CN102805863B - 一种人二倍体细胞培养新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种使用转瓶培养人二倍体细胞MRC-5细胞和新布尼亚病毒(JS-2007-001)毒种来制备新布尼亚病毒(SFTS bunyavirus)纯化灭活疫苗的方法。本发明采用新布尼亚病毒(JS-2007-001)毒种，用转瓶培养人二倍体MRC-5细胞为产毒细胞，经过细胞扩增、病毒种子驯化、接种、培养、收集病毒滤液，再经过除菌、浓缩以及加入保护液制备成品疫苗。

Description

一种人二倍体细胞培养新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法

1.发明领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新布尼亚病毒(SFTSbunyavirus)纯化灭活疫苗的制备方法。

2.发明背景

新布尼亚病毒(Novel Bunyavirus，SFTS Bunyavirus)，是发热伴血小板减少综合症(Fever with Throbocytopenia Associated syndrome，SFTS)的病原，为布尼亚病毒科白蛉热病毒属的一种新型病毒，于2009年在中国首先发现，也是中国首例发现的新型病毒。患者出现以高热、血小板减少、白血球降低、多器官功能紊乱、出血等为特征的严重急性传染病，严重影响着人民的健康和生命安全。到目前为止，全国已有河南、江苏、湖北、山东、安徽和辽宁等16个省发现300多病例，造成40余人死亡。中国国家疾控中心、江苏省疾控中心先后成功的分离到该病病毒，并对其进行了病原学、流行病学、临床医学等研究。目前该病毒序列已经阐明，但是对SFTS尚无特效药治疗和疫苗预防。

3.发明内容

本发明的目的之一在于提供了一株新的，用于制备灭活疫苗的新布尼亚病毒JS-2007-001，该病毒分类命名为新布尼亚病毒(Severe fever withthrombocytopenia syndrome virus；Novel Bunyaviridae)，其保藏号为CCTCC V201211；保藏时间为2012年3月1日；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山。

本发明的目的之二在于提供了将上述新布尼亚病毒JS-2007-001制备成为纯化灭活疫苗的方法。

本发明的优点在于，经过适应性培养、免疫原性鉴定和免疫保护作用鉴定发现，本发明中涉及的JS-2007-001病毒毒种具有最佳的生长特性和适应特性，在较短时间内达到生长高峰，可稳定获得较高滴度病毒，免疫动物获得抗体水平较高，从而能开发成为一种稳定的可商业化应用的纯化灭活疫苗。

具体的，本发明涉及了一种新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法，其包括如下步骤：1)采用转瓶培养人二倍体MRC-5细胞为产毒细胞；2)以保藏号为CCTCC V201211的新布尼亚病毒JS-2007-001作为毒种进行接种；3)接种、培养，收集病毒滤液；4)将病毒滤液进行灭活、除菌、浓缩和纯化；以及5)加入病毒保护剂，并检定合格后制备成品疫苗。

在所述的制备方法中，其中所述的接种人二倍体MRC-5细胞的毒种为经二倍体细胞MRC-5传代适应的毒种，该毒种滴度按CCID₅₀法不低于7.0lgCCID₅₀/mL。

上述制备方法的培养步骤具体为：

1)制备人二倍体细胞培养液。所述人二倍体细胞培养液为含10％新生牛血清、0.3％水解乳蛋白、1％NaHCO₃、2mM谷氨酰胺的MEM培养基；

2)采用3L、10L或15L转瓶培养人二倍体细胞，其按1∶2或1∶4进行细胞传代，37℃培养，待细胞成片后接种二倍体细胞毒种；

3)接种病毒。包括倒去培养液，加入浓度为100～1000CCID₅₀/mL病毒，其MOI为0.001～0.0001；将接种病毒后的细胞置于33℃～35℃12小时，使病毒与细胞充分接触吸附；然后倒去病毒液，用0.01磷酸盐缓冲液对细胞表面进行冲洗；最后加入pH7.4～7.6DMEM溶液，送入33℃～35℃恒温室进行培养；

