和/或阴性对照、和/或显色液(TMB)、和/或终止液。

另一方面，本申请还保护以上任一所述抗原组合物、所述第一抗原、所述多核苷酸、所述表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞、或所述试剂盒在特异性检测鸡滑液囊支原体中的应用，

优选的，所述特异性检测鸡滑液囊支原体的方法为ELISA法，也可为其它方法如免疫胶体金法，

优选的，所述特异性检测鸡滑液囊支原体的靶标为鸡滑液囊支原体抗体，所述鸡滑液囊支原体抗体包括多克隆抗体或单克隆抗体，更优选的，所述多克隆抗体包括动物血清。

另一方面，本申请还提供一种特异性检测鸡滑液囊支原体抗体的方法，包括使以上任一所述抗原组合物或所述第一抗原与待测样品中的抗体接触的步骤，

优选的，所述待测样品来自动物的体液，更优选，血液，更优选，血清；

优选的，所述检测的方法包括ELISA，也可为其它方法如免疫胶体金法。

本发明的有益效果：

本发明在研究国内外鸡滑液囊支原体全基因组序列的基础上，筛选到3个共有抗原蛋白，按照计算机预测分析和免疫学相结合的方法，使其按照一定比例混合，可以有效平衡反应原性和敏感性，达到其作为ELISA检测抗原的要求。以本发明的抗原组合物做为ELISA法的包被抗原，对鸡滑液囊支原体流行血清型的检出率明显高于现有的进口试剂盒。

附图说明

图1为原核表达的蛋白的SDS电泳图及western-blot结果，其中，M为蛋白Marker，K为pET-30a空载体菌株，1-3:分别为3540.1、1919.1和2050.1蛋白的超声破碎沉淀，4-6：分别为3540.1、1919.1和2050.1蛋白的western-blot结果。

图2为三种抗原蛋白的反应原性分析结果。

图3为四种抗原组合的反应原性分析结果。

具体实施方式

实施例1、鸡滑液囊支原体特异性抗原蛋白的获得

1.1鸡滑液囊支原体不同毒株全基因序列的获得

从美国国立生物技术信息中心(NCBI)中找到具有代表性的编号53的鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)毒株的全基因序列。

1.2抗原蛋白的计算机预测分析

使用在线生物学软件PSORTb、Vaxign 2Beta、BLASTp等分析不同鸡滑液囊支原体毒株的蛋白定位、跨膜区、抗原参数和同源性比对，得到如下候选鸡滑液囊支原体特异性抗原蛋白3540.1、1919.1和2050.1。

1.3候选鸡滑液囊支原体特异性抗原蛋白的密码子优化和表达载体的构建

使用DNAstar软件分析候选鸡滑液囊支原体特异性抗原蛋白是否含有TGA的密码子，将TGA的密码子修改为TGG后，进一步使用在线的密码子优化软件进行密码子的优化、密码子使用频率分析、大肠杆菌表达适应性参数预测等，优化后的基因序列合成并连接至载体pET-30a获得重组载体(原核表达载体pET-30a+3540.1、pET-30a+1919.1和pET-30a+2050.1)以表达相应的候选鸡滑液囊支原体特异性抗原蛋白，优化后的候选鸡滑液囊支原体特异性抗原蛋白的序列信息如下：

3540.1抗原蛋白：其氨基酸序列(154aa，SEQ ID No.1)如下；

MIKLIVALDPNNLIGKGDQMPKIAEEFKHFKTTTLTHSLLFGRNTFLGLPAKLENRTIYVLSKERVPRADYTLKTEQELFSLFAQFKNDDFNTLFIAGGKTIYEKYYKFADELIISRVKKAYEGDVYLNLDLSHYSLTKVVDYSEFAVEYYTKK；

3540.1抗原蛋白的优化后的核酸序列(465bp，SEQ ID No.4)如下：

ATGATTAAACTAATAGTAGCTTTAGATCCCAACAACCTCATCGGCAAAGGCGACCAGATGCCGAAAATCGCGGAAGAATTTAAGCACTTCAAGACCACTACGCTGACCCATAGCCTTCTGTTCGGCCGTAATACCTTTCTGGGTTTACCGGCAAAACTGGAAAATCGTACCATCTACGTTCTGTCCAAAGAGCGCGTTCCGCGTGCAGACTACACCTTGAAGACCGAACAAGAGCTGTTCAGCTTGTTCGCTCAGTTTAAGAACGATGATTTTAACACCTTGTTCATCGCCGGTGGTAAGACGATTTACGAGAAATACTATAAATTTGCGGACGAGCTGATTATTAGCCGCGTGAAAAAGGCGTATGAGGGTGACGTTTATCTGAATCTGGATCTGAGCCACTATTCGTTGACGAAGGTCGTGGATTACTCTGAGTTCGCGGTGGAATATTACACCAAAAAGTAA；

