CN102343087A - 麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗及制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗及制备工艺，用二倍体细胞株制备麻疹减毒活疫苗，病毒培养容器为细胞工厂，可连续三次收获病毒液，并以浓缩液形式保存。并通过了猴体神经毒力试验及安全性试验。此技术属于对麻疹减毒活疫苗生产的重大改革，对麻疹减毒活疫苗的生产质量有着质的飞跃。解决用鸡胚（CEC）生产存在外源因子污染和一小部分人存在过敏反应的可能及解决了生产效率和质量不高的问题。
Description
技术领域
本发明公开一种麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗及制备工艺，是对该疫苗现有制备工艺的改进，属于疫苗制备方法技术领域。
背景技术
麻疹病毒属副粘病毒科麻疹病毒属（morbillivirus），与其它副粘病毒不同之处为无特定的神经氨酸酶活力。麻疹病毒属单股负链核糖核酸（RNA）病毒，外壳脂蛋白包膜上有短小突起，带血凝素，可凝集猴红血球。此病毒可在人二倍体细胞、人羊膜细胞、狗肾细胞、鸡胚细胞等多种细胞上培养增殖。从1965年国家批准生产麻疹减毒活疫苗开始，各厂家均用鸡胚（CEC）细胞生产，病毒培养容器为转瓶或静止培养，收获病毒方式为原液一次收获。此疫苗问世四十多年，但从未有厂家改变其疫苗的生产基质和培养及收获方式。
用鸡胚（CEC）细胞生产麻疹减毒活疫苗，多年来就有潜在外源因子（禽病毒）危险的争论和对鸡蛋过敏者不能接种的局限性。病毒的培养方式在六、七十年代就已确定。转瓶生产有着转机机械故障导致生产损失的必然，静止培养有着对培养室的面积要求和收获的局限性，同时收获的病毒原液也因存在批间差而失去均一性（因病毒培养后为以一次性以原液方式获取，并根据培养细胞的病变程度，收获病毒原液）。另一点原代细胞的获取操作比较麻烦及耗材大，但上述操作方法却被各生产厂家一直延续至今。
发明内容
本发明公开麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗的制备工艺，旨在解决用鸡胚（CEC）生产存在外源因子污染和一小部分人存在过敏反应的可能及解决了生产效率和质量不高的问题。
本发明公开的麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗制备工艺，包括以下步骤：
1）将人胚肺二倍体细胞按1：2—1：4比例传代至细胞工厂，E-MEM培养液的pH为7.2~7.6、牛血清含量为10~15%（ml/ml）、浓度为3%的谷氨酰胺含量为1%，加入量为每层细胞工厂体积的30~40%；同时，长-47株麻疹病毒以1：（100~1000）的感染复数加入细胞工厂中，33℃培养细胞及病毒；
2）当细胞出现50~60%病变时，弃去细胞工厂内的液体，以培养液2-3倍的HanKs′液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液；加入199疫苗液，加入量为每层细胞工厂体积的25~40%，33℃继续培养；重复三次，收获病毒液；
3）将三次收获的病毒液保存于（2~8）℃，待无菌试验合格后，将疫苗液通过0.65μm孔径的中空纤维滤柱进行过滤澄清，以孔径为300k的超滤膜浓缩5~10倍，保存于（2~8）℃或（-25~-20）℃。
所述的麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗制备工艺，还可以通过以下步骤实现：
1）将人胚肺二倍体细胞按1：2—1：4比例传代传至细胞工厂，E-MEM培养液的pH为7.2~7.6、牛血清含量为10～15%（ml/ml）、浓度为3%的谷氨酰胺含量为1%，加入量为每层细胞工厂体积的30~40%；37℃培养3-5天，对人胚肺二倍体细胞进行传代；
2）长-47株麻疹病毒以1：（100~1000）的感染复数加入已形成细胞单层的细胞工厂中，33℃培养病毒；
3）当细胞出现50~60%病变时，弃去细胞工厂内的液体，以培养液2-3倍的HanKs′液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液；加入199疫苗液，加入量为每层细胞工厂体积的25~40%，33℃继续培养；当细胞病变出现75%开始进行收毒，收获病毒液，重复三次；
