JP2636199B2 - 豚腎尿細管上皮細胞由来株化細胞（ｆｓ−ｌ３細胞）、当該細胞増殖用無血清培養液およびそれを用いる株化細胞の作出方法 - Google Patents
豚腎尿細管上皮細胞由来株化細胞（ｆｓ−ｌ３細胞）、当該細胞増殖用無血清培養液およびそれを用いる株化細胞の作出方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＦＳ−Ｌ３細胞、当該
細胞の増殖用無血清培養液およびそれを用いる株化細胞
の作出方法に関し、詳しくは哺乳類由来細胞を分化さ
せ、無血清培養液で増殖可能な細胞系を作出することが
できる無血清培養液、当該無血清培養液を用いてＦＳ−
Ｌ３細胞等の無血清培養液で増殖可能な細胞系を作出す
る方法、当該ＦＳ−Ｌ３細胞を用いて豚コレラ，牛ウイ
ルス性下痢，狂犬病等の疾病の診断用抗原および／また
はワクチンを製造する方法並びに無血清培養液を用いて
ＦＳ−Ｌ３細胞を増殖させて細胞増殖因子様物質を生産
させ、当該物質を採取することを特徴とする細胞増殖因
子様物質を製造する方法に関する。
細胞の増殖用無血清培養液およびそれを用いる株化細胞
の作出方法に関し、詳しくは哺乳類由来細胞を分化さ
せ、無血清培養液で増殖可能な細胞系を作出することが
できる無血清培養液、当該無血清培養液を用いてＦＳ−
Ｌ３細胞等の無血清培養液で増殖可能な細胞系を作出す
る方法、当該ＦＳ−Ｌ３細胞を用いて豚コレラ，牛ウイ
ルス性下痢，狂犬病等の疾病の診断用抗原および／また
はワクチンを製造する方法並びに無血清培養液を用いて
ＦＳ−Ｌ３細胞を増殖させて細胞増殖因子様物質を生産
させ、当該物質を採取することを特徴とする細胞増殖因
子様物質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ウイルスの培養および検査には培養細胞
が必要であるが、従来は該細胞の調製には血清を添加し
た培養液が必須とされていた。しかしながら、動物の組
織細胞や血清中には抗体の存在や未知の病原体の迷入の
危険があり、使用前に十分な検査が必要とされる。すな
わち、ウイルスの検査、ワクチンの製造等に動物組織由
来の初代培養細胞や株化細胞が用いられているが、調製
された細胞由来の病原体の迷入の危険が残されている。
例えば、初代腎臓細胞では、ヘルペスウイルス等の、Ｐ
Ｋ−１５細胞等の株化細胞では、レトロウイルス等の迷
入が考えられる。
が必要であるが、従来は該細胞の調製には血清を添加し
た培養液が必須とされていた。しかしながら、動物の組
織細胞や血清中には抗体の存在や未知の病原体の迷入の
危険があり、使用前に十分な検査が必要とされる。すな
わち、ウイルスの検査、ワクチンの製造等に動物組織由
来の初代培養細胞や株化細胞が用いられているが、調製
された細胞由来の病原体の迷入の危険が残されている。
例えば、初代腎臓細胞では、ヘルペスウイルス等の、Ｐ
Ｋ−１５細胞等の株化細胞では、レトロウイルス等の迷
入が考えられる。
【０００３】一方、最近、種々の増殖因子などが添加さ
れた無血清培養液が市販されるようになり、これらの問
題の一部は消去されつつあるが、販売価格が高いため、
大量のワクチンや診断用抗原の製造には実用的でない。
れた無血清培養液が市販されるようになり、これらの問
題の一部は消去されつつあるが、販売価格が高いため、
大量のワクチンや診断用抗原の製造には実用的でない。
【０００４】また、豚コレラウイルス（ＨＣＶ）や牛ウ
イルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）のウイルス定量およ
び中和試験などには、それらのウイルスが細胞変性効果
（ＣＰＥ）を示さないことから、ＥＮＤ法や干渉法等の
間接的な方法が採用されている。しかしながら、これら
の方法は、強毒のＨＣＶやニューキャッスル病ウイルス
（ＮＤＶ）、人体に感染の恐れのある西部馬脳炎ウイル
ス（ＷＥＥＶ）、重要な海外病である水胞性口炎（ＶＳ
Ｖ）などを使用しなければならず、漏洩汚染の点で問題
が残されている。
イルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）のウイルス定量およ
び中和試験などには、それらのウイルスが細胞変性効果
（ＣＰＥ）を示さないことから、ＥＮＤ法や干渉法等の
間接的な方法が採用されている。しかしながら、これら
の方法は、強毒のＨＣＶやニューキャッスル病ウイルス