1919.1可变表面脂蛋白：其氨基酸序列(230aa，SEQ ID No.2)如下：

YETFRSAVATQGVVLQGPGQFTSNKQIYHKFAMSIGSTAGYTHNYIESVEGTINFNFSQYSGFNFKASTNKSDRNNYNRSGFLTFGLGLNGLGRKYRTNYTSDQIFLGFGSFKNGLAKSNVTLKSRFDIKSIDTTNDASIQAAIDKIKNDTSNWKLLLLQQSDSSKTQEFTDFQTVVKNAASQNSSEIIYGGVAESSNSKNPQKSLVVFVKSSNSNPVKADWEKYIFAVL；

1919.1可变表面脂蛋白的优化后的核酸序列(690bp，SEQ ID No.5)如下：

TACGAAACTTTCCGCTCCGCTGTGGCGACTCAAGGCGTGGTTCTGCAGGGTCCGGGTCAATTTACCTCCAACAAGCAGATTTACCATAAATTCGCTATGAGCATCGGCAGCACGGCCGGTTATACCCACAACTACATTGAAAGCGTCGAGGGCACCATTAACTTTAACTTTAGCCAATATTCAGGTTTTAATTTCAAGGCAAGCACCAACAAATCTGATCGTAATAACTACAACCGTAGCGGCTTCTTGACCTTTGGCCTGGGCCTGAACGGCCTTGGCCGTAAATACCGCACCAACTACACCTCGGACCAGATTTTCCTGGGCTTTGGTAGCTTCAAGAACGGTCTAGCGAAGTCCAACGTTACCCTGAAGTCCCGTTTTGATATTAAGTCCATCGACACTACGAATGACGCTAGCATCCAGGCGGCGATTGACAAAATCAAAAACGACACCAGCAACTGGAAACTGCTGTTGTTGCAACAAAGCGATTCTTCCAAGACCCAAGAATTTACTGACTTTCAGACCGTTGTGAAGAACGCCGCGTCCCAAAATAGCAGCGAGATCATCTACGGTGGTGTGGCCGAAAGCTCTAACTCCAAGAACCCACAGAAATCACTTGTTGTCTTTGTAAAAAGCTCTAACAGCAATCCGGTCAAAGCGGATTGGGAAAAATATATCTTCGCCGTGCTC；

2050.1可变表面脂蛋白：其氨基酸序列(362aa，SEQ ID No.3)如下：

EIDFSKVTGGFKYTKNSVGDEPAKEITVNSAQELAKIMTNAYASTENQDKQIKFAKNSLFYQYKDLTNEKVTVTNDANKQKLQVSRIVANFVSLGYPISKDDLGNLRAEFPAKYAGPEGKLLAENDSSLWTNKPQKGRNFYQEFGNRLNRSMILRNFVQYPGIYDLFITNPVINKGVGFNIKQIKDKTSSYQQGNYLNYGLAYSLESWRPAPGASGSSLRDLNNEVLGINFAIRAGAGSGTSLIQAFRSEGANYGGVYGSYNLPQYDLIYGGGKDQRTSYREALAKILKNGETTNLFTSGVNVIPEEYKFRTNALINFTNSSNPEEAGLITNTGGGAQALTDQNKKYGSTITNPVVLPEGTS；

