CN103751772A - 一种制备f基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法，将腮腺炎减毒毒株MHM-19接种到培养至单层的人胚肺二倍体细胞MHL-3中，待病毒增殖高峰期，冻融细胞释放病毒，离心去除细胞碎片，向离心后的病毒悬液中加入保护剂，制成疫苗半成品，将半成品进行冷冻干燥，即得F基因型腮腺炎减毒活疫苗成品。通过本发明方法制备的MHM-19株减毒活疫苗在免疫注射恒河猴之后，可诱导产生较好的体液免疫效果，在免疫接种后不同时间测定其免疫效价均高于腮腺炎参考苗S79，且安全性实验表明，MHM-19减毒活疫苗对恒河猴没有产生腮腺炎相关症状，病理组织观察情况与S79株相比无显著差异，因此MHM-19疫苗具有良好的安全性。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗制备领域，具体地说，涉及一种制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法。
背景技术
流行性腮腺炎，简称腮腺炎或流腮，是由腮腺炎病毒所致的急性全身性传染病。腮腺炎在世界范围内流行，全年均可发病，以冬春季为主。任何年龄均可发病，以5-15岁患者居多，1岁以下和15岁以上很少发病。感染后一般可获得终身免疫。感染潜伏期14～25日，平均18日。临床特征为腮腺肿痛，可伴发热、头痛等。早期患者及隐性感染者均为传染源。通过空气飞沫或直接接触唾液及唾液污染的食具玩具等传播。MuV是腮腺炎最常见的病因，可引起脑炎、睾丸炎、卵巢炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎、心肌炎、乳腺炎、甲状腺炎等。大多数严重并发症在成人中较多见，青春期后男性患者中25％出现睾丸炎。有1-10％临床腮腺炎患者出现轻型无菌性脑膜炎，腮腺炎脑膜炎可造成永久性后遗症，包括瘫痪、癫瘸、颅神经麻痹、脑积水等。经发现，妊娠早期（3个月内）感染腮腺炎病毒的孕妇中有25％会自然流产，其发生率高于风疹病毒感染。
在我国，尽管已在大范围人群内使用了疫苗，但是近年来腮腺炎呈现一种高发的态势，以卫生部公布的全国法定传染病疫情为例，流行性腮腺炎连续几年均高居全国丙类传染病报告数的第二位。国际通用的Jeryl--Lynn株及我国使用的S79株减毒毒种均属于流行于60年代后的A基因型，而当前我国流行的腮腺炎病毒株主要为F基因型。不同基因型之间的中和抗原会有一定差异，可能会导致不完全交叉性保护。我国近10年来腮腺炎减毒活疫苗纳入免疫规划，无偿接种，但腮腺炎的发病率依然维持在较高水平。此外，目前我国常规使用的Jeryl-Lynn株及S79株减毒活疫苗均是以鸡胚细胞为基质进行生产而来的。鸡胚细胞（CEC）作为一种异源性细胞基质，可能带来过敏反应；可能携带传染性禽逆转录病毒；并且每批原代细胞质量不稳定，导致对同一个病毒灵敏度存在差异,影响产品的稳定性等不足。而使用人二倍体细胞进行腮腺炎减毒毒种的制备以及疫苗的植被，不存在致肿瘤的潜在危险性及其他不良反应，且有利于质量控制。
因而，通过人二倍体细胞基质对腮腺炎病毒进行培养和疫苗的制备，从而研究开发我国流行的绝对优势F基因型腮腺炎疫苗，对我国腮腺炎的防控具有重要意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法，将腮腺炎减毒毒株MHM-19接种到培养至单层的人胚肺二倍体细胞MHL-3中，待病毒增殖高峰期，冻融细胞释放病毒，离心去除细胞碎片，向离心后的病毒悬液中加入保护剂，制成F基因型腮腺炎减毒活疫苗半成品，将半成品进行冷冻干燥，即得F基因型腮腺炎减毒活疫苗成品。
其中，保护剂配方为：右旋糖酐6%、蔗糖15%、海藻糖9%、精氨酸0.3%、尿素1.5%、人白蛋白1%和谷氨酸钠1.5%，以PBS缓冲液配制。
具体地，上述方法包括如下步骤：