4)将病毒培养144～168小时，当细胞病变达到“++++”后开始收获病毒；收获的病毒液按1∶4000加入β丙内酯，灭活72小时后进行浓缩纯化；

5)纯化后的病毒液加入病毒保护剂除菌，检定合格后即为疫苗原液，再经分装，各项检验合格后制成疫苗。

本发明所述的制备方法获得的疫苗主要质量指标为：病毒滴度≥7.0lgCCID₅₀/mL；疫苗免疫剂量：0.5mL/剂/人；抗生素残留量：≤50ng/剂；牛血清残留量：≤50ng/剂；热原：≤20EU/剂；疫苗pH：7.4-7.8；热稳定性：符合2010年药典第三部标准，合格；疫苗效力：15μg/剂免疫动物对新布尼亚病毒感染≥90％保护作用；无菌检查：符合2010年药典第三部标准；支原体检查：符合2010年药典第三部标准；异常毒性试验：符合2010年药典第三部标准疫苗。其它各项指标符合2000版《中国药典》标准。

4.附图说明

图1为人二倍体细胞MRC-5制备新布尼亚病毒灭活疫苗方法。

5.具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。本实施例仅仅用于对本发明的说明，不构成对本发明的限制。

实施例1：细胞复苏和传代培养

人二倍体细胞MRC-5购自美国科尼尔公司，冷冻细胞37℃解冻，加入37℃预热的MEM培养基(Invitrogen)。1000RPM离心10分钟，收集细胞，新用1mL完全培养基(MEM培养基加上10％胎牛血清、0.3％水解乳蛋白、1％NaHCO₃、2mM谷氨酰胺溶液)悬浮，进行细胞计数，按1.5×10⁶/mL细胞接种到每个含10mL完全培养基的25cm²细胞培养瓶。置于37℃，5％CO₂相对湿度90％细胞培养箱培养。当细胞形成完全单层时，倒掉培养基，加入0.25％胰蛋白酶(Invitrogen)(PH7.6-7.8)，消化到细胞单层表面出现针孔样时加入10mL MEM培养基吹打到形成单细胞悬液，1000RPM离心10分钟，收集细胞，1mL完全培养基悬浮，进行细胞计数，每个含10mL完全培养基的25cm²细胞培养瓶接种1.5×10⁶/mL细胞，标明时间和世代，置于37℃，5％CO₂相对湿度90％细胞培养箱培养。

实施例2：转瓶扩增培养人二倍体细胞MRC-5

采用3L、10L或15L转瓶培养人二倍体细胞。分别接种1.5×10⁵/mL细胞400m l、1000m l、1500m l到装有完全培养基的3L、10L或15L细胞转瓶中，置于37℃细胞培养箱培养。经历5～6天，细胞形成完全单层时，常规消化制备单细胞悬液，按1∶2或1∶4进行细胞传代，37℃培养。

实施例3：二倍体细胞适应新布尼亚病毒株的建立

7株新布尼亚病毒株分别分离自江苏和安徽疫区，6株直接分离于病人血清，1株来源于可疑病犬。分离时所有细胞为VERO细胞(表1)。

表1：7株新布尼亚病毒株的分离时间与来源

7株新布尼亚病毒株在VERO细胞做适应性培养、免疫原性鉴定和免疫保护作用鉴定发现，JS-2007-001病毒毒种具有最佳的生长特性和适应特性，在较短时间内达到生长高峰，可稳定获得较高滴度病毒，免疫动物获得抗体水平较高，免疫血清中和试验发现对所有7株病毒均有良好的保护作用。所以选JS-2007-001病毒毒种作疫苗制备毒种。来源于犬类的毒种(JS-2010-DOG)因为考虑到种属差异可能的潜在不确定性，尽管检测指标较好，依然没有选用(表2)。

表2：7株新布尼亚病毒株的培养特性和免疫特性鉴定

VERO细胞为动物传代细胞，考虑疫苗制备的安全性要求，我们将6株新布尼亚病毒株在人二倍体细胞MRC5上进行了的培养特性和免疫特性鉴定，结果与VERO细胞基本相似，考虑到疫苗制备应该具备病毒毒种的统一性，选用JS-2007-001病毒毒种作MRC5驯化适应疫苗毒种。

当细胞形成完全单层时，先倒去营养液，加入浓度为100～1000CCID₅₀/mL的新布尼亚病毒(JS-2007-001病毒毒株)毒种。其MOI为0.001～0.0001。接种病毒后的细胞置33℃～35℃12小时，使病毒与细胞充分接触吸附。然后倒去病毒液，用磷酸盐缓冲液(PBS)对细胞表面进行冲洗，最后加入含0.1％人白蛋白，pH 7.4～7.6DMEM维持液，置于33℃～35℃恒温室进行培养。病毒培养144～168小时后根据细胞病变(CPE)的发展进行收获，CPE达到“++++”时，病毒滴度可达到高峰。收获病毒培养液，并测定病毒滴度。所产病毒作为毒种接种新的二倍体细胞。通过反复多次传代，病变出现的时间逐渐提前至为3～4天，而病毒滴度亦随着传代次数的增加，而逐渐升高，滴度达到7.0-8.0lgCCID₅₀/mL，说明新布尼亚病毒已适应到这些细胞上，获得了适应MRC-5细胞新布尼亚病毒(JS-2007-001病毒毒株)毒种。

收获的病毒从5代以后，每5代进行免疫原性检查和DNA序列分析。选择稳定代次作为主代毒种和工作种子。

免疫原性检查：

JS-2007-001病毒毒种在VERO细胞培养后产生的病毒收获后，经1∶4000加入β丙内酯灭活制成疫苗，用腹腔法免疫小鼠2次，间隔7天，于第一次免疫后4周采集小鼠血分离血清。试验时采用血清定量病毒变量法检测其免疫原性(抵抗病毒的能力)，即将病毒进行10倍系列稀由10^-1至10^-9，抗血清与等量的10^-2-10^-6的病毒混合，对照组阴性血清与等量的10^-5-10^-9的病毒混合，于37℃水浴中和90分钟后接种VERO细胞，观察两组细胞出现“++”病变终点，计算两组滴度之差，即是该抗血清抵抗病毒的能力其能力不低于500。

抗原性检查：

JS-2007-001病毒毒种在VERO细胞培养后产生的病毒收获后，经1∶4000加入β丙内酯灭活制成疫苗，用腹腔法免疫小鼠2次，间隔7天，于第一次免疫后4周采集小鼠血分离血清。试验时采用血清变量病毒定量法，来检测疫苗免疫小鼠后产生的免疫应答能力(血清中和效价)，

用100个CCID₅₀/mL的病毒量，与10、20、40、80、160、320倍稀释的小鼠抗血清与等量的病毒混合，置37℃中和90分钟后接种细胞，以细胞出现“++”病变为终点，即该血清的中和效价，亦即疫苗免疫小数后产生的免疫应答能力。其效价一般在1∶160-1∶320之间。

实施例4：病毒接种、培养与收获

病毒接种方法为：待细胞成片后，接种人二倍体细胞MRC-5适应的新布尼亚病毒(JS-2007-001病毒毒株)毒种。先倒去营养液，加入浓度为100～1000CCID₅₀/mL病毒液。其MOI为0.001～0.0001。接种病毒后的细胞置33℃～35培养12小时，使病毒与细胞充分接触吸附。然后倒去病毒液，用PBS对细胞表面进行冲洗，最后加入含0.1％人白蛋白、pH 7.4～7.6DMEM维持液，置于33℃～35℃恒温室进行培养。

病毒培养144～168小时后根据CPE的发展进行收获，CPE达到“++++”时，病毒滴度可达到高峰。每次收获后，可根据二倍体细胞CPE情况再补加新的病毒维持液。

实施例5：病毒灭活。

采用1∶4000的β-丙内酯灭活，2～10℃72小时可以灭活病毒。检验灭活效果，将灭活的病毒液接种人二倍体细胞MRC-5上培养，并盲传3代，用荧光免疫检查无病变细胞，说明病毒已完全被灭活。

实施例6：病毒液的浓缩、纯化：

用经过截留分子量30万以上分子的超滤器(Minipore，USA)对病毒液透析浓缩。用截留分子量30万以上分子的超滤器(Minipore，USA)对病毒液透析浓缩。把疫苗浓缩到一定体积，然后加入PBS稀释至原体积，再按前浓缩倍数浓缩，再加入PBS至原体积。如此反复4～6次，除去绝决大部分残留的牛血清蛋白。用Sepharose 4ff(GE Healthcare Life Sciences)凝胶层析进一步去除疫苗中的小分子杂质与残留的牛血清蛋白，用BSAELISA检测试剂盒(博生公司，无锡)检测牛血清残留量，应低于《国家药典》规程≤50ng/剂的要求。然后加入1％(V/V)换人白蛋白作为疫苗保护液。经过0.2μm孔径的滤器过滤除菌，即为疫苗原液。取样做无菌试验、DNA含量、总蛋白含量、宿主蛋白等检测。送入2-8℃保存。

实施例8：疫苗的制备与分装

检测合格后的病毒原液按病毒总蛋白量分装15μg/剂分装。

分装后，进行检定，各项指标合格后即为成品疫苗。

本发明所述的制备方法，疫苗主要质量指标为：病毒滴度≥7.0lgCCID₅₀/mL；疫苗免疫剂量：0.5mL/剂/人；抗生素残留量：≤50ng/剂；牛血清残留量：≤50ng/剂；热原：≤20EU/剂；疫苗pH：7.4-7.8；热稳定性：符合2010年药典第三部标准，合格；疫苗效力15μg/剂免疫动物对新布尼亚病毒感染≥90％保护作用；无菌检查：符合2010年药典第三部标准；支原体检查：符合2010年药典第三部标准；异常毒性试验：符合2010年药典第三部标准疫苗各项指标符合2010版《中国药典》标准。

Claims (3)

1.一种新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

1)采用转瓶培养人二倍体MRC-5细胞为产毒细胞；2)以保藏号为CCTCC V201211的新布尼亚病毒JS-2007-001作为毒种进行接种；3)接种、培养，收集病毒滤液；4)将病毒滤液进行灭活、除菌、浓缩和纯化；以及5)加入保护液，并检定合格后制备成品疫苗。

2.如权利要求1所述的制备方法，其中所述的人二倍体MRC-5产毒细胞为经二倍体细胞MRC-5传代适应的毒种，该毒种滴度按CCID₅₀法不低于7.0lgCCID₅₀/mL。

3.如权利要求1所述的制备方法，其中所述的培养步骤具体为：

1)制备人二倍体细胞培养液，所述人二倍体细胞培养液为含10％新生牛血清、0.3％水解乳蛋白、1％NaHCO₃、2mM谷氨酰胺的MEM培养基；

2)采用3L、10L或15L转瓶培养人二倍体细胞，其按1∶2或1∶4进行细胞传代，37℃培养，待细胞成片后接种二倍体细胞毒种；

3)接种病毒，包括倒去培养液，加入浓度为100～1000CCID₅₀/mL病毒，其MOI为0.001～0.0001；将接种病毒后的细胞置于33℃～35℃下12小时，使病毒与细胞充分接触吸附；然后倒去病毒液，用0.01磷酸盐缓冲液对细胞表面进行冲洗；最后加入含0.1％人白蛋白pH7.4～7.6DMEM溶液，送入33℃～35℃恒温室进行培养；

4)将病毒培养144～168小时，当细胞病变达到“++++”后开始收获病毒；收获的病毒液按1∶4000加入β丙内酯，灭活72小时后进行浓缩纯化；

5)纯化后的病毒液加入病毒保护剂后除菌，检定合格后即为单价病毒液，再经分装，各项检验合格后制成疫苗。