（ＮＤＶ）、人体に感染の恐れのある西部馬脳炎ウイル
ス（ＷＥＥＶ）、重要な海外病である水胞性口炎（ＶＳ
Ｖ）などを使用しなければならず、漏洩汚染の点で問題
が残されている。
【０００５】一方、牛胎児や子牛血清中にＨＣＶと同属
のペスチウイルスに分類されるＢＶＤＶが迷入したり、
これらに対する抗体が高頻度に検出されることから、ウ
イルスのワクチン等の製造やウイルスの正確な定量に
は、事前に厳重な検査を行なうことが必須であった。し
かし、これらの検査は煩雑である上に、長時間を要する
という欠点がある。
のペスチウイルスに分類されるＢＶＤＶが迷入したり、
これらに対する抗体が高頻度に検出されることから、ウ
イルスのワクチン等の製造やウイルスの正確な定量に
は、事前に厳重な検査を行なうことが必須であった。し
かし、これらの検査は煩雑である上に、長時間を要する
という欠点がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、廉価
な無血清培養液を提供し、当該無血清培養液を用いてＦ
Ｓ−Ｌ３細胞等の哺乳類由来細胞を分化させ、無血清培
養液で増殖可能な細胞系を作出する方法を確立すること
である。これにより、既知の病原体の迷入のない清浄な
細胞系を作出することができ、ウイルス検査は勿論のこ
と、抗体検査の技術的改善、ワクチン等の生物学的製剤
の製造の安全性の確保、大量生産による低コスト化等に
飛躍的に有用な技術を提供することができる。
な無血清培養液を提供し、当該無血清培養液を用いてＦ
Ｓ−Ｌ３細胞等の哺乳類由来細胞を分化させ、無血清培
養液で増殖可能な細胞系を作出する方法を確立すること
である。これにより、既知の病原体の迷入のない清浄な
細胞系を作出することができ、ウイルス検査は勿論のこ
と、抗体検査の技術的改善、ワクチン等の生物学的製剤
の製造の安全性の確保、大量生産による低コスト化等に
飛躍的に有用な技術を提供することができる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決すべく
検討を重ねた結果、目的とする無血清培養液を確立する
と共に、本発明者の一人が２０年程前に樹立した豚腎臓
由来の株化細胞（ＳＫ−Ｌ細胞）を使用して無血清培養
液で増殖可能な細胞系を作出することに成功した。本発
明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
検討を重ねた結果、目的とする無血清培養液を確立する
と共に、本発明者の一人が２０年程前に樹立した豚腎臓
由来の株化細胞（ＳＫ−Ｌ細胞）を使用して無血清培養
液で増殖可能な細胞系を作出することに成功した。本発
明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】請求項１に記載の本発明は、病原体の迷入
がなく、細胞表層にドームを形成する、豚腎尿細管上皮
細胞由来株化細胞（ＦＳ−Ｌ３細胞）（ＦＥＲＭ Ｐ−
１４８０６）である。請求項２に記載の本発明は、精製
水中にEagle MEM ９．４ｇ／Ｌ，Tryptose Phosphate B
roth ２．９５ｇ／ＬおよびBacto-Peptone ５．００〜
１０．００ｇ／Ｌを溶解させたことを特徴とするＦＳ−
Ｌ３細胞増殖用無血清培養液である。請求項３に記載の
本発明は、請求項２に記載の無血清培養液を用いて哺乳
類由来細胞を分化させることを特徴とする無血清培養液
で増殖可能な細胞系の作出方法である。請求項４に記載
の本発明は、無血清培養液で増殖可能な細胞系が、ＦＳ
−Ｌ３細胞である請求項３記載の作出方法である。請求
項５に記載の本発明は、請求項１に記載のＦＳ−Ｌ３細
胞を用いて豚コレラ，牛ウイルス性下痢，狂犬病等の疾
病の診断用抗原および／またはワクチンを製造する方法
である。請求項６に記載の本発明は、請求項２に記載の
無血清培養液を用いてＦＳ−Ｌ３細胞を増殖させて細胞
増殖因子様物質を生産させ、当該物質を採取することを
特徴とする細胞増殖因子様物質の製造方法である。
がなく、細胞表層にドームを形成する、豚腎尿細管上皮
細胞由来株化細胞（ＦＳ−Ｌ３細胞）（ＦＥＲＭ Ｐ−
１４８０６）である。請求項２に記載の本発明は、精製
水中にEagle MEM ９．４ｇ／Ｌ，Tryptose Phosphate B
roth ２．９５ｇ／ＬおよびBacto-Peptone ５．００〜
１０．００ｇ／Ｌを溶解させたことを特徴とするＦＳ−
