CN111537714B - 一种用于检测鸡滑液囊支原体的冻干血凝抑制试验抗原及抗原组合、制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽医诊断技术领域，具体涉及一种用于检测鸡滑液囊支原体(MS)的冻干血凝抑制试验抗原及抗原组合、制备方法。所述MS的冻干血凝抑制试验抗原是选取滑液囊支原体CCTCC No.M 20191100菌株，经过种子液培养、扩大培养、灭活、浓缩和冷冻干燥而制成。本发明还公开了其与鸡毒支原体(MG)血凝抑制试验抗原的组合。本发明提供的血凝抑制试验抗原及其组合，性质稳定，易于保存。利用该抗原建立的HI检测方法，操作简单快捷，成本低廉，具有良好的敏感性和特异性。

Description

一种用于检测鸡滑液囊支原体的冻干血凝抑制试验抗原及抗原组合、制备方法
技术领域
本发明属于兽医诊断技术领域，具体涉及一种用于检测鸡滑液囊支原体的冻干血凝抑制试验抗原及抗原组合、制备方法。
背景技术
滑液囊支原体(Mycoplasma Synoviae，MS)和鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum，MG)是严重危害养鸡业的两种最为常见的致病性支原体。MS感染可引起以关节渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎为特征的急性或慢性传染病，其严重影响蛋鸡、肉鸡的生产性能，给养殖业带来严重损失。MG感染鸡所导致的疾病通常被称之为慢性呼吸道病(Chronic respiratory disease，CRD)，感染鸡可能无明显临床表现，也可出现不同程度的呼吸窘迫，伴有轻微到明显的啰音、呼吸困难、咳嗽和喷嚏，MG感染鸡可导致饲料转化率低和增重下降，肉鸡感染后在屠宰的过程中会导致胴体废弃率增加，产蛋鸡感染后可能导致无法达到产蛋高峰，且全程产蛋率低于正常水平。
目前已经商品化的MS和MG抗体检测方法包括血清平板凝集试验(Serum plateagglutination test，SPAT)以及酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)。SPAT使用方便，适合在现场进行操作，不需要专门的仪器设备，但在特异性方面与不同禽源支原体抗体之间存在一定程度的交叉反应。ELISA方法可以同时检测大量的样品，并且具有特异性高、敏感性强、结果可以量化等优势，但现有试剂盒价格昂贵，检测成本较高。MS和MG均具有凝集禽类红细胞的能力，血清中的特异性抗体可对其产生抑制作用，故可以使用血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test，HI)检测血清中的MS和MG特异性抗体水平，从而达到监测MS和MG感染的目的。与SPAT和ELISA方法相比，HI试验特异性更佳，且操作简便，价格便宜，适用于养殖一线使用，但常规HI抗原长期保存的稳定性仍不理想，因此目前国内外市面上尚未见有MS和MG血凝抑制试验抗原商品化供应，一般均由各检测实验室现做现用，无法实现方法的标准化和大规模推广应用，限制了该方法在临床上的推广应用。因此，建立一种标准化的、适合长期稳定保存的MS和MG血凝抑制试验抗原制备方法，并应用于MS和MG感染的监测和疾病净化，将对这两种病原感染的控制具有重要的意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种MS和MG血凝抑制试验抗原及其制备方法，解决当前这两种抗原稳定性差、不能长期保存的问题。发明的抗原为临床进行MS和MG感染监测或免疫抗体监测提供了新的选择，与现有SPAT和ELISA方法相比具有特异性强、操作简便、检测成本低廉的优点。
本发明以本实验室分离鉴定的MS流行株JS2018-4株和MG标准株R株为制备用种毒，通过大量培养、对抗原灭活方法、冻干保护剂和冻干技术参数进行了筛选和优化，制备出了稳定性好、特异性强的MS和MG血凝抑制试验抗原。