1）在细胞瓶内培养人胚肺二倍体细胞MHL-3至细胞长成单层，用0.25%胰蛋白酶溶液消化成单个细胞，去除细胞瓶内的胰蛋白酶溶液，加入MEM细胞培养液稀释至105个细胞/mL，然后接种于CELLFACTORIES（丹麦NUNC公司）或CELL STACK（美国CORNING公司），置于37℃培养；
2）待MHL-3细胞长成单层弃去培养液，用Earl’s液清洗细胞表面；
3）按MOI=0.1接种F基因型腮腺炎减毒毒株MHM-19的病毒悬液，加入MEM维持液置于33℃培养；
4）培养48h后，弃去维持液，用Earl’s液清洗细胞表面，加入MEM维持液置于33℃培养；
5）待MHL-3细胞完全病变（病变达++++），冻融三次，释放病毒，制成腮腺炎病毒悬液，4000rpm/min、4℃离心，去除细胞碎片；向离心后的病毒悬液中加入保护剂，制成F基因型腮腺炎减毒活疫苗半成品；
6）将半成品分装并进行冷冻干燥，制成F基因型腮腺炎减毒活疫苗成品。
步骤1）中使用丹麦NUNC公司生产的CELL FACTORIES或美国CORNING公司生产的Cell STACK，译为细胞工厂或细胞培养室，两者培养原理相同，外观尺寸略有不同。细胞工厂可有效节省空间和培养液，保证操作的无菌性。
步骤1）中所述MEM培养液中含有0.03%谷氨酰胺、0.08%碳酸氢钠和10%小牛血清，以水配制；步骤3）和4）中所述MEM维持液中含有0.08%碳酸氢钠、0.03%谷氨酰胺和2%小牛血清，以水配制。
步骤5）中病毒悬液与保护剂按2:1的体积比混合。
本发明还提供根据上述所述方法制备的F基因型腮腺炎减毒活疫苗。
本发明还提供所述F基因型腮腺炎减毒活疫苗在制备用于预防腮腺炎的药物中的应用。
本发明中涉及的F基因型腮腺炎减毒毒株MHM-19是将F基因型腮腺炎病毒MHM-19株连续在MHL-3细胞上传代28次获得的减毒毒株。具体为：取含有人胚肺二倍体细胞MHL-3的冻存管，迅速放入40℃水浴中融化，然后加入到预温到37℃的MEM细胞培养液中，置于37℃培养，经2-3天长成单层后接种F基因型腮腺炎病毒MHM-19株悬液，75cm2培养瓶接种1mL病毒悬液，加20mL维持液，置于33℃培养，培养10天，冻融三次，充分释放病毒到细胞上清中，制成病毒悬液。其中，所述维持液为MEM加2%的小牛血清。按以上方法，将F基因型腮腺炎病毒MHM-19株连续在MHL-3细胞上传代28次，最终获得在MHL-3细胞上适应性好的F基因型腮腺炎减毒毒株MHM-19。
本发明进一步提供一种疫苗冻干保护剂，所述保护剂的配方为：右旋糖酐6%、蔗糖15%、海藻糖9%、精氨酸0.3%、尿素1.5%、人白蛋白1%和谷氨酸钠1.5%，以PBS缓冲液配制。
通过本发明方法制备的Ｆ基因型腮腺炎减毒活疫苗（MHM-19株减毒活疫苗）在免疫注射恒河猴之后，可诱导产生较好的体液免疫效果，在免疫接种后不同时间测定其免疫效价均高于腮腺炎参考苗S79，且安全性实验表明，MHM-19减毒活疫苗对恒河猴没有产生腮腺炎相关症状，病理组织观察情况与S79株相比无显著差异，因此MHM-19疫苗具有良好的安全性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1F基因型腮腺炎减毒活疫苗及其制备方法
取长成单层的人胚肺二倍体细胞MHL-3（MHL-3购自北京民海生物科技有限公司），用0.25%胰蛋白酶溶液消化，细胞经胰蛋白酶溶液浸泡后形成单个细胞后，倒去细胞瓶内的胰蛋白酶溶液，加入已预温37℃的MEM细胞培养液稀释到105个细胞/mL。然后接种于细胞工厂，置于37℃培养24-48h。
待MHL-3细胞长成单层弃去原培养液，用Earl’s液清洗细胞面及细胞工厂侧壁。按0.1MOI接种F基因型腮腺炎病毒MHM-19悬液，加MEM维持液置于33℃培养。
其中，MEM培养液为含有0.03%谷氨酰胺、0.08%碳酸氢钠、10%小牛血清；MEM维持液为含有0.08%碳酸氢钠、0.03%谷氨酰胺、2%小牛血清。细胞工厂是丹麦NUNC公司出品的CELL FACTORIES或美国CORNING公司出品的Cell STACK，译为细胞工厂或细胞培养室，两者培养原理相同，外观尺寸略有不同。细胞工厂可有效节省空间和培养液，保证操作的无菌性。