Ｌ３細胞増殖用無血清培養液である。請求項３に記載の
本発明は、請求項２に記載の無血清培養液を用いて哺乳
類由来細胞を分化させることを特徴とする無血清培養液
で増殖可能な細胞系の作出方法である。請求項４に記載
の本発明は、無血清培養液で増殖可能な細胞系が、ＦＳ
−Ｌ３細胞である請求項３記載の作出方法である。請求
項５に記載の本発明は、請求項１に記載のＦＳ−Ｌ３細
胞を用いて豚コレラ，牛ウイルス性下痢，狂犬病等の疾
病の診断用抗原および／またはワクチンを製造する方法
である。請求項６に記載の本発明は、請求項２に記載の
無血清培養液を用いてＦＳ−Ｌ３細胞を増殖させて細胞
増殖因子様物質を生産させ、当該物質を採取することを
特徴とする細胞増殖因子様物質の製造方法である。
【０００９】前記のＳＫ−Ｌ細胞は、プラスチック培
養瓶において、細胞単層を形成後、豚腎尿細管上皮細胞
由来の培養細胞に特徴的なドームを細胞表層に多数形成
するおよびＨＣＶのＧＰＥ- 株（日本の豚コレラのワ
クチン株）の感染によって、当該培養細胞に形成された
ドームが消失する現象が認められるという特性を有して
いる。そこで、本発明者らは、これらの性状を損なわな
いようにして、無血清培養液で増殖可能な細胞の作出を
試みた。すなわち、Eagle MEM を基礎培養液とし、これ
にTryptose Phosphate Broth, Yeast Extract, Lactalb
umin Hydrolysate, Tryptone, Peptone などの栄養物を
種々の濃度で加え、当該細胞に適した血清無添加の培養
液について検討した。その結果、下記の処方による無血
清培養液が最適であることを見出した。
養瓶において、細胞単層を形成後、豚腎尿細管上皮細胞
由来の培養細胞に特徴的なドームを細胞表層に多数形成
するおよびＨＣＶのＧＰＥ- 株（日本の豚コレラのワ
クチン株）の感染によって、当該培養細胞に形成された
ドームが消失する現象が認められるという特性を有して
いる。そこで、本発明者らは、これらの性状を損なわな
いようにして、無血清培養液で増殖可能な細胞の作出を
試みた。すなわち、Eagle MEM を基礎培養液とし、これ
にTryptose Phosphate Broth, Yeast Extract, Lactalb
umin Hydrolysate, Tryptone, Peptone などの栄養物を
種々の濃度で加え、当該細胞に適した血清無添加の培養
液について検討した。その結果、下記の処方による無血
清培養液が最適であることを見出した。
【００１０】 無血清培養液の調製 Eagle MEM （日水製薬） ９．４０ｇ／Ｌ（リットル） Tryptose Phosphate Broth(DIFCO) ２．９５ｇ／Ｌ Bacto-Peptone(DIFCO) ５．００〜１０．００ｇ／Ｌ 精製水 適量（１Ｌにする）
【００１１】次に、上記の無血清培養液を用いて哺乳類
由来細胞を分化させ、無血清培養液で増殖可能な細胞系
を作出する方法について述べる。哺乳類由来細胞として
は、例えばＰＫ−１５細胞等の多くの株化細胞があり、
これらの細胞を上記無血清培養液を用いて、細胞継代培
養時の血清濃度を順次１０％から０．５％に下げ、最終
的には完全無血清培養液に順化させることにより目的と
する無血清培養液順化細胞系（例えばＦＳ−Ｌ３細胞）
を得ることが可能である。このようにして得られた無血
清培養液順化細胞系の１株であるＦＳ−Ｌ３細胞は、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、そ
の受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４８０６である。
由来細胞を分化させ、無血清培養液で増殖可能な細胞系
を作出する方法について述べる。哺乳類由来細胞として
は、例えばＰＫ−１５細胞等の多くの株化細胞があり、
これらの細胞を上記無血清培養液を用いて、細胞継代培
養時の血清濃度を順次１０％から０．５％に下げ、最終
的には完全無血清培養液に順化させることにより目的と
する無血清培養液順化細胞系（例えばＦＳ−Ｌ３細胞）
を得ることが可能である。このようにして得られた無血
清培養液順化細胞系の１株であるＦＳ−Ｌ３細胞は、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、そ