本发明同时提供了使用研制的血凝抑制试验抗原检测MS和MG特异性抗体的HA试验和HI试验的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用于检测鸡滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原，是选取滑液囊支原体CCTCC No.M 20191100菌株，经过种子液培养、扩大培养、灭活、浓缩和冷冻干燥而制成。
一种用于检测鸡滑液囊支原体和鸡毒支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原组合，包括上述用于检测鸡滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原和用于检测鸡毒支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原。所述用于检测鸡毒支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原，是选取鸡毒支原体CVCC1651菌株，经过种子液培养、扩大培养、灭活、浓缩和冷冻干燥而制成。
MS和MG血凝抑制试验抗原，是分别选取MS流行株JS2018-4株(CCTCCNo.M20191100)和MG标准菌株R株(CVCC1651)，经过种子液培养、扩大培养、灭活、浓缩和冷冻干燥而制成。
MS和MG血凝抑制试验抗原的制备方法，是选取MS流行株JS2018-4株(CCTCCNo.M20191100)和MG标准菌株R株(CVCC1651)，通过对抗原灭活方法、冻干保护剂和冻干技术参数进行了筛选、优化和组合而成。
本发明还公开了一种用于检测鸡滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取滑液囊支原体CCTCC No.M 20191100菌株，使用改良Frey’s液体培养基进行逐级扩大培养，收获24h～36h培养液；
所述改良Frey’s液体培养基配方以及配制方法如下：支原体肉汤基础培养基25.5g/L、葡萄糖3.3g/L、辅酶Ⅰ100mg/L、精氨酸400mg/L、半胱氨酸100mg/L、酚红指示剂0.02％，将各组份加入超纯水中，pH调至7.8；使用0.22μm细菌滤器过滤除菌，加入15％猪血清即可；
(2)对收获的培养液进行灭活，灭活剂为β-丙内酯，添加比例为1:2000～1:4000，灭活条件为：先4℃放置8h～24h，然后37℃放置2h；
(3)浓缩：先使用切向流方式Vivaflow 50对灭活菌液进行超滤浓缩，然后在10000×g离心1h沉淀菌体，pH7.4PBS重悬，重复该步骤2～3次，用pH7.4PBS重悬菌体，根据具体浓度调整至合适的体积，获得抗原悬浮液；
(4)冷冻干燥：使用冻干保护剂各组分的浓度为：D-甘露醇5％，蔗糖5％，配制所使用的溶剂为超纯水，经高压灭菌备用；添加比例为：保护剂:抗原悬浮液＝1:1。
一种用于检测鸡滑液囊支原体和鸡毒支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原组合的制备方法，具体包括以下制备步骤：
(1)分别培养MS流行株JS2018-4株(CCTCC No.M 20191100)和MG标准菌株R株(CVCC1651)，获得菌液；
(2)对菌液进行灭活，灭活剂为β-丙内酯，添加比例按体积比为1:2000～1:4000，灭活条件为：先4℃放置8h～24h，然后37℃放置2h；
(3)浓缩：灭活后的菌液经过滤去除杂质，然后进行切向流超滤浓缩，然后在10000×g离心1h沉淀菌体，pH7.4PBS重悬，重复该步骤2～3次，用pH7.4PBS重悬菌体，根据具体浓度调整至合适的体积，得抗原悬浮液；
(4)冷冻干燥：使用优选的的冻干保护剂各组分的浓度为：D-甘露醇5％，蔗糖5％，配制所使用的溶剂为超纯水，经高压灭菌备用；添加比例为：保护剂:抗原悬浮液＝1:1；分别冷冻干燥得到用于检测鸡滑液囊支原体和鸡毒支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原。本发明还公开了MS和MG血凝抑制试验抗原的应用，采用相应抗原进行血凝抑制试验(HI)，判定标准为：HI效价≥1:80判为阳性；1:40≤HI效价＜1:80判定为疑似阳性；HI效价＜1:40判定为阴性。