2050.1蛋白的优化后的基因序列(1089bp，SEQ ID No.6)如下；

GAAATCGACTTCAGCAAAGTTACCGGAGGCTTCAAATACACCAAAAACAGCGTTGGTGATGAACCGGCCAAAGAGATTACGGTTAACAGCGCCCAAGAACTGGCGAAAATCATGACCAACGCATACGCAAGCACTGAAAACCAGGATAAGCAGATCAAATTTGCAAAGAACTCGCTTTTTTACCAGTATAAGGACCTGACCAATGAGAAAGTGACGGTGACGAACGACGCGAATAAACAAAAACTGCAAGTAAGCCGTATTGTTGCAAATTTCGTGAGCCTGGGTTATCCCATCTCCAAAGACGACCTCGGCAATCTGCGTGCTGAATTTCCGGCGAAGTACGCGGGTCCGGAGGGCAAATTGCTGGCGGAAAACGACAGCAGCCTGTGGACCAACAAACCGCAGAAGGGTCGCAACTTCTATCAAGAGTTCGGCAACCGCCTGAATCGTAGCATGATTCTGCGCAATTTCGTCCAGTACCCGGGTATTTACGACTTGTTTATCACCAACCCGGTCATCAACAAGGGTGTGGGTTTCAATATTAAGCAGATTAAGGACAAGACCTCGAGCTATCAGCAAGGTAACTACCTGAACTACGGCCTGGCGTATTCGCTGGAAAGCTGGCGCCCGGCGCCTGGTGCTTCCGGTTCTTCCCTGCGTGATTTGAATAACGAGGTGCTTGGCATCAACTTCGCTATTAGAGCAGGTGCCGGTAGCGGCACTTCGTTAATTCAGGCGTTTCGTAGCGAAGGTGCGAATTATGGCGGCGTTTATGGTAGCTACAACCTGCCGCAATACGATTTGATCTACGGTGGCGGTAAAGACCAGCGTACAAGCTATCGCGAAGCTTTAGCTAAGATCCTGAAGAACGGTGAGACAACCAATCTGTTCACTTCTGGCGTCAACGTGATCCCGGAAGAGTACAAATTCCGCACCAACGCACTGATTAATTTTACCAATAGCTCTAATCCGGAGGAGGCGGGTTTGATCACCAACACCGGTGGTGGTGCGCAGGCGCTGACGGACCAAAATAAGAAATACGGCAGCACCATTACCAATCCGGTTGTTCTGCCGGAAGGCACTTCCTAA。

1.4抗原蛋白的表达和纯化

将步骤1.3中的重组载体分别转入表达宿主菌BL21，挑取阳性菌落，接种含Kan抗生素的LB培养基，使用IPTG诱导后，超声破碎，SDS电泳和Western-blot分析目标蛋白的表达含量及可溶性。使用商品化的HIS标签纯化柱，按照操作说明进行蛋白的纯化。使用考马斯亮蓝法进行蛋白定量后，保存备用。

图1的电泳结果显示，3540.1、1919.1和2050.1蛋白的大小符合预期，分别为20kD、27kD和43kD，在37℃下诱导均为包涵体，灰度分析显示目标蛋白表达量占菌体蛋白的35％，Western-bolt结果显示各蛋白的抗原性方面也符合预期。

实施例2、不同鸡滑液囊支原体特异性抗原蛋白的反应原性分析

将实施例1步骤1.4得到的纯化后的抗原蛋白分别按照32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25μg/mL的梯度包被ELISA板的反应孔。

使用鸡滑液囊支原体CVCC385(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，http://cvccinfo.ivdc.org.cn/web/shopcart/ProductsSetting_Virus_Detail.aspx？id＝CVCC385)的发酵培养物灭活后免疫30日龄的SPF鸡，45日龄强化免疫一次，在70日龄采集血样作为阳性血清备用，进行其反应原性的研究，以未免疫的SPF鸡血清为阴性对照。

缓冲液的制备：

包被缓冲液(pH9.6碳酸盐缓冲液)：1.59g的碳酸钠，2.93g的碳酸氢钠，使用超纯水定容至1000ml，pH计确认其pH值为9.6，0.44μm膜过滤后备用。

洗涤缓冲液：称取8.0g氯化钠，0.2g磷酸二氢钾，6.29g十二水磷酸氢二钠，超纯水定容至1000ml，加入0.5ml吐温-20，调节pH值为7.2，使用0.44μm的膜过滤后，保存备用。

封闭液：使用洗涤缓冲液配制0.8％的牛血清白蛋白，过滤除菌后作为封闭液。

样品稀释液：与封闭液相同。

阳性血清：纯化的蛋白免疫新西兰白兔制备。

阴性对照：未免疫抗原蛋白的健康新西兰白兔血清。

酶标二抗：HRP标记的葡萄球菌A蛋白，使用时用封闭液做1:5000的稀释使用。

终止液：1M的硫酸。

实验流程

1、使用包被缓冲液，将实施例1表达纯化备用的3个蛋白分别稀释至32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25μg/ml，按照每孔100μl加入ELISA反应板中，4℃过夜。

2、甩干弃掉包被缓冲液，每孔加入150μl洗涤缓冲液，震荡2min，甩干；重复洗涤3次。

3、加入封闭缓冲液，每孔200μl，封闭1小时。

4、使用洗涤缓冲液，每孔200μl，震荡2min，甩干；重复洗涤3次。

5、加入制备的阳性血清(使用封闭缓冲液1:100稀释)，每孔100μl，设置8个重复，37℃反应30min。

6、使用洗涤缓冲液，每孔200μl，震荡2min，甩干；重复洗涤3次。

7、加入使用封闭缓冲液1:5000稀释的酶标二抗，每孔100μl，37℃反应30min。

8、使用洗涤缓冲液，每孔200μl，震荡2min，甩干；重复洗涤3次。

9、加入TMB显色液，每孔100μl，室温避光反应15min。

10、加入终止液，每孔50μl，使用酶标仪测定OD450的数值。

结果：不同特异性包被抗原在不同包被浓度下的OD450值如表1、表2和表3所示。根据包被抗原浓度和OD450平均值，使用GraphPAD prism作图如图2所示。