の受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４８０６である。
【００１２】このようにして作出したＦＳ−Ｌ３細胞を
用いて豚コレラ，牛ウイルス性下痢・粘膜病，狂犬病等
の疾病の診断用抗原および／またはワクチンを製造する
には、公知の方法を適用すればよく、例えばローラーボ
トルを用いた細胞培養法や浮遊細胞培養法等を用いてウ
イルスを増殖させ、ウイルス原液を製造する方法を適用
することができる。
用いて豚コレラ，牛ウイルス性下痢・粘膜病，狂犬病等
の疾病の診断用抗原および／またはワクチンを製造する
には、公知の方法を適用すればよく、例えばローラーボ
トルを用いた細胞培養法や浮遊細胞培養法等を用いてウ
イルスを増殖させ、ウイルス原液を製造する方法を適用
することができる。
【００１３】また、ＦＳ−Ｌ３細胞は、その増殖に伴い
培養液中に細胞増殖因子様物質を産生するので、浮遊細
胞培養法等を用いて当該細胞を大量に増殖させて培養液
を回収し、必要に応じて精製し、当該物質を一般の細胞
増殖のための廉価な培養液添加物として利用することが
できる。
培養液中に細胞増殖因子様物質を産生するので、浮遊細
胞培養法等を用いて当該細胞を大量に増殖させて培養液
を回収し、必要に応じて精製し、当該物質を一般の細胞
増殖のための廉価な培養液添加物として利用することが
できる。
【００１４】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明す
る。 実施例１ 親細胞であるＳＫ−Ｌ細胞の継代培養には、当初Eagle
MEM を基礎培養液として、これにTryptose Phosphate B
roth (DIFCO)を２．９５ｇ／Ｌ加え、さらに牛胎児血清
を５〜１０％添加したものを使用していた。無血清培養
液に移行する過程において、牛胎児血清の量を順次減量
した。血清の添加量を約０．５％まで減少させても、当
該細胞の増殖を維持することができたが、血清を全く添
加しない場合は、細胞の増殖は甚だ減弱した。
る。 実施例１ 親細胞であるＳＫ−Ｌ細胞の継代培養には、当初Eagle
MEM を基礎培養液として、これにTryptose Phosphate B
roth (DIFCO)を２．９５ｇ／Ｌ加え、さらに牛胎児血清
を５〜１０％添加したものを使用していた。無血清培養
液に移行する過程において、牛胎児血清の量を順次減量
した。血清の添加量を約０．５％まで減少させても、当
該細胞の増殖を維持することができたが、血清を全く添
加しない場合は、細胞の増殖は甚だ減弱した。
【００１５】そこで、当初５代継代目まで上記の無血清
培養液に血清を０．５％添加した培養液を用い、６代継
代からは完全無血清培養液に移行した。しかしながら、
約２０代継代目までは、その増殖性は不安定であるた
め、細胞の継代間隔は、その増殖性の相違によって５〜
２０日とした。その結果、細胞の増殖性の違いにより約
１０系統の細胞系が分離、維持され、その中の１系統の
細胞が効率的な増殖を示すようになった。さらに、約３
０代継代を重ねたのち、安定した増殖を示すようにな
り、約１００代継代を経過したものも安定かつ良好な増
殖性を示している。この細胞を無血清培養液順化細胞株
として、ＦＳ−Ｌ３細胞と命名した。この細胞は、前記
したように、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
されており、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４８０６
である。
培養液に血清を０．５％添加した培養液を用い、６代継
代からは完全無血清培養液に移行した。しかしながら、
約２０代継代目までは、その増殖性は不安定であるた
め、細胞の継代間隔は、その増殖性の相違によって５〜
２０日とした。その結果、細胞の増殖性の違いにより約
１０系統の細胞系が分離、維持され、その中の１系統の
細胞が効率的な増殖を示すようになった。さらに、約３
０代継代を重ねたのち、安定した増殖を示すようにな
り、約１００代継代を経過したものも安定かつ良好な増
殖性を示している。この細胞を無血清培養液順化細胞株
として、ＦＳ−Ｌ３細胞と命名した。この細胞は、前記
したように、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
されており、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４８０６
である。
【００１６】実施例２ 実施例１で得たＦＳ−Ｌ３細胞の前記無血清培養液にお
ける増殖状態を調べたところ、その増殖曲線は、図１に
示した通りであった。当該細胞の増殖率は細胞のまきこ
み時の細胞数により異なり、まきこみ数を約５０万個／
ｍｌとした場合（図中の●）は、細胞の増殖は良好で、
その倍加時間は約２４時間であり、４日後には細胞数は
約４５０万個／ｍｌに増加した。また、経時的な細胞の
増殖形態を観察したところ、ドーム形成は約３日後から
観察され、４〜５日後には細胞表層全面に多数認められ
た（図２参照）。なお、図中のＡは３時間目、Ｂは１日
目、Ｃは２日目、Ｄは３日目、Ｅは４日目、Ｆは５日目
の結果をそれぞれ示す。一方、細胞のまきこみ数を約２
０万個／ｍｌとした場合（図中の▲）は、効率的な増殖
は認められず、約１０万個／ｍｌ（図中の■）以下で
は、細胞の増殖は認められなかった。しかしながら、こ
れらの細胞の培養液を３〜４日後に更新することによ
り、細胞の増殖が良好になることが認められた。
ける増殖状態を調べたところ、その増殖曲線は、図１に
示した通りであった。当該細胞の増殖率は細胞のまきこ
み時の細胞数により異なり、まきこみ数を約５０万個／
ｍｌとした場合（図中の●）は、細胞の増殖は良好で、
その倍加時間は約２４時間であり、４日後には細胞数は
約４５０万個／ｍｌに増加した。また、経時的な細胞の
増殖形態を観察したところ、ドーム形成は約３日後から
観察され、４〜５日後には細胞表層全面に多数認められ
た（図２参照）。なお、図中のＡは３時間目、Ｂは１日
目、Ｃは２日目、Ｄは３日目、Ｅは４日目、Ｆは５日目
の結果をそれぞれ示す。一方、細胞のまきこみ数を約２
０万個／ｍｌとした場合（図中の▲）は、効率的な増殖
は認められず、約１０万個／ｍｌ（図中の■）以下で
は、細胞の増殖は認められなかった。しかしながら、こ
れらの細胞の培養液を３〜４日後に更新することによ
り、細胞の増殖が良好になることが認められた。
【００１７】実施例３ ＦＳ−Ｌ３細胞が豚由来であるか否かを確認するため、
豚の染色体遺伝子上の反復配列であるPre I 配列（豚に
特異的な遺伝子配列、約２０００塩基数）をプローブと
して、当該細胞から抽出した細胞ＤＮＡを用いてドット
ブロットハイブリダイゼーションを実施した。その結
果、当該細胞が豚由来であることが確認された（図３参
照）。すなわち、豚由来の培養細胞であるＣＰＫ細胞、
ＳＫ−Ｌ細胞およびＦＳ−Ｌ３細胞から抽出したＤＮＡ
と反応したが、アフリカミドリザル腎臓由来のＶｅｒｏ
細胞、ハムスター腎臓由来のＢＨＫ−２１細胞および牛
腎臓由来のＭＤＢＫ細胞とは反応しなかった。このこと
から、ＦＳ−Ｌ３細胞は豚由来であることが証明され
た。なお、図中の１は豚由来ＣＰＫ細胞、２は豚由来Ｓ
Ｋ−Ｌ細胞、３は本発明のＦＳ−Ｌ３細胞、４はアフリ
カミドリザル腎臓由来のＶｅｒｏ細胞、５はハムスター
腎臓由来のＢＨＫ−２１細胞、６は牛腎臓由来のＭＤＢ
Ｋ細胞を示す。
豚の染色体遺伝子上の反復配列であるPre I 配列（豚に
特異的な遺伝子配列、約２０００塩基数）をプローブと
して、当該細胞から抽出した細胞ＤＮＡを用いてドット
ブロットハイブリダイゼーションを実施した。その結
果、当該細胞が豚由来であることが確認された（図３参
照）。すなわち、豚由来の培養細胞であるＣＰＫ細胞、
ＳＫ−Ｌ細胞およびＦＳ−Ｌ３細胞から抽出したＤＮＡ
と反応したが、アフリカミドリザル腎臓由来のＶｅｒｏ
細胞、ハムスター腎臓由来のＢＨＫ−２１細胞および牛
腎臓由来のＭＤＢＫ細胞とは反応しなかった。このこと
から、ＦＳ−Ｌ３細胞は豚由来であることが証明され
た。なお、図中の１は豚由来ＣＰＫ細胞、２は豚由来Ｓ
Ｋ−Ｌ細胞、３は本発明のＦＳ−Ｌ３細胞、４はアフリ
カミドリザル腎臓由来のＶｅｒｏ細胞、５はハムスター
腎臓由来のＢＨＫ−２１細胞、６は牛腎臓由来のＭＤＢ
Ｋ細胞を示す。
【００１８】さらに、当該細胞の染色体数を調べたとこ
ろ、３６（２ｎ）を中心に分布していることが解明され
た（図４参照）。豚の正常染色体数は３８（２ｎ）であ
ることから、一部の染色体の脱落が生じているものと考
えられる。
ろ、３６（２ｎ）を中心に分布していることが解明され
た（図４参照）。豚の正常染色体数は３８（２ｎ）であ
ることから、一部の染色体の脱落が生じているものと考
えられる。
