CN110257344A - 无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，包括以下步骤：A.采用第一无血清培养基a，建立无血清Vero细胞主细胞库和工作细胞库；B.采用第二无血清培养基b，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批；C.将步骤A的Vero工作细胞库的细胞复苏、传代扩增后接种生物反应器，采用第三无血清培养基c1，载体灌流培养；接种步骤B的毒株工作种子批，采用第四无血清培养基c2，培养病毒；收获病毒液，经超滤浓缩、病毒液灭活、纯化、半成品配制后分装冻干，得到无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗。本发明采用无血清培养替代现有有血清培养工艺、重组人血白蛋白替代现有人血白蛋白工艺，保证了生物制品安全性。

Description

无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒引起的人兽共患疾病，人和所有的温血动物对狂犬病病毒都易感。一旦发病100％死亡，唯一有效的方法是接种有效的人用狂犬病疫苗。Vero细胞由于它的生长快速、易于规模化培养、生产成本低等特点，已应用于多种人用疫苗的生产，如乙脑疫苗、手足口疫苗、灭活脊髓灰质炎疫苗、轮状疫苗、狂犬病疫苗等等。

目前国内上市销售的狂犬病疫苗生产工艺，在细胞培养阶段无论是Vero细胞还是二倍体细胞，均需要添加一定比例的牛血清，在病毒培养阶段或添加低含量的牛血清，或添加一定比例的人血白蛋白，由于狂犬病病毒易聚集和不稳定的特点，在纯化后的原液及半成品中需要添加保护剂，几乎都使用人血白蛋白作为保护剂。

利用牛血清作为细胞培养和疫苗制备的培养基补充成分，具有诸多不利因素：(1)血清的批间差异及质控：每批血清都不同，更换血清时需要做大量的测试以确保替换的血清与前一批血清最为相似；(2)污染：血清经常被病毒污染，目前血清灭菌技术能够避免正规厂家提供的血清感染支原体的可能，但病毒感染仍然是个问题；(3)价格：血清是培养基中最贵的成分，但如果用指定的成分来替换血清，那么这些成分的总价格与血清相当，但随着转铁蛋白、硒、胰岛素等市场需求的不断增加，这些物质的价格在降低，无血清培养基也会更便宜。(4)生长抑制剂：血清不仅对细胞生长起促进作用，而且也起抑制作用。因此，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。

人血白蛋白(HSA)是存在于人循环系统中的最普遍的血液蛋白，由585个氨基酸组成，是人用生物制品很好的蛋白保护剂，但由于血液中存在各种传染性疾病病原体的潜在危险，尤其是艾滋病、乙肝等病毒的传播，来自人源血浆的白蛋白在纯化过程中难免将这些病毒带入终产品。

发明专利(公开号CN106834239A和CN107760647A)均阐述了使用无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，但仍然使用人血白蛋白为疫苗保护剂，同时上述两个专利申请的工艺仍存在不足。本发明通过大量实验摸索出无血清培养替代现有有血清培养工艺、重组人血白蛋白替代现有人血白蛋白工艺，且制备出的疫苗产品质量标准与原工艺相当，生产成本合理，可实现无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的商业化生产。

本发明提供的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法属于首次。

发明内容

为解决狂犬病疫苗生产过程中大量的使用牛血清和人血白蛋白的问题，本发明提供一种无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，为狂犬病疫苗的安全制备开拓了新领域。

本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，包括以下步骤：

A.采用第一无血清培养基a，进行Vero细胞的复苏、传代和冻存，建立无血清Vero细胞主细胞库和工作细胞库；

B.将步骤A建立的无血清Vero细胞工作细胞库的冻存无血清Vero细胞进行复苏、传代扩增，然后接种人用狂犬病疫苗毒株，采用第二无血清培养基b培养扩增至病毒高峰，收获病毒液冻存，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批；

C.将步骤A的建立的无血清Vero细胞工作细胞库的冻存无血清Vero细胞复苏、传代扩增后接种至生物反应器，采用第三无血清培养基c1，载体灌流培养细胞；在细胞的数量达高峰时接种步骤B的无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批，采用第四无血清培养基c2，培养病毒；然后收获病毒液，经超滤浓缩、病毒液灭活和水解、纯化、半成品配制后分装冻干，得到所述无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗；

其中，在步骤A中，所述第一无血清培养基a为含5～7g/L Sheff-VAX Plus ACF的VP-SFM；在步骤B中，所述第二无血清培养基b为含8～10g/LSheff-VAX Plus PF ACF VP的VP-SFM；在步骤C中，所述第三无血清培养基c1为含9～15g/LSheff-VAX Plus ACF的VP-SFM，所述第四无血清培养基c2为含6～8g/L Sheff-VAX Plus PF ACF VP的VP-SFM。

进一步地，所述步骤C具体步骤为：

1)无血清Vero细胞复苏及传代

将步骤A建立的无血清Vero细胞工作细胞库的冻存无血清Vero细胞复苏、传代扩增至细胞密度2～4×10⁶个/ml；

2)生物反应器片状载体细胞培养

将上述步骤1)复苏传代至细胞密度2～4×10⁶个/ml的无血清Vero细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到生物反应器内；补充所述第三无血清培养基c1至工作体积；调整生物反应器培养参数，温度37±0.5℃，pH7.2±0.1，溶氧50％，搅拌速度30～50转/分钟；细胞接种24小时后，调整搅拌桨转速50～90转/分钟，开始灌流培养细胞；结合每日监测的葡萄糖含量调整灌流量，使葡萄糖含量保持大于1.0g/L；当第6-7天细胞数量达高峰时，准备接种病毒；

3)病毒扩增及病毒液收获

(1)病毒接种

根据葡萄糖消耗量计算上述步骤2)Vero细胞数量达高峰时的细胞数，按MOI0.01-0.05加入步骤B的无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批毒种，和第四无血清培养基c2，以20～30转/分钟进行片状载体上细胞与病毒的吸附，吸附时间为30-60分钟，吸附温度为33-35℃；吸附完成后，将转速调至50～90转/分钟；

(2)病毒培养及收获

完成细胞对病毒的吸附之后，转速提至50-90转/分钟，温度34～35℃，72h之后，用所述第四无血清培养基c2进行连续灌流并开始收获病毒液，连续收获7-10天病毒液之后，停止收获；

4)病毒液超滤浓缩

将上述步骤3)得到的病毒收获液以0.8+0.65μm进行预过滤，以除去细胞碎片，然后用300KD-1000KD膜包，浓缩15-40倍，得到病毒浓缩液；

5)灭活、水解

上述步骤4)得到的病毒浓缩液置2～8℃预冷18小时以上，每1000ml病毒浓缩液按终浓度1/4000，加10％稀释的β-丙内酯2.5ml，充分摇匀，置2～8℃24小时后置37℃水解2小时；

6)纯化

灭活后的病毒液经index-20Sepharose4FF琼脂糖凝胶柱层析进行纯化；上样量为层析柱体积的5～10％，当紫外监测数值达到0.02Au以上时，收集第一目的峰，按照质量体积终浓度1％加入重组人血白蛋白，得到疫苗原液；检测疫苗原液的蛋白质含量和抗原含量；

7)半成品配制

根据上述步骤6)检测的疫苗原液蛋白质含量和抗原含量，将疫苗原液与稀释液PBS进行1:4～1:8体积比混合并除菌，加入冻干保护剂，配制成半成品；

8)成品

将上述步骤7)得到的半成品进行分装冻干，即为成品。

再进一步地，上述步骤7)中，所述冻干保护剂的成分及终浓度为，2％重组人血白蛋白、5％蔗糖、1％右旋糖酐40，所述浓度均为质量体积百分比。

进一步地，所述步骤A中，在Vero细胞的复苏、传代中，采用重组胰酶TrypL E进行Vero细胞的消化。

再进一步地，所述步骤A中，在Vero细胞冻存时，采用Synth-a-Freeze^TMMedium作为Vero细胞主细胞库和工作细胞库的无血清细胞冻存液进行Vero细胞的冻存。

再进一步地，在所述步骤B中，所述人用狂犬病疫苗毒株为CTN-1V疫苗株。

更进一步地，在所述步骤B中，收获病毒液冻存时，采用重组人血白蛋白作为毒种冻存保护剂进行病毒液冻存。

将本发明方法制备的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗与市售冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)进行效价比较，结果显示两种方法制备的狂犬病疫苗效价无显著差异。

本发明的有益效果为：

跟现有技术相比，本发明提供的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，采用无血清培养替代现有有血清培养工艺、重组人血白蛋白替代现有人血白蛋白工艺，且制备出的疫苗产品质量标准与原工艺相当，生产成本合理，可实现无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的商业化生产，最大程度的保证了生物制品的安全性。

附图说明

图1为本发明无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗工艺流程图；

图2为本发明实施例1无血清培养的Vero细胞图；

图中，a为正常Vero细胞形态，细胞形态规则，呈多边形，边缘清晰，贴壁率95％以上；

图3为本发明实施例3病毒液收获时Vero细胞的病变情况图；

图中，b为病变Vero细胞形态，细胞圆缩比例达到50％。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等。

本发明所使用的无血清超低蛋白培养基(VP-SFM)购自Gibco公司，Sheff-VAXPlus ACF和Sheff-VAX Plus PF ACF VP购自Kerry公司，重组胰酶(TrypLE)和无血清细胞冻存液(Synth-a-Freeze^TMMedium)购自Gibco公司，重组人血白蛋白购自华北制药。

【实施例1】建立无血清Vero细胞主细胞库和工作细胞库

建立无血清Vero细胞主细胞库和工作细胞库，均采用下述步骤：

1.细胞复苏

(1)从液氮中取出美国ATCC细胞库引进的CCL-81.5 Vero细胞，在37℃水浴中快速溶解(＜1min)；

(2)无菌条件下，在75cm²细胞培养瓶中加入预热的15ml第一无血清培养基a，用2ml吸管吸取冻存管中细胞液，逐滴加入培养基中；

(3)将培养瓶置于37℃含5～8％CO₂培养箱中，培养瓶松盖或者透气盖培养，以便气体交换；

(4)培养1～3天，细胞达到80～100％融合时，进行传代。

2.细胞传代

(1)移除培养瓶中的培养基，用5ml预热的无Ca²⁺或Mg²⁺的DPBS洗单层细胞，弃去DPBS；

(2)加5ml预热的胰酶到培养瓶中；

(3)室温消化2～5min，直至细胞分散；

(4)在培养瓶中加入9ml第一无血清培养基a终止消化反应，自动细胞计数仪计数，按1-5×10⁴个活细胞/cm²接种传代细胞；

(6)培养1～3天，细胞达到80～100％融合时，再进行传代。

3.细胞冻存

(1)移除培养瓶中的培养基，用预热的无Ca²⁺或Mg²⁺的DPBS洗单层细胞，弃去DPBS；

(2)加5ml预热的胰酶到培养瓶中；

(3)室温消化2～5min，直至细胞分散；

(4)在培养瓶中加入一定体积第一无血清培养基a，125×g，离心5～10分钟；

(6)用2～8ml预热的培养基重悬细胞；

(7)进行细胞计数，125×g，再次离心5～10分钟；

(8)用无血清细胞冻存液重悬细胞，细胞密度为3～5×10⁶个/ml，分装1ml/支，用细胞冻存程序降温盒进行冻存，最后将冻存的细胞移入液氮长期保存。

本实施例无血清培养的Vero细胞如图2所示，细胞形态规则，呈多边形，边缘清晰，贴壁率95％以上。

在本实施例中，所使用的第一无血清培养基a为补入Sheff-VAX Plus ACF的VP-SFM，其中Sheff-VAX Plus ACF的终浓度为5～7g/L；所使用的胰酶为重组胰酶TrypLE；所使用的无血清细胞冻存液为Synth-a-Freeze^TMMedium。