结果表明，通过在图2中绘制OD450＝1.0的水平线，对应的3540.1、1919.1和2050.1三个蛋白的最佳包被浓度分别为22、4和2μg/mL。

表1、3540.1抗原蛋白的反应原性

表2、1919.1抗原蛋白的反应原性

表3、2050.1抗原蛋白的反应原性

实施例3、不同鸡滑液囊支原体特异性抗原蛋白的组合与优化

一、不同鸡滑液囊支原体特异性抗原蛋白的组合配比确定

根据实施例2中各抗原蛋白的OD450值反应原性比较中，3540.1、1919.1和2050.1在OD450值为1时，包被浓度分别约为22、4和2μg/mL，因此设如下包被抗原组合及其抗原的质量比：

组合一：3540.1和1919.1的质量比为11:2；

组合二：1919.1和2050.1的质量比为2:1；

组合三：3540.1和2050.1的质量比为11:1；

组合四：3540.1、1919.1和2050.1的质量比为11:2:1。

二、鸡滑液囊支原体特异性抗原蛋白的组合的最佳包被浓度筛选

在步骤一中组合的总包被浓度分别设为32.0、16.0、8.0、4.0、2.0μg/ml的梯度并按照实施例2的方法进行包被和ELISA检测，测定抗原组合的最佳包被浓度，结果如表4、表5、表6、表7所示。根据包被抗原浓度和OD450平均值，使用GraphPAD prism作图如图3所示。

结果表明，通过在图3中绘制OD450＝1.0的水平线，组合一、二、三、四的最佳包被浓度分别为11、2、10、14μg/mL。

表4、组合一3540.1和1919.1的质量比为11:2的检测结果

表5、组合二1919.1和2050.1的质量比为2:1的检测结果

表6、组合三3540.1和2050.1的质量比为11:1的检测结果

表7、组合四3540.1、1919.1和2050.1的质量比为11:2:1的检测结果

实施例4、鸡滑液囊支原体特异性抗原蛋白的反应特异性分析

1、临界值的确定

采集20日龄的SPF鸡血清60份，作为阴性血清。

分别使用蛋白3540.1、1919.1和2050.1，以及组合一至四的最佳的包被抗原浓度进行包被，按照实施例2的方法检测60份阴性血清的OD450值。

计算临界值＝OD450平均值(X)+3×标准方差(S)。当待测样本OD450平均值<临界值时，结果判定为阴性，当待测样本OD450平均值≥临界值时，结果判定为阳性。

结果：3540.1、1919.1和2050.1三个蛋白，以及组合一至四获得的临界值结果分别为：0.313、0.307、0.295、0.314、0.326、0.338、0.324。

2、不同阳性血清的制备

使用病原鸡毒支原体(CVCC1651)、火鸡支原体(CVCC366)、鸡巴氏杆菌(CVCC482)、金黄色葡萄球菌(CVCC1882)、大肠杆菌(YZU0258、CAU0768)的培养物灭活产物，分别配制油乳剂灭活疫苗，免疫SPF鸡制备阳性血清。

3、特异性检测

分别使用蛋白3540.1、1919.1和2050.1，以及组合一至四的最佳的包被抗原浓度进行包被，按照实施例2的方法检测步骤2中的阳性血清。

结果：上述7个不同抗原包被的ELISA反应中，特异性检测试验数值均在0.3以下，小于临界值，证实上述7个不同包被抗原的特异性均较好。

实施例5、最佳包被抗原筛选

用滑液囊支原体(CVCC385)发酵培养物制备油乳剂灭活疫苗，免疫100只30日龄的SPF鸡，45日龄强化免疫一次，在70日龄采集血样作为待检血清1备用。

用市场购买的澳大利亚的鸡滑液囊支原体活疫苗株MS-H免疫100只20日龄SPF鸡一次，在60日龄采集血样作为待检血清2备用。

使用蛋白3540.1、1919.1和2050.1，以及组合一至四的最佳的包被抗原浓度进行包被，按照实施例2的方法检测100份待检血清1和100份待检血清2，结果如表8所示。3540.1蛋白单独包被时检出率较低，但是在与1919.1蛋白和2050.1蛋白组合后，能够有效的提升检出率(组合一、组合三和组合四)，组合四的针对待检血清1的阳性检出率明显高于其它组，以上结果表明，组合四的阳性检出率最高，可以作为抗原组合的最优选择。

