ES2352638T3

ES2352638T3 - Células animales y procedimientos de replicación del virus de la gripe.

Info

Publication number: ES2352638T3
Application number: ES97915627T
Authority: ES
Inventors: Albrecht Groner; Jurgen Vorlop
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH
Current assignee: GSK Vaccines GmbH
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1997-04-01
Publication date: 2011-02-22
Anticipated expiration: 2017-04-01
Also published as: ATE482267T1; EP2275535A1; US6455298B1; DE19612966B4; EP0904351A1; US6656720B2; DE69740002D1; JP2000507448A; JP2012005502A; US20050202553A1; JP2006230415A; JP2005211080A; JP2012016358A; DK0904351T3; JP4243349B2; US20030073223A1; PT904351E; US20080274141A1; EP0904351B1; WO1997037000A1

Abstract

SE DESCRIBEN CELULAS ANIMALES QUE PUEDEN SER INFECTADAS POR VIRUS DE LA GRIPE Y QUE ESTAN ADAPTADAS PARA CRECER EN SUSPENSION EN UN MEDIO EXENTO DE SUERO. SE DESCRIBEN ADEMAS PROCEDIMIENTOS PARA LA REPLICACION DE VIRUS DE LA GRIPE EN UN CULTIVO CELULAR, UTILIZANDO DICHAS CELULAS, ASI COMO VACUNAS QUE CONTIENEN LOS VIRUS DE LA GRIPE OBTENIDOS MEDIANTE DICHO PROCEDIMIENTO O CONSTITUYENTES DE LOS MISMOS.

Description

La presente invención se refiere a células MDCK que pueden infectarse con el virus de la gripe y que están adaptadas al crecimiento en suspensión en medio sin suero, y a procedimientos para la producción de una vacuna para el virus de la gripe en cultivo celular usando estas células. La presente divulgación se refiere además a virus de la gripe que se pueden obtener mediante el procedimiento descrito y a vacunas que contienen virus de este tipo

o constituyentes de los mismos.

Todas las vacunas de la gripe que se han usado desde la década de 1940 hasta hoy en día como vacunas permitidas para el tratamiento de seres humanos y animales constan de una o más cepas de virus que se han replicado en huevos de gallinas embrionados. Estos virus se aíslan del líquido alantoideo de huevos de gallinas infectadas y sus antígenos se usan como vacuna, bien en forma de partículas de virus intactos o como partículas de virus desintegrados con detergentes y/o disolventes, la denominada vacuna fragmentada, o en forma de proteínas aisladas de virus, la denominada vacuna en subunidad. En todas las vacunas permitidas, los virus se inactivan mediante procedimientos conocidos para el experto en la técnica. La replicación de los virus vivos atenuados, que se analizan en vacunas experimentales, también se lleva a cabo en huevos de gallina embrionados.

El uso de los huevos de gallina embrionados para la producción de vacunas requiere tiempo y es laborioso y costoso. Los huevos, de bandadas de gallinas sanas monitorizadas por veterinarios, tienen que incubarse antes de la infección, habitualmente durante 12 días. Antes de la infección se tienen que seleccionar los huevos con respecto a los embriones vivos, ya que sólo estos huevos son adecuados para la replicación del virus. Después de la infección se incuban de nuevo los huevos, habitualmente durante de 2 a 3 días. Se mata a los embriones todavía vivos en este momento con frío y, después, se obtiene el fluido alantoideo de cada huevo individual mediante aspiración. Por medio de laboriosos procedimientos de purificación, las sustancias del huevo de gallina que dan lugar a efectos secundarios indeseados de la vacuna se separan de los virus y se concentran los virus. Como los huevos no son estériles (sin patógenos), es, adicionalmente, necesario eliminar y/o inactivar los pirógenos y todos los patógenos que posiblemente estén presentes.

Los virus de otras vacunas, tales como, por ejemplo, los virus de la rabia, de las paperas, del sarampión, de la rubéola, de la polio y los virus FSME se pueden replicar en cultivos celulares. Dado que los cultivos celulares que proceden de bancos de células analizadas no presentan patógenos y, en contraste con los huevos de gallina, son un sistema de replicación de virus definido que (en teoría) están disponibles en cantidades casi ilimitadas, posibilitan la replicación de virus económica en ciertas circunstancias, incluso en el caso del virus de la gripe.

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Posiblemente, la producción económica de vacunas también se puede conseguir en cuanto a que el aislamiento y purificación de un medio de cultivo celulares estéril definido parece más sencillo del procedente del líquido alantoideo que contiene gran cantidad de proteínas.

El aislamiento y la replicación de los virus de la gripe en huevos conducen a una selección de ciertos fenotipos, la mayoría de los cuales difiere del aislamiento clínico. En contraste con ello se encuentra el aislamiento y la replicación de los virus en cultivo celular, en el que no se produce ninguna selección dependiente de pases (Oxford, J.S. y col., J. Gen. Virology 72 (1991), 185 189; Robertson, J.S. y col., J. Gen. Virology 74 (1993) 2047 -2051). Por tanto, para una vacuna eficaz también se prefiere en este aspecto la replicación de virus en cultivo celular por encima de en huevos.

Se sabe que los virus de la gripe se pueden replicar en cultivos celulares. Además de las células de embrión de gallina y las células de hámster (BHK21-F y HKCC), se ha descrito que las células MDBK, en particular las células MDCK, son células adecuadas para la replicación in vitro de los virus de la gripe (Kilbourne, E. D., en: Influenza, páginas 89 -110, Plenum Medicak Book Company -New York y London, 1987). Por ejemplo, Merten y col. (1996) advances in Experimental Medicine and Biology, páginas141-151, da a concer la producción de virus de la gripe en células BHK-21/BRS, Vero y MDCK. Las células BHK 21/BRS se cultivaron en cultivo en suspensión; las células Vero y MDCK se cultivaron en microtransportadores. Un requisito previo para el éxito de una infección es la adición de proteasas al medio de infección, preferentemente tripsina o serín proteasas similares, ya que estas proteasas escinden extracelularmente la proteína precursora de la hemaglutinina [HA0] en hemaglutinina activa [HA1 y HA2]. Sólo la hemaglutinina escindida conduce a la absorción de los virus de la gripe en las células, con la posterior asimilación del virus en las células (Tobita, K. y col., Med. Microbiol. Immunol., 162 (1975), 9 -14; Lazarowitz, S.G. & Choppin, P.W., Virology, 68 (1975) 440 -454; Klenk, H.-D. y col., Virology 68 (1975) 426 -439) y, por tanto, a otro ciclo de replicación del virus en el cultivo celular.

La patente de EE.UU. US 4 500 513 describió la replicación de virus de la gripe en cultivos celulares de células en crecimiento adherente. Tras la proliferación celular, el medio nutriente se elimina y se añade medio nutriente fresco a las células, y de forma simultánea o poco después tiene lugar la infección de las células con virus de la gripe. Un tiempo dado después de la infección se añade proteasa (p. ej., tripsina) con el fin de obtener una replicación óptima del virus. Los virus se recogen, purifican y procesan, para dar la vacuna inactivada o atenuada. No obstante, la replicación económica del virus de la gripe como requisito previo para la producción de vacunas no se puede conseguir usando la metodología descrita en la patente mencionada, dado que el cambio de medio, la posterior infección, así como la adición de tripsina

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que se lleva a cabo más tarde necesitan abrir los vasos de cultivo celular individuales y, por tanto, es muy laboriosa. Además, el peligro de contaminación del cultivo celular con microorganismos y virus indeseados aumenta con cada manipulación de los vasos de cultivo. Una alternativa más rentable es la proliferación celular en los sistemas fermentadores conocida para el experto en la técnica, en los que las células crecen de forma adherente en los microtransportadores. No obstante, el suero necesario para el crecimiento de las células en los microtransportadores (habitualmente suero bovino fetal) contiene inhibidores de tripsina, de modo que incluso en este procedimiento de producción se necesita un cambio de medio a medio sin suero con el fin de conseguir la escisión de la hemaglutinina de la gripe por la tripsina y, por tanto, una replicación del virus adecuadamente alta. Por tanto, esta metodología también requiere abrir los vasos de cultivo varias veces y, por tanto, conlleva el incremento del peligro de contaminación.

Por tanto, la presente invención se basa en el objeto de hacer disponibles células y procedimientos que posibiliten la producción sencilla y económica de una vacuna del virus de la gripe.

Este objeto se consigue mediante la condición de las formas de realización indicadas en las reivindicaciones adjuntas. La invención usa células MDCK que se pueden infectar con virus de la gripe y que están adaptadas al crecimiento en suspensión en medio sin suero. Se encontró que es posible, con la ayuda de células de este tipo, replicar virus de la gripe en cultivo celular de un modo sencillo y económico. Mediante el uso de estas células, por un lado se puede obviar un cambio de medio antes de la infección para eliminar el suero y, por otro, se puede llevar a cabo la adición de proteasa simultáneamente a la infección. En total, de este modo sólo es necesaria una única apertura del vaso de cultivo para infectar con virus de la gripe, de modo que el peligro de contaminación de los cultivos celulares se reduce drásticamente. De forma adicional se disminuye el gasto de esfuerzo que llevaría asociado el cambio de medio, la infección y la posterior adición de proteasa. Otra ventaja es que el consumo de medio se reduce marcadamente.

Las células de acuerdo con la invención son células que derivan de células MDCK cells (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2)), y, particularmente, preferentemente células de la línea celular MDCK 33016. Esta línea celular se depositó con el número de depósito DSM ACC2219 el 7 de junio de 1995 de acuerdo con los requisitos de la Convención de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Patentado en la Colección Alemana de Microorganismos (DSM) en Brunswick, República Federal de Alemania, reconocido como el centro de depósito internacional. La línea celular MDCK 33016 deriva de la línea celular MDCK mediante pases y selección con respecto a la capacidad de cultivar en suspensión en medio sin suero y de replicar varios virus, por ejemplo ortomixovirus,

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paramixovirus, rabdovirus y flavovirus. Debido a estas propiedades, estas células son adecuadas para la replicación económica de los virus de la gripe en cultivo celular por medio de un procedimiento sencillo y rentable.

Por tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento para la producción de una vacuna del virus de la gripe en cultivo celular, en el que se usan células de acuerdo con la invención, en particular un procedimiento que comprende las etapas siguientes:

(i) proliferación de las células de acuerdo con la invención descrita en lo que antecede en medio sin suero en suspensión;

(ii) infección de las células con virus de la gripe;

(iii) adición de la proteasa poco después, simultáneamente o poco después de la infección; y

(iv) cultivar adicionalmente las células infectadas y aislar los virus de la gripe replicados; y

(v) formular los virus de la gripe aislados para dar una vacuna para administrar a seres humanos o animales, en el que las células se pueden infectar con virus de la gripe y se han seleccionado a partir de células MDCK para adaptarlas al crecimiento en suspensión.

Las células de acuerdo con la invención se pueden cultivar en el curso del procedimiento en varios medios sin suero conocidos para el experto en la técnica (p. ej., medio de Iscove, medio ultra para CHO (BioWhittaker), EX-CELL (JRH Biosciences)). De otro modo, las células para replicación también se pueden cultivar en el medio habitual que contiene suero (p. ej., medio MEM o DMEM con 0,5% a 10%, preferentemente de 1,5% a 5% de suero bovino fetal) o medio sin proteínas (p. ej., JRH Biosciences)). Los vasos de cultivo adecuados que se pueden emplear en el curso del procedimiento de acuerdo con la invención son, todos ellos, vasos conocidos para el experto en la técnica, tales como, por ejemplo, frascos giratorios, frascos rotatorios o fermentadores.

La temperatura para la proliferación de las células antes de la infección con virus de la gripe es, preferentemente, 37ºC.

El cultivo para la proliferación de las células (etapa (ii)) se lleva a cabo en una forma de realización preferida del procedimiento en un sistema de perfusión, por ejemplo en un fermentador de vasos en agitación, usando sistemas de retención celular conocidos para el experto en la técnica, tales como, por ejemplo, centrifugación, filtración, filtros de centrífuga y similares. En este caso, las células proliferan, preferentemente, durante de 2 a 18 días, particularmente preferentemente durante de 3 a 11 días. El intercambio del medio se lleva a cabo durante este ciclo, se incrementa de 0 a aproximadamente de 1 a 3 volúmenes de fermentador al día. De este modo, las células proliferan hasta densidades celulares muy altas, preferentemente hasta aproximadamente 2 x 107 células/ml. Los índices de perfusión durante en cultivo en el

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sistema de perfusión se pueden regular mediante el recuento celular, el contenido de glucosa, glutamina o lactato en el medio y a través de otros parámetros conocidos para el experto en la técnica.

Para la infección con virus de la gripe, aproximadamente 85% a 99%, preferentemente de 93 a 97%, del volumen del fermentador se transfiere con las células a otro fermentador. Las células que quedan en el primer fermentador pueden, a su vez, mezclarse con medio y replicarse adicionalmente en el sistema de perfusión. De este modo, se dispone de un cultivo celular continuo para la replicación de virus.

Como alternativa al sistema de perfusión, las células de la etapa (i) del procedimiento de acuerdo con la invención pueden también cultivarse, preferentemente, en un proceso discontinuo. Las células de acuerdo con la invención proliferan aquí a 37ºC, con un tiempo de generación de 20 a 30 horas hasta una densidad celular de aproximadamente 8 a 25 x 105 células/ml.

En una forma de realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, el pH del medio de cultivo usado en la etapa (i) está regulada durante el cultivo y está en el intervalo de pH de 6,6 a pH 7,8, preferentemente en el intervalo de de pH de 6,8 a pH 7,3.

Adicionalmente, el valor de PO2 se regula de forma ventajosa en esta etapa del procedimiento y, preferentemente, está entre 25% y 95%, en particular entre 35% y 69% (sobre la base de la saturación del aire).

De acuerdo con la invención, la infección de las células cultivadas en suspensión se lleva a cabo, preferentemente, cuando las células en el proceso discontinuo han alcanzado una densidad celular de aproximadamente 8 a 25 x 105 células/ml o de aproximadamente 5 a 20 x 106 células/ml en el sistema de perfusión.

En otra forma de realización preferida, la infección de las células con virus de la gripe se lleva a cabo a una m.d.i (multiplicidad de infección) de aproximadamente 0,0001 a 10, preferentemente de 0,002 a 0,5.

La adición de la proteasa que realiza la escisión de la proteína precursora de hemaglutinina [HA0] y, por tanto, la absorción de los virus en las células, se puede llevar a cabo de acuerdo con la invención poco antes, simultáneamente o poco después de la infección de las células con virus de la gripe. Si la adición se lleva a cabo simultáneamente a la infección, la proteasa se puede añadir directamente al cultivo celular que se va a infectar o, por ejemplo, como concentrado junto con el inoculado del virus. Preferentemente, la proteasa es una serínproteasa y, particularmente, preferentemente tripsina.

En una forma de realización preferida, la tripsina se añade al cultivo celular que se va a infectar hasta una concentración final de 1 a 200 µg/ml, preferentemente de 5 a 50 µg/ml y, particularmente preferentemente, de 5 a 30 µg/ml en el medio de cultivo. Durante el cultivo

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adicional de las células infectadas de acuerdo con la etapa (iv) del procedimiento de acuerdo con la invención, la reactivación de la tripsina se puede llevar a cabo mediante la adición fresca de tripsina en el caso del procedimiento discontinuo o, en el caso del sistema de perfusión, mediante la adición continua de la solución de tripsina o mediante adición intermitente. En el último caso, la concentración de tripsina está, preferentemente, en el intervalo de 1 µg/ml a 80 µg/ml.

Tras la infección, el cultivo celular infectado se cultiva adicionalmente para replicar los virus, en particular hasta que se pueda detectar un efecto citopático máximo o una cantidad máxima de antígeno del virus. Preferentemente, el cultivo de estas células se lleva a cabo durante de 2 a 10 días, en particular durante de 3 a 7 días. A su vez, el cultivo puede llevarse a cabo, preferentemente, en el sistema de perfusión o en el procedimiento discontinuo.

En una forma de realización adicional, las células se cultivan a una temperatura de 30ºC a 36ºC, preferentemente de 32ºC a 34ºC, tras la infección con virus de la gripe. El cultivo de las células infectadas a temperaturas inferiores a 37ºC, en particular en los intervalos de temperatura indicados anteriormente, conduce a la producción de virus de la gripe que, tras la inactivación, tienen una actividad apreciadamente mayor como vacunas, en comparación con los virus de la gripe que se han replicado a 37ºC en cultivo celular.

A su vez, el cultivo de las células después de la infección con virus de la gripe (etapa (iv)) se lleva a cabo, preferentemente, a un pH y una pO2 regulados. En este caso, el pH está, preferentemente, en el intervalo de 6,6 a 7,8, particularmente preferentemente de 6,8 a 7,2, y la pO2 en el intervalo de 25% a 150%, preferentemente de 30% a 75% y, particularmente preferentemente, en el intervalo de 35% a 60% (sobre la base de la saturación de aire).

Durante el cultivo de las células o la replicación del virus de acuerdo con la etapa (iv) del procedimiento, también es posible una sustitución del medio de cultivo celular con medio recién preparado, concentrado de medio o con constituyentes definidos, tales como aminoácidos, vitaminas, fracciones lipídicas, fosfatos etc., optimizando el rendimiento del antígeno.

Tras la infección con virus de la gripe, las células se pueden diluir lentamente mediante adición adicional de medio o de concentrado de medio durante varios días o se puede incubar durante la posterior perfusión con medio o concentrado de medio, disminuyendo de aproximadamente 1 a 3 a 0 volúmenes de fermentador/día. En este caso, los índices de perfusión pueden a su vez regularse por medio del recuento celular, el contenido de glucosa, glutamina, lactato o lactato deshidrogenasa en el medio u otros parámetros conocidos por el experto en la técnica.

Además es posible una combinación del sistema de perfusión con un procedimiento de alimentación discontinua.

En una forma de realización preferida del procedimiento, la recogida y el aislamiento de

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los virus de la gripe replicados se lleva a cabo de 2 a 10 días, preferentemente de 3 a 7 días, tras la infección. Para ello, por ejemplo, las células o residuos celulares se separan del medio de cultivo por medio de procedimientos conocidos para el experto, por ejemplo mediante separadores o filtros. Tras esto, la concentración de los virus de la gripe presentes en el medio de cultivo se lleva a cabo mediante procedimientos conocidos para el experto en la técnica, tales como, por ejemplo, centrifugación por gradiente, filtración, precipitación y similares.

Loas virus de la gripe que se pueden obtener mediante un procedimiento de acuerdo con la invención se formulan mediante procedimientos conocidos que dan una vacuna para administrar a seres humanos o animales. La inmunogenicidad o eficacia de los virus de la gripe obtenidos como vacuna se puede determinar mediante procedimientos conocidos para el experto en la técnica, por ejemplo por medio de la protección impartida en el experimento de carga o como títulos de anticuerpos de anticuerpos neutralizantes. La determinación de la cantidad de virus o antígeno producida se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, la determinación de la cantidad de hemaglutinina de acuerdo con los procedimientos conocidos para el experto en la técnica. Por ejemplo, se sabe que la hemaglutinina escindida se une a eritrocitos de varias especies, por ejemplo a eritrocitos de gallina. Esto posibilita una cuantificación rápida y sencilla de los virus producidos o del antígeno formado.

Los virus de la gripe que se pueden obtener a partir del procedimiento se pueden usar en vacunas. Opcionalmente, las vacunas se este tipo pueden contener los aditivos habituales para vacunas, en particular sustancias que incrementan la respuesta inmunitaria, es decir los denominados adyuvantes, por ejemplo hidróxido de varios metales, constituyentes de paredes de células bacterianas, aceites o saponinas, y además, excipientes habituales farmacéuticamente tolerables.

Los virus pueden presentarse en las vacunas en forma de partículas de virus intacto, en particular como virus vivos atenuados. Para este fin, los concentrados de virus se ajustan al título deseado y se liofilizan o estabilizan en forma líquida

En otra forma de realización adicional, las vacunas pueden contener virus disgregados, es decir inactivados, o intactos pero inactivados. Para este fin, la capacidad de infección de los virus se destruye por medio de procedimientos químicos y/o físicos (p. ej., mediante detergentes o formaldehído). Después, la vacuna se ajusta a la cantidad deseada de antígeno y, tras la posible mezcla de los adyuvantes o la posible formulación de la vacuna, se dispensa en forma de, por ejemplo, liposomas, microesferas o formulaciones de “liberación lenta”.

En otra forma de realización preferida, las vacunas pueden ser, por último, una vacuna por subunidades, es decir pueden contener constituyentes de virus aislados definidos, preferentemente proteínas aisladas del virus de la gripe. Estos constituyentes pueden aislarse de

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los virus de la gripe mediante procedimientos bien conocidos para el experto en la técnica.

De forma adicional, los virus de la gripe obtenidos mediante el procedimiento de acuerdo con la invención se pueden usar para fines diagnósticos. Por tanto, la presente divulgación también se refiere a composiciones diagnósticas que contienen virus de la gripe de acuerdo con la invención o constituyentes de dichos virus, si es adecuado en combinación con aditivos habituales en este campo y agentes de detección adecuados.

Los ejemplos ilustran la invención. Ejemplo 1 Preparación de líneas celulares que están adaptadas al crecimiento en suspensión y pueden infectarse con virus de la gripe

Se selecciona una línea celular que está adaptada al crecimiento en cultivo en suspensión y que pueden infectarse con virus de la gripe partir de células MDCK (ATCC CCL34 MDCK (NBL2), que habían proliferado por medio de únicamente unos pocos pasos o durante varios meses en el laboratorio. Esta selección se llevó a cabo mediante la proliferación de las células en frascos rotatorios que giraron a 16 rpm (en lugar de a aproximadamente 3 rpm como es habitual para los frascos giratorios que tienen células en crecimiento adherente). Después de varios pases de las células presentes suspendidas en el medio se obtuvieron cepas de células en crecimiento en suspensión. Estas cepas celulares se infectaron con virus de la gripe y se seleccionaron las cepas que producían el rendimiento de virus más elevado. Un incremento de la tas de células en crecimiento en suspensión durante los primeros pases a 16 rpm se consigue con de 1 a 3 pases mediante la adición de sistemas de selección conocidos por el experto en la técnica, tal como hipoxantina, aminopterina y timidina, o alanosina y adenina, de forma individual

o en combinación. La selección de células en crecimiento en suspensión también es posible en otros sistemas de cultivo celular agitado conocidos para el experto en la técnica, tales como matraces agitados.

Como alternativa, los clones celulares de alta replicación de virus se pueden establecer antes de la selección como células en suspensión mediante clonación en placas de microtitulación. En este procedimiento, las células de partida en crecimiento adherente (tras tripsinización) se diluyen hasta una concentración de aproximadamente 25 células/ml con medio que contiene suero y 100 µl de esta suspensión celular se añaden a un pocillo de una placa de microtitulación. Se a cada pocillo se añaden 100 µl de medio filtrado en esterilidad de un cultivo celular (“medio acondicionado") de 2 a 4 días (homólogo), la probabilidad de crecimiento de las células inoculadas a una densidad celular muy baja aumenta. Por medio de comprobación con microscopio óptico, se seleccionan los pocillos que solo contienen una célula; la pasta celular resultante del mismo se pasa a vasos de cultivo celular más grandes-La adición de medio de

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selección (p. ej., hipoxantina, aminopterina y timidina o alanosina y adenina, individualmente o en combinación) después del primer pase celular conduce a de 1 a 3 pases a una mayor distinguibilidad de los clones celulares. Los clones celulares resultantes de este modo se seleccionaron con respecto a su replicación del virus específico y, después, se seleccionaron

5 como células de suspensión. La selección de células que están adaptadas al crecimiento en medio sin suero también se puede llevar a cabo mediante procedimientos conocidos para el experto en la técnica.

Ejemplos de células que están adaptadas al crecimiento en medio sin suero en suspensión y que se pueden infectar con virus de la gripe son las líneas celulares MDCK 33016 10 (DSM ACC2219) y MDCK 13016, cuyas propiedades se describen en los ejemplos siguientes.

Ejemplo 2 Replicación de virus de la gripe en la línea celular MDCK 33016

La línea celular MDCK 33016 (DSM ACC2219; obtenida de un cultivo de células MDCK mediante presión de selección) proliferó a 37ºC en medio de Iscove con una tasa de división de

15 1:8 a 1:12 dos veces a la semana en un frasco rotatorio que giró a 16 rpm. Cuatro días después de la transferencia se consiguió un recuento celular de aproximadamente .0 7,0 x 105 a 10 x 105 células/ml. Simultáneamente a la infección del cultivo celular de 4-días con la cepa del virus de la gripe A/PR/8/34 (m.d.i. = 0.1), el cultivo celular se trató con tripsina (25 µg/ml de concentración final) y se cultivaron adicionalmente a 37ºC. y se determinó la replicación del virus en 3 días

20 (Tabla I).

Replicación de la gripe A/PR/8/34 en frascos rotatorios (línea celular MDCK 33016) tras la infección del cultivo celular sin cambio de medio, medida como el contenido en antígeno (unidades HA) Contenido HA después de días desde la infección (dpi)

1 dpi: 2 dpi 3 dpi

Experimento 1: 1:64 1:512 1:1024

Experimento 2: 1:4 1:128 1:1024

Experimento 3: 1:8 1:32 1:512

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Las proporciones indicadas significan que una dilución 1:X del virus recogido seguía teniendo propiedades de hemaglutinación. Las propiedades de hemaglutinación se pueden determinar ¡, por ejemplo, tal como se ha descrito en Mayer y col., Virologische Arbeitsmethoden,

30 [Virological Working Methods), Volumen 1 (1974), páginas 260-261 o en Grist, Diagnostic Methods in Clinical Virology, páginas 72 a 75.

Ejemplo 3 Replicación de virus de la gripe en la línea celular MDCK 13016 en frascos giratorios

La línea celular MDCK 13016 se replicó a 37ºC en medio de Iscove con una tasa de división de 1:6 a 1:10 semanalmente en un frasco giratorio (50 rpm). Cuatro días después de la

5 transferencia se consiguió un recuento celular de 8,0 x 105 células/ml. Simultáneamente a la infección del cultivo celular de 4-días con la cepa del virus de la gripe A/PR/8/34 (m.d.i. = 0.1), el cultivo celular se trató con tripsina (25 µg/ml de concentración final) y se incubó a 33ºC y se determinó la replicación del virus en 6 días (Tabla II).

Tabla II

10 Replicación de la gripe A/PR/8/34 en frascos giratorios (línea celular MDCK 13016) tras la infección del cultivo celular sin cambio de medio, medida como el contenido en antígeno (unidades HA) Contenido HA después de días desde la infección (dpi)

1 dpi: 3 dpi 4 dpi 5 dpi 6 dpi

Experimento 1: 1:2 1:128 1:1024 1:1024 1:2048

Experimento 2: 1:4 1:512 1:2048 1:2048 1:1024

Ejemplo 4 15 Replicación de virus de la gripe en la línea celular MDCK 33016 en frascos rotatorios

La línea celular MDCK 33016 (DSM ACC2219) se replicó a 37ºC en medio de Iscove con una tasa de división de 1:8 a 1:12 dos veces a la semana en un frasco rotatorio que giró a 16 rpm. Cuatro días después de la transferencia se consiguió un recuento celular de aproximadamente .0 7,0 x 105 a 10 x 105 células/ml. Simultáneamente a la infección del cultivo

20 celular de 4-días con varias cepas del virus de la gripe (m.d.i. = 0,1), el cultivo celular se trató con tripsina (25 µg/ml de concentración final) y se incubó adicionalmente a 33ºC y se determinó la replicación del virus al 5º día desde la inyección (Tabla III). Tabla III Replicación de la gripe en frascos rotatorios (línea celular MDCK 33016) tras la infección

25 de un cultivo celular sin cambio de medio, medida como el contenido en antígeno (unidades HA) Ejemplo 5 Replicación de varias cepas de gripe en células MDCK 33016 en el fermentador

Contenido HA 5 días después de la infección

Cepa de gripe: Contenido HA

A/Singapore/6/86: 1:1024

A/Sichuan/2/87: 1:256

A/Shanghai/11/87: 1:256

A/Guizhou/54/89: 1:128

A/Beijing/353/89: 1:512

B/Beijing/1/87: 1:256

B/Yamagata/16/88: 1:512

A/PR/8/34: 1:1024

A/Equi 1/Prague: 1:512

A/Equi 2/Miami: 1:256

A/Equi 2 Fontainebleau: 1:128

A/Swine/Ghent: 1:512

A/Swine/Iowa: 1:1024

A/Swine/Arnsberg: 1:512

La línea celular MDCK 33016 (DSM ACC2219) se inoculó en medio de Iscove con un

5 inoculado celular de 1 x 105 células/ml en un fermentador de vaso agitado (volumen de trabajo 8 1). A una temperatura de incubación de 37ºC, una pO2 de 50 ± 10% (regulada) y a un pH de 7,1 1 ± 0,2 (regulado), las células proliferaron en 4 días hasta una densidad celular de 7 x 105 células/ml. A estas células se añadieron 8 ml de solución madre del virus (bien A/PR/8/34 o A/Singapore/6/86 o A/Shanghai/11/87 o A/Beijing/1/87 o B/Massachusetts/71 o

10 B/Yamagata/16/88 o B/Panama/45/90) y simultáneamente 16 ml de una solución de tripsina de concentración 1,25% y el cultivo celular inoculado se incubó a 33ºC. La replicación del virus se determinó en 6 días (Tabla IV).

Tabla IV

Replicación de cepas de virus de la gripe en el fermentador (línea celular MDCK 33016) 15 tras la infección de un cultivo celular sin cambio de medio, medida como el contenido en antígeno (unidades HA) Contenido HA después de días desde la infección (dpi)

1 dpi: 3dpi 4 dpi 5 dpi 6 dpi

A/PR/8/34: 1:64 1:512 1:1024 1:2048 1:2048

A/Singapore: 1:32 1:512 1:2048 1:2048 1:1024

A/Shangha: 1:8 1:128 1:256 1:256 1:512

A/Beijing: 1:16 1:256 1:1024 1:1024 nd

B/Yamagata: 1:8 1:128 1:512 1:512 nd

B/Massachussets: 1:4 1:128 1:256 1:512 nd

B/Panama: nd 1:128 1:256 nd 1:1024

Ejemplo 6 Influencia de la dosis de infección (m.d.i) sobre la replicación del virus

La línea celular MDCK 13016 (obtenida de un cultivo de células MDCK mediante presión

5 de selección) proliferó a 37ºC en medio ultra CHO con una tasa de división de 1:8 a 1:12 dos veces a la semana en un frasco rotatorio que giró a 16 rpm. Cuatro días después de la transferencia se consiguió un recuento celular de aproximadamente .0 7,0 x 105 a 10 x 105 células/ml. Se investigó la influencia de la dosis infectiva (m.d.i) sobre el rendimiento del antígeno y la capacidad de infección. Simultáneamente a la infección del cultivo celular de 4 días con la

10 cepa del virus de la gripe A/PR/8/34 (m.d.i. = 0,5 y .m.d.i.= 0,005), el cultivo celular se trató con tripsina (25 µg/ml de concentración final) y se incubó a 37ºC y se determinó la replicación del virus en 3 días (Tabla V). Tabla V Replicación de la cepa de virus de la gripe PR/8/34 en la línea celular MDCK 13016 en

15 frascos rotatorios tras la inyección con una m.d.i. de 0,5 o 0,005 La evaluación de la replicación del virus se llevó a cabo mediante detección antigénica (HA) y título de infectividad (CCID50, dosis infecciosa al 50% en cultivo celular en log10)

Días después de la infección: 2 3 4 5

HA: CCID50 HA CCID50 HA CCID50 HA CCID50

PP./8/34

m.d.i.= 0,5: 128 5,1 256 5,7 512 5,3 1024 5,4

m.d.i.= 0,005: 64 4,9 512 8,0 512 5,3 1024 8,3

En este caso, la determinación de la CCID50 puede llevarse a cabo, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento que se describe en Paul, Zell-und Gewebekultur [Cell and tissue culture] (1980), p. 395.

Ejemplo 7 Influencia de la sustitución del medio sobre la replicación del virus

La línea celular MDCK 33016 (DSM ACC2219) proliferó a 37ºC en medio de Iscove con

5 una tasa de división de 1:8 a 1:12 dos veces a la semana en un frasco rotatorio que giró a 16 rpm. Cuatro días después de la transferencia se consiguió un recuento celular de aproximadamente .0 7,0 x 105 a 10 x 105 células/ml. Se investigó la influencia de una sustitución de medio sobre el rendimiento del antígeno y la capacidad de infección. El cultivo celular de ahora 4 días se infectó con la cepa del virus de la gripe A/PR/8/34 (m.d.i. = 0,05) y la adición de

10 tripsina (20 µg/ml de concentración final en el frasco rotatorio) se llevó a cabo mediante la mezcla del inóculo del virus con la solución madre de tripsina. El cultivo celular se trató con adiciones de medio y se incubó adicionalmente a 33ºC y se determinó la replicación del virus en 5 días (Tabla VI). Tabla VI

15 Replicación de la gripe A/PR/8/34 en frascos rotatorios (línea celular MDCK 33016); adición de 5% (concentración final) de un medio de Iscove triple concentrado, de glucosa (concentración final 3%) o glucosa e hidrolizado de caseína (concentración final 3% o 0,1%) medida como contenido en antígeno (unidades HA) Contenido HA después de días desde la infección (dpi)

Adición: 1 dpi 3 dpi 4 dpi 5 dpi

(control): 1:16 1:256 1:1024 1:1024

3 x Iscove: 1:8 1:128 1:1024 1:2048

Glucosa: 1:32 1:512 1:2048 1:2048

Glucosa/hidrolizad o de caseína: 1:8 1:128 1:512 1:1024

20 Ejemplo 8 Replicación de virus de la gripe en células MDCK 33016 en el fermentador y obtención de los virus La línea celular MDCK 33016 (ACC2219) se inoculó en medio de Iscove con un inoculado

25 celular de 0,5 x 105 células/ml en un fermentador de vaso agitado (volumen de trabajo 10 1). A una temperatura de incubación de 37ºC, una pO2 de 55 ± 10% (regulada) y a un pH de 7,1 ± 0,2 (regulado), las células proliferaron en 4 días hasta una densidad celular de 7 x 105 células/ml. A estas células se añadieron 0,1 ml de solución madre del virus (A/Singapore/6/86; m.d.i. aproximadamente 0,0015) y simultáneamente 16 ml de una solución de tripsina de 1,25% de concentración y el cultivo celular inoculado se incubó adicionalmente a 33ºC. La replicación del virus se determinó tras 5 días y se recogió el virus. Las células y los residuos celulares se eliminaron mediante filtración en flujo tangencial (Sarcoton Mini-Microsart Module con un tamaño de poro de 0,45 µm); el procedimiento de filtración de acuerdo con las instrucciones del fabricante), no se detectó pérdida de antígeno (medido como HA) en el filtrado. El material vírico se concentró de 9,5 1 a 600 ml mediante filtración en flujo tangencial (Sartocon Mini-Ultrasart Module con un LSPMN (límite de separación de peso molecular nominal); procedimiento de filtración de acuerdo con las instrucciones del fabricante). La cantidad de antígeno en el concentrado fue de 5120 unidades HA (inicio 256 unidades HA; factor de concentración 201, mientras que la capacidad de infección en el concentrado fue de 9,2 log10 CCID50 (inicio 8,9 log10 CCID50; factor de concentración 16); la pérdida de antígeno y la capacidad de infección fue inferior al 1%, medido en el filtrado tras la filtración 100.000 LSPMN.

Ejemplo 9 Replicación de virus de gripe en células MDCK 33016 en el fermentador de perfusión

1,6 x 108 células de la línea celular MDCK 33016 (DSM ACC2219) se suspendieron en medio UltraCHO (0,8 x 105 células/ml) en el vaso reactor de Biostat MD (Braun Biotech Int., Melsungen, Germany) con un volumen eficaz de 2000 ml y proliferaron a 37ºC en operación de perfusión con un caudal creciente (entrada de oxígeno mediante aireación con manguera (regulación de oxígeno 40 ± 10% de pO2); regulación del pH pH ≤ 7,2; retención celular mediante filtro de centrífuga > 95%). El recuento de células vivas aumentó en 11 días 200 veces a 175 x 105 células/ml (Tabla VIIIa). 1990 ml de este cultivo celular se transfirieron a un 2º fermentador de perfusión (volumen de trabajo 5 l), mientras que el resto de las células se llevaron hasta 2000 ml de nuevo con medio y la proliferación celular se llevó a cabo de nuevo en operación de perfusión. En el 2º fermentador de perfusión (infección por virus), las células se infectaron con la cepa del virus de la gripe A/PR/8/34 (m.d.i. = 0,01) con la adición simultánea de tripsina (10 µg/ml concentración final) y se incubaron durante 1 hora. Después, el fermentador se incubó adicionalmente en operación de perfusión (regulación de pO2:40 ± 10% y pH: ≤ 7,2). El primer día después de la infección se llevó a cabo la incubación a 37ºC y se desechó el virus recogido en el sobrenadante del cultivo celular prefundido. Desde del 2º día después de la infección se llevó a cabo la replicación del virus a 33ºC y la tasa de perfusión de 2 volúmenes del fermentador/día se redujo a 0 en 7 días. La tripsina necesaria para la replicación del virus estaba presente en el medio UltraCHO, que se usó para la perfusión en una concentración de 10 µg/ml. El virus recogido (= sobrenadante del cultivo celular prefundido) se recogió a 4ºC y se determinó la replicación del virus durante 7 días como la cantidad de antígeno (Tabla VIIIb).

15 Tabla VIIIa

Replicación de células MDCK 33016 en el fermentador de perfusión

Día: Recuento de células vivas [x 105/ml] Recuento de células totales [x 105/ml] Perfusión [1/día]

0: 0,6 0,6
0

3: 8,0 8,3 0

4: 14,6 17,5 1,1

5: 33,3 34,7 1,1

6: 49,8 53,6 2,1

7: 84,5 85,6 3,9

9: 82,6 84,9 4,0

10: 148,5 151,0 4,0

11: 175,8 179,6 3,9

Tabla VIIIb

Replicación de gripe A/PR/8/34 en el fermentador de perfusión (línea celular MDCK 33016), medida como el contenido antigénico (unidades HA) en el sobrenadante de cultivo celular perfundido acumulado

Día después de la infección: Contenido HA en el virus recogido Adición de medio (perfusión) Cantidad total de virus recogido

1: <4 4 1 0 1

2: 8 4 1 4 1

3: 64 3 1 7 1

4: 256 2 1 9 1

5: 2048 2 1 11 1

6: 4096 2 1 12 1

7: 4096 0 1 12 1

Ejemplo 10 10 Preparación de una vacuna experimental para la gripe

Se preparó una vacuna experimental a partir del virus de la gripe A/PR/8/34 del Ejemplo 2-el A/PR/8 se replicó a 37ºC (Experimento 2; vacuna A) y Ejemplo 4 -A/PR/8 se replicó a 33ºC (vacuna B). Los virus de la gripe en el medio de cultivo celular se separaron de las células y fragmentos celulares mediante centrifugación a baja velocidad (2000 g, 20 min, 4ºC) y se

purificaron mediante centrifugación en gradiente de sacarosa (10 a 50% (p/p) de gradiente de sacarosa lineal, 30.000 g, 2 h, 4ºC). Se obtuvo la banda que contenía el virus de la gripe, se diluyó a 1:10 con PBS a pH 7,2 y se sedimentó a 20.000 rpm y el sedimento se suspendió en PBS (volumen 50% del medio de cultivo celular original). Los virus de la gripe se inactivaron con 5 formaldehído (adición dos veces de 0,025% de una solución de formaldehído de concentración 35% a un intervalo de 24 horas, incubación a 20ºC, con agitación). A 10 ratones NMRI cada uno de 18 a 20 g de peso se inoculó 0,3 ml de cada una de estas vacunas inactivadas experimentales el día 0 y el día 28 mediante inyección subcutánea. 2 y 4 semanas después de la inoculación y, también, 1 y 2 semanas después de la revacunación se extrajo sangre de los animales para

10 determinar el título de anticuerpos neutralizantes contra A/PR/8/34. Para determinar la tasa de protección, los ratones fueron expuestos 2 semanas después de la revacunación (6 semanas después de iniciado el experimento) mediante administración intranasal de 1000 DL50 (dosis letal al 50%). Los resultados del experimento de recopilan en la Tabla IX. Tabla IX

15 Eficacia de vacunas experimentales: Para la vacuna A se replicó el virus de la gripe A/PR/8/34 a 37ºC y para la vacuna B a 33ºC. Se investigó el título de anticuerpos neutralizantes contra A/PR/8 y también la tasa de protección tras la exposición de los ratones

Título de anticuerpos neutralizantes/ml*: Índice de protección Número vivos/total

2 w pvac.: 4 w pvac. 1 w prevac. 2 w prevac.

Vacuna A: < 28 56 676 1.620 1/10

Vacuna B: 112 1.549 44.670 112.200 9/10

*Semanas después de la vacunación ( w pvac.) y semanas después de la revacunación ( w prevac.)

20 Los experimentos confirman que los virus de la gripe que se habían replicado a 37ºC en cultivo celular con un alto rendimiento de antígeno (título HA) sólo inducían un título bajo de anticuerpos neutralizantes en el ratón y que apenas proporcionaban protección, mientras que los virus de la gripe que se habían replicado a 33ºC en cultivo celular también con un alto rendimiento de antígeno (título HA) inducían títulos muy altos de anticuerpos neutralizantes en el

25 ratón y conducía a una protección muy buena.

Claims

1.: Línea celular MDCK 33016, DSM ACC2219.

2.: Un procedimiento para la producción de una vacuna contra el virus de la gripe, que comprende:

(i): células en proliferación en medio sin suero en suspensión;

(ii): infección de las células con virus de la gripe;

(iii) poco antes de la infección, simultáneamente con la infección o poco después de la infección, adición a la suspensión celular de una proteasa para escindir la proteína precursora de la hemaglutinina [HAD];

(iv) tras una fase adicional de cultivo, aislamiento de los virus de la gripe replicados en las células; y

(v) formulación de los virus de la gripe aislados para dar una vacuna para la administración a seres humanos o animales; en el que las células pueden infectarse con los virus de la gripe y se han seleccionado a partir de células MDCK para adaptarlas al crecimiento en suspensión en medio sin suero.

3.: El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el cultivo de las células tiene lugar en un sistema de perfusión o un procedimiento discontinuo.

4.: El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en el que el pH del medio de cultivo en la etapa (i) está en el intervalo de 6,6 a 7,8.

5.: El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el pH del medio de cultivo está en el intervalo de 6,8 a 7,3.

6.: El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que la infección con virus de la gripe se lleva a cabo cuando el cultivo celular ha alcanzado una densidad celular de aproximadamente 8 a 25 x 105 células/ml (procedimiento discontinuo) o de aproximadamente 5 a 20 x 106 células/ml (procedimiento de perfusión).

7.: El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que la infección de las células con virus de la gripe se lleva a cabo a m.d.i (multiplicidad de infección) de aproximadamente 0,001 a 10.

8.: El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la infección se lleva a cabo a una m.d.i de aproximadamente 0,002 a 0,5.

9.: El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que la proteasa es una serín proteasa.

10.: El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la serín proteasa es tripsina.

11.: El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la tripsina se añade hasta una concentración final en el medio de cultivo de entre 1 y 200 µg/ml.

12.: El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el la concentración final de tripsina en el medio de cultivo está en el intervalo de 5 a 50 µg/ml.

13.: El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en el que las células infectadas están cultivadas durante 2 a 10 días.

14.: El procedimiento de la reivindicación 13, en el que las células infectadas se cultivan durante de 3 a 7 días.

15.: El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, en el que las células infectadas se cultivan entre 30ºC y 36 ºC.

16.: El procedimiento de la reivindicación 15, en el que las células infectadas se cultivan a entre 32ºC y 34ºC.

17.: El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16 en el que la recolección y aislamiento de los virus replicados se lleva a cabo de 2 a 10 días después de la infección,

18.: El procedimiento de la reivindicación 17,en el que la recolección y aislamiento de los virus se lleva a cabo de 3 a 7 días después de la infección.

19.: El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 18, en el que las células son de la línea celular MDCK 33016, DSM ACC2219.

20.: El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, en el que la vacuna contiene un adyuvante.

21.: El procedimiento de la reivindicación 20, en el que la vacuna contiene partículas de virus intactas, virus inactivados o proteínas aisladas del virus.