4）将三次收获的疫苗液保存于（2~8）℃，待无菌试验合格后，将疫苗液通过0.65μm孔径的中空纤维滤柱进行过滤澄清，以孔径为300k的超滤膜浓缩5~10倍，保存于（2~8）℃或（-25~-20）℃。
在上述的麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗制备工艺中，所述的人胚肺二倍体细胞可以选择2BS株或KMB-17或MRC-5中的任一种。
本发明的积极效果在于：采用人胚肺二倍体细胞培养病毒，改变了培养病毒的宿主，避免了潜在的外源因子（禽病毒）污染的可能，和对鸡蛋过敏者接种该疫苗产生过敏的危险，并消除了接种者对异体蛋白的摄入。利用细胞工厂为培养病毒容器，可连续稳定培养病毒；还能至病毒培养高峰，连续三次收获疫苗原液，减小了疫苗生产的批间差异；合并原液经过滤过浓缩，可将细胞碎片滤除，使疫苗液更加澄清，体积缩小易保存，以（2~8）℃或（-25~-20）℃低温冻存方式保存，以稀释方法制备半成品。本发明制备工艺比用鸡胚（CEC）细胞生产的麻疹疫苗收获率高，细胞残存量少；利用人胚肺二倍体细胞作为病毒培养基质，生产中的可控性远远大于用消化原代鸡胚（CEC）细胞培养病毒的方法。大大提高了疫苗收获率及疫苗质量。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1：
1)将人胚肺二倍体细胞(2BS)按1：4比例传代至细胞工厂，E-MEM培养液的pH为7.2、牛血清含量为10%（ml/ml）、浓度为3%的谷氨酰胺含量为1%，加入量为每层细胞工厂体积的30%；同时，以长-47株麻疹病毒`1：500的感染复数加入细胞工厂中，33℃培养细胞及病毒；
2）当细胞出现50~60%病变时，弃去细胞工厂内的液体，以培养液2-3倍的HanKs′液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液；加入199疫苗液，加入量为每层细胞工厂体积的25~40%，33℃继续培养，收获病毒液，重复三次；
3）将三次收获的病毒液保存于(2~8)℃，待无菌试验合格后，将病毒液通过0.65μm孔径的中空纤维滤柱进行过滤澄清，以孔径为300k的超滤膜浓缩5倍，保存于（2~8）℃；
4）根据病毒滴度，将浓缩的病毒液稀释成疫苗。
经检定全部符合2011版《药典三部》对该疫苗的质量要求。
实施例2：
1）将人胚肺二倍体细胞(KMB-17)按1：3比例传代至细胞工厂，E-MEM培养液的pH为7.4、牛血清含量为12%（ml/ml）、浓度为3%的谷氨酰胺含量为1%，加入量为每层细胞工厂体积的35%；同时，长-47株麻疹病毒以1：1000的感染复数加入细胞工厂中，33℃培养细胞及病毒；
2）当细胞出现50~60%病变时，弃去细胞工厂内的液体，以培养液2-3倍的HanKs′液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液；加入199疫苗液，加入量为每层细胞工厂体积的30%，33℃继续培养；重复三次，收获病毒液；
3）将三次收获的病毒液保存于（2~8）℃，待无菌试验合格后，将病毒液通过0.65μm孔径的中空纤维滤柱进行过滤澄清，以孔径为300k的超滤膜浓缩5~10倍，保存于（-25~-20）℃；
4）根据病毒滴度，将浓缩的病毒液稀释成疫苗。
经检定全部符合2011版《药典三部》对该疫苗的质量要求。
实施例3：
1）人二倍体细胞（2BS）株按1：2比例传代传至使用代至细胞工厂，E-MEM生长液的PH为7.6、牛血清含量为14%（ml/ml），37℃培养3天，待细胞长成均匀、致密的单层；
2）按1：100的感染复数以长-47株麻疹病毒感染细胞，所用维持液E-MEM培养液的pH为7.4、牛血清含量为2%（ml/ml）、浓度为3%的谷氨酰胺含量为1%，加入量为每层细胞工厂体积的30%；
3）当细胞出现50%病变时，弃去细胞工厂内的液体，以相当于2~3倍的HanKs′液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液，加入199疫苗液，继续置33℃培养，当细胞病变出现75%时开始进行收获病毒液，重复三次；
4）将三次收获的病毒液保存于（2~8）℃，待无菌试验合格后，将病毒液通过0.65μm孔径的中空纤维滤柱进行过滤澄清，以孔径为300k的超滤膜浓缩5~10倍，保存于（2~8）℃；
5）根据病毒滴度，将浓缩的病毒液稀释成疫苗。
经检定全部符合2011版《药典三部》对该疫苗的质量要求。
实施例4