本发明使用的MS分离株JS2018-4为本实验室从感染MS并发生典型传染性滑膜炎的鸡场分离获得，菌种已在中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏编号为：CCTCC M 20191100。本发明所使用的MG为标准株R株，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CVCC1651。
本发明通过对甲醛灭活和β-丙内酯灭活的效果进行了比较，结果显示甲醛灭活效果良好，但易导致蛋白变性，从而破坏抗原性，致使血凝效价降低；使用β-丙内酯进行灭活，灭活彻底、作用时间快、不破坏抗原性且灭活剂可水解无残留。
在步骤(4)中，为保证制备的抗原能够长期稳定保存，选用真空冷冻干燥的方法。关于冻干保护剂的使用，在本发明的研究中，从含有不同比例和成分的保护剂(例如明胶、基础培养基、甘氨酸、以及尿素等)中，筛选出冻干成品物理状态最佳、保护效果最佳的配方和配制方法，即高压灭菌过的含有5％D-甘露醇和5％蔗糖的水溶液。浓缩菌体抗原与保护剂按一定比例混合后先在-70℃条件下进行预冻，之后转移至冷冻干燥机进行冷冻干燥。
本发明对冻干后的抗原成品进行物理性状、血凝效价、特异性、长期保存稳定性进行检验。
HA试验和HI试验方法
(1)使用PBS溶解血凝抗原，测定血凝价，配制4HA单位抗原。
(2)HA试验流程：
①96孔“V”形底血凝板第1孔到第12孔每孔加入25μl PBS。
②第1孔加入25μl溶解的抗原液，吹吸混匀，依次倍比稀释至第11孔，弃掉25μl。
③每孔加入25μl 0.5％鸡红细胞悬浮液，混匀，室温静置1h，读数，以能够使红细胞发生完全凝集的最小抗原量称为1个HA单位。
(3)HI试验流程：
①将待测血清进行5倍稀释，进行HI试验。
②第1孔到第12孔每孔加入25μl PBS。
③第1孔加入稀释好的待测血清吹吸混匀，依次倍比稀释至第10孔，弃掉25μl。
④第1孔到第11孔每孔加入25μl四单位抗原，轻弹混匀。
⑤室温放置15min，每孔加入25μl 0.5％鸡红细胞悬浮液，混匀，室温静置1h，读数。血凝抑制效价(HI效价)为能引起完全血凝抑制的血清最高稀释倍数。
⑥HI试验结果判定：HI效价≥1:80判为阳性；1:40≤HI效价＜1:80判定为疑似阳性；HI效价＜1:40判定为阴性。
有益效果：
(1)本发明提供了一种检测MS和MG抗体的冻干血凝抑制试验抗原组合及其制备方法，以本实验室在国内发病鸡场分离获得的MS分离株JS2018-4株和MG标准株R株，经过一系列处理，制备成为冻干HI试验抗原，该抗原性质稳定、可以长期稳定保存，具有良好的敏感性和特异性。
(2)本发明还提供了检测MS和MG的HA试验和HI试验方法，该方法能够特异性检测MS和MG抗体，而与其他病原单因子阳性血清无交叉反应，表明该方法具有良好的特异性。本发明还通过检测国内各地鸡场大量的临床血清样品，经过统计分析，确立了相应的判定标准，与商品化ELISA试剂盒具有良好的符合性。目前对于MS和MG感染的血清学检测主要依靠SPAT和ELISA方法进行检测。其中SPAT方法敏感性偏低，且与其他禽支原体抗体存在一定比例的交叉反应，因此临床使用较少；ELISA试剂盒敏感性高，但检测成本较高，且需要专门的仪器设备。本发明提供的方法能够简单、快捷地对血清样品进行检测，检测成本低，操作难度小，无需专门设备，非常适合在生产一线进行快速检测。
附图说明
图1不同灭活方式对抗原血凝效价的影响
图2使用不同冻干保护剂冻干的血凝抑制试验抗原的外观状态
图3使用不同冻干保护剂冻干的血凝抑制试验抗原的复水性比较结果
图4不同冻干保护剂对抗原血凝效价的保护效果比较结果
图5确定MS HI试验判定标准的ROC曲线
图6MS HI试验检测参考血清样品结果的交互式点状分布图
图7以JS2018-4和WVU1853分别制备的MS血凝抑制试验抗原检测不同抗体滴度血清样品的效果比较
图8确定MG HI试验判定标准的ROC曲线
图9MG HI试验检测参考血清样品结果的交互式点状分布图
图10本发明提供的MG HI方法检测不同ELISA抗体滴度区间的血清样品的结果。
菌株JS2018-4于2019年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学。保藏编号为：CCTCC NO:M 20191100。分类命名为：Mycoplasma synoviaeJS2018-4。
具体实施方式
下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，如变换制备抗原用的MS和MG菌株、调整培养条件和抗原浓缩条件、调整冻干保护剂各组分的浓度、调整抗原与冻干保护剂的配伍比例、改变成品抗原的包装规格或将该抗原组合进行拆分使用等，这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。以下实施例中所用材料和实验方法如无特殊说明，均可从常规途径获得。
实施例1：MS JS2018-4株的分离和筛选
1.实验材料
支原体肉汤基础培养基(产品编号：CM0403B)和支原体琼脂基础培养基(产品编号：CM0401B)均购自OXOID公司；精氨酸、半胱氨酸、辅酶Ⅰ均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；猪血清购自金源康生物工程有限公司。
改良Frey’s液体培养基配制方法：支原体肉汤基础培养基(OXOID，产品编号：CM0403B)25.5g/L、葡萄糖3.3g/L、辅酶Ⅰ100mg/L、精氨酸400mg/L、半胱氨酸100mg/L、酚红指示剂0.02％，将各组份加入超纯水中，pH调至7.8。使用0.22μm细菌滤器过滤除菌，加入15％～20％猪血清即可。
改良Frey’s固体培养基配制方法：支原体肉汤基础培养基(OXOID，产品编号：CM0403B)35.5g/L，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃，加入葡萄糖3.3g/L、辅酶Ⅰ100mg/L、精氨酸400mg/L、半胱氨酸100mg/L、酚红指示剂0.02％和15～20％猪血清。
2.实验方法
2.1菌株的分离
从江苏某鸡场获得发生传染性关节滑膜炎的病鸡，无菌采集发病鸡关节腔积液，接种到事先37℃预热的新鲜改良Frey’s液体培养基中，37℃、220r/min培养2-4h进行前增菌，之后通过无菌注射器吸取该培养液，经过0.45μm细菌滤器过滤至新鲜培养基，37℃、220r/min进行培养。待培养液变色后，按照1:10的比例进行传代培养。
2.2纯化培养
吸取适量传代培养物，涂布于改良Frey’s固体培养基上，37℃培养，显微镜下观察菌落形态，挑取典型菌落接种于新鲜改良Frey’s液体培养基中，37℃、220r/min进行培养，培养基颜色变为橙黄后，继续涂布于改良Frey’s固体培养基上，挑取单菌落纯化培养，如此反复3次。
2.3菌株鉴定与分型
参照Hong等的方法(Hong Y,Maricarmen García,Leiting V,et al.SpecificDetection and Typing of Mycoplasma synoviae Strains in Poultry with PCR andDNA Sequence Analysis Targeting the Hemagglutinin Encoding Gene vlhA.AvianDiseases,2004,48(3):606-616.)对分离菌株进行鉴定并命名为JS2018-4。参照Sun等的方法(Sun SK,Lin X,Chen F,et al.Epidemiological investigation of MycoplasmaSynoviae in native chicken breeds in China.BMC veterinary research,2017,13(1):115.)进行菌株分型，确定该菌株属于我国流行的基因K型，而常用参考菌株WVU1853株(CVCC385)属于基因A型。