【００１９】また、当該細胞の病原体の汚染について調
べたところ、豚由来の細胞に高頻度に迷入しているレ
トロウイルスの汚染は否定された。すなわち、細胞培養
液上清の逆転写酵素活性の有無について調べた結果（図
５）から明らかなように、ＦＳ−Ｌ３細胞では逆転写酵
素活性が認められず、レトロウイルスの迷入がない。な
お、図５はレトロウイルスが迷入している豚由来ＣＰＫ
細胞を陽性対照として逆転写酵素の検出を実施した結果
を示しており、ＦＳ−Ｌ３細胞では超遠心法により濃縮
した試料からも逆転写酵素活性が認められなかった。さ
らに、同様に豚由来細胞に高頻度に迷入しているサー
コウイルスやペスチウイルスの汚染を否定された。ま
た、マイコプラズマの汚染についても否定された。
べたところ、豚由来の細胞に高頻度に迷入しているレ
トロウイルスの汚染は否定された。すなわち、細胞培養
液上清の逆転写酵素活性の有無について調べた結果（図
５）から明らかなように、ＦＳ−Ｌ３細胞では逆転写酵
素活性が認められず、レトロウイルスの迷入がない。な
お、図５はレトロウイルスが迷入している豚由来ＣＰＫ
細胞を陽性対照として逆転写酵素の検出を実施した結果
を示しており、ＦＳ−Ｌ３細胞では超遠心法により濃縮
した試料からも逆転写酵素活性が認められなかった。さ
らに、同様に豚由来細胞に高頻度に迷入しているサー
コウイルスやペスチウイルスの汚染を否定された。ま
た、マイコプラズマの汚染についても否定された。
【００２０】実施例４ ＦＳ−Ｌ３細胞のＨＣＶのＧＰＥ- 株に対する感受性を
調べたところ、ウイルスを接種したのち、約４〜５日で
１０7 ＴＣＩＤ50／ｍｌのレベルで増殖することが解明
された。さらに、本細胞の特徴であるドーム形成を指標
にして、ＧＰＥ- 株の感染の有無を識別することが可能
であることが確認された。すなわち、当該細胞にＧＰＥ
- 株が感染した場合、当該細胞の形成するドームが消失
する現象を利用してウイルスの定量が可能となった。具
体的に述べると、無血清培養液を用いてＧＰＥ-株の１
０倍階段希釈列を作り、各希釈列あたり４穴（９６穴マ
イクロプレートを用いる）に５０μｌ／穴のウイルス液
を接種し、さらに５０μｌ／穴の細胞浮遊液を加え、３
７℃で７日間培養後、ドームの有無を指標にしてウイル
ス価を判定した。この方法で得た力価と従来の干渉法に
よるウイルス力価は完全に一致した。なお、当該細胞の
ＨＣＶの感染によるドームの消失現象は、ＨＣＶのＧＰ
Ｅ-株に特異的な現象であり、現在のところ他のＨＣＶ
の野外株では認められていない。しかし、ＧＰＥ- 株以
外のＨＣＶ（例えばＡＬＤ−Ａ７６株等）においても、
ドームの消失現象は認められないものの、ウイルスに対
する感受性は高く、高力価のウイルスを産生することが
可能である。さらに、ＨＣＶ以外のウイルス、例えばＢ
ＶＤＶの当該細胞における増殖性は良好であり、その他
のウイルスに対しても高感受性を有するものと考えられ
る。
調べたところ、ウイルスを接種したのち、約４〜５日で
１０7 ＴＣＩＤ50／ｍｌのレベルで増殖することが解明
された。さらに、本細胞の特徴であるドーム形成を指標
にして、ＧＰＥ- 株の感染の有無を識別することが可能
であることが確認された。すなわち、当該細胞にＧＰＥ
- 株が感染した場合、当該細胞の形成するドームが消失
する現象を利用してウイルスの定量が可能となった。具
体的に述べると、無血清培養液を用いてＧＰＥ-株の１
０倍階段希釈列を作り、各希釈列あたり４穴（９６穴マ
イクロプレートを用いる）に５０μｌ／穴のウイルス液
を接種し、さらに５０μｌ／穴の細胞浮遊液を加え、３
７℃で７日間培養後、ドームの有無を指標にしてウイル
ス価を判定した。この方法で得た力価と従来の干渉法に
よるウイルス力価は完全に一致した。なお、当該細胞の
ＨＣＶの感染によるドームの消失現象は、ＨＣＶのＧＰ
Ｅ-株に特異的な現象であり、現在のところ他のＨＣＶ
の野外株では認められていない。しかし、ＧＰＥ- 株以
外のＨＣＶ（例えばＡＬＤ−Ａ７６株等）においても、
ドームの消失現象は認められないものの、ウイルスに対
する感受性は高く、高力価のウイルスを産生することが
可能である。さらに、ＨＣＶ以外のウイルス、例えばＢ
ＶＤＶの当該細胞における増殖性は良好であり、その他
のウイルスに対しても高感受性を有するものと考えられ
る。
【００２１】実施例５ ＦＳ−Ｌ３細胞を用いて、豚コレラおよび牛ウイルス性