表8、各包被抗原的检测结果

实施例6、盲样检测

1、待测样品

实施例5中的100份待检血清1和100份待检血清2(疫苗免疫样本)，以及300份临床样本。

2、使用组合四(3540.1、1919.1和2050.1的质量比为11:2:1)的最佳包被浓度14μg/mL包被ELISA板，按照实施例2的方法检测步骤1的待测样品(临界值在实施例4中已经确定为0.324)

3、使用商品化的滑液囊支原体ELISA检测试剂盒(爱德士)检测步骤1的待测样品。

结果如表9所示。

表9、盲样检测结果

不同包被抗原	疫苗免疫样本	临床样本	平均阳性率
				商品化试剂盒	62.5％	52.3％	56.4％
组合四	85％	62.7％	71.6％

表9结果表明，组合四对鸡滑液囊支原体抗体的阳性检出率明显高于对照商品化试剂盒。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东绿都生物科技有限公司

<120> 检测鸡滑液囊支原体抗体的抗原组合物、试剂盒及其应用

<130> JN-CNP202124

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 154

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ile Lys Leu Ile Val Ala Leu Asp Pro Asn Asn Leu Ile Gly Lys

1 5 10 15

Gly Asp Gln Met Pro Lys Ile Ala Glu Glu Phe Lys His Phe Lys Thr

20 25 30

Thr Thr Leu Thr His Ser Leu Leu Phe Gly Arg Asn Thr Phe Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Ala Lys Leu Glu Asn Arg Thr Ile Tyr Val Leu Ser Lys Glu

50 55 60

Arg Val Pro Arg Ala Asp Tyr Thr Leu Lys Thr Glu Gln Glu Leu Phe

65 70 75 80

Ser Leu Phe Ala Gln Phe Lys Asn Asp Asp Phe Asn Thr Leu Phe Ile

85 90 95

Ala Gly Gly Lys Thr Ile Tyr Glu Lys Tyr Tyr Lys Phe Ala Asp Glu

100 105 110

Leu Ile Ile Ser Arg Val Lys Lys Ala Tyr Glu Gly Asp Val Tyr Leu

115 120 125

Asn Leu Asp Leu Ser His Tyr Ser Leu Thr Lys Val Val Asp Tyr Ser

130 135 140

Glu Phe Ala Val Glu Tyr Tyr Thr Lys Lys

145 150

<210> 2

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Tyr Glu Thr Phe Arg Ser Ala Val Ala Thr Gln Gly Val Val Leu Gln

1 5 10 15

Gly Pro Gly Gln Phe Thr Ser Asn Lys Gln Ile Tyr His Lys Phe Ala

20 25 30

Met Ser Ile Gly Ser Thr Ala Gly Tyr Thr His Asn Tyr Ile Glu Ser

35 40 45

Val Glu Gly Thr Ile Asn Phe Asn Phe Ser Gln Tyr Ser Gly Phe Asn

50 55 60

Phe Lys Ala Ser Thr Asn Lys Ser Asp Arg Asn Asn Tyr Asn Arg Ser

65 70 75 80

Gly Phe Leu Thr Phe Gly Leu Gly Leu Asn Gly Leu Gly Arg Lys Tyr

85 90 95

Arg Thr Asn Tyr Thr Ser Asp Gln Ile Phe Leu Gly Phe Gly Ser Phe

100 105 110

Lys Asn Gly Leu Ala Lys Ser Asn Val Thr Leu Lys Ser Arg Phe Asp

115 120 125

Ile Lys Ser Ile Asp Thr Thr Asn Asp Ala Ser Ile Gln Ala Ala Ile

130 135 140

Asp Lys Ile Lys Asn Asp Thr Ser Asn Trp Lys Leu Leu Leu Leu Gln

145 150 155 160

Gln Ser Asp Ser Ser Lys Thr Gln Glu Phe Thr Asp Phe Gln Thr Val

165 170 175

Val Lys Asn Ala Ala Ser Gln Asn Ser Ser Glu Ile Ile Tyr Gly Gly

180 185 190

Val Ala Glu Ser Ser Asn Ser Lys Asn Pro Gln Lys Ser Leu Val Val

195 200 205

Phe Val Lys Ser Ser Asn Ser Asn Pro Val Lys Ala Asp Trp Glu Lys

210 215 220

Tyr Ile Phe Ala Val Leu

225 230

<210> 3

<211> 362

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Glu Ile Asp Phe Ser Lys Val Thr Gly Gly Phe Lys Tyr Thr Lys Asn

1 5 10 15

Ser Val Gly Asp Glu Pro Ala Lys Glu Ile Thr Val Asn Ser Ala Gln

20 25 30

Glu Leu Ala Lys Ile Met Thr Asn Ala Tyr Ala Ser Thr Glu Asn Gln

35 40 45

Asp Lys Gln Ile Lys Phe Ala Lys Asn Ser Leu Phe Tyr Gln Tyr Lys

50 55 60

Asp Leu Thr Asn Glu Lys Val Thr Val Thr Asn Asp Ala Asn Lys Gln

65 70 75 80

Lys Leu Gln Val Ser Arg Ile Val Ala Asn Phe Val Ser Leu Gly Tyr

85 90 95

Pro Ile Ser Lys Asp Asp Leu Gly Asn Leu Arg Ala Glu Phe Pro Ala

100 105 110

Lys Tyr Ala Gly Pro Glu Gly Lys Leu Leu Ala Glu Asn Asp Ser Ser

115 120 125

Leu Trp Thr Asn Lys Pro Gln Lys Gly Arg Asn Phe Tyr Gln Glu Phe

130 135 140

Gly Asn Arg Leu Asn Arg Ser Met Ile Leu Arg Asn Phe Val Gln Tyr

145 150 155 160

Pro Gly Ile Tyr Asp Leu Phe Ile Thr Asn Pro Val Ile Asn Lys Gly

165 170 175

Val Gly Phe Asn Ile Lys Gln Ile Lys Asp Lys Thr Ser Ser Tyr Gln

180 185 190

Gln Gly Asn Tyr Leu Asn Tyr Gly Leu Ala Tyr Ser Leu Glu Ser Trp

195 200 205

Arg Pro Ala Pro Gly Ala Ser Gly Ser Ser Leu Arg Asp Leu Asn Asn

210 215 220

Glu Val Leu Gly Ile Asn Phe Ala Ile Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly

225 230 235 240

Thr Ser Leu Ile Gln Ala Phe Arg Ser Glu Gly Ala Asn Tyr Gly Gly

245 250 255

Val Tyr Gly Ser Tyr Asn Leu Pro Gln Tyr Asp Leu Ile Tyr Gly Gly

260 265 270

Gly Lys Asp Gln Arg Thr Ser Tyr Arg Glu Ala Leu Ala Lys Ile Leu

275 280 285

Lys Asn Gly Glu Thr Thr Asn Leu Phe Thr Ser Gly Val Asn Val Ile

290 295 300

Pro Glu Glu Tyr Lys Phe Arg Thr Asn Ala Leu Ile Asn Phe Thr Asn

305 310 315 320

Ser Ser Asn Pro Glu Glu Ala Gly Leu Ile Thr Asn Thr Gly Gly Gly

325 330 335

Ala Gln Ala Leu Thr Asp Gln Asn Lys Lys Tyr Gly Ser Thr Ile Thr

340 345 350

Asn Pro Val Val Leu Pro Glu Gly Thr Ser

355 360

<210> 4

<211> 465

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgattaaac taatagtagc tttagatccc aacaacctca tcggcaaagg cgaccagatg 60

ccgaaaatcg cggaagaatt taagcacttc aagaccacta cgctgaccca tagccttctg 120

ttcggccgta atacctttct gggtttaccg gcaaaactgg aaaatcgtac catctacgtt 180

ctgtccaaag agcgcgttcc gcgtgcagac tacaccttga agaccgaaca agagctgttc 240

agcttgttcg ctcagtttaa gaacgatgat tttaacacct tgttcatcgc cggtggtaag 300

acgatttacg agaaatacta taaatttgcg gacgagctga ttattagccg cgtgaaaaag 360

gcgtatgagg gtgacgttta tctgaatctg gatctgagcc actattcgtt gacgaaggtc 420

gtggattact ctgagttcgc ggtggaatat tacaccaaaa agtaa 465

<210> 5

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tacgaaactt tccgctccgc tgtggcgact caaggcgtgg ttctgcaggg tccgggtcaa 60

tttacctcca acaagcagat ttaccataaa ttcgctatga gcatcggcag cacggccggt 120

tatacccaca actacattga aagcgtcgag ggcaccatta actttaactt tagccaatat 180

tcaggtttta atttcaaggc aagcaccaac aaatctgatc gtaataacta caaccgtagc 240

ggcttcttga cctttggcct gggcctgaac ggccttggcc gtaaataccg caccaactac 300

acctcggacc agattttcct gggctttggt agcttcaaga acggtctagc gaagtccaac 360

gttaccctga agtcccgttt tgatattaag tccatcgaca ctacgaatga cgctagcatc 420

caggcggcga ttgacaaaat caaaaacgac accagcaact ggaaactgct gttgttgcaa 480

caaagcgatt cttccaagac ccaagaattt actgactttc agaccgttgt gaagaacgcc 540

gcgtcccaaa atagcagcga gatcatctac ggtggtgtgg ccgaaagctc taactccaag 600

aacccacaga aatcacttgt tgtctttgta aaaagctcta acagcaatcc ggtcaaagcg 660

gattgggaaa aatatatctt cgccgtgctc 690

<210> 6

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaaatcgact tcagcaaagt taccggaggc ttcaaataca ccaaaaacag cgttggtgat 60

gaaccggcca aagagattac ggttaacagc gcccaagaac tggcgaaaat catgaccaac 120

gcatacgcaa gcactgaaaa ccaggataag cagatcaaat ttgcaaagaa ctcgcttttt 180

taccagtata aggacctgac caatgagaaa gtgacggtga cgaacgacgc gaataaacaa 240

aaactgcaag taagccgtat tgttgcaaat ttcgtgagcc tgggttatcc catctccaaa 300

gacgacctcg gcaatctgcg tgctgaattt ccggcgaagt acgcgggtcc ggagggcaaa 360

ttgctggcgg aaaacgacag cagcctgtgg accaacaaac cgcagaaggg tcgcaacttc 420

tatcaagagt tcggcaaccg cctgaatcgt agcatgattc tgcgcaattt cgtccagtac 480

ccgggtattt acgacttgtt tatcaccaac ccggtcatca acaagggtgt gggtttcaat 540

attaagcaga ttaaggacaa gacctcgagc tatcagcaag gtaactacct gaactacggc 600

ctggcgtatt cgctggaaag ctggcgcccg gcgcctggtg cttccggttc ttccctgcgt 660

gatttgaata acgaggtgct tggcatcaac ttcgctatta gagcaggtgc cggtagcggc 720

acttcgttaa ttcaggcgtt tcgtagcgaa ggtgcgaatt atggcggcgt ttatggtagc 780

tacaacctgc cgcaatacga tttgatctac ggtggcggta aagaccagcg tacaagctat 840

cgcgaagctt tagctaagat cctgaagaac ggtgagacaa ccaatctgtt cacttctggc 900

gtcaacgtga tcccggaaga gtacaaattc cgcaccaacg cactgattaa ttttaccaat 960

agctctaatc cggaggaggc gggtttgatc accaacaccg gtggtggtgc gcaggcgctg 1020

acggaccaaa ataagaaata cggcagcacc attaccaatc cggttgttct gccggaaggc 1080

acttcctaa 1089

Claims

1.一种用于特异性检测鸡滑液囊支原体抗体的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物包括第一抗原，所述第一抗原的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示序列。

2.根据权利要求1所述的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物还包括第二抗原，所述第二抗原的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示序列。

3.根据权利要求2所述的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物中所述第一抗原和所述第二抗原的质量比为1：（1-3）。

4.根据权利要求3所述的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物中所述第一抗原和所述第二抗原的质量比为1：（1.5-2.5）。

5.根据权利要求4所述的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物中所述第一抗原和所述第二抗原的质量比为1：2。

6.根据权利要求1所述的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物还包括第三抗原，所述第三抗原的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示序列。

7.根据权利要求6所述的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物中所述第一抗原和所述第三抗原的质量比为1：（6-16）。

8.根据权利要求7所述的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物中所述第一抗原和所述第三抗原的质量比为1：（9-13）。

9.根据权利要求8所述的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物中所述第一抗原和所述第三抗原的质量比为1：11。

10.一种用于特异性检测鸡滑液囊支原体抗体的抗原，其特征在于，所述抗原为权利要求1中所述第一抗原、或权利要求2-5中任一所述第二抗原、或权利要求6-9中任一所述第三抗原。

11.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸能够编码权利要求1-9中任一所述抗原组合物或权利要求10所述抗原。

12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述第一抗原的多核苷酸序列为SEQ ID No.6所示序列。

13.根据权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述第二抗原的多核苷酸序列为SEQ ID No.5所示序列。

14.根据权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述第三抗原的多核苷酸序列为SEQ ID No.4所示序列。

15.含有权利要求11-14中任一所述多核苷酸的表达盒、重组载体、重组菌、或重组细胞。

16.权利要求1-9中任一所述抗原组合物、权利要求10所述抗原、权利要求11-14中任一所述多核苷酸、或权利要求15所述表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞在制备鸡滑液囊支原体检测产品中的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述鸡滑液囊支原体检测的方法为ELISA法或免疫胶体金法。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述鸡滑液囊支原体检测的靶标为鸡滑液囊支原体抗体，所述鸡滑液囊支原体抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体来自动物的体液。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体来自动物的血液。

21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体来自动物的血清。

22.一种特异性检测鸡滑液囊支原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被抗原，所述包被抗原为权利要求1-9中任一所述抗原组合物或权利要求10所述抗原。

23.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，当所述包被抗原为权利要求10所述抗原时，所述第一抗原的包被浓度为0.5-3.5μg/ml。

24.根据权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗原的包被浓度为1.5-2.5μg/ml。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗原的包被浓度为2.0μg/ml。

26.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，当所述包被抗原包括所述第一抗原和所述第二抗原时，所述第一抗原的包被浓度为0.4-1.0μg/ml，所述第二抗原的包被浓度为0.8-2.0μg/ml。

27.根据权利要求26所述的试剂盒，其特征在于，当所述包被抗原包括所述第一抗原和所述第二抗原时，所述第一抗原的包被浓度为0.5-0.8μg/ml，所述第二抗原的包被浓度为1.0-1.6μg/ml。

28.根据权利要求27所述的试剂盒，其特征在于，当所述包被抗原包括所述第一抗原和所述第二抗原时，所述第一抗原的包被浓度为0.6-0.7μg/ml，所述第二抗原的包被浓度为1.3-1.4μg/ml。

29.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，当所述包被抗原包括所述第一抗原和所述第三抗原时，所述第一抗原的包被浓度为0.5-1.2μg/ml，所述第三抗原的包被浓度为5.5-13.2μg/ml。

30.根据权利要求29所述的试剂盒，其特征在于，当所述包被抗原包括所述第一抗原和所述第三抗原时，所述第一抗原的包被浓度为0.6-1.0μg/ml，所述第三抗原的包被浓度为6.6-11.0μg/ml。

31.根据权利要求30所述的试剂盒，其特征在于，当所述包被抗原包括所述第一抗原和所述第三抗原时，所述第一抗原的包被浓度为0.8-0.9μg/ml，所述第三抗原的包被浓度为8.8-10.0μg/ml。

32.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，当所述包被抗原包括所述第一抗原、所述第二抗原和所述第三抗原时，所述包被抗原中所述第一抗原的包被浓度为0.5-1.5μg/ml，所述包被抗原中所述第二抗原的包被浓度为1.0-3.0μg/ml，所述包被抗原中所述第三抗原的包被浓度为5.5-16.5μg/ml。

33.根据权利要求32所述的试剂盒，其特征在于，当所述包被抗原包括所述第一抗原、所述第二抗原和所述第三抗原时，所述包被抗原中所述第一抗原的包被浓度为0.8-1.2μg/ml，所述包被抗原中所述第二抗原的包被浓度为1.6-2.4μg/ml，所述包被抗原中所述第三抗原的包被浓度为8.8-13.2μg/ml。

34.根据权利要求33所述的试剂盒，其特征在于，当所述包被抗原包括所述第一抗原、所述第二抗原和所述第三抗原时，所述包被抗原中所述第一抗原的包被浓度为1.0μg/ml，所述包被抗原中所述第二抗原的包被浓度为2.0μg/ml，所述包被抗原中所述第三抗原的包被浓度为11.0μg/ml。

35.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于固定所述包被抗原的固相载体、和/或酶标二抗、和/或包被缓冲液、和/或样品稀释液、和/或封闭液、和/或阳性对照、和/或阴性对照、和/或显色液、和/或终止液。

36.权利要求1-9中任一所述抗原组合物、权利要求10所述抗原、权利要求11-14中任一所述多核苷酸、权利要求15所述表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞、或权利要求22-35中任一所述试剂盒在制备特异性检测鸡滑液囊支原体的产品中的应用。

37.根据权利要求36所述的应用，其特征在于，所述鸡滑液囊支原体检测的方法为ELISA法。

38.根据权利要求37所述的应用，其特征在于，所述鸡滑液囊支原体检测的靶标为鸡滑液囊支原体抗体，所述鸡滑液囊支原体抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

39.根据权利要求38所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体来自动物的体液。

40.根据权利要求39所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体来自动物的血液。

41.根据权利要求40所述的应用，其特征在于，所述多克隆抗体来自动物的血清。