实施例2：冻干MS血凝抑制试验抗原的制备与应用
1实验材料
1.1菌株
MS JS2018-4株为扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室分离鉴定并保存，并在中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏编号为：CCTCC M20191100。
2实验方法
2.1菌株培养
2.1.1种子菌液的获得
取MS JS2018-4分离株菌种，接种至新鲜的改良Frey's液体培养基，置于培养箱37℃，220r/min培养24h，至培养基颜色由紫红色变为橙黄色。然后吸取菌液以1:10比例接种新鲜改良Frey's液体培养基，培养24h，连续进行3次传代培养，使其完全恢复活力，即为种子菌液。
2.1.2扩大培养
将种子菌液以1:10比例接种至新鲜培养基，逐级扩大培养，直至实验所需要的体积。
2.2灭活条件的优选
按照表1所示不同灭活条件分别进行抗原灭活。灭活完成后，参照中华人民共和国兽药典中规定的支原体检验方法进行检验，选择灭活彻底、HA效价不受影响的灭活方式。
表1灭活条件
Figure BDA0002518891370000071
灭活后HA效价测定结果如图1所示，使用甲醛灭活后的菌体重悬液HA效价较灭活前明显降低，而使用β-丙内酯灭活的菌体重悬液HA效价基本没有变化。由此可见β-丙内酯能够较好保护抗原的抗原性。综合成本和其他相关因素考虑，确定使用β-丙内酯在浓度为1:4000条件下8～24h进行抗原灭活。
2.3抗原浓缩与洗涤
(1)过滤除杂质：将灭活后的菌液通过4层灭菌纱布过滤，并收集滤液。
(2)超滤浓缩：使用切向流超滤浓缩方式对上一步所收集的滤液进行浓缩，浓缩5倍左右。
(3)离心洗涤：将上一步超滤浓缩所得的悬浮液使用进行高速冷冻离心，由于超滤浓缩后的悬浮液浓度较高，大量制备时离心体积较大，为保证离心效率，将离心条件设定为4℃条件下，10000×g离心1h，吸弃上清，沉淀使用无菌PBS反复洗涤3次，最后使用1/2初始体积的无菌PBS彻底重悬，获得浓缩10倍的抗原悬浮液。
2.4真空冷冻干燥与冻干保护剂筛选
按照表2所示，对4种不同配方的冻干保护剂分别进行真空冷冻干燥试验测试。
表2. 4种冻干保护剂
Figure BDA0002518891370000081
将4种保护剂分别与浓缩抗原悬浮液以1:1比例混合，以2ml/瓶分装至西林瓶，-70℃过夜预冻，之后放入冷冻干燥机进行真空冷冻干燥24h后取出进行封口。按以下方式进行成品检验和评价：
(1)物理性状评价：
冻干后抗原应呈白色疏松团块，易与瓶壁脱离，加入稀释液后迅速溶解，复水性较好。
冻干成品外观状态和复水性如图2和图3所示，使用保护剂A、B、C冻干的抗原出现固体物质较少、不同程度的喷瓶等现象，而使用保护剂D的冻干抗原呈疏松、海绵状团块；除保护剂C以外，使用保护剂A、B、D冻干的抗原均遇水即溶，具有良好的复水性。由此可知保护剂D在冻干成品物理性质方面具有明显优势。
(2)血凝效价测定：测定不同方式制备的冻干抗原HA效价，比较冻干前后HA效价的变化情况。结果如图4所示，使用保护剂D冻干的样品在冻干前后HA效价并未发生改变，具有较好的保护效果。综合比较，选择保护剂D为该抗原冻干保护剂。
2.5MS血凝抑制试验抗原的大量制备
按照2.1～2.4确定的条件大量制备一批MS血凝抑制试验抗原。
2.6MS血凝抑制试验抗原的检验
2.6.1HA效价测定
使用2ml PBS溶液溶解血凝抑制试验抗原，测定HA效价。随机抽取的10瓶冻干抗原经测定HA效价均为28。
2.6.2特异性检验
采用HI试验的方法，使用制备的冻干MS血凝抑制试验抗原分别对鸡毒支原体(MG)、新城疫病毒、(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、以及滑液囊支原体(MS)阳性血清以及SPF鸡血清进行HI检测。结果如表3所示，该抗原与MS以外的其他病原的单因子血清均不发生交叉反应，表明该抗原具有良好的特异性。