【实施例2】建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批

1.无血清Vero细胞复苏及传代

采用【实施例1】中的步骤1和步骤2，将上述实施例1建立的无血清Vero细胞工作细胞库的冻存无血清Vero细胞复苏、传代扩增至细胞密度2～4×10⁶个/ml。

2.无血清狂犬病疫苗毒株工作种子批的建立

将上述复苏传代至细胞密度2～4×10⁶个/ml的无血清Vero细胞，于37℃培养2～3天，按MOI0.01～0.05接种人用狂犬病疫苗毒株，更换第二无血清培养基b，33～35℃培养3～4天至病毒高峰，收获病毒液，加入毒种冻存保护剂，分装至毒种瓶，于-80℃冻存，建立无血清培养狂犬病病毒工作种子库。

在步骤2中，所使用的第二无血清培养基b为补入Sheff-VAX Plus PF ACF VP的VP-SFM，其中Sheff-VAX Plus PF ACF VP的终浓度为8～10g/L；所述人用狂犬病疫苗毒株为CTN-1V疫苗株；所使用的毒种冻存保护剂为重组人血白蛋白。

【实施例3】无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备

1.无血清Vero细胞复苏及传代

采用【实施例1】中的步骤1和步骤2，将实施例1建立的无血清Vero细胞工作细胞库的冻存无血清Vero细胞复苏、传代扩增至细胞密度2～4×10⁶个/ml。

2. 30L生物反应器片状载体细胞培养

将上述步骤1复苏传代至细胞密度2～4×10⁶个/ml的无血清Vero细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到生物反应器内。补充第三无血清培养基c1至工作体积30L。调整生物反应器培养参数，温度37±0.5℃，pH7.2±0.1，溶氧50％，搅拌速度30～50转/分钟。细胞接种24小时后，调整搅拌桨转速50～90转/分钟。开始灌流细胞扩增培养基。结合每天监测的葡萄糖含量调整灌流量，使葡萄糖含量保持大于1.0g/L。当第6-7天细胞数量达高峰时，做好接种病毒的准备。

在本步骤2中，所使用的第三无血清培养基c1为补入Sheff-VAX Plus ACF的VP-SFM，其中Sheff-VAX Plus ACF的终浓度为9～15g/L。

3.病毒扩增及病毒液收获

(1)病毒接种

根据葡萄糖消耗量计算上述步骤2 Vero细胞数量达高峰时的细胞数，按MOI0.01-0.05加入实施例2的无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批毒种，和第四无血清培养基c2，以20～30转/分钟进行载体上细胞与病毒的吸附，30-60分钟，温度33-35℃。吸附完成后，将搅拌桨转速调至50～90转/分钟。

(2)病毒培养及收获

完成细胞对病毒的吸附之后，搅拌桨转速提至50-90转/分钟，温度34～35℃。三天左右之后，用第四无血清培养基c2进行连续灌流并开始收获病毒液，得到单次病毒收获液，对单次病毒收获液进行无菌检查，支原体检查，病毒滴定，抗原含量检测。观察细胞病变，如图3所示，细胞圆缩比例达到50％。连续收获7-10天病毒液之后，停止收获。

在本步骤3中，所使用的第四无血清培养基c2为补入Sheff-VAX Plus PF ACF VP的VP-SFM，其中Sheff-VAX Plus PF ACF VP的终浓度为6～8g/L。

4.病毒液超滤浓缩

将上述步骤3得到的病毒收获液以0.8+0.65μm进行预过滤，以除去细胞碎片，然后用300KD-1000KD膜包，浓缩15-40倍，得到病毒浓缩液。

5.灭活、水解

上述病毒浓缩液置2～8℃预冷18小时以上，每1000ml病毒浓缩液按终浓度1/4000，加10％稀释的β-丙内酯2.5ml，充分摇匀，置2～8℃24小时后置37℃水解2小时。

6.纯化(凝胶层析)

灭活后的病毒液经index-20Sepharose4FF琼脂糖凝胶柱层析进行纯化。上样量为层析柱体积的5～10％，当紫外监测数值达到0.02Au以上时，收集第一目的峰，按照质量体积终浓度1％加入重组人血白蛋白，得到疫苗原液。对疫苗原液进行抗原、蛋白含量检测。

7.半成品配制

根据测定的疫苗原液的蛋白质含量和抗原含量，将上述步骤6得到的疫苗原液与稀释液PBS进行1:4～1:8体积比混合并除菌，加入冻干保护剂，即为半成品；所述冻干保护剂的成分及终浓度为，2％重组人血白蛋白、5％蔗糖、1％右旋糖酐，所述浓度均为质量体积百分比。。

8.成品

将上述步骤7得到的半成品进行分装冻干，即为成品。

【实施例4】无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗免疫效果评价

取体重11-13g清洁级昆明种小鼠，按本发明方法制备的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗与本公司市售冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)进行小鼠腹腔注射免疫2次，每次0.5ml，间隔7天。首次免疫后14天分别按5-100 LD₅₀脑内攻击CVS病毒液0.03ml；同时以稀释液脑内注射0.03ml攻击的病毒感染量于相同体重健康小鼠脑内接种，测定病毒滴度(LD₅₀)，攻击后小鼠观察14天，根据动物死亡数计算保护力。结果见下表1：

表1

对上述效价结果采用进行IBM SPSS软件分析，以上述无动物源性、人源性狂犬病疫苗的6个批号效价值为第1组，以本公司市售冻干人用狂犬病疫苗(含牛血清和人血白蛋白)的6个批号效价值为第2组，组统计量结果见下表2，独立样本检验结果见下表3，

表2

表3

由上述分析结果可知，F是比较的正态分布情况，t是比较的均值，图中Levene检验，F为0.491，Sig值为0.499，P＞0.10，方差齐性，t检验Sig值为0.238，P＞0.05，两组均值无差异，因此，无动物源性、人源性狂犬病疫苗与本公司市售冻干人用狂犬病疫苗(含牛血清和人血白蛋白)在效价上无显著差异。

综上所述，本发明提供的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，采用无血清培养替代现有有血清培养工艺、重组人血白蛋白替代现有人血白蛋白工艺，制备出的疫苗与原工艺制备的疫苗效价相当，最大程度的保证了生物制品的安全性，可替代现有有动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗。

Claims (7)

1.一种无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

A.采用第一无血清培养基a，进行Vero细胞的复苏、传代和冻存，建立无血清Vero细胞主细胞库和工作细胞库；

B.将步骤A建立的无血清Vero细胞工作细胞库的冻存无血清Vero细胞进行复苏、传代扩增，然后接种人用狂犬病疫苗毒株，采用第二无血清培养基b培养扩增至病毒高峰，收获病毒液冻存，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批；

C.将步骤A建立的无血清Vero细胞工作细胞库的冻存无血清Vero细胞复苏、传代扩增后接种至生物反应器，采用第三无血清培养基c1，载体灌流培养细胞；在细胞的数量达高峰时，接种步骤B的无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批，采用第四无血清培养基c2，培养病毒；然后收获病毒液，经超滤浓缩、病毒液灭活和水解、纯化、半成品配制后分装冻干，得到所述无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗；

其中，在步骤A中，所述第一无血清培养基a为含5～7g/L Sheff-VAX Plus ACF的VP-SFM；在步骤B中，所述第二无血清培养基b为含8～10g/L Sheff-VAX Plus PF ACF VP的VP-SFM；在步骤C中，所述第三无血清培养基c1为含9～15g/L Sheff-VAX Plus ACF的VP-SFM，所述第四无血清培养基c2为含6～8g/L Sheff-VAX Plus PF ACF VP的VP-SFM。

2.如权利要求1所述的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗制备方法，其特征在于：所述步骤C具体步骤为：

1)无血清Vero细胞复苏及传代

将步骤A建立的无血清Vero细胞工作细胞库的冻存无血清Vero细胞复苏、传代扩增至细胞密度2～4×10⁶个/ml；

2)生物反应器片状载体细胞培养

将上述步骤1)复苏传代至细胞密度2～4×10⁶个/ml的无血清Vero细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到生物反应器内；补充所述第三无血清培养基c1至工作体积；调整生物反应器培养参数，温度37±0.5℃，pH7.2±0.1，溶氧50％，搅拌速度30～50转/分钟；细胞接种24小时后，调整搅拌桨转速50～90转/分钟，开始灌流培养细胞；结合每日监测的葡萄糖含量调整灌流量，使葡萄糖含量保持大于1.0g/L；当第6-7天细胞数量达高峰时，准备接种病毒；

3)病毒扩增及病毒液收获

(1)病毒接种

根据葡萄糖消耗量计算上述步骤2)Vero细胞数量达高峰时的细胞数，按MOI0.01-0.05加入步骤B的无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批毒种，和所述第四无血清培养基c2，以20～30转/分钟进行片状载体上细胞与病毒的吸附，吸附时间为30-60分钟，吸附温度为33-35℃；吸附完成后，将转速调至50～90转/分钟；

(2)病毒培养及收获

完成细胞对病毒的吸附之后，转速提至50-90转/分钟，温度34～35℃，72h之后，用所述第四无血清培养基c2进行连续灌流并开始收获病毒液，连续收获7-10天病毒液之后，停止收获；

4)病毒液超滤浓缩

将上述步骤3)得到的病毒收获液以0.8+0.65μm进行预过滤，以除去细胞碎片，然后用300KD-1000KD膜包，浓缩15-40倍，得到病毒浓缩液；

5)灭活、水解

上述步骤4)得到的病毒浓缩液置2～8℃预冷18小时以上，每1000ml病毒浓缩液按终浓度1/4000，加10％稀释的β-丙内酯2.5ml，充分摇匀，置2～8℃24小时后置37℃水解2小时；

6)纯化

灭活后的病毒液经index-20Sepharose4FF琼脂糖凝胶柱层析进行纯化；上样量为层析柱体积的5～10％，当紫外监测数值达到0.02Au以上时，收集第一目的峰，按照质量体积终浓度1％加入重组人血白蛋白，得到疫苗原液；检测疫苗原液的蛋白质含量和抗原含量；

7)半成品配制

根据上述步骤6)检测的疫苗原液蛋白质含量和抗原含量，将疫苗原液与稀释液PBS进行1:4～1:8体积比混合并除菌，加入冻干保护剂，配制成半成品；

8)成品

将上述步骤7)得到的半成品进行分装冻干，即得到成品。

3.如权利要求2所述的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：步骤7)中，所述冻干保护剂的成分及终浓度为，2％重组人血白蛋白、5％蔗糖、1％右旋糖酐40，所述浓度均为质量体积百分比。

4.如权利要求1所述的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：步骤A中，在Vero细胞的复苏、传代中，采用重组胰酶TrypL E进行Vero细胞的消化。

5.如权利要求1所述的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：步骤A中，在Vero细胞冻存时，采用Synth-a-Freeze^TMMedium作为Vero细胞主细胞库和工作细胞库的无血清细胞冻存液进行Vero细胞的冻存。

6.如权利要求1所述的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗制备方法，其特征在于：步骤B中，所述人用狂犬病疫苗毒株为CTN-1V疫苗株。

7.如权利要求1所述的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗制备方法，其特征在于：步骤B中，收获病毒液冻存时，采用重组人血白蛋白作为毒种冻存保护剂进行冻存。