1）人胚肺二倍体细胞（MRC-5）株按1：4比例传代传至使用代至细胞工厂，E-MEM生长液的pH为7.6、牛血清含量为15%（ml/ml），37℃培养3天，待细胞长成均匀、致密的单层；
2）按1：500的感染复数以长-47株麻疹病毒感染细胞，所用维持液E-MEM培养液的pH为7.5、牛血清含量为3%（ml/ml）、浓度为3%的谷氨酰胺含量为1%，加入量为每层细胞工厂体积的35%；
3）当细胞出现50%病变时，弃去细胞工厂内的液体，以相当于2~3倍的HanKs′液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液，加入199疫苗液，继续置33℃培养，当细胞病变出现75%开始进行收获病毒液，重复三次；
4）将三次收获的病毒液保存于（2~8）℃，待无菌试验合格后，将病毒液通过0.65μm孔径的中空纤维滤柱进行过滤澄清，以孔径为300k的超滤膜浓缩5~10倍，保存于（-25~-20）℃；
5）根据病毒滴度，将浓缩的病毒液稀释成疫苗。
经检定全部符合2011版《药典三部》对该疫苗的质量要求。
按实施例1-2生产的麻疹原液滴度结果见下表一：
表一 实施例1-2 麻疹长47毒种同时法生产疫苗原液滴度结果
| 批次 | 病毒感染倍数 | 收获次数 | 同时感染法合并滴度LgCCID50/ml |
| 实施例1 | 1：500 | 1-3 | 5.50 |
| 实施例2 | 1：1000 | 1-3 | 5.88 |
按实施例3-4生产的麻疹原液滴度结果见下表二：
表二 实施例3-4麻疹长-47毒种单层法生产疫苗原液滴度结果
| 批次 | 感染倍数 | 收获次数 | 单层感染法合并滴度LgCCID50/ml |
| 实施例3 | 1：100 | 1-3 | 5.63 |
| 实施例4 | 1：500 | 1-3 | 5.88 |
上述方法均可获得病毒滴度较高的疫苗。连续收获的疫苗浓缩保存：病毒经滤过浓缩保存于（2~8）℃或（-25~-20）℃以下。待稀释合并后加冻干保护剂制备成疫苗。检定结果见表三：
表三 疫苗成品检定结果
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施4 |
| 病毒滴度LgCCID50/ml | 4.63 | 4.88 | 5.0 | 4.63 |
| 无菌检查 | 合格 | 合格 | 合格 | 合格 |
| 支原体检查 | 阴性 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 热稳定性实验 | 4.13 | 4.38 | 4.50 | 4.00 |
| 牛血清白蛋白残余量 | 10ng/ml | 15ng/ml | 10ng/ml | 12ng/ml |
| 异常毒性试验 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 |
| 水分 | 1.9% | 2.1% | 2.3% | 1.8% |
| 鉴别试验 | 麻疹病毒 | 麻疹病毒 | 麻疹病毒 | 麻疹病毒 |
用人胚肺二倍体细胞制备的冻干麻疹减毒活疫苗保存于（2~8）℃
稳定性结果。见表四：
表四 冻干麻疹减毒活疫苗（人胚肺二倍体细胞）稳定性结果
| 保存月份 | 0 | 4 | 8 | 12 | 16 | 18 |
| 实施例1 | 4.63 | 4.63 | 4.50 | 4.63 | 4.50 | 4.38 |
| 实施例2 | 4.63 | 4.50 | 4.63 | 4.50 | 4.38 | 4.38 |
| 实施例3 | 4.88 | 4.63 | 4.63 | 4.50 | 4.50 | 4.38 |
| 实施例4 | 4.75 | 4.75 | 4.63 | 4.63 | 4.88 | 4.50 |
冻干麻疹减毒活疫苗（人胚肺二倍体细胞）猴体安全及免疫原性试验，用实施例3成品疫苗接种1.5-2.5Kg体重，猴龄1.5-3周岁的恒河猴，上肢注射，每只试验猴静脉接种经复融0.5ml疫苗，用麻疹血凝抑制（HI）试验测定抗体。结果见表五；
表五： 猴体安全及免疫原性试验（周）
| 猴号 | 0 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 |
| 1 | ﹤2x | 128 x | 128 x | 64 x | 56 x | 32 x |
| 2 | ﹤2 x | 112 x | 128 x | 96 x | 64 x | 80 x |