表3.特异性试验结果
Figure BDA0002518891370000091
2.6.3稳定性检验
(1)将制备的HI试验抗原成品分别于4℃和-20℃保存，定期抽样测定效价。结果如表4所示，抗原成品于4℃和-20℃保存12个月，HA效价依然维持初始水平，可见该抗原性质稳定，易于保存。
表4.血凝抑制试验抗原保存期测定
Figure BDA0002518891370000092
(2)将制备的血凝抑制试验抗原稀释后，分别保存于4℃和-20℃条件下，定期测定HA效价，结果如表5所示，可见稀释后的血凝抑制试验抗原于4℃可以在13d内维持效价稳定；于-20℃条件下存放15d，期间经过多次冻融，效价依然稳定不变。
表5.稀释的血凝抑制试验抗原保存期测定
Figure BDA0002518891370000093
2.7HI试验结果判定标准的确定
使用制备的冻干MS血凝抑制试验抗原通过HI试验检测了148份参考血清样品(包含47份阴性样品和101份使用JS2018-4株对SPF鸡进行人工感染制备的阳性血清)，检测结果通过统计软件GraphPad Prism 8.3进行ROC曲线分析，并绘制交互式点状分布图，结合ROC曲线分析的敏感性和特异性，确定合适的判定标准。
ROC曲线分析结果如图5、表6所示，此时ROC曲线线下面积(Area under the ROCcurve，AUC)＝0.9981，表明该试验具有较高的诊断价值。当HI效价>1:15时，敏感性为100％，特异性为87.23％；当HI效价>1:30时，敏感性为97.03％，特异性为100％。检测结果交互式点状分布图如图6所示，阴性样品与阳性样品在HI效价＝1:20时有重叠。综合以上分析结果，为了保证判定标准的特异性，将判定标准确定为：HI效价≥1:80时，判为阳性；1:40≤HI效价＜1:80时，判为疑似阳性；HI效价＜1:40时，判为阴性。
表6.ROC曲线特异性和敏感性分析结果
Figure BDA0002518891370000101
2.8MS血凝抑制试验抗原对临床样品检测的效果评价
(1)使用本发明提供的方法检测了本实验室从全国各地鸡场收集并保存的453份血清样品(经IDEXX公司MS抗体ELISA试剂盒检测，其中阴性样品187份，阳性样品266份)。HI检测结果如表7所示，使用本发明制定的判定标准进行判定，结果如下：266份ELISA检测阳性血清样品中，HI试验检出阳性205份，疑似阳性34份，阴性27份，阳性符合率为77.07％；187份ELISA检测阴性样品中，HI试验检出阴性187份，疑似阳性0份，阳性0份，符合率为100％。结果中存在部分ELISA阳性样品的HI试验结果为阴性，主要是由于这部分样品抗体效价相对较低，而且两种方法的敏感性存在差异造成的。由结果可知，使用本发明提供的HI试验抗原具有较高的临床应用价值。
表7.临床血清样品ELISA检测与HI试验结果对比结果
Figure BDA0002518891370000102
(2)根据IDEXX ELISA检测结果，按照抗体滴度将部分血清分成阴性、2000-5000、5000-8000、8000以上四个区间，使用本发明中JS2018-4株制备的抗原和以常用标准参考菌株WVU1853(购自中国兽医微生物菌种保藏中心，保藏编号为CVCC385)按同样方法制备的抗原，通过本发明提供的HI方法分别检测。结果如图7所示，血清样品HI检测结果与ELISA结果高低趋势一致；使用本发明中的JS2018-4制备的抗原测定的HI效价要明显高于使用标准参考菌株WVU1853株制备的抗原测定的HI效价，说明本发明使用国内分离株制备的抗原与WVU1853株相比具有更高的敏感性。
实施例3：冻干MG血凝抑制试验抗原的制备与应用
3.1MG血凝抑制试验抗原的大量制备
按照实施例2中2.1～2.4确定的冻干MS血凝抑制试验抗原制备条件大量制备一批MG血凝抑制试验抗原。
3.2MG血凝抑制试验抗原的检验
3.2.1HA效价测定
使用2ml PBS溶液溶解血凝抑制试验抗原，测定HA效价。结果显示，随机抽取的10瓶冻干抗原HA效价均为28。
3.2.2特异性检验
采用HI试验的方法，使用制备的MG血凝抑制试验抗原分别对MG、MS、NDV、AIV、IBV阳性血清以及SPF鸡血清进行HI检测。结果如表8所示，该抗原与MG以外的其他病原的单因子血清均不发生交叉反应，表明该抗原具有良好的特异性。
表8.MG血凝抑制试验抗原特异性试验结果
Figure BDA0002518891370000111
3.2.3稳定性检验
将制备的HI试验抗原成品分别于4℃和-20℃保存，定期抽样测定效价。结果如表9所示，抗原成品于4℃和-20℃保存12个月，HA效价依然维持初始水平，可见该抗原性质稳定，易于保存。
表9.血凝抑制试验抗原保存期测定
Figure BDA0002518891370000121
(2)将制备的MG血凝抑制试验抗原稀释后，分别保存于4℃和-20℃条件下，定期测定HA效价，结果如表10所示，可见稀释后的MG血凝抑制试验抗原于4℃可以在13d内维持效价不变；于-20℃条件下存放15d，期间经过多次冻融，效价依然稳定不变。
表10.稀释的血凝抑制试验抗原保存期测定
Figure BDA0002518891370000122
3.3HI试验结果判定标准的确定
使用制备的MG血凝抑制试验抗原，通过HI试验检测了194份参考血清样品(包含67份阴性样品和127份经R株人工感染SPF鸡制备的阳性血清)，检测结果通过统计软件GraphPad Prism 8.3进行ROC曲线分析，并绘制交互式点状分布图，结合ROC曲线分析的敏感性和特异性，确定合适的判定标准。
ROC曲线分析结果如图8、表11所示，此时ROC曲线线下面积(Area under the ROCcurve，AUC)＝0.9962，表明该试验具有较高的诊断价值。当HI效价>1:30时，敏感性为99.21％，特异性为100％；当HI效价>1:60时，敏感性为88.98％，特异性为100％。检测结果交互式点状分布图如图9所示，阴性样品与阳性样品在HI效价＝1:40时有重叠。综合以上分析结果，为了保证判定标准的特异性，将判定标准确定为：HI效价≥1:80时，判为阳性；1:40≤HI效价＜1:80时，判为疑似阳性；HI效价＜1:40时，判为阴性。
表11.ROC曲线特异性和敏感性分析结果
Figure BDA0002518891370000131
3.4MG血凝抑制试验抗原对临床样品检测的效果评价
(1)使用本发明提供的HI方法检测了本实验室从全国各地鸡场收集并保存的364份临床血清样品(经IDEXX公司MG抗体ELISA试剂盒检测，其中阴性样品208份，阳性样品156份)。HI检测结果如表12所示，使用本发明制定的判定标准进行判定，结果如下：156份ELISA检测阳性血清样品中，HI试验检出阳性130份，疑似阳性18份，阴性8份，符合率为83.33％；208份ELISA检测阴性样品中，HI试验检出阴性208份，疑似阳性0份，阳性0份，符合率为100％。由结果可知，使用本发明提供的MG HI试验抗原用于MG特异性抗体检测具有良好的特异性和敏感性。
表12.临床血清样品ELISA检测与HI试验结果对比结果
Figure BDA0002518891370000132
(2)根据IDEXX公司MG抗体ELISA检测试剂盒检测结果，按照抗体滴度将部分血清分成阴性、2000-5000、5000-8000、8000以上四个区间，使用本发明中制备的MG血凝抑制试验抗原通过本发明提供的HI方法进行检测这些血清样品。结果如图10所示，血清样品HI检测结果与ELISA结果高低趋势一致。

Claims (5)

1.一种用于检测鸡滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原，其特征在于，是选取滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)菌株，经过种子液培养、扩大培养、灭活、浓缩和冷冻干燥而制成；所述滑液囊支原体菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.M20191100。
2.一种用于检测鸡滑液囊支原体和鸡毒支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原组合，其特征在于包括权利要求1所述的用于检测鸡滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原和用于检测鸡毒支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原。
3.根据权利要求2所述的抗原组合，其特征在于，所述用于检测鸡毒支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原，是选取鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)菌株，经过种子液培养、扩大培养、灭活、浓缩和冷冻干燥而制成；所述鸡毒支原体菌株保藏于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CVCC1651。
4.权利要求1所述用于检测鸡滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
(1)选取滑液囊支原体CCTCC No.M 20191100菌株，使用改良Frey’s液体培养基进行逐级扩大培养，收获24h～36h培养液；
所述改良Frey’s液体培养基配方以及配制方法如下：支原体肉汤基础培养基25.5g/L、葡萄糖3.3g/L、辅酶Ⅰ100mg/L、精氨酸400mg/L、半胱氨酸100mg/L、酚红指示剂0.02％，将各组份加入超纯水中，pH调至7.8；使用0.22μm细菌滤器过滤除菌，加入15％猪血清即可；
(2)对收获的培养液进行灭活，灭活剂为β-丙内酯，添加比例为1:2000～1:4000，灭活条件为：先4℃放置8h～24h，然后37℃放置2h；
(3)浓缩：先使用切向流方式Vivaflow 50对灭活菌液进行超滤浓缩，然后在10000×g离心1h沉淀菌体，pH7.4PBS重悬，重复该步骤2～3次，用pH7.4PBS重悬菌体，根据具体浓度调整至合适的体积，获得抗原悬浮液；
(4)冷冻干燥：使用冻干保护剂各组分的浓度为：D-甘露醇5％，蔗糖5％，配制所使用的溶剂为超纯水，经高压灭菌备用；添加比例为：保护剂:抗原悬浮液＝1:1。
5.权利要求2所述的用于检测鸡滑液囊支原体和鸡毒支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原组合的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
(1)选取滑液囊支原体CCTCC No.M 20191100菌株和鸡毒支原体CVCC1651菌株，分别使用改良Frey’s液体培养基进行逐级扩大培养，收获24h～36h培养液；
所述改良Frey’s液体培养基配方以及配制方法如下：支原体肉汤基础培养基25.5g/L、葡萄糖3.3g/L、辅酶Ⅰ100mg/L、精氨酸400mg/L、半胱氨酸100mg/L、酚红指示剂0.02％，将各组份加入超纯水中，pH调至7.8；使用0.22μm细菌滤器过滤除菌，加入15％猪血清即可；
(2)对收获的培养液分别进行灭活，灭活剂为β-丙内酯，添加比例为1:2000～1:4000，灭活条件为：先4℃放置8h～24h，然后37℃放置2h；
(3)浓缩：先使用切向流方式Vivaflow 50对灭活菌液进行超滤浓缩，然后在10000×g离心1h沉淀菌体，pH7.4PBS重悬，重复该步骤2～3次，用pH7.4PBS重悬菌体，根据具体浓度调整至合适的体积，获得抗原悬浮液；
(4)冷冻干燥：使用冻干保护剂各组分的浓度为：D-甘露醇5％，蔗糖5％，配制所使用的溶剂为超纯水，经高压灭菌备用；添加比例为：保护剂:抗原悬浮液＝1:1；分别冷冻干燥得到用于检测鸡滑液囊支原体和鸡毒支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原。
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