待培养48h后，弃去培养液，用Earl’s液清洗细胞面，以充分去除残留的牛血清白蛋白，加MEM维持液置于33℃培养；待MHL-3细胞完全病变时（病变达++++），将细胞培养物冻融三次，使病毒充分释放。4000rpm/min，4℃离心去除细胞碎片，制备成腮腺炎病毒悬液。
对腮腺炎减毒活疫苗MHM-19病毒原液进行相关检测。检测项为病毒鉴定、病毒滴度滴定、澄清度检测、无菌检测、支原体检测，外源因子检测、神经毒力检测。检测结果如表1所示。
表1MHM-19病毒原液相关检测结果
所述腮腺炎减毒活疫苗MHM-19病毒原液的制备方法为：取含有人胚肺二倍体细胞MHL-3的冻存管，迅速放入40℃水浴中融化，然后加入到预温到37℃的MEM细胞培养液中，置于37℃培养，经2-3天长成单层后接种F基因型腮腺炎病毒MHM-19株悬液，75cm2培养瓶接种1mL病毒悬液，加20mL维持液，置于33℃培养，培养10天，冻融三次，充分释放病毒到细胞上清中，制成病毒悬液。其中，所述维持液为MEM加2%的小牛血清。按以上方法，将F基因型腮腺炎病毒MHM-19株连续在MHL-3细胞上传代28次制备获得。
将离心后的病毒悬液加入保护剂制成F基因型腮腺炎减毒活疫苗半成品，病毒液与保护剂混合比例为2:1，保护剂配方（3×）为：右旋糖酐6%、蔗糖15%、海藻糖9%、精氨酸0.3%、尿素1.5%、人白蛋白1%和谷氨酸钠1.5%，以PBS缓冲液配制。
对F基因型腮腺炎减毒活疫苗半成品进行无菌检测。检测结果为阴性。
将F基因型腮腺炎减毒活疫苗半成品按0.6mL/只分装并进行冷冻干燥，制备成F基因型腮腺炎减毒活疫苗成品。
实施例2F基因型腮腺炎减毒活疫苗的质量检测
对实施例1中制备的F基因型腮腺炎减毒活疫苗成品进行相关检测。检测项目有：鉴定实验、外观检查、水分检测、病毒滴度、热稳定性试验、牛血清白蛋白残留量检测、无菌检查、异常毒性检查。检测结果如表2所示。
表2F基因型腮腺炎减毒活疫苗成品相关检测结果
实施例3F基因型腮腺炎减毒活疫苗的免疫原性分析
筛选腮腺炎抗体阴性的恒河猴15只(年龄2-3岁，体重3kg±0.5kg)，随即分为3组，MHM-19株（实施例1中制备）与S79株腮腺炎减毒活疫苗分别各免疫一组恒河猴，阴性对照一组注射0.5mlDMEM，免疫方式为皮下免疫。免疫后2、4、8、12、24周取血分离血清进行中和抗体测定。结果如表3所示，阴性对照组的血清中和抗体效价均小于2，呈阴性，MHM-19及S79实验组均具有较好的中和抗体反应，且MHM-19与S79株免疫效果具有显著差异（P<0.05）。在试验期间，各试验组恒河猴均无腮腺肿大，体温升高，精神状态异常等体征。于免疫4周时，取试验组各2只恒河猴，猴体取腮腺组织进行病理观察，结果表明，各试验猴腮腺组织均无淋巴细胞浸润等病理现象，因此，MHM-19安全性较好，不低于S79参考腮腺炎疫苗。
表3MHM-19与S79疫苗恒河猴免疫原性结果
| 免疫时间 | MHM-19 | S79 |
| 2 | 1:20 | 1:8 |
| 4 | 1:40 | 1:32 |
| 8 | 1:70 | 1:40 |
| 12 | 1:121 | 1:65 |
| 24 | 1:90 | 1:20 |
经猴体免疫原性实验表明，采用本发明方法制备的F基因型腮腺炎减毒活疫苗免疫原性及安全性优于参考苗。本发明可以提供我国流行的腮腺炎病毒绝对优势F基因型疫苗，其免疫原性及安全性均不低于现行使用的腮腺炎疫苗。由于采用人二倍体细胞作为培养基质，避免了异源基质疫苗产生的过敏反应等不良影响。
另外，本发明还提供了一种不含明胶的疫苗冷冻干燥保护剂，使得疫苗在冻干后具有良好的外观，较低的水分以及较好的稳定性。本疫苗生产简化工艺，缩短生产周期，降低生产成本，实现F基因型腮腺炎减毒活疫苗的规模化生产。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，将腮腺炎减毒毒株MHM-19接种到培养至单层的人胚肺二倍体细胞MHL-3中，待病毒增殖高峰期，冻融细胞释放病毒，离心去除细胞碎片，向离心后的病毒悬液中加入保护剂，制成F基因型腮腺炎减毒活疫苗半成品，将半成品进行冷冻干燥，即得F基因型腮腺炎减毒活疫苗成品；
其中，保护剂配方为：右旋糖酐6%、蔗糖15%、海藻糖9%、精氨酸0.3%、尿素1.5%、人白蛋白1%和谷氨酸钠1.5%，以PBS缓冲液配制。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）在细胞瓶内培养人胚肺二倍体细胞MHL-3至细胞长成单层，用0.25%胰蛋白酶溶液消化成单个细胞，去除细胞瓶内的胰蛋白酶溶液，加入MEM细胞培养液稀释至105个细胞/mL，然后接种于CELLFACTORIES或CELL STACK，置于37℃培养；
2）待MHL-3细胞长成单层弃去培养液，用Earl’s液清洗细胞表面；
3）按MOI=0.1接种F基因型腮腺炎减毒毒株MHM-19的病毒悬液，加入MEM维持液置于33℃培养；
4）培养48h后，弃去维持液，用Earl’s液清洗细胞表面，加入MEM维持液置于33℃培养；
5）待MHL-3细胞完全病变，冻融三次，释放病毒，制成腮腺炎病毒悬液，4000rpm/min、4℃离心，去除细胞碎片；向离心后的病毒悬液中加入保护剂，制成F基因型腮腺炎减毒活疫苗半成品；
6）将半成品分装并进行冷冻干燥，制成F基因型腮腺炎减毒活疫苗成品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述MEM培养液中含有0.03%谷氨酰胺、0.08%碳酸氢钠和10%小牛血清，以水配制；步骤3）和4）中所述MEM维持液中含有0.08%碳酸氢钠、0.03%谷氨酰胺和2%小牛血清，以水配制。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5）中病毒悬液与保护剂按2:1的体积比混合。
5.根据权利要求1-4任一项所述方法制备的F基因型腮腺炎减毒活疫苗。
6.权利要求5所述F基因型腮腺炎减毒活疫苗在制备用于预防腮腺炎的药物中的应用。
7.一种疫苗冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂的配方为：右旋糖酐6%、蔗糖15%、海藻糖9%、精氨酸0.3%、尿素1.5%、人白蛋白1%和谷氨酸钠1.5%，以PBS缓冲液配制。
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 100000 Beijing City, Daxing District Daxing biomedical industry base of Zhongguancun science and Technology Park Si Miao Road No. 35 Applicant after: Beijing Min Hai Bio-Scientific Inc. Address before: Zhongguancun science and Technology Park 102600 Beijing Daxing biomedical industry base Si Miao Road No. 1 Applicant before: Beijing Min Hai Bio-Scientific Inc. |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 102600 DAXING, BEIJING TO: 100000 DAXING, BEIJING |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140430 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |