DE19612966A1

DE19612966A1 - Tierische Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren

Info

Publication number: DE19612966A1
Application number: DE19612966A
Authority: DE
Inventors: Albrecht Dr Groener; Juergen Dr Vorlop
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: GSK Vaccines GmbH
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1996-04-01
Publication date: 1997-10-02
Anticipated expiration: 2016-04-02
Also published as: ATE482267T1; EP0904351B1; JP4243349B2; US6455298B1; WO1997037000A1; PT904351E; JP2012016358A; JP2005211080A; JP2004331673A; HK1019233A1; EP2275535A1; JP2000507448A; JP2006230415A; ES2352638T3; DE19612966B4; US20050202553A1; US6656720B2; EP0904351A1; DE69740002D1; JP2009034115A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft tierische Zellen, die durch Influenzaviren infi zierbar sind und an Wachstum in Suspension in serumfreiem Medium adaptiert sind, sowie Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur unter Ver wendung dieser Zellen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die durch das beschriebene Verfahren erhältlichen Influenzaviren sowie Vakzinen, die derartige Viren oder Bestandteile davon enthalten.

Alle Influenza-Impfstoffe, die seit den 40er Jahren bis heute als zugelassene Impfstoffe zur Behandlung von Mensch und Tier angewandt werden, bestehen aus einem oder mehreren Virusstämmen, die in embryonierten Hühnereiern ver mehrt worden waren. Diese Viren werden aus der Allantoisflüssigkeit infizierter Hühnereier isoliert und deren Antigene entweder als intakte Viruspartikel oder als durch Detergentien und/oder Lösungsmittel desintegrierte Viruspartikel - sog. Spaltimpfstoff- oder als isolierte, definierte Virusproteine - sog. Subunit-Impfstoff - als Impfstoff angewandt. In allen zugelassenen Impfstoffen sind die Viren durch den Fachmann bekannte Verfahren inaktiviert. Auch die Vermehrung lebend attenuierte Viren, die in Versuchsvaccinen erprobt werden, erfolgt in embryonier ten Hühnereiern.

Die Benutzung embryonierter Hühnereier zur Impfstoff-Produktion ist zeit-, arbeits- und kostenintensiv. Die Eier - aus tierärztlich überwachten, gesunden Hühnerherden - müssen vor der Infektion bebrütet werden, üblicherweise 12 Ta ge. Vor der Infektion müssen die Eier hinsichtlich lebender Embryonen selektiert werden, da nur diese Eier zur Virusvermehrung geeignet sind. Nach der Infektion werden die Eier erneut bebrütet, üblicherweise 2 bis 3 Tage. Die zu diesem Zeit punkt noch lebenden Embryonen werden in der Kälte abgetötet und die Allantois flüssigkeit wird dann durch Absaugen aus den einzelnen Eiern gewonnen. Durch aufwendige Reinigungsverfahren werden Substanzen aus dem Hühnerei, die zu unerwünschten Nebenwirkungen des Impfstoffes führen, von den Viren getrennt, und die Viren konzentriert. Da Eier nicht steril (pathogenfrei) sind, ist es außer dem erforderlich, Pyrogene und alle eventuell vorhandenen Pathogene zu entfer nen und/oder zu inaktivieren.

Viren anderer Impfstoffe wie z. B. Tollwutviren, Mumps-, Masern-, Röteln-Viren, Polioviren und FSME-Viren können in Zellkulturen vermehrt werden. Da Zellkultu ren, ausgehend von geprüften Zellbänken, pathogenfrei sind und im Gegensatz zu Hühnereiern ein definiertes Virusvermehrungssystem darstellen, das (theoretisch) in beinahe unbegrenzter Menge zur Verfügung steht, ermöglichen sie unter Umständen auch im Fall von Influenzaviren eine wirtschaftliche Virus vermehrung. Eine wirtschaftliche Impfstoffproduktion wird eventuell auch dadurch erreicht, daß die Virus-Isolierung und -Reinigung aus einem definierten, sterilen Zellkulturmedium einfacher erscheint als aus der stark proteinhaltigen Allantois flüssigkeit.

Die Isolierung und Vermehrung von Influenzaviren in Eiern führt zu einer Selek tion bestimmter Phenotypen, von denen sich die Mehrzahl vom klinischen Isolat unterscheidet. Im Gegensatz dazu steht die Isolierung und Vermehrung der Viren in Zellkultur bei der keine passagenabhängige Selektion eintritt (Oxford, J. S. et al., J. Gen. Virology 72 (1991), 185-189; Robertson, J. S. et al., J. Gen. Virology 74 (1993) 2047-2051). Für einen wirksamen Impfstoff ist deshalb die Virusver mehrung in Zellkultur auch unter diesem Aspekt der in Eiern vorzuziehen.

Es ist bekannt, daß Influenzaviren sich in Zellkulturen vermehren lassen. Neben Hühnerembryozellen und Hamsterzellen (BHK21-F und HKCC) sind MDBK-Zel len, sowie insbesondere MDCK-Zellen als geeignete Zellen zur in vitro-Vermeh rung von Influenzaviren beschrieben worden (Kilbourne, E. D., in: Influenza, Sei ten 89-110, Plenum Medicak Book Company-New York und London, 1987). Vor aussetzung für eine erfolgreiche Infektion ist die Zugabe von Proteasen zum In fektionsmedium, vorzugsweise Trypsin oder ähnliche Serinproteasen, da diese Proteasen extrazellulär das Vorläuferprotein des Hämagglutinin [HA₀] in das akti ve Hämagglutinin [HA₁ und HA₂] spalten. Nur gespaltenes Hämagglutinin führt zur Adsorption der Influenzaviren an Zellen mit nachfolgender Virusaufnahme in die Zelle (Tobita, K. et al., Med. Microbiol. Immunol., 162 (1975), 9-14; Lazaro witz, S. G. & Choppin, P. W., Virology, 68 (1975) 440-454; Klenk, H.-D. et al., Virology 68 (1975) 426-439) und somit zu einem weiteren Vermehrungszyklus des Virus in der Zellkultur.

Im Patent US 4 500 513 wurde die Vermehrung von Influenzaviren in Zellkulturen adhärent wachsender Zellen beschrieben. Nach Zellvermehrung wird das Nähr medium entfernt und frisches Nährmedium bei gleichzeitiger oder kurz darauf folgender Infektion der Zellen mit Influenzaviren zu den Zellen gegeben. Eine vorgegebene Zeit nach der Infektion wird Protease (z. B. Trypsin) zugesetzt, um eine optimale Virusvermehrung zu erhalten. Die Viren werden geerntet, gereinigt und zu inaktiviertem oder attenuiertem Impfstoff verarbeitet. Eine wirtschaftliche Influenzavirus-Vermehrung als Voraussetzung für eine Impfstoff-Produktion läßt sich mit der im genannten Patent beschriebenen Methodik jedoch nicht leisten, da der Medienwechsel, die nachfolgende Infektion sowie die später erfolgende Zu gabe von Trypsin mehrmaliges Öffnen der einzelnen Zellkulturgefäße erfordert und somit sehr arbeitsintensiv ist. Ferner steigt die Gefahr einer Kontamination der Zellkultur durch unerwünschte Mikroorganismen und Viren mit jeder Manipu lation der Kulturgefäße. Eine kostengünstigere Alternative stellt die Zellvermeh rung in dem Fachmann bekannten Fermenter-Systemen dar, wobei die Zellen adhärent auf Microcarriern wachsen. Das für das Anwachsen der Zellen auf den Microcarriern erforderliche Serum (üblicherweise fötales Kälberserum) enthält jedoch Trypsin-Inhibitoren, so daß auch bei dieser Produktionsmethode ein Medi umwechsel auf serumfreies Medium notwendig ist, um die Spaltung des Influen zahämaglutinins durch Trypsin und damit eine ausreichend hohe Virusvermeh rung zu erzielen. Somit erfordert auch diese Methodik mehrfaches Öffnen der Kulturgefäße und bringt so die erhöhte Gefahr der Kontamination mit sich.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Zellen und Verfah ren zur Verfügung zu stellen, die eine einfache und wirtschaftliche Influenzavirus- Vermehrung in Zellkultur ermöglichen.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen be zeichneten Ausführungsformen gelöst.

Somit betrifft die Erfindung tierische Zellen, die durch Influenzaviren infizierbar sind und die an Wachstum in Suspension in serumfreien Medium adaptiert sind. Es wurde gefunden, daß es mit Hilfe derartiger Zellen möglich ist, auf eine einfa che und wirtschaftliche Art und Weise Influenzaviren in Zellkultur zu vermehren. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Zellen kann zum einen auf einen Mediumwechsel vor der Infektion zum Entfernen des Serums verzichtet werden und zum anderen kann die Proteasezugabe gleichzeitig mit der Infektion erfolgen. Insgesamt ist somit nur ein einmaliges Öffnen der Kulturgefäße für die Infektion mit Influenzaviren erforderlich, wodurch die Gefahr der Kontamination der Zellkul turen drastisch herabgesetzt wird. Ferner vermindert sich der Arbeitsaufwand, der mit dem Mediumwechsel, der Infektion und der anschließenden Proteasezugabe verbunden wäre. Ein weiterer Vorteil ist, daß der Medienverbrauch deutlich ver ringert wird.

Bei den erfindungsgemäßen Zellen handelt es sich vorzugsweise um Vertebra tenzellen, z. B. Vogelzellen, insbesondere Hühnerembryozellen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Zellen Säugerzellen, z. B. aus Hamstern, Rindern, Affen oder Hunden, insbeson dere Nierenzellen oder von diesen abgeleitete Zellinien. Vorzugsweise sind es Zellen, die von MDCK-Zellen (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2)) abgeleitet sind, und besonders bevorzugt Zellen der Zellinie MCDK 33016. Diese Zellinie wurde am 7. Juni 1995 entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrages für die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke der Patentierung bei der als internationale Hinterlegungsstelle anerkannten Deut schen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC2219 hinterlegt. Die Zel linie MDCK 33016 ist abgeleitet aus der Zellinie MCDK durch Passagieren und Selektion hinsichtlich der Fähigkeit, in serumfreien Medium in Suspension zu wachsen und verschiedene Viren zu vermehren, z. B. Orthomyxoviren, Pa ramyxoviren, Rhabdoviren und Flavoviren. Aufgrund dieser Eigenschaften eignen sich diese Zellen für eine wirtschaftliche Vermehrung von Influenzaviren in Zell kultur mittels eines einfachen und kostengünstigen Verfahrens.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Ver mehrung von Influenzaviren in Zellkultur, bei dem erfindungsgemäße Zellen ver wendet werden, insbesondere ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

(i) Vermehrung der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Zellen in serum freiem Medium in Suspension;
(ii) Infektion der Zellen mit Influenzaviren;
(iii) Zugabe von Protease kurz vor, gleichzeitig oder kurz nach der Infektion; und
(iv) weitere Kultivierung der infizierten Zellen und Isolierung der vermehrten In fluenzaviren.

Die erfindungsgemäßen Zellen können im Rahmen des Verfahrens in verschie denen dem Fachmann bekannten serumfreien Medien (z. B. Iscove′s Medium, UltraCHO-Medium (Fa. BioWhittaker), EX-CELL (Fa. JRH Biosciences)) kultiviert werden. Ansonsten können die Zellen zur Vermehrung auch in den gängigen ser umhaltigen Medien (z. B. MEM- oder DMEM-Medium mit 0,5% bis 10%, vorzugs weise 1,5% bis 5% fötalem Kälberserum) oder proteinfreien Medien (z. B. PF- CHO (Fa. JRH Biosciences)) kultiviert werden. Als Kulturgefäße, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können, sind alle dem Fachmann bekannten Gefäße wie z. B. Spinnerflaschen, Rollflaschen oder Fer menter geeignet.

Die Temperatur für die Vermehrung der Zellen vor der Infektion mit Influenzaviren liegt vorzugsweise bei 37°C.

Die Kultivierung zur Vermehrung der Zellen (Schritt (i)) erfolgt in einer bevorzug ten Ausführungsform des Verfahrens im Perfusionssystem, z. B. in einem Rühr kesselfermenter, mit dem Fachmann bekannten Zellrückhaltesystemen, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Spinfilter u.ä.

Die Zellen werden dabei bevorzugt für 2 bis 18 Tage, besonders bevorzugt für 3 bis 11 Tage, vermehrt. Dabei erfolgt ein Austausch des Mediums, zunehmend von 0 auf etwa 1 bis 3 Fermentervolumen pro Tag. Die Zellen werden auf diese Art bis auf sehr hohe Zelldichten vermehrt, vorzugsweise bis zu etwa 2 × 10⁷ Zellen/ml. Die Perfusionsrate kann bei Kultur im Perfusionssystem sowohl über die Zellzahl, den Gehalt an Glucose, Glutamin oder Lactat im Medium, als auch über andere dem Fachmann bekannte Parameter geregelt werden.

Zur Infektion mit Influenzaviren werden ca. 85% bis 99%, vorzugsweise 93 bis 97% des Fermentervolumens mit Zellen in einen weiteren Fermenter überführt. Die im ersten Fermenter verbliebenen Zellen können wiederum mit Medium ver setzt und im Perfusionssystem weiter vermehrt werden. Auf diese Weise ist eine dauernde Zellkultur für die Virusvermehrung vorhanden.

Alternativ zum Perfusionssystem können die Zellen in Schritt (i) des erfindungs gemäßen Verfahrens vorzugsweise auch im Batchverfahren kultiviert werden. Die erfindungsgemäßen Zellen vermehren sich hierbei bei 37°C mit einer Generationszeit von 20 bis 30 h bis zu einer Zelldichte von ca. 8 bis 25 × 10⁵ Zellen/ml.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der pH-Wert des in Schritt (i) verwendeten Kulturmediums während der Kultivie rung geregelt und liegt im Bereich von pH 6,6 bis pH 7,8, vorzugsweise im Be reich von pH 6,8 bis pH 7,3.

Ferner wird in diesem Schritt des Verfahrens vorteilhafterweise der pO₂-Wert ge regelt und liegt vorzugsweise zwischen 25% und 95%, insbesondere zwischen 35% und 60% (bezogen auf die Luftsättigung).

Erfindungsgemäß erfolgt die Infektion der in Suspension kultivierten Zellen vor zugsweise wenn die Zellen im Batchverfahren eine Zelldichte von ca. 8 bis 25 × 10⁵ Zellen/ml bzw. ca. 5 bis 20 × 10⁶ Zellen/ml im Perfusionssystem erreicht hat.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Infektion der Zellen mit Influenzaviren bei einer m.o.i. (multiplicity of infection) von ca. 0,0001 bis 10, vor zugsweise von 0,002 bis 0,5.

Die Zugabe der Protease, die die Spaltung des Vorläuferproteins des Hämagglu tinins [HA₀] und somit die Adsorption der Viren an die Zellen bewirkt, kann erfin dungsgemäß kurz vor, gleichzeitig mit oder kurz nach der Infektion der Zellen mit Influenzaviren erfolgen. Erfolgt die Zugabe gleichzeitig mit der Infektion, so kann die Protease entweder direkt zu der zu infizierenden Zellkultur zugegeben wer den oder beispielsweise als Konzentrat gemeinsam mit dem Virus-Inokulat. Die Protease ist vorzugsweise eine Serinprotease, und besonders bevorzugt Trypsin.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird der zu infizierenden Zellkultur Trypsin bis zu einer Endkonzentration von 1 bis 200 µg/ml, vorzugsweise 5 bis 50 µg/ml, und besonders bevorzugt 5 bis 30 µg/ml im Kulturmedium zugesetzt. Bei der weiteren Kultivierung der infizierten Zellen gemäß Schritt (iv) des erfindungsge mäßen Verfahrens kann die Trypsinreaktivierung durch erneute Zugabe von Trypsin im Falle des Batchverfahrens bzw. wird im Falle des Perfusionssystems durch kontinuierliche Zugabe einer Trypsin-Lösung oder durch diskontinuierliche Zugabe aufrechterhalten werden. Im letzteren Fall liegt die Trypsinkonzentration vorzugsweise im Bereich von 1 µg/ml bis 80 µg/ml.

Nach der Infektion wird die infizierte Zellkultur zur Vermehrung der Viren weiter kultiviert, insbesondere bis ein maximaler cytophatischer Effekt bzw. eine maxi male Virusantigenmenge nachgewiesen werden kann. Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung der Zellen für 2 bis 10 Tage, insbesondere für 3 bis 7 Tage. Die Kul tivierung kann wiederum vorzugsweise im Perfusionssystem oder im Batchverfah ren erfolgen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen nach der Infektion mit Influenzaviren bei einer Temperatur von 30°C bis 36°C, vorzugs weise von 32°C bis 34°C, kultiviert. Die Kultivierung der infizierten Zellen bei Temperaturen unter 37°C, insbesondere in den oben angegebenen Temperatur bereichen, führt zur Produktion von Influenzaviren, die nach Inaktivierung eine wesentlich höhere Wirksamkeit als Impfstoff aufweisen, im Vergleich zu Influ enzaviren, die bei 37°C in Zellkultur vermehrt wurden.

Die Kultivierung der Zellen nach Infektion mit Influenzaviren (Schritt (iv)) erfolgt wiederum vorzugsweise bei geregeltem pH- und pO₂-Wert. Der pH-Wert liegt dabei vorzugsweise im Bereich von 6,6 bis 7,8, besonders bevorzugt von 6,8 bis 7,2, und der pO₂-Wert im Bereich von 25% bis 150%, vorzugsweise von 30% bis 75%, und besonders bevorzugt im Bereich von 35% bis 60% (bezogen auf die Luftsättigung).

Während der Kultivierung der Zellen zur Virusvermehrung gemäß Schritt (iv) des Verfahrens ist auch eine Substitution des Zellkulturmediums mit frisch zubereite tem Medium, Mediumkonzentrat oder mit definierten Bestandteilen wie Amino säuren, Vitaminen, Lipoidfraktionen, Phosphaten usw. zur Optimierung der Anti genausbeute möglich.

Nach Infektion mit Influenzaviren können die Zellen entweder durch weitere Zu gabe von Medium oder Mediumkonzentrat über mehrere Tage langsam verdünnt werden oder bei weiterer Perfusion mit abnehmend von etwa 1 bis 3 auf 0 Fer mentervolumen/Tag Medium oder Mediumkonzentrat inkubiert werden. Die Per fusionsrate kann dabei wiederum über die Zellzahl, den Gehalt an Glucose, Glutamin, Lactat, Lactatdehydrogenase im Medium oder anderen dem Fachmann bekannte Parameter geregelt werden.

Möglich ist ferner eine Kombination des Perfusionssystems mit einem Feed- Batch-Verfahren.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt das Ernten und Iso lieren der vermehrten Influenzaviren 2 bis 10 Tage, vorzugsweise 3 bis 7 Tage, nach der Infektion. Hierzu werden beispielsweise die Zellen bzw. Zellreste mittels dem Fachmann bekannten Methoden vom Kulturmedium getrennt, beispielsweise durch Separatoren oder Filter. Nachfolgend erfolgt die Konzentrierung der im Kulturmedium vorhandenen Influenzaviren nach dem Fachmann bekannten Me thoden, wie z. B. Gradientenzentrifugation, Filtration, Präzipitation u.ä.

Die Erfindung betrifft ferner Influenzaviren, die erhältlich sind durch ein erfin dungsgemäßes Verfahren. Diese können nach bekannten Methoden zu einem Impfstoff für die Anwendung am Menschen oder Tier formuliert werden. Die Im munogenität bzw. Effektivität der gewonnenen Influenzaviren als Impfstoff kann nach dem Fachmann bekannten Methoden, z. B. durch den vermittelten Schutz im Belastungsversuch oder als Antikörpertiter neutralisierender Antikörper bestimmt werden. Die erzeugte Virus- bzw. Antigenmenge kann z. B. durch die Bestimmung der Menge an Hämagglutinin nach dem Fachmann bekannten Methoden erfol gen. Es ist beispielsweise bekannt, daß gespaltenes Hämagglutinin an Erythro zyten verschiedener Spezies, z. B. an Hühnererythrozyten, bindet. Dies ermöglicht eine einfache und schnelle Quantifizierung der produzierten Viren bzw. des ge bildeten Antigens.

Somit betrifft die Erfindung auch Vakzinen, die die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Influenzaviren enthalten. Derartige Vakzinen können ge gebenenfalls die für Impfstoffe üblichen Zusatzstoffe enthalten, insbesondere Stoffe, die die Immunantwort verstärken, d. h. sogenannte Adjuvantien, z. B. Hy droxide verschiedener Metalle, Bestandteile von Bakterienzellwänden, Öle oder Saponine, und darüber hinaus gängige pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe.

Die Viren können in den Vakzinen als intakte Viruspartikel, insbesondere als le bend attenuierte Viren vorliegen. Hierzu werden Viruskonzentrate auf den ge wünschten Titer eingestellt und entweder lyophilisiert oder in flüssiger Form sta bilisiert.

In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Vakzinen desintegrierte, d. h. inaktivierte, oder intakte, jedoch inaktivierte Viren enthalten. Hierzu wird die Infektiosität der Viren mittels chemischer und/oder physikalischer Methoden (z. B. durch Detergentien oder Formaldehyd) zerstört. Der Impfstoff wird anschließend auf die gewünschte Antigenmenge eingestellt und nach eventueller Zumischung von Adjuvantien oder nach eventueller Impfstofformulierung, z. B. als Liposome, Microspheres oder "slow release"-Formulierungen, abgefüllt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann schließlich die erfindungs gemäße Vakzine als Subunit-Impfstoff vorliegen, d. h. sie kann definierte, isolierte Virusbestandteile, vorzugsweise isolierte Proteine des Influenzavirus enthalten. Diese Bestandteile können nach dem Fachmann bekannten Methoden aus den Influenzaviren isoliert werden.

Weiterhin können die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Influen zaviren für diagnostische Zwecke verwendet werden. Somit betrifft die vorlie gende Erfindung auch diagnostische Zusammensetzungen, die erfindungsgemä ße Influenzaviren oder Bestandteile solcher Viren enthalten, gegebenenfalls in Kombination mit in diesem Gebiet gängigen Zusatzstoffen und geeigneten Nach weismitteln.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von Zellinien, die an das Wachstum in Suspension angepaßt und durch Influenzaviren infizierbar sind

Eine Zellinie, die an das Wachstum in Suspensionskultur angepaßt ist und durch Influenzaviren infizierbar ist wurde ausgehend von MDCK-Zellen (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2)), die nur wenige Passagen oder über mehrere Monate im Labor vermehrt worden waren, selektioniert. Diese Selektion erfolgte durch Vermehrung der Zellen in Rollerflaschen, die sich mit 16 Upm (anstatt ca. 3 Upm wie für Rol lerflaschen mit adhärent wachsenden Zellen üblich) drehten. Nach mehreren Passagen der im Medium suspendiert vorliegenden Zellen wurden in Suspension wachsende Zellstämme gewonnen. Diese Zellstämme wurden mit Influenzaviren infiziert und die Stämme ausgewählt, die die höchste Virusausbeute erbrachten. Eine Erhöhung der Rate an in Suspension wachsenden Zellen während der er sten Passagen bei 16 Upm wird durch die Zugabe von dem Fachmann bekannten Selektionssystemen wie Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin, oder Alanosin und Adenin, einzeln oder in Kombination, über 1 bis 3 Passagen erreicht. Die Selektion von in Suspension wachsenden Zellen ist auch in anderen bewegten, dem Fachmann bekannten, Zellkultursystemen wie Rührflaschen möglich.

Alternativ können vor der Selektion als Suspensionszelle durch Zellclonierung in Mikrotiterplatten hoch virusvermehrende Zellclone etabliert werden. Hierbei wer den die adhärent wachsenden Ausgangszellen (nach Trypsinierung) mit serum haltigem Medium auf eine Konzentration von ca. 25 Zellen/ml verdünnt und je 100 µl dieser Zellsuspension in einen Napf einer Mikrotiterplatte gegeben. Werden zu jedem Napf 100 µl sterilfiltriertes Medium aus einer 2 bis 4 Tage alten (homologen) Zellkultur ("konditioniertes Medium") zugegeben, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit des Wachstums der in sehr geringer Zelldichte ausgesäten Zellen. Durch lichtmikroskopische Kontrolle werden die Näpfe ausgewählt, in denen nur 1 Zelle enthalten ist; der daraus entstandene Zellrasen wird dann in größere Zellkulturgefäße passagiert. Die Zugabe von Selektionsmedien (z. B. Hy poxanthin, Aminopterin und Thymidin, oder Alanosin und Adenin, einzeln oder in Kombination) nach der 1. Zellpassage über 1 bis 3 Passagen führt zu einer stär keren Unterscheidbarkeit der Zellclone. Die so entstandenen Zellclone wurden hinsichtlich ihrer spezifischen Virusvermehrung ausgewählt und dann als Sus pensionszelle selektioniert. Die Selektion von Zellen, die an Wachstum in serum freien Medium adaptiert sind, kann ebenfalls nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.

Beispiele für Zellen, die an das Wachstum in serumfreien Medium in Suspension angepaßt sind und durch Influenzaviren infizierbar sind, sind die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) und MDCK 13016, deren Eigenschaften in den folgenden Beispielen beschrieben werden.

Beispiel 2 Vermehrung von Influenzaviren in der Zellinie MDCK 33016

Die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219; durch Selektionsdruck aus einer MDCK-Zellkultur erhalten) wurde in Iscove′s Medium mit einer Splittingrate von 1 : 8 bis 1 : 12 zwei mal wöchentlich in einer Rollflasche, die sich mit 16 UpM dreh te, bei 37°C vermehrt. Vier Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von etwa 7,0 × 10⁵ bis 10 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit dem Influenzavirusstamm A/PR/8/34 (m.o.i = 0,1) wurde die Zellkultur mit Trypsin (25 µg/ml Endkonzentration) versetzt, bei 37°C weiter inku biert und die Virusvermehrung über 3 Tage bestimmt (Tabelle I).

Tabelle I

Vermehrung von Influenza A/PR/8/34 in Rollerflaschen (Zellinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Mediumwechsel, gemessen als Anti gengehalt (HA-Einheiten)

HA-Gehalt nach Tagen nach Infektion (dpi)

Die angegebenen Verhältnisse bedeuten, daß eine 1 : X-Verdünnung der Virus ernte noch hämagglutinierende Eigenschaften besitzt. Die hämmagglutinierenden Eigenschaften können bespielsweise bestimmt werden wie in Mayer et al., Viro logische Arbeitsmethoden, Band 1(1974), Seite 260 bis 261 oder in Grist, Dia gnostic Methods in Clinical Virology, Seite 72 bis 75 beschrieben durchgeführt werden.

Beispiel 3 Vermehrung von Influenzaviren in der Zellinie MDCK 13016 in Spinnerfla schen

Die Zellinie MDCK 13016 wurde in Iscove′s Medium mit einer Splittingrate von 1 : 6 bis 1 : 10 zwei mal wöchentlich in einer Spinnerflasche (50 Upm) bei 37°C ver mehrt. Vier Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von 8,0 × 10⁵ Zellen/ml er reicht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit dem Influ enzavirusstamm A/PR/8/34 (m.o.i = 0,1) wurde die Zellkultur mit Trypsin (25 µg/ml Endkonzentration) versetzt, bei 33°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung über 6 Tage bestimmt (Tabelle II).

Tabelle II

Vermehrung von Influenza A/PR/8/34 in Spinnerflaschen (Zellinie MDCK 13016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Mediumwechsel, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten)

HA-Gehalt nach Tagen nach Infektion (dpi)

Beispiel 4 Vermehrung verschiedener Influenzastämme in der Zellinie MDCK 33016 in Rollerflaschen

Die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurde in Iscove′s Medium mit einer Splittingrate von 1 : 8 bis 1 : 12 zwei mal wöchentlich in einer Rollflasche, die sich mit 16 UpM drehte, bei 37°C vermehrt. Vier Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von etwa 7,0 × 10⁵ bis 10 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit verschiedenen Influenzavirusstäm men (m.o.i ≈ 0,1) wurde die Zellkultur mit Trypsin (25 µg/ml Endkonzentration) versetzt, bei 33°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung am 5. Tage nach der Infektion bestimmt (Tabelle III).

Tabelle III
Vermehrung von Influenzastämmen in Rollerflaschen (Zellinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Mediumwechsel, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten)

HA-Gehalt 5 Tage nach Infektion
Influenzastamm
HA-Gehalt
A/Singapore/6/86	1 : 1024
A/Sichuan/2/87	1 : 256
A/Shanghai/11/87	1 : 256
A/Guizhou/54/89	1 : 128
A/Beÿing/353/89	1 : 512
B/Beÿing/1/87	1 : 256
B/Yamagata/16/88	1 : 512
A/PR/8/34	1 : 1024
A/Equi 1/Prag	1 : 512
A/Equi 2/Miami	1 : 256
A/Equi 2 Fontembleau	1 : 128
A/Swine/Gent	1 : 512
A/Swine/Iowa	1 : 1024
A/Swine/Arnsberg	1 : 512

Beispiel 5 Vermehrung verschiedener Influenzastämme in MDCK 33016-Zellen im Fer menter

Die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurde in Iscove′s Medium mit einer Zelleinsaat von 1 × 10⁵ Zellen/ml in einen Rührkesselfermenter (Arbeitsvolumen 8 l) eingesät. Bei einer Inkubationstemperatur von 37°C, einem pO₂-Wert von 50 ± 10% (geregelt) und einem pH-Wert von 7,1 ± 0,2 (geregelt) vermehrten sich die Zellen innerhalb von 4 Tagen auf eine Zelldichte von 7 × 10⁵ Zellen/ml. Zu diesen Zellen wurden 8 ml Virus-Stocklösung (entweder A/PR/8/34 oder A/Singapore/6/86 oder A/Shanghai/11/87 oder NBeÿing/1/87 oder B/Massachusetts/71 oder B/Yamagata/16/88 bzw. B/Panama/45/90) und gleich zeitig 16 ml einer 1,25%igen Trypsinlösung zugegeben und die inokulierte Zell kultur bei 33°C weiter inkubiert. Die Virusvermehrung wurde über 6 Tage be stimmt (Tabelle IV).

Tabelle IV

Vermehrung von Influenzavirus-Stämmen im Fermenter (Zellinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Mediumwechsel, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten)

HA-Gehalt nach Tagen nach Infektion (dpi)

Beispiel 6 Einfluß der Infektionsdosis (m.o.i.) auf die Virusvermehrung

Die Zellinie MDCK 13016 (durch Selektionsdruck aus einer MDCK-Zellkultur er halten) wurde in UltraCHO-Medium mit einer Splittingrate von 1 : 8 bis 1 : 12 zwei mal wöchentlich in einer Rollflasche, die sich mit 16 Upm drehte, bei 37°C ver mehrt. Vier Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von etwa 7,0 × 10⁵ bis 10 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Es wurde der Einfluß der Infektionsdosis (m.o.i.) auf die Ausbeute an Antigen und Infektiosität untersucht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit dem Influenzavirusstamm A/PR/8/34 (m.o.i = 0,5 und m.o.i. = 0,005) wurde die Zellkultur mit Trypsin (25 µg/ml Endkonzentrati on) versetzt, bei 37°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung über 3 Tage be stimmt (Tabelle V).

Tabelle V Vermehrung von Influenzavirusstamm PR/8/34 in der Zellinie MDCK 13016 in Rollerflaschen nach Infektion mit einer m.o.i. von 0,5 bzw. 0,005. Die Aus wertung der Virusvermehrung erfolgte durch Antigennachweis (HA) und In fektionsitätstiter (CCID₅₀-Cell culture infective dose 50% in log₁₀)

Die Bestimmung des CCID₅₀-Wertes kann dabei z. B. nach der Methode erfolgen, die in Paul, Zell- und Gewebekultur (1980), S. 395 beschrieben ist.

Beispiel 7 Einfluß der Medien-Substitution auf die Virusvermehrung

Die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurde in Iscove′s Medium mit einer Splittingrate von 1 : 8 bis 1 : 12 zwei mal wöchentlich in einer Rollflasche, die sich mit 16 UpM drehte, bei 37°C vermehrt. Vier Tage nach Umsetzen war eine Zellzahl von etwa 7,0 × 10⁵ bis 10 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Es wurde der Einfluß einer Medien-Substitution auf die Ausbeute an Antigen und Infektiosität unter sucht. Die nun 4 Tage alte Zellkultur wurde mit dem Influenzavirusstamm A/PR/8/34 (m.o.i. = 0,05) infiziert, wobei die Trypsinzugabe (20 µg/ml Endkonzen tration in der Rollflasche) durch Mischen des Virusinokulums mit der Trypsin stammlösung erfolgte. Die Zellkultur wurde mit Medienzusätzen versetzt, bei 33°C weiter inkubiert und die Virusvermehrung über 5 Tage bestimmt (Tabelle VI).

Tabelle VI Vermehrung von Influenza A/PR/8/34 in Rollflaschen (Zellinie MDCK 33016); Zugabe von 5% (Endkonzentration) eines 3fach konzentrierten Iscove′s Mediums, von Glucose (Endkonzentration 3%) bzw. Glucose und Caseinhy drolysat (Endkonzentration 3% bzw. 0,1%) gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten) HA-Gehalt nach Tagen nach Infektion (dpi)

Beispiel 8 Vermehrung von Influenzaviren in MDCK 33016-Zellen im Fermenter und Gewinnung der Viren

Die Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurde in Iscove′s Medium mit einer Zelleinsaat von 0,5 × 10⁵ Zellen/ml in einen Rührkesselfermenter (Arbeitsvolumen 10 l) eingesät. Bei einer Inkubationstemperatur von 37°C, einem pO₂-Wert von 55 ± 10% (geregelt) und einem pH-Wert von 7,1 ± 0,2 (geregelt) vermehrten sich die Zellen innerhalb von 4 Tagen auf eine Zelldichte von 7 × 10⁵ Zellen/ml. Zu diesen Zellen wurden 0,1 ml Virus-Stocklösung (A/Singapore/6/86; m.o.i. ca. 0,0015) und gleichzeitig 16 ml einer 1,25%igen Trypsinlösung zugege ben und die inokulierte Zellkultur bei 33°C weiter inkubiert. Die Virusvermehrung wurde nach 5 Tagen bestimmt und das Virus geerntet. Zellen und Zellreste wur den durch Tangentialflußfiltration entfernt (Sartocon Mini-Microsart Modul mit 0,45 µm Porengröße; Durchführung der Filtration entsprechend den Angaben des Herstellers), wobei kein Verlust an Antigen (gemessen als HA) im Filtrat nach weisbar war. Das Virusmaterial wurde durch erneute Tangentialflußfiltration (Sartocon Mini - Ultrasart Modul mit 100 000 NMGT (nominelle Molekularge wichts-Trenngrenze); Durchführung der Filtration entsprechend den Angaben des Herstellers) von 9,5 l auf 600 ml ankonzentriert. Die Antigenmenge im Konzentrat betrug 5120 HA-Einheiten (Ausgang 256 HA-Einheiten; Konzentrierungsfaktor 20), während die Infektiosität im Konzentrat 9,2 log₁₀ CCID₅₀ betrug (Ausgang 8,9 log₁₀ CCID₅0; Konzentrierungsfaktor 16); der Verlust an Antigen und Infek tiosität betrug weniger als 1%, gemessen im Filtrat nach der 100 000 NMGT-Fil tration.

Beispiel 9 Vermehrung der Influenzaviren in MDCK 33016-Zellen im Perfusionsfermen ter

1,6 × 10⁸ Zellen der Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) wurden in das Reak torgefäß des Biostat MD (Fa. Braun Biotech Int., Melsungen, Deutschland) mit einem Nutzvolumen von 2000 ml in UItraCHO-Medium suspendiert (0,8 × 10⁵ Zellen/ml) und im Perfusionsbetrieb mit steigender Durchflußrate bei 37°C ver mehrt (Sauerstoffeintrag durch Schlauchbegasung (Sauerstoffregelung 40 ± 10% pO₂); pH-Regelung pH-Wert 7,2; Zellrückhaltung durch Spinnfilter < 95%). Die Lebendzellzahl nahm innerhalb von 11 Tagen um das 200fache auf 175 × 10⁵ Zellen/ml zu (Tabelle VIIIa). 1990 ml dieser Zellkultur wurden in einen 2. Perfusi onsfermenter (Arbeitsvolumen 5 l) überführt, während die restlichen Zellen mit Medium wieder auf 2000 ml aufgefüllt wurden und die Zellvermehrung im Per fusionsbetrieb erneut erfolgte. Im 2. Perfusionsfermenter (Virusinfektion) wurden die Zellen mit dem Influenzavirusstamm A/PR/8/34 (m.o.i. = 0,01) unter gleichzei tiger Zugabe von Trypsin (1,0 µg/ml Endkonzentration) infiziert und 1 h inkubiert. Anschließend wurde der Fermenter im Perfusionsbetrieb weiter inkubiert (Regelung von pO₂ : 40 ± 10% und pH: 7,2). Am ersten Tag nach der Infektion erfolgte die Inkubation bei 37°C, die Virusernte im perfundierten Zellkulturüber stand wurde verworfen. Ab dem 2. Tag nach der Infektion erfolgte die Virusver mehrung bei 33°C und die Perfusionsrate von 2 Fermentervolumen/Tag wurde innerhalb von 7 Tagen auf 0 reduziert. Das für die Virusvermehrung erforderliche Trypsin lag in einer Konzentration von 10 µg/ml im UItraCHO-Medium vor, das für die Perfusion benutzt wurde. Die Virusernte (=perfundierter Zellkulturüberstand) wurde bei 4°C gesammelt und die Virusvermehrung über 7 Tage als Antigen menge bestimmt (Tabelle VIIIb).

Tabelle VIIIa

Vermehrung von MDCK 33016-Zellen im Perfusionsfermenter

Tabelle VIIIb

Vermehrung von Influenza A/PR/8/34 im Perfusionsfermenter (Zellinie MDCK 33016), gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten) im kumulierten perfundierten Zellkulturüberstand

Beispiel 10 Herstellung eines experimentellen Influenza-Impfstoffes

Aus Infuenzavirus A/PR/8/34 aus Beispiel 2 - A/PR/8 bei 37°C vermehrt - (Versuch 2; Vaccine A) und Beispiel 4 - A/PR/8 bei 33°C vermehrt - (Vaccine B) wurde ein experimenteller Impfstoff hergestellt. Die Influenzaviren im Zellkultur medium wurden von Zellen und Zellbruchstücken durch niedertourige Zentrifuga tion (2000 g, 20 min, 4°C) getrennt und durch eine Saccharosegradientenzentri fugation (10 bis 50% (Gew./Gew.) linearer Saccharosegradient, 30 000 g, 2 h, 4°C) gereinigt. Die Influenzavirus-haltige Bande wurde gewonnen, mit PBS pH 7,2 1 : 10 verdünnt, bei 20 000 Upm sedimentiert und das Pellet in PBS aufge nommen (Volumen 50% des ursprünglichen Zellkulturmediums). Die Influenzavi ren wurden mit Formaldehyd inaktiviert (zweimalige Zugabe von 0,025% einer 35%igen Formaldehydlösung im Abstand von 24 h, Inkubation bei 20°C unter Rühren).

Je 10 NMRI-Mäuse, 18 bis 20 g schwer, wurden mit je 0,3 ml dieser inaktivierten Versuchsimpfstoffe am Tag 0 und Tag 28 durch subcutane Injektion geimpft. 2 und 4 Wochen nach der Impfung sowie 1 und 2 Wochen nach der Revaccination wurde den Tieren Blut zur Bestimmung des Titers neutralisierender Antikörper gegen A/PR/8/34 entnommen. Zur Bestimmung der Schutzrate wurden die Mäuse 2 Wochen nach Revaccination (6 Wochen nach Versuchsbeginn) durch intrana sale Applikation von 1000 LD₅₀ (Letale Dosis 50%) belastet. Die Ergebnisse des Versuches sind in Tabelle IX zusammengefaßt.

Tabelle IX

Wirksamkeit von Versuchsvaccinen: für Vaccine A wurde das Influenzavirus A/PR/8/34 bei 37°C und für Vaccine B bei 33°C vermehrt. Untersucht wurden die Titer neutralisierender Antikörper gegen A/PR/8 sowie die Schutzrate nach Belastung der Mäuse

Die Versuche belegen, daß Influenzaviren, die bei 37°C in Zellkultur mit hoher Antigenausbeute (HA-Titer) vermehrt worden waren, in der Maus nur geringe neutralisierende Antikörper-Titer induzierten und kaum Schutz vermittelten, wäh rend Influenzaviren, die bei 33°C in Zellkultur mit ebenfalls hoher Antigenausbeute (HA-Titer) vermehrt worden waren, in der Maus sehr hohe neutralisierende Antikörper-Titer induzierten und zu sehr gutem Schutz führten.

Claims

1. Tierische Zellen, die durch Influenzaviren infizierbar sind und an Wachstum in Suspension in serumfreiem Medium adaptiert sind.

2. Zellen nach Anspruch 1, wobei die Zellen aus einem Vertebraten stammen.

3. Zellen nach Anspruch 2, wobei die Zellen aus einem Säuger stammen.

4. Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zellen abgeleitet sind aus Nierenzellen.

5. Zellen nach Anspruch 4, wobei die Zellen von MDCK-Zellen (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2)) abgeleitet sind.

6. Zellen nach Anspruch 5, wobei es sich um Zellen der Zellinie MDCK 33016 (DSM ACC2219) handelt.

7. Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, daß

(i) Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in serumfreiem Medium in Suspension vermehrt werden;
(ii) die Zellen mit Influenzaviren infiziert werden;
(iii) kurz vor der Infektion, gleichzeitig mit der Infektion oder kurz nach der Infektion der Zellsuspension eine Protease zur Spaltung des Vorläufer proteins des Hämagglutinins [HA₀] zugesetzt wird; und
(iv) nach einer weiteren Kultivierungsphase, die in den Zellen vermehrten Influenzaviren isoliert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kultur der Zellen im Perfusionssystem erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kultur der Zellen im Batch-Verfahren erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei der pH-Wert des Kulturmediums im Schritt (i) im Bereich von 6,6 bis 7,8 liegt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der pH-Wert des Kulturmediums im Bereich von 6,8 bis 7,3 liegt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei die Infektion mit Influenzaviren erfolgt, wenn die Zellkultur eine Zelldichte von ca. 8 bis 25 × 10⁵ Zellen/ml (Batchverfahren) bzw. von ca. 5 bis 20 × 10⁶ Zellen/ml (Perfusionsverfahren) erreicht hat.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei die Infektion der Zellen mit Influenzaviren bei einer m.o.i. (multiplicity of infection) von ca. 0,001 bis 10 erfolgt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Infektion bei einer m.o.i. von ca. 0,002 bis 0,5 erfolgt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, wobei die Protease eine Serinprotease ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Serinprotease Trypsin ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei Trypsin bis zu einer Endkonzentration im Kulturmedium von 1 bis 200 µg/ml zugegeben wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Endkonzentration von Trypsin im Kulturmedium im Bereich von 5 bis 50 µg/ml liegt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 18, wobei die infizierten Zellen 2 bis 10 Tage kultiviert werden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die infizierten Zellen 3 bis 7 Tage kultiviert werden.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 20, wobei die infizierten Zellen bei 30°C bis 36°C kultiviert werden.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die infizierten Zellen bei 32°C bis 34°C kultiviert werden.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 22, wobei das Ernten und Isolieren der vermehrten Viren 2 bis 10 Tage nach der Infektion erfolgt.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Ernten und Isolieren der Viren 3 bis 7 Tage nach der Infektion erfolgt.

25. Influenzavirus erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 24.

26. Vakzine enthaltend Influenzaviren nach Anspruch 25, gegebenenfalls in Kombination mit Stoffen, die die Immunantwort verstärken.

27. Vakzine nach Anspruch 26, wobei die Influenzaviren als intakte Viruspartikel vorliegen.

28. Vakzine nach Anspruch 26, wobei die Influenzaviren als attenuierte Viren vorliegen.

29. Vakzine nach Anspruch 26, wobei die Influenzaviren als desintegrierte Viruspartikel vorliegen.

30. Vakzine enthaltend Bestandteile eines Influenzavirus nach Anspruch 25, gegebenenfalls in Kombination mit Stoffen, die die Immunantwort verstärken.

31. Vakzine nach Anspruch 30, wobei die Vakzine isolierte Proteine des Influenzavirus enthält.

32. Diagnostische Zusammensetzung enthaltend Influenzaviren nach Anspruch 25 oder Bestandteile eines solchen Virus.