| 3 | ﹤2 x | 112 x | 128 x | 64 x | 80 x | 64 x |
| 4 | ﹤2 x | 128 x | 40 x | 48 x | 48 x | 48 x |
| 5 | ≦2 x | 128 x | 128 x | 128 x | 128 x | 64 x |
| 6 | ﹤2 x | 48 x | 48 x | 48 x | 32 x | 16 x |
| 7 | ﹤2 x | 64 x | 64 x | 96 x | 128 x | 128 x |
| 8 | ﹤2 x | 128 x | 128 x | 128 x | 128 x | 128 x |
| 9 | ﹤2 x | 64 x | 128 x | 64 x | 48 x | 32 x |
| 10 | ﹤2 x | 128 x | 112 x | 96 x | 64 x | 64 x |
| 对照1 | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x |
| 对照2 | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x |
| 对照3 | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x |
| 对照4 | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x | ﹤2 x |
试验中10只试验猴全部健存，未出现神经毒力反应，抗体至接种一周后全部阳转，4只对照猴麻疹抗体阴性。
Claims (3)
1.一种麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗制备工艺，包括以下步骤：
1）将人胚肺二倍体细胞按1：2—1：4比例传代至细胞工厂，E-MEM培养液的pH为7.2~7.6、牛血清含量为10~15%（ml/ml）、浓度为3%的谷氨酰胺含量为1%，加入量为每层细胞工厂体积的30~40%；同时，以长-47株麻疹病毒1：（100~1000）的感染复数加入细胞工厂中，33℃培养细胞及病毒；
2）当细胞出现50~60%病变时，弃去细胞工厂内的液体，以培养液2-3倍的HanKs′液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液；加入199疫苗液，加入量为每层细胞工厂体积的25~40%，33℃继续培养；收获病毒液，重复三次；
3）将三次收获的病毒液保存于（2~8）℃，待无菌试验合格后，将病毒液通过0.65μm孔径的中空纤维滤柱进行过滤澄清，以孔径为300k的超滤膜浓缩5~10倍，保存于（2~8）℃或（-25~-20）℃。
2. 一种麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗制备工艺，包括以下步骤：
1）将人胚肺二倍体细胞按1：2—1：4比例传代传至细胞工厂，E-MEM培养液的pH为7.2~7.6、牛血清含量为10~15%（ml/ml）、浓度为3%的谷氨酰胺含量为1%，加入量为每层细胞工厂体积的30~40%；37℃培养3-5天，对人胚肺二倍体细胞进行传代；
2）以长-47株麻疹病毒1：（100~1000）的感染复数感染人胚肺二倍体细胞，所用维持液E-MEM培养液的pH为7.4~7.6、牛血清含量为2~3%（ml/ml）、浓度为3%的谷氨酰胺含量为1%，加入量为每层细胞工厂体积的30~40%；
3）当细胞出现50~60%病变时，弃去细胞工厂内的液体，以培养液2-3倍的HanKs′液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液；加入199疫苗液，加入量为每层细胞工厂体积的25~40%，33℃继续培养；当细胞病变出现75%开始进行收获病毒液，重复三次；
4）将三次收获的病毒液保存于（2~8）℃，待无菌试验合格后，将病毒液通过0.65μm孔径的中空纤维滤柱进行过滤澄清，以孔径为300k的超滤膜浓缩5~10倍，保存于（2~8）℃或（-25~-20）℃。
3. 权利要求1或2所述的麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗制备工艺，其特征在于：所述的人胚肺二倍体细胞选自：2BS株或KMB-17或MRC-5。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120208 |