下痢ウイルスを増殖させたところ、従来のワクチン製造
に用いられている培養細胞でのウイルス価よりも高い数
値（１０7.5 ＴＣＩＤ50／ｍｌ以上）で得られ、豚接種
試験においても安全性が確認された。このことから、当
該細胞がワクチンおよび診断抗原製造用の細胞として有
用であることが解明された。さらに、当該細胞に感受性
のあるウイルスによる疾病（狂犬病等）のワクチンの製
造用細胞としても有用と考えられる。
下痢ウイルスを増殖させたところ、従来のワクチン製造
に用いられている培養細胞でのウイルス価よりも高い数
値（１０7.5 ＴＣＩＤ50／ｍｌ以上）で得られ、豚接種
試験においても安全性が確認された。このことから、当
該細胞がワクチンおよび診断抗原製造用の細胞として有
用であることが解明された。さらに、当該細胞に感受性
のあるウイルスによる疾病（狂犬病等）のワクチンの製
造用細胞としても有用と考えられる。
【００２２】実施例６ ＦＳ−Ｌ３細胞を５日間培養しして得た培養上清を血清
不含の培養液に１０％の割合で添加し、これを用いて豚
由来の培養細胞（ＣＰＫ細胞）を培養し、当該細胞の増
殖に対する効果の有無を調べた。その結果、ＦＳ−Ｌ３
細胞の培養上清を添加した培養液では、血清の全く添加
されていない培養液に比較して良好な細胞増殖を示し、
細胞増殖を促進する物質（細胞増殖因子様物質）が存在
することが確認された。このことから、ＦＳ−Ｌ３細胞
が細胞増殖因子様物質を産生していることが明らかとな
った。
不含の培養液に１０％の割合で添加し、これを用いて豚
由来の培養細胞（ＣＰＫ細胞）を培養し、当該細胞の増
殖に対する効果の有無を調べた。その結果、ＦＳ−Ｌ３
細胞の培養上清を添加した培養液では、血清の全く添加
されていない培養液に比較して良好な細胞増殖を示し、
細胞増殖を促進する物質（細胞増殖因子様物質）が存在
することが確認された。このことから、ＦＳ−Ｌ３細胞
が細胞増殖因子様物質を産生していることが明らかとな
った。
【００２３】
【発明の効果】本発明により、以下に指摘する効果が奏
される。 無血清培養液を用いて各種動物由来の細胞を増殖させ
ることが可能となり、その利用性が広がる。 ＦＳ−Ｌ３細胞を用いるＨＣＶのウイルス検査法や抗
体検査法は、培養液中に血清を添加しないで実施できる
ため、高頻度に検出されるＢＶＤＶ（ＨＣＶと共通の抗
原を有する）の抗体を事前に検査する必要がない。 従来のＥＮＤ法や干渉法に用いられていた病原性の強
いウイルス等を漏洩する危険がなくなり、都道府県の家
畜保健衛生所や病性鑑定所で実施する検査業務を安全か
つ省力的に行なうことができる。 ＦＳ−Ｌ３細胞は無血清培養液から得られ、レトロウ
イルス、サーコウイルス、ペスチウイルス等の迷入が否
定されているので、豚コレラや牛ウイルス性下痢ワクチ
ン等の生物学的製剤の製造に使用することにより、製品
の均一化、安全性の確保、省力化、製造コストの低減を
図ることができる。 ＦＳ−Ｌ３細胞は狂犬病ワクチンなどの他の疾病の生
物学的製剤に応用可能である。 ＦＳ−Ｌ３細胞の増殖に伴い産生される細胞増殖因子
様物質を一般の細胞増殖用培養液の添加物として利用す
ることができる。
される。 無血清培養液を用いて各種動物由来の細胞を増殖させ
ることが可能となり、その利用性が広がる。 ＦＳ−Ｌ３細胞を用いるＨＣＶのウイルス検査法や抗
体検査法は、培養液中に血清を添加しないで実施できる
ため、高頻度に検出されるＢＶＤＶ（ＨＣＶと共通の抗
原を有する）の抗体を事前に検査する必要がない。 従来のＥＮＤ法や干渉法に用いられていた病原性の強
いウイルス等を漏洩する危険がなくなり、都道府県の家
畜保健衛生所や病性鑑定所で実施する検査業務を安全か
つ省力的に行なうことができる。 ＦＳ−Ｌ３細胞は無血清培養液から得られ、レトロウ
イルス、サーコウイルス、ペスチウイルス等の迷入が否
定されているので、豚コレラや牛ウイルス性下痢ワクチ
ン等の生物学的製剤の製造に使用することにより、製品
の均一化、安全性の確保、省力化、製造コストの低減を
図ることができる。 ＦＳ−Ｌ３細胞は狂犬病ワクチンなどの他の疾病の生
物学的製剤に応用可能である。 ＦＳ−Ｌ３細胞の増殖に伴い産生される細胞増殖因子
様物質を一般の細胞増殖用培養液の添加物として利用す
ることができる。
【図１】 無血清培養液におけるＦＳ−Ｌ３細胞の増殖
曲線である。
曲線である。
【図２】 ＦＳ−Ｌ３細胞のドーム形成を示す顕微鏡写
真である。
真である。
【図３】 ＦＳ−Ｌ３細胞および各種動物由来の細胞の
ドットブロットハイブリダイゼーションの結果を示す。
ドットブロットハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図４】 ＦＳ−Ｌ３細胞の染色体数の分布率を示す。
【図５】 ＦＳ−Ｌ３細胞の培養上清の逆転写酵素活性
を示す。陽性対照は豚由来のＣＰＫ細胞（白色部）であ
る。
を示す。陽性対照は豚由来のＣＰＫ細胞（白色部）であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ
Claims (6)
- 【請求項１】 病原体の迷入がなく、細胞表層にドーム
を形成する、豚腎尿細管上皮細胞由来株化細胞（ＦＳ−
Ｌ３細胞）（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８０６）。 - 【請求項２】 精製水中にEagle MEM ９．４ｇ／Ｌ，Tr
yptose PhosphateBroth ２．９５ｇ／ＬおよびBacto-P
eptone ５．００〜１０．００ｇ／Ｌを溶解させたこと
を特徴とするＦＳ−Ｌ３細胞増殖用無血清培養液。 - 【請求項３】 請求項２に記載の無血清培養液を用いて
哺乳類由来細胞を分化させることを特徴とする無血清培
養液で増殖可能な細胞系の作出方法。 - 【請求項４】 無血清培養液で増殖可能な細胞系が、Ｆ
Ｓ−Ｌ３細胞である請求項３記載の作出方法。 - 【請求項５】 請求項１に記載のＦＳ−Ｌ３細胞を用い
て豚コレラ，牛ウイルス性下痢，狂犬病等の疾病の診断
用抗原および／またはワクチンを製造する方法。 - 【請求項６】 請求項２に記載の無血清培養液を用いて
ＦＳ−Ｌ３細胞を増殖させて細胞増殖因子様物質を生産
させ、当該物質を採取することを特徴とする細胞増殖因
子様物質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7078471A JP2636199B2 (ja) | 1995-03-10 | 1995-03-10 | 豚腎尿細管上皮細胞由来株化細胞（ｆｓ−ｌ３細胞）、当該細胞増殖用無血清培養液およびそれを用いる株化細胞の作出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7078471A JP2636199B2 (ja) | 1995-03-10 | 1995-03-10 | 豚腎尿細管上皮細胞由来株化細胞（ｆｓ−ｌ３細胞）、当該細胞増殖用無血清培養液およびそれを用いる株化細胞の作出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08242848A JPH08242848A (ja) | 1996-09-24 |
| JP2636199B2 true JP2636199B2 (ja) | 1997-07-30 |
Family
ID=13662937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7078471A Expired - Lifetime JP2636199B2 (ja) | 1995-03-10 | 1995-03-10 | 豚腎尿細管上皮細胞由来株化細胞（ｆｓ−ｌ３細胞）、当該細胞増殖用無血清培養液およびそれを用いる株化細胞の作出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2636199B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5134964B2 (ja) * | 2005-10-05 | 2013-01-30 | ジェノミディア株式会社 | 単離されたヒト細胞、その取得方法及び用途 |
| JP5544122B2 (ja) * | 2009-07-27 | 2014-07-09 | 森永製菓株式会社 | 潤い効果の評価方法 |
-
1995
- 1995-03-10 JP JP7078471A patent/JP2636199B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08242848A (ja) | 1996-09-24 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |