CN111909905A - 一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法，包括：制备细胞悬液、单层细胞的制备、病毒液制备、超滤浓缩、原液配制、冻存，可获得病毒滴度损失率极低的腮腺炎减毒活疫苗病毒浓缩液，再配合半成品配制和冻干方法，可保证腮腺炎减毒活疫苗病毒疫苗在长时间保存过程中病毒滴度几乎无损失。

Description

一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法
技术领域
本发明属于疫苗病毒技术领域，具体涉及一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法。
背景技术
减毒活疫苗是指病原体经过处理后，A亚单位（毒性亚单位）的结构改变，毒性减弱，但B亚单位（结合亚单位）的活性保持不变，即保持了抗原性的一类疫苗；将其接种到身体内，不会引起疾病的发生，但病原体可以引发机体免疫反应，刺激机体产生特异性的记忆B细胞和记忆T细胞，起到获得长期或终生保护的作用，与灭活疫苗（死疫苗）相比，这类疫苗免疫力强、作用时间长。
目前腮腺炎减毒活疫苗领域，在病毒液收获之后，即进行半成品的配制和成品的制备。批间病毒收获液中的病毒浓度存在偏差，每批产品间的一致性得不到很好的控制；实际生产过程中每批病毒收获液的量很大，病毒液保存过程繁琐，费时费力，增加成本，病毒滴度损失较高，暂时没有解决这一问题的最佳方法。
因此，如何提供一种方法简单、效果稳定、滴度损失率低的腮腺炎减毒活疫苗病毒浓缩保藏方法是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明公开了一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法，本发明为生产制造企业提供了一条简便高效可行的病毒浓缩保存方法，为产品质量的提升提供了一项解决方案。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法，步骤包括：
1）制备细胞悬液：将孵化种蛋弃去鸡胚头和内脏，将其余组织制备成细胞悬液；
孵化种蛋为孵化9~11天的SPF种蛋；
2）单层细胞的制备：将细胞悬液，置于适宜温度下培养，培养成致密单层细胞；
优选的，适宜温度为36.5±0.5℃恒温条件；
3）病毒细胞的制备：待细胞长成致密单层后，弃去细胞营养液换上病毒生长液，接种病毒，调至合适的PH、温度恒温培养；感染40-56小时后弃去病毒生长液，去除牛血清白蛋白，去除后，换上不含牛血清白蛋白的病毒维持液，调至合适的PH、温度恒温培养，当融合性病变达到75%以上时，收获病毒液；
4）超滤浓缩：选择孔径大小为100-300KD的超滤膜包对病毒液进行1-50倍浓缩，得病毒浓缩液；
5）原液配制：将冻干保护剂与病毒浓缩液按1：4-1：6体积比混合，即为原液；
6）冻存：将配制好的原液于-60℃以下冻存；
所述冻干保护剂包括：终浓度为5%的乳糖、终浓度为2%的山梨醇和终浓度为0.5%的谷氨酸钠；
病毒生长液为含1.5%灭能新生牛血清、0.2%水解乳蛋白的Earle’s培养液；
病毒维持液为含0.8%人血白蛋白溶液的199培养液；
细胞营养液为含2.5%灭能新生牛血清、0.3%水解乳蛋白的Earle’s培养液；
半成品配制：取冻存后的腮腺炎减毒活疫苗原液按疫苗半成品目标病毒滴度加入适量稀释液配制成疫苗半成品；
优选的，疫苗半成品目标病毒滴度为6.0±0.3lg CCID50/ml；
优选的，稀释液为冻干保护剂；
优选的，稀释液为pH6.8~7.4的溶液；
优选的，按疫苗半成品目标病毒滴度；
优选的，疫苗半成品为冻干前的液态疫苗；
疫苗半成品在2-8℃条件下分装，冻干，得疫苗成品；
优选的，冻干条件：将疫苗半成品预冻阶段温度-45~-50℃，达到温度后维持2小时，升华干燥阶段最终温度-20℃，达到最终温度的时间为10小时，真空压力控制在5±1Pa，解吸干燥阶段最终温度28℃，真空不控制，运行8小时；
步骤1）中，将其余组织制备成细胞悬液的方法为：使用0.75‰胰蛋白酶溶液对组织进行消化，弃去消化液，吹打至糊状，加入细胞营养液，静置后，上部的细胞营养液，即为细胞悬液；
优选的，先将其余组织切割成2～3mm3小块，再使用0.75‰胰蛋白酶溶液对组织块进行消化，消化20分钟后弃去消化液，使用吹打管对组织块进行吹打至糊状后加入细胞营养液，摇匀静置，待组织块充分下沉后，将上部的细胞营养液取出，即为细胞悬液；
步骤2）中，单层细胞的制备方法为：用细胞营养液将细胞悬液稀释到细胞浓度为2×105个/ml，分装于细胞工厂中，每层细胞工厂加液200ml，置于36.5±0.5℃恒温室培养，培养至细胞长成致密单层细胞；
优选的，细胞工厂为10层；
步骤3）中，病毒细胞的制备：待细胞长成致密单层后，弃去细胞营养液换上病毒生长液，接种病毒，pH调至7.2-7.4，33.0±0.5℃恒温培养，感染40-56小时后弃去病毒生长液，去除牛血清白蛋白，去除后，换上不含牛血清白蛋白的病毒维持液，pH调制7.4-7.6，33±0.5℃恒温培养，当融合性病变达到75%以上时，收获病毒液；
步骤3）中，按MOI0.001~0.01接种病毒；
步骤3）中，去除牛血清白蛋白的方法为用0.8%的盐水洗涤细胞表面以去除牛血清白蛋白；
步骤3）中，通过加入碳酸氢钠调节pH；
步骤4）中，选择使用100~300KD膜包对病毒液进行浓缩，浓缩10~20倍；
步骤4）中，选择使用100KD膜包对病毒液进行浓缩，浓缩20倍。
综上所述，本发明公开了一种腮腺炎减毒活疫苗病毒收获液的浓缩方法，可获得病毒滴度几乎无损失的腮腺炎减毒活疫苗病毒浓缩液，再配合半成品配制和冻干方法，可保证腮腺炎减毒活疫苗病毒保存前后病毒滴度几乎无差异；相比离心或其他浓缩方法，本发明中的方法更加简便高效，浓缩后病毒活性及感染力没有损失，适合腮腺炎病毒、风疹病毒、麻疹病毒等多种减毒活疫苗单次收获液的病毒浓缩。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
腮腺炎减毒活疫苗病毒浓缩保藏及稳定性检测
1）制备细胞悬液：将孵化9~11天的SPF种蛋进行解剖，弃去鸡胚头及内脏，将组织块用剪刀剪成约2～3mm3小块，使用0.75‰胰蛋白酶溶液对组织块进行消化，消化20分钟后弃去消化液，使用吹打管对组织块进行吹打至糊状后加入细胞营养液，摇匀静置，待组织块充分下沉后，将上部的细胞营养液取出，即为细胞悬液；
2）单层细胞的制备：用细胞营养液将细胞悬液稀释到细胞浓度为2×105个/ml，分装于10层细胞工厂中，每层细胞工厂加液200ml，置于36.5±0.5℃恒温室培养，培养至细胞长成致密单层细胞；
3）病毒细胞的制备：待细胞长成致密单层后，弃去细胞营养液换上病毒生长液，按MOI0.001~0.01接种腮腺炎减毒活疫苗病毒，同时加入碳酸氢钠调节pH值至7.2~7.4，置于33.0±0.5℃恒温室继续培养；感染40小时后弃去病毒生长液，并用0.8%的盐水洗涤细胞表面以去除牛血清白蛋白，洗后换上不含牛血清白蛋白的病毒维持液，同时加入碳酸氢钠调节pH值至7.4~7.6，置于33±0.5℃恒温室继续培养；镜下观察当融合性病变达到75%以上时，收获病毒液，合并后即为单次收获液。对单次收获液取样进行病毒滴定，检测病毒滴度，检测结果为5.8lgCCID50/ml。
4）超滤浓缩：使用密理博公司生产的Labscale小型切向流超滤系统，选择100KD的Pellicon XL50cm2超过滤膜管匣。
使用管路将超滤膜包管匣与小型切向流超滤系统各端口连接紧密，将待浓缩病毒收获液加入至500ml料杯，开启搅拌，设定转速50转/分钟，打开TANK VALVE，启动进液泵，增加泵转速使进口压力表达到20psi，缓慢调整回流阀，控制回流压力为10psi；持续在相同条件下操作，对腮腺炎减毒活疫苗病毒收获液进行10浓缩，直到预定浓缩之体积时，将泵关闭；将泵OUTLET之软管接头取下，放入浓缩液的收集瓶中；将标有RET IN的接头取下并安装一个针筒，推入气体将管线内的液体排出；将标有FEED IN上之接头取下放进收集瓶中，打开TANK VALVE、启动泵调整转速使样品槽中的液体排出，收入到收集瓶中；对收集瓶中的浓缩液取样进行病毒滴定，检测病毒滴度，检测结果为6.8lg CCID50/ml。
5）原液配制：将冻干保护剂与病毒浓缩液按1:4(V/V)的比例混合制备成原液。对原液取样进行病毒滴定，检测病毒滴度，结果为6.875lgCCID50/ml，记录病毒滴度。
6）冻存：将原液分装至10个50ml冻存瓶中，于-60℃以下超低温冰柜中冻存。
分别于0、1、3、6、12、24个月取样进行病毒滴定，考察浓缩后病毒保存的稳定性，结果如表1所示，病毒收获液保存至24个月时，病毒滴度无明显下降趋势，病毒滴度稳定，说明本发明中的超滤方法对病毒的感染力无破坏作用。
腮腺炎减毒活疫苗病毒浓缩保藏液成品疫苗的制备及稳定性检测和评价
1）将冻存24个月的冻存液，加入pH6.8~7.4的稀释剂（冻干保护剂），按目标病毒滴度6.0±0.3lg CCID50/ml配制成半成品。
2）将半成品分装于2ml西林瓶中，进行冻干：预冻阶段温度-45℃，达到温度后维持2小时；升华干燥阶段最终温度-20℃，达到最终温度的时间为10小时，真空压力控制在5±1Pa；解吸干燥阶段最终温度28℃，真空不控制，运行8小时；即为腮腺炎减毒活疫苗成品。
对上述制得的腮腺炎减毒活疫苗成品分别于37℃、4℃放置不同时间，取样进行外观、水分及病毒滴定。
质量标准如下：
外观：淡黄色疏松体，复溶后为淡黄色液体，无异物。
水分：依《中华人民共和国药典》三部（附录ⅫD）检查，应不高于3.0%。
病毒滴定：采用微量细胞病变法进行病毒滴定检测。取疫苗3瓶混合，进行适当稀释，每稀释度病毒液接Vero细胞，置36.5±1℃、5%CO2培养，培养8天判定结果，病毒滴度应不低于4.0lg CCID50/ml。结果见表2、表3。
对上述生产的成品分别于进行安全性评价
评价标准如下：
细菌内毒素检查：依《中华人民共和国药典》三部（附录ⅫE 凝胶限度试验）检查，应不高于50 EU/剂。
豚鼠全身主动过敏试验：供试品经皮下注射致敏后再经静脉注射激发，观察豚鼠注射供试品后所产生的全身过敏反应，过敏反应应为阴性。试验结果如表4所示。
实施例2
腮腺炎减毒活疫苗病毒浓缩保藏及稳定性检测
1）制备细胞悬液：将孵化9~11天的SPF种蛋进行解剖，弃去鸡胚头及内脏，将组织块用剪刀剪成约2～3mm3小块，使用0.75‰胰蛋白酶溶液对组织块进行消化，消化20分钟后弃去消化液，使用吹打管对组织块进行吹打至糊状后加入细胞营养液，摇匀静置，待组织块充分下沉后，将上部的细胞营养液取出，即为细胞悬液；
2）单层细胞的制备：用细胞营养液将细胞悬液稀释到细胞浓度为2×105个/ml，分装于10层细胞工厂中，每层细胞工厂加液200ml，置于36.5±0.5℃恒温室培养，培养至细胞长成致密单层细胞；
3）病毒细胞的制备：待细胞长成致密单层后，弃去细胞营养液换上病毒生长液，按MOI0.001~0.01接种腮腺炎减毒活疫苗病毒，同时加入碳酸氢钠调节pH值至7.2~7.4，置于33.0±0.5℃恒温室继续培养；感染56小时后弃去病毒生长液，并用0.8%的盐水洗涤细胞表面以去除牛血清白蛋白，洗后换上不含牛血清白蛋白的病毒维持液，同时加入碳酸氢钠调节pH值至7.4~7.6，置于33±0.5℃恒温室继续培养；镜下观察当融合性病变达到75%以上时，收获病毒液，合并后即为单次收获液。对单次收获液取样进行病毒滴定，检测病毒滴度，检测结果为5.8lgCCID50/ml。
4）超滤浓缩：使用密理博公司生产的Labscale小型切向流超滤系统，选择300KD的Pellicon XL50cm2超过滤膜管匣。
使用管路将超滤膜包管匣与小型切向流超滤系统各端口连接紧密，将待浓缩病毒收获液加入至500ml料杯，开启搅拌，设定转速50转/分钟，打开TANK VALVE，启动进液泵，增加泵转速使进口压力表达到20psi，缓慢调整回流阀，控制回流压力为10psi；持续在相同条件下操作，对腮腺炎减毒活疫苗病毒收获液进行50倍浓缩，直到预定浓缩之体积时，将泵关闭；将泵OUTLET之软管接头取下，放入浓缩液的收集瓶中；将标有RET IN的接头取下并安装一个针筒，推入气体将管线内的液体排出；将标有FEED IN上之接头取下放进收集瓶中，打开TANK VALVE、启动泵调整转速使样品槽中的液体排出，收入到收集瓶中；对收集瓶中的浓缩液取样进行病毒滴定，检测病毒滴度，检测结果为7.5lgCCID50/ml。
5）原液配制：将冻干保护剂与病毒浓缩液按1:6(V/V)的比例混合制备成原液。对原液取样进行病毒滴定，检测病毒滴度，结果为7.5lgCCID50/ml，记录病毒滴度。
6）冻存：将原液分装至10个50ml冻存瓶中，于-60℃以下超低温冰柜中冻存。
分别于0、1、3、6、12、24个月取样进行病毒滴定，考察浓缩后病毒保存的稳定性，结果如表1所示，病毒收获液保存至24个月时，病毒滴度无明显下降趋势，病毒滴度稳定，说明本发明中的超滤方法对病毒的感染力无破坏作用。
腮腺炎减毒活疫苗病毒浓缩保藏液成品疫苗的制备及稳定性检测和评价
1）将冻存24个月的冻存液，加入pH6.8~7.4的稀释剂（冻干保护剂），按目标病毒滴度6.0±0.3lg CCID50/ml配制成半成品。
2）将半成品分装于2ml西林瓶中，进行冻干：预冻阶段温度-45℃，达到温度后维持2小时；升华干燥阶段最终温度-20℃，达到最终温度的时间为10小时，真空压力控制在5±1Pa；解吸干燥阶段最终温度28℃，真空不控制，运行8小时；即为腮腺炎减毒活疫苗成品。
对上述制得的腮腺炎减毒活疫苗成品分别于37℃、4℃放置不同时间，取样进行外观、水分及病毒滴定。
质量标准如下：
外观：淡黄色疏松体，复溶后为淡黄色液体，无异物。
水分：依《中华人民共和国药典》三部（附录ⅫD）检查，应不高于3.0%。
病毒滴定：采用微量细胞病变法进行病毒滴定检测。取疫苗3瓶混合，进行适当稀释，每稀释度病毒液接Vero细胞，置36.5±1℃、5%CO2培养，培养8天判定结果，病毒滴度应不低于4.0lg CCID50/ml。结果见表2、表3。
对上述生产的成品分别于进行安全性评价
评价标准如下：
细菌内毒素检查：依《中华人民共和国药典》三部（附录ⅫE 凝胶限度试验）检查，应不高于50 EU/剂。
豚鼠全身主动过敏试验：供试品经皮下注射致敏后再经静脉注射激发，观察豚鼠注射供试品后所产生的全身过敏反应，过敏反应应为阴性。试验结果如表4所示。
实施例3
腮腺炎减毒活疫苗病毒浓缩保藏及稳定性检测
1）制备细胞悬液：将孵化9~11天的SPF种蛋进行解剖，弃去鸡胚头及内脏，将组织块用剪刀剪成约2～3mm3小块，使用0.75‰胰蛋白酶溶液对组织块进行消化，消化20分钟后弃去消化液，使用吹打管对组织块进行吹打至糊状后加入细胞营养液，摇匀静置，待组织块充分下沉后，将上部的细胞营养液取出，即为细胞悬液；
2）单层细胞的制备：用细胞营养液将细胞悬液稀释到细胞浓度为2×105个/ml，分装于10层细胞工厂中，每层细胞工厂加液200ml，置于36.5±0.5℃恒温室培养，培养至细胞长成致密单层细胞；
3）病毒细胞的制备：待细胞长成致密单层后，弃去细胞营养液换上病毒生长液，按MOI0.001~0.01接种腮腺炎减毒活疫苗病毒，同时加入碳酸氢钠调节pH值至7.2~7.4，置于33.0±0.5℃恒温室继续培养；感染48小时后弃去病毒生长液，并用0.8%的盐水洗涤细胞表面以去除牛血清白蛋白，洗后换上不含牛血清白蛋白的病毒维持液，同时加入碳酸氢钠调节pH值至7.4~7.6，置于33±0.5℃恒温室继续培养；镜下观察当融合性病变达到75%以上时，收获病毒液，合并后即为单次收获液。对单次收获液取样进行病毒滴定，检测病毒滴度，检测结果为5.8lg CCID50/ml。
4）超滤浓缩：使用密理博公司生产的Labscale小型切向流超滤系统，选择200KD的Pellicon XL50cm2超过滤膜管匣。
使用管路将超滤膜包管匣与小型切向流超滤系统各端口连接紧密，将待浓缩病毒收获液加入至500ml料杯，开启搅拌，设定转速50转/分钟，打开TANK VALVE，启动进液泵，增加泵转速使进口压力表达到20psi，缓慢调整回流阀，控制回流压力为10psi；持续在相同条件下操作，对腮腺炎减毒活疫苗病毒收获液进行20倍浓缩，直到预定浓缩之体积时，将泵关闭；将泵OUTLET之软管接头取下，放入浓缩液的收集瓶中；将标有RET IN的接头取下并安装一个针筒，推入气体将管线内的液体排出；将标有FEED IN上之接头取下放进收集瓶中，打开TANK VALVE、启动泵调整转速使样品槽中的液体排出，收入到收集瓶中；对收集瓶中的浓缩液取样进行病毒滴定，检测病毒滴度，检测结果为7.1lg CCID50/ml。
5）原液配制：将冻干保护剂与病毒浓缩液按1:5(V/V)的比例混合制备成原液。对原液取样进行病毒滴定，检测病毒滴度，结果为7.1lgCCID50/ml，记录病毒滴度。
6）冻存：将原液分装至10个50ml冻存瓶中，于-60℃以下超低温冰柜中冻存。
分别于0、1、3、6、12、24个月取样进行病毒滴定，考察浓缩后病毒保存的稳定性，结果如表1所示，病毒收获液保存至24个月时，病毒滴度无明显下降趋势，病毒滴度稳定，说明本发明中的超滤方法对病毒的感染力无破坏作用。
腮腺炎减毒活疫苗病毒浓缩保藏液成品疫苗的制备及稳定性检测和评价
1）将冻存24个月的冻存液，加入pH6.8~7.4的稀释剂（冻干保护剂），按目标病毒滴度6.0±0.3lg CCID50/ml配制成半成品。
2）将半成品分装于2ml西林瓶中，进行冻干：预冻阶段温度-45℃，达到温度后维持2小时；升华干燥阶段最终温度-20℃，达到最终温度的时间为10小时，真空压力控制在5±1Pa；解吸干燥阶段最终温度28℃，真空不控制，运行8小时；即为腮腺炎减毒活疫苗成品。
对上述制得的腮腺炎减毒活疫苗成品分别于37℃、4℃放置不同时间，取样进行外观、水分及病毒滴定。
质量标准如下：
外观：淡黄色疏松体，复溶后为淡黄色液体，无异物。
水分：依《中华人民共和国药典》三部（附录ⅫD）检查，应不高于3.0%。
病毒滴定：采用微量细胞病变法进行病毒滴定检测。取疫苗3瓶混合，进行适当稀释，每稀释度病毒液接Vero细胞，置36.5±1℃、5%CO2培养，培养8天判定结果，病毒滴度应不低于4.0lg CCID50/ml。结果见表2、表3。
对上述生产的成品分别于进行安全性评价
评价标准如下：
细菌内毒素检查：依《中华人民共和国药典》三部（附录ⅫE 凝胶限度试验）检查，应不高于50 EU/剂。
豚鼠全身主动过敏试验：供试品经皮下注射致敏后再经静脉注射激发，观察豚鼠注射供试品后所产生的全身过敏反应，过敏反应应为阴性。试验结果如表4所示。
表1腮腺炎减毒活疫苗原液病毒滴度稳定性结果
Figure RE-GDA0002703621490000131
表2腮腺炎减毒活疫苗37℃加速稳定性结果
Figure RE-GDA0002703621490000132
表3腮腺炎减毒活疫苗4℃长期稳定性结果
Figure RE-GDA0002703621490000141
表4腮腺炎减毒活疫苗安全性评价
实施例 细菌内毒素检查 豚鼠全身主动过敏试验
1 <1.25 阴性
2 <1.25 阴性
3 <1.25 阴性
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是 与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法，其特征在于，步骤包括：
1）制备细胞悬液：将孵化种蛋弃去鸡胚头和内脏，将其余组织制备成细胞悬液；
2）单层细胞的制备：将细胞悬液，置于适宜温度下培养，培养成致密单层细胞；
3）病毒液的制备：待细胞长成致密单层后，弃去细胞营养液换上病毒生长液，接种病毒，调至合适的pH、温度恒温培养；感染40-56小时后弃去病毒生长液，去除牛血清白蛋白，去除后，换上不含牛血清白蛋白的病毒维持液，调至合适的pH、温度恒温培养，当融合性病变达到75%以上时，收获病毒液；
4）超滤浓缩：选择孔径大小为100-300KD的超滤膜包对病毒液进行10-50倍浓缩，得病毒浓缩液；
5）原液配制：将冻干保护剂与病毒浓缩液按1：4-1：6体积比混合，即为原液；
6）冻存：将配制好的原液于-60℃以下冻存；
步骤5）中，所述冻干保护剂包括：终浓度为5%的乳糖、终浓度为2%的山梨醇和终浓度为0.5%的谷氨酸钠。
2.如权利要求1所述一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法，其特征在于，步骤1）中，将其余组织制备成细胞悬液的方法为：使用0.75‰胰蛋白酶溶液对组织进行消化，弃去消化液，吹打至糊状，加入细胞营养液，静置后，上部的细胞营养液，即为细胞悬液。
3.如权利要求1所述一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法，其特征在于，步骤2）中，单层细胞的制备方法为：用细胞营养液将细胞悬液稀释到细胞浓度为2×105个/ml，分装于细胞工厂中，每层细胞工厂加细胞悬液200ml，置于36.5±0.5℃恒温室培养，培养至细胞长成致密单层细胞。
4.如权利要求1所述一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法，其特征在于，步骤3）中，待细胞长成致密单层后，弃去细胞营养液换上病毒生长液，接种病毒，pH调制7.2-7.4，33.0±0.5℃恒温培养；感染40-56小时后弃去病毒生长液，去除牛血清白蛋白，去除后，换上不含牛血清白蛋白的病毒维持液，pH调制7.4-7.6，33±0.5℃恒温培养，当融合性病变达到75%以上时，收获病毒液。
5.如权利要求1或4所述一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法，其特征在于，步骤3）中，按MOI0.001~0.01接种病毒。
6.如权利要求1或4所述一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法，其特征在于，步骤3）中，去除牛血清白蛋白的方法为用0.8%的盐水洗涤细胞表面以去除牛血清白蛋白。
7.如权利要求1或4所述一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法，其特征在于，步骤3）中，通过加入碳酸氢钠调节pH。
8.如权利要求1所述一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法，其特征在于，步骤4）中，选择使用100~300KD膜包对病毒液进行浓缩，浓缩10~20倍。
9.如权利要求1所述一种腮腺炎减毒活疫苗病毒的浓缩保藏方法，其特征在于，步骤4）中，选择使用100KD膜包对病毒液进行浓缩，浓缩20倍。
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