WO2005026333A1 - プロテアーゼを用いた接着性細胞の浮遊培養技術、及び該細胞を宿主として用いてウィルスを生産する方法 - Google Patents

プロテアーゼを用いた接着性細胞の浮遊培養技術、及び該細胞を宿主として用いてウィルスを生産する方法 Download PDF

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suspension
virus
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Shigehiro Sato
Reiko Tsutsumi
Sumiko Yaegashi
Kumi Furusawa
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Japan Science And Technology Agency
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    • C12N2760/16051—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a suspension culture method for adhesive cells using a protease, and an adhesive cell method.
  • Virus as a host in suspension culture in the presence of protease and serum
  • Somatic cells other than blood cells generally initiate cell division after adhering to a solid surface such as glass or plastic. For this reason, as described below, large-scale cell culturing has been carried out using cells such as hollow fibers and porous carriers (Non-Patent Document 1) and microcarriers (Non-patent Document 2). Carriers have been developed to increase the area of adhesion between a solid and a solid phase. Furthermore, there has been reported a method of selecting a clone having a low adhesive ability such as an LS cell line (Non-patent Document 3) or a clone of Hela-S3 and adapting it to suspension culture. Has limitations.
  • the culture solution contains tribcine.
  • serum contains trypsin inhibitor Yuichi Because it has been Therefore, as a procedure, a two-stage treatment is required in which MDCKi spores that have been grown in advance in a medium containing fetal serum are washed with a serum-free medium and then infected with the virus (Patent Documents 1 and 2).
  • Non-Patent Document 1 Bryan Griffiths (2000), In Animal Cell Culture Third Edition edited by John R. W. Masters, pp.1566, Oxford University Press
  • Non-Patent Document 2 Brown F, et al .: Inactivated Influenza Vaccines Prepared in Cell Culture. Dev Biol Stand. Basel Karger, 1999, vol.98, pp.23-37.
  • Non-Patent Document 3 Paul, J. and Struthers, MG (1963), Biochem. Biophys. Res. Commun., 11, 135
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 55-1553 723
  • Patent Document 2 US Patent No. 4,500,513
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-50007448 Disclosure of the Invention
  • cells are attached to the microcarriers in a suspended state. It does not go beyond the conventional principle of monolayer culture in which cells are adhered to a solid phase surface and cultured. Also, such a method is suitable for scale-up of Hozuki S ⁇ Fat, but requires careful operation and expensive culture equipment. Also, the life of cells adhered to the solid phase Life usually lasts between 50 and 60 days, at most around 150 days, and cannot be cultured for longer. Furthermore, a method for producing a virus by growing cells in a suspension culture system in the presence of protease and serum has not yet been developed.
  • an object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to establish a simple and effective suspension cell culture system and a virus production system by simple means.
  • the inventor of the present invention has proposed that the use of the protease allows the adherent cultured cells to be coated on the solid surface without using any conventionally used carrier, that is, by allowing the protease to be present at an appropriate concentration in the culture solution.
  • the present inventors have found that the adherent cultured cells themselves can be grown in a floating state at a high density over a long period of time, thereby completing the present invention. Therefore, the present invention is a highly versatile method that can be applied to cells having strong adhesion ability, such as MDCK cells (established cell line derived from canine kidney).
  • the present invention relates to a method for cultivating a leukocyte derived from an adherent cell in a suspension state in the presence of a protease, and the cell itself obtained by the culturing method. Further, the present invention relates to a method for producing a virus in a suspension culture system in the presence of protease and serum using the above-mentioned adherent cells as a host. The present invention further relates to a vaccine produced using the virus thus obtained.
  • FIG. 1 is a micrograph of MDCK cells in suspension after 180 days of culture (200 ⁇ magnification).
  • FIG. 2 is a scanning electron microscope of MDCK cells after 180 days of culture (magnification 2.000). Times).
  • FIG. 3 shows the growth curve of the MDCK suspension cell line.
  • FIG. 4 shows a comparison of the protease (-) with a growth curve in a monolayer culture.
  • Figure 5 shows the results of culturing MDCK cells and 4 strains of MDCK 6M "in NUNC flasks (catalog No. 169900) with a culture area of 25 cm 2. Each plot shows the number of cells obtained from different flasks. is there.
  • FIG. 6 shows that 6M "4 is a non-adhesive flask treated with MPC (2-methacryloyl oxyethyl phosphoryl choline) 9 In a 6-well plastic plate (NUNC), the medium containing or not containing MEP-F 50 9 I ml
  • MPC 2-methacryloyl oxyethyl phosphoryl choline
  • Figure 7 is a photomicrograph showing the 5th CPE (x10 (H 5) after influenza virus inoculation in a 6M "4 suspension culture system. In the figure, a large number of broken cells indicated by""are shown. Such clear CPE had already appeared on day 3 after virus inoculation BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the type of protease used in the present invention and its origin (source) were particularly restricted. There is no limitation, and appropriate cells known to those skilled in the art can be appropriately selected and used according to the type of cells to be cultured, other culture conditions such as ⁇ cultured organs, ⁇ ground, and the like. In particular, metallodene-peptidase F is an example.
  • protease refers to a protein segmentation / enzyme in general, and refers to an enzyme called proteinase or endose, which mainly degrades proteins, and peptide, which degrades small peptides. Is included. Proteases are usually
  • proteases Based on the amino acid residues and metals required for the expression of the activity, such as (1) serine protease, (2) cysteine protease, (3) aspartate protease, and (4) MEP-F Mouth proteases are often divided into four main groups. In the method of the present invention, any of these proteases can be used alone or in an appropriate combination. In the culturing method of the present invention, suitable conditions known to those skilled in the art can be appropriately selected and used for the culturing apparatus, the cultivation period, the culture conditions such as the culture medium, and the like.
  • the culture method of the present invention when applying the culture method of the present invention for virus production, it is preferable to use a medium supplemented with any serum known to those skilled in the art, such as maggot fetal serum, to the medium. Serum-free culture without serum is also possible.
  • the culture method of the present invention can also be carried out using a cell non-adhesive culture device such as a flask treated with MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphoryl choline).
  • MPC 2-methacryloyloxyethyl phosphoryl choline
  • an appropriate concentration known to those skilled in the art can be appropriately selected and used. Come out. The concentration does not need to be kept constant during the culture.
  • the concentration of the protease in the culture solution is adjusted in advance prior to the start of the culture, it is not necessary to replenish the organs of the culture, especially the protease.
  • an appropriate amount of protease can be added to the culture system at an appropriate time, for example, when the cells are subcultured (passaged).
  • the concentration of the protease in the culture solution is, for example, 10 yCig / ml to 100 xg / ml, preferably 1 Oyag / m "! To 5 O / ug / ml.
  • the present invention is particularly effective when the cells are adherent cells, for example, somatic cells.
  • adherent cells for example, somatic cells.
  • somatic cells examples include MDCK And RD18s, LLCMK2
  • the method of the present invention is to subculture the adherent cells MDCK for at least 6 months, Next, culture the cells in a protease-free medium for at least 7 days, collect the cells in suspension, subculture the cells at least three times under the same conditions, and then proceed from the cells in suspension.
  • Cells obtained by collecting cells that can be subcultured under static culture conditions for example,
  • the MDCK 6M-4 strain derived from MDCK cells created by the inventor is 3 ⁇ 4 ⁇ .
  • this MDCK 6M-4 strain is a meta-oral protein such as MEP-F.
  • the culture method of the present invention shows high growth efficiency.Furthermore
  • the MDCK 6M-4 strain is suitable as a host for virus inoculation in a suspension culture in the presence of protease and serum.
  • the virus can be grown and produced at a high yield, and the virus of the present invention can be obtained by using the cells cultured in suspension in the presence of protease as a host by using the method of the present invention.
  • Example 1 Suspension culture system of adherent cells in the presence of protease Sustained using MDCK cells (ATCC: CCL-34; Dainippon Co., Ltd. Laboratory Products Division) which are established cells derived from dog kidney A suspension culture system was created.
  • FIG. 1 is a photomicrograph (200x magnification) of MDCK cells in suspension after 180 days of culture. Cells can be observed as they aggregate and proliferate.
  • Fig. 2 shows a photograph of these cells taken with a scanning electron microscope (2,000-fold magnification).
  • FIG. 2 shows the growth curve of the MDCK suspension cell line. Approximately 1.5 x 10 6 or more MDCK cells were obtained, and this condition could last for more than 12 months at this time.
  • Figure 4 shows a comparison with the growth curve of monolayer culture of proteases (1) performed under the same culture conditions. In both split ratios of 1: 4 and 1:12, the number of cells reached a plateau in about one week for proteaze (-). In order to maintain the cells, it was necessary to continue cultivation as soon as possible after reaching the plateau.
  • Example 2 Suspension culture system of adherent cell-derived cells in the presence of protease and serum MDCK cells cultured in suspension by the method of the present invention described in Example 1 were subjected to subculture for 6 months. An aliquot was taken and cultured in a culture flask having normal adhesion (Nunc tissue culture flask: catalog No. 163371) using a MEP-F-free medium (Eagle's MEM + 10% FCS). Many cells adhered to the bottom of the flask and began to proliferate, but some cells did not adhere to the cells for more than 7 days after the start of culture and remained in suspension (first time).
  • MDCK suspension cells (MDCK 6 to 4 strains) thus produced using MEP-F differ from the parent strain, MDCKi spores (ATCC CCL-34, batch H 3305), in several respects in the following points. It turned out to be.
  • the MDCK 6M "4 shares were purchased on March 31, 2006, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japan. No. 1 Higashi 1-chome 1 Central No. 6 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) has been deposited at the Patent Organism Depositary, and has a deposit number of FERM P-19761.
  • MDCI cells (3.33 ⁇ 10 5 ) and (MDCK 6M3.94 strains (3.9 ⁇ 10 5 )) were cultured in a 25 cm 2 NUNC flask (catalog No. 169900). MEM was supplemented with 10% FCS and both cells adhered to the bottom and proliferated, and the cells were counted until day 9 after the start of culture, and the medium was changed on days 3 and 7. As a result, the number of cells in static culture of MDCK 6M-4 (hereinafter referred to as 6M "4) was about 1.6 times that of the parent strain MDCKI spores in the same area (Fig. 5).
  • 6M "4 was treated with a non-adhesive flask, MPC (2-methacryloxyl oxyethyl phosphoryl choline) 9
  • MPC (2-methacryloxyl oxyethyl phosphoryl choline) 9
  • a 6-well plastic plate cultured in a medium containing 50 yug I ml of MEP-F ( 4 Ixl O / well), compared to 6M-4 cells cultured in MEP-F-free medium, from the first day of culture (dayl) to the fourth day (day4).
  • MPC-treated flask makes it possible to obtain a suspension culture of the MDCKi spore parent strain in a MEP-F-free medium, but it proliferates more than 6 M "4 strains in suspension culture in a MEP-F-containing medium. Furthermore, when MEP-F is added to the suspension culture of the MDCK ⁇ strain cultured in MPC-treated flasks, most cells undergo apoptosis and die. Are cells that have been selected and survived against the presence of such proteases.By using the method of the present invention using such cells, the problem of apoptosis using MPCia Physico-Flasco is also reduced. It is possible to avoid.
  • the MDC strain was statically cultured (Nunc flask, Catalog No. 169900), and when it reached the state of conf 1 uent (100% sheet) on the fourth day of culture, 2 units of trypsin / ml containing Dul becco's Modi fied After the medium was replaced with MEM1 Oml, 100 ml of influenza A / Morioka / H3 / 2000 (infection titer x8, 192/100 ml) was inoculated.
  • 6M-4 which became conf 1 uent by static culture, was suspended and cultured by the method of the present invention using 10 ml of Dul becco's Modi fied MEM containing 10% FCS and 50 mg MEP-F, and the same amount of influenza virus was used.
  • CPE cytopathic effect
  • influenza virus with an infectious titer of X 4,096 / 251 was recovered, whereas 6M-4 was already 3 days after inoculation.
  • FIG. 7 shows the CPE 5 days after influenza virus inoculation in the 6M-4 suspension culture system.
  • the suspension culture system of MDCI cells has been developed for the purpose of mass culture of the influenza virus vaccine.However, in the suspension culture system of 6M-4 using MEP-F, the growth of influenza virus is not It was shown that higher yields were obtained for the same volume of medium than in static culture. This is considered to be advantageous for vaccine production of influenza virus. Furthermore, since MEP-F is used in combination with fetal calf serum, cells can be propagated by infecting influenza virus while growing cells. The scale-up of suspension culture is easy, and it may be possible to provide pectin more quickly and at a much lower cost compared to the conventional method for preparing an influenza vaccine using yidani chicken eggs.
  • the chorioallantoic fluid obtained is about 5 ml, and 100,000 embryonated eggs were used for influenza vaccine ⁇ , and the resulting chorioallantoic fluid is about 500,000 ml, or about 500 l. If tank cultivation becomes possible, suspension cultivation of this scale will be easy, and it will be possible to significantly reduce the cost of influenza vaccine, and it will also be possible to cope with livestock-related pectin such as triinfluenza. .
  • Industrial applicability In the method of the present invention, cells can grow in suspension in a nutrient solution in the presence of protease without adhering to the solid surface. Therefore, this method does not require a special device such as a hollow fiber, a hollow carrier or a microcarrier, and can be easily scaled up.
  • the present invention can be widely applied to the bioindustry in various fields such as production of a virus vaccine by culturing various viruses such as Influenza virus and mass production of various cell components. It is possible.

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Abstract

本発明は、簡易な手段による簡便でかつ有効な浮遊細胞培養系であって、インフルエンザウイルスのような各種ウイルスの培養によるウイルスワクチンの製造、及び各種細胞成分の大量生産などに広く応用することが可能な培養系を確立することを目的とする。本発明は、プロテアーゼ存在下で接着性細胞を浮遊状態で培養する方法、及び、接着性細胞を宿主として用いて、プロテアーゼ及び血清存在下の浮遊培養系でウイルスを生産する方法等に係る。この方法では培養液中で細胞が固相表面に付着せずに液中で浮遊させることが出来る。従って、この方法は特殊な装置を必要とせず、簡単にスケールアップすることも可能である。更に、培養液を交換するだけで半永久的な長期培養が可能である。又、本発明方法である浮遊培養のスケールアップは容易であり、従来の孵化鶏卵を用いたインフルエンザワクチン作成法に比べ、より迅速且つ安価にワクチンを提供することができる。

Description

プロテアーゼを用いた接着性細胞の浮遊培養技術、 及び該細胞を宿主として用い てウィルスを生産する方法 技術分野 明
本発明は、 プロテアーゼを用いた接着性細胞の浮遊培養方法、 及び接着性細胞 田
を宿主として用いて、 プロテア—ゼ及び血清存在下の浮遊培養系でウィルスを生 書
産する方法等に関する。 背景技術 血液細胞以外の体細胞 （接着 細胞） は一般にガラスやプラスチック等の固相 表面に接着してから細胞分裂を開始する。 そのため細胞の大量培養には、 以下に 示すように、 これまで中空繊锥（hollow fibers )及び中空担体 (porous carrier) ( 非特許文献 1 )や微小担体 (microcarrier) (非特許文献 2 )など細胞と固相との 接着面積の拡大を図る担体が開発されてきた。 更に、 L S細胞系 （非特許文献 3 ) や H e l a— S 3クローンのような接着能 力の弱いクローンを選んで浮遊培養 (suspension culture) に適応させる方法も 報告されているが、 細胞の種類に限界がある。 又、 インフルエンザウイルスが細胞表面のレセプ夕一に結合するためには、 基 本的に、 リガンドであるへマグルチニンがプロテア一ゼで開裂される必要がある 。 このため、 インビトロにおけるインフルエンザウイルスの増殖には培養液に卜 リブシンを含有させている。 しかし、 その場合には細胞増殖に必要なゥシ胎児血 清を用いることができない。 なぜなら、 血清にはトリプシンインヒビ夕一が含ま れているからである。従って、 手順として、 あらかじめゥシ胎児血清含有培地で 増殖させた MDCKi田胞を無血清培地で洗ってからゥィルスを感染させるという二段 階の処理が必要である （特許文献 1及び 2 ) 。 これらはすべて静置培養系で行わ れるため、 スケールアップには大量のフラスコが必要になるとともに、 ウィルス 接種の手間も煩雑である。 更に、 無血清培地の懸濁物における増殖に適した、 MDCI細胞由来の細胞も開発 され、 この浮遊細胞を用いて無血清培地においてィンフルェンザウィルスを増殖 させる方法が記載されている （特許文献 3 )。
[非特許文献 1 ] Bryan Griffiths (2000)， In Animal Cell Culture Third Edition edited by John R. W. Masters, pp.1566, Oxford University Press
[非特許文献 2 ] Brown F, et al.： Inactivated Influenza Vaccines Prepared in Cell Culture. Dev Biol Stand. Basel Karger, 1999， vol.98, pp.23-37
[非特許文献 3 ] Paul, J. and Struthers, M. G. ( 1963), Biochem. Biophys. Res. Commun. , 11， 135
[特許文献 1 ] 特開昭 5 5— 1 5 3 7 2 3号公報
[特許文献 2 ] 米国特許第 4， 5 0 0 , 5 1 3号明細書
[特許文献 3 ] 特表 2 0 0 0— 5 0 7 4 4 8号公報 発明の開示 微小担体を用し、る培養では細胞を微小担体に付着させて浮遊状態にしているが 、 基本的に従来の固相表面に細胞を接着させて培養する単層培養の原理を超える ものではない。 又、 このような方法は細月 S±咅養のスケールアップには適している が、 注意深い操作と高価な培養装置が必要である。 また固相に接着した細胞の寿 命は通常 5 0〜6 0日、 最長でも 1 5 0日程度であり、 それ以上長期間培養する ことができない。 更に、細胞をプロテア一ゼ及び血清存在下の浮遊培養系で増殖させることによ つて、 ゥィルスを製造する方法は未だ開発されていない。 そこで、本発明の目的は、 上記のような課題を解決し、簡易な手段による簡便 でかつ有効な浮遊細胞培養系及びゥィルス生産系を確立することである。 本発明者は、 プロテアーゼを利用することにより、従来使用されていた担体を 一切用いることなく、即ち、 プロテア一ゼを培養液中に適当な濃度で存在させる ことにより接着性培養細胞が固相表面に接着することを防ぎ、接着 培養細胞自 体を浮遊状態で高密度で長期間に亘り増殖させることが出来ることを見出し、本 発明を完成した。 従って、 本発明は、例えば、 M D C K細胞（ィヌ腎臓由来の樹立細胞系） のよ うな接着能力の強い細胞にも応用することが出来る汎用性の高い方法であり、既 に記載した従来の培養技術とは基本的に異なる原理に基づくものである。 即ち、本発明は、 プロテアーゼ存在下で接着性細胞に由来する綱包を浮遊状態 で培養する方法、及び該培養方法で得られた細胞自体に係る。 又、本発明は、 上記の接着性細胞を宿主として用いて、 プロテア一ゼ及び血清 存在下の浮遊培養系でゥィルスを生産する方法に係る。 本発明は更に、 こうして得られたウィルスを用いて製造されたワクチンに係る 図面の簡単な説明 図 1は、 ±き養 1 8 0日後の浮遊状態の MDCK細胞の顕微鏡写真（倍率 200倍） 図 2は、培養 1 8 0日後の MDCK細胞の走査型電子顕微鏡（倍率 2.000倍）で あ 。
図 3は、 MDCK浮遊細胞系の増殖曲線を示す。
図 4は、 プロテアーゼ（―） の単層培養における増殖曲線との比較を示す。 図 5は、 MDCK細胞及び MDCK 6M"4株を培養面積 2 5 c m 2の NUNCフラスコ （カタ ログ No. 169900) で培養した結果を示す。それぞれのプロッ卜は異なるフラスコ から得られた細胞数である。
図 6は、 6M"4は非接着性フラスコである MPC (2-methacryl oyl oxyethyl phosphoryl chol i ne)処理 9 6穴プラスチックプレート (NUNC) において、 MEP-F 50 9 I ml含有培地又は不含培地で培養した結果を示す。図中、左のパー MPC 処理プレ一卜で MEP-F不含培地を用いて 6M"4を浮遊培養した場合、右のバーは MPC 処理プレー卜で MEP-F含有培地を用いて 6M"4を浮遊培養した場合を示す。
図 7は、 6M"4浮遊培養系におけるインフルエンザウイルス接種後 5曰目の CPE (x10(H咅）を示す顕微鏡の写真である。図中、 「 」で示すような破壊された細 胞が数多く見られる。 ウイルス接種後 3日目にはすでにこのような明瞭な CPEが 現れていた。 発明を実施するための最良の形態 本発明において使用するプロテアーゼの種類及びその由来（取得源） に特に制 限はなく、 ±咅養する細胞の種類、 ±咅養器官、 ±咅地等のその他の培養条件等に応じ て、 当業者に公知の適当なものを適宜選択して使用することが出来る。特に、 メ タロェンドぺプチダ一ゼ Fが 茵である。 本明細書において「プロテアーゼ」 とは、 タンパク質分角?酵素全般を意味し、 タンパク質を主に分解するプロティナ一ゼ又はェンドぺプチ夕一ゼ、 小ペプチド を分解するぺプチ夕一ゼと呼ばれる酵素を含むものである。 プロテア一ゼは通常
、活性発現に必要なアミノ酸残基及び金属等に基づいて、 （1 )セリンプロテア一 ゼ、 （2 ) システィンプロテアーゼ、 （3 )ァスパラギン酸プロテア—ゼ、及び（ 4 ) M E P— Fのようなメタ口プロテアーゼの 4つの主なグループに分けられる ことが多い。 本発明方法ではこれらに属するいずれのプロテアーゼも単独又は適当に組み合 わせて使用することが出来る。 本発明の培養方法において、培養装置、 ±き養期間、培地等の培養条件等は当業 者に公知の適当なものを適宜選択して使用することが出来る。特に、 ウィルス生 産の為に本発明の培養方法を適用する際には、培地にウジ胎児血清等の当業者に 公知の任意の血清を添カ卩した培地を使用することが好ましいが、 かかる血清を含 まない無血清培養も可能である。 更に、 MPC ( 2-methacryl oyl oxyethyl phosphoryl chol ine)処理フラスコのように細胞非接着性培養器具を使用して本 発明の培養方法を «することも出来る。 培養液中に含まれるプロテア一ゼの濃度は培養する細胞の種類、及び上記の培 養条件等に応じて、 当業者に公知の適当なものを適: 1^1択して使用することが出 来る。濃度は培養中、 常に一定に維持する必要はない。 本発明方法においては、 ±き養の開始に先立って培養液中のプロテア—ゼの濃度 を予め調整しておけば、培養の器官中、特にプロテア一ゼを補充する必要はない 。 しかしながら、適当な時期、例えば、 細胞を植え継ぐ （継代） 時に適当量のプ □テアーゼを培養系に追加することも出来る。 培養液中のプロテアーゼの濃度は、例えば、 1 0yCig/ml〜100 xg/m 1、 好ましくは、 1 Oyag/m"！〜 5 O/ug/mlである。 本発明方法で培養することが出来る細胞の種類に特に制限はないが、特に、細 胞が接着性の細胞である、例えば、体細胞のような に本発明は特に有効であ る o このような細胞の例として、 M DC K、 RD 18 s、 LLCMK2と呼ばれる 各種綳包を挙げることが出来る。更に、 以下の実施例で示されるように、本発明 方法で、接着性細胞である MDCKを少なくとも 6ヶ月間継代培養し、次にプロ テア一ゼ不含培地を用いて少なくとも 7日培養し、 浮遊状態にある細胞回収して 更に同じ条件で、 少なくとも 3回継代培養し、 その後、 浮遊状態にあった細胞か ら通常の静置培養の条件で継代できる細胞を回収することによって得られる細胞 、例えば、本発明者によって作成された M DC K細胞由来の MDCK 6M-4 株が¾Ιである。以下の実施例で示されるように、 この MDCK 6M— 4株は ME P— Fのようなメタ口プロテア一ゼの存在下で MP C処理フラスコを用いる 本発明の培養方法で高い増殖効率を示し、更に、 MDCK 6M— 4株はウィル スを接種する宿主として、 プロテアーゼ及び血清存在下の浮遊培養系に適してお り、 この培養系でゥィルスを高収率で増殖させ生産することが出来る。 上記の本発明方法を利用して、 プロテアーゼ存在下の浮遊状態で培養されてい る細胞を宿主として用いてウイルスを生産することが出来る。 かかるゥィルスの 種類に特に制限はない。本発明方法は上記のような特有な効果を有しているので 、例えばワクチン製造の対象となるィンフルェンザウィルスのようなウィルスの 培養に好適である。 従って、例えば、本発明方法で細胞を培養しながら、 かかる培養細胞を宿主と して利用することによってウィルスを生産し、 このウィルスを用いて、 当業者に 公知の任意の方法によりヮクチンを製造することが出来る。 以下に、 ^例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限 定されるものではない。 実施例 1 ：プロテアーゼ存在下での接着性細胞の浮遊培養系 ィヌ腎臓由来の樹立細胞である MDCK細胞（ATCC:CCL-34；大日本製對朱式 会社ラボラトリ一プロダクツ部） を用いて持続浮遊培養系を作成した。 具体的には、 Nunc組織培養用フラスコ （カタログ No.163371) 内の 10mlの Eagle' s MEM + 10%FCS培地にプロテア一ゼ（メタ口エンドべプチダ一ゼ F ： M E P - F s 酵素医^ ΐ开究所から供与） を 5 0 yu g/m lの濃度になるように 添加し、 4〜5日の適応期を経て、 この中で MDCK細胞（初期細胞数 3 x 1 0 5 個 m l ) を培養した。 図 1は培養 1 8 0日後の浮遊状態の MDCK細胞の顕微鏡写真（倍率 200倍） である。細胞が集合して増殖している が観察できる。 この細胞を走査型電子 顕微鏡（倍率 2,000倍）で撮影したものを図 2に示す。 図 2から、細胞が集合し て細 BSi鬼となっていることが分かる。 更に、 MDCK浮遊細胞系の増殖曲線を図 3に示す。約 1.5 X 106以上の MDCK 細胞が得られ、 この状態は現時点で 1 2か月以上持続することが可能であった。 同様の培養条件で行ったプロテア一ゼ（一）の単層培養における増殖曲線との 比較を図 4に示す。 1 : 4、 1 ： 1 2のいずれの split ratioにおいてもプロテア —ゼ （―）では約一週間で細胞数がプラトーに達した。細胞を維持するためには ブラトーに達してからなるべく早い時期に継 ti咅養が必要となった。 それに対し て、プロテアーゼ（+ )の浮遊培養ではブラ卜一に達するまでに 1 : 4の split ratio で約 3週間かかるが、 細胞数はプロテア一ゼ（一） のそれに匹敵するまで増殖し た。培養液量を増やせばさらに多くの細胞の収穫が見込まれる。 1 ： 1 2の split ratioでは増殖までの適応期間が長くなるが、増殖を開始してからは 1 : 4の split ratioの増殖曲線とほぼ平行に増殖していることから最終的な細胞数は同等とな ることが期待される。 これは継代培養の労を省き、培養液の交換のみで細胞を長 期間生存状態で保存しておくためには好都合である。 実施例 2 ：プロテア—ゼ及び血清存在下での接着性細胞由来細胞の浮遊培養系 実施例 1に記載した本発明方法で浮遊培養化した MDCK細胞を 6ヶ月間継代 培養した時点で、その一部をとり、 MEP-F不含培地（Eagle's MEM + 10%FCS) を用いて通常の接着 を有する培養フラスコ （Nunc組織培養フラスコ：カタ口 グ No.163371 )で培養した。多くの細胞はフラスコ底面に接着して増殖をはじめ たが、 一部の細胞は培養開始後 7曰以上経過しても接着せず、 浮遊状態のままで あった（ 1回目）。この浮遊状態にある細胞をさらに同じ条件で継代すると、一部 の細胞はフラスコ底面に接着して増殖したが、 さらに 7日以上経過してもまだ浮 遊状態にある細胞が残った（2回目）。この操作をさらに 2回繰り返し、 4回目ま で （1ヶ月以上）浮遊状態にあった細胞から通常の静置培養の条件で継代できる 細胞を回収し、 この細胞を 6M-4と名付けた。尚、かかる細胞は、〒 020-8505岩 手県盛岡市内丸 1 9 ? 1所在の岩手医科大学細菌学講座にて保管されており、本 発明を微又は研究のために する際に必要な場合には、何人にも分譲するこ とが可能である。
MEP - Fを用いてこうして作成された MDCK浮遊細胞 (MDCK 6 ~4株）はその親株で ある MDCKi田胞 (ATCC CCL-34, batch H 3305 )と以下のいくつかの点で性質を 異にすることが明らかになった。 尚、 MDCK 6M"4株は、 平成 1 6年 3月 3 1日付けで、 〒305-8566茨城県つくば 巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物 寄託センタ一に寄託され、 受託番号 FERM P- 19761 が付されている。 即ち、 MDCI細胞 （3 · 3χ105個）及び (MDCK 6M~4株 （3.9x105個） を培養面積 2 5 c m 2の NUNCフラスコ （カタログ No. 169900)で培養した。培地は、 Eagle' s MEM に FCSを 1 0 %添加したものを使用した。細胞は両者ともに底面に接着して増殖 し、培養開始後 9日まで細胞を計数した。培地は 3日目及び 7日目に交換した。 その結果、 MDCK 6M-4 (以下 6M"4) は静置培養における細胞数が、 同一面積当た り、 親株である MDCKI田胞の約 1 .6倍であった （図 5 ) 。 更に、 6M"4を非接着性フラスコである MPC (2-methacryl q l oxyethyl phosphoryl chol i ne)処理 9 6穴プラスチックプレート (NUNC) において、 MEP-F 50 yug I ml含有培地で培養した （Ixl O4個/ wel l ) 場合、 MEP-F不含培地で培養し た 6M-4細胞に比し、培養 1日目（dayl )から 4日目（day4)に至るまで、
3H-Thymi di ne 取り込み (cpm)が高かった （図 6 ) 。 このことは、 浮遊状態であ ることに加えて、 更に MEP-Fを培地含有されることによって、 6M-4の浮遊培養に より適したものになることを示している。 以上の 2点は、親株の MDCKから浮遊培養に適した 6M~4のような細胞株を選択し、 かつ、選択された綱包株を浮遊培養系で維持するためには MEP-F等のプロテア一 ゼを添力□することが好ましいことを示している。但し、 例えば、 MEP- Fがいかな る細胞内シグナル伝達糸 1S§を介して 6M"4を活性化するかについては今のところ 不明である。
MPC処理フラスコを用いると MEP-F不含培地で MDCKi田胞親株の浮遊培養系を得 ることが可能であるが、 6M"4株を MEP-F含有培地で浮遊培養した とくらベて 増殖効率が劣る。 さらに、 MPC処理フラスコで培養した MDCK^株の浮遊培養系に MEP-Fを加えると大部分の細胞がアポトーシスに陥って死んでいく。従って、 6M"4 はそのようなプロテアーゼの存在に抗して選択され生き残つてきた細胞であり、 このような細胞を使用する本発明の方法を用いることによって、 MPCia理フラス コを使用するアポ卜一シスの問題も回避することが可能である。
MPC処理フラスコが利用できる以前は、 通常の細^ ±咅養用フラスコを用いて MEP-Fを用いない浮遊培養系を作ることができなかった。このため、 MEP-Fの作用 は一義的に細胞接着を阻止することにあると考えていたが、 MPC 理フラスコが 出現するに及び、対照としての MEP- F不含浮遊培養系を作ることが可能になつた。 その結果、 上記のように、 MEP-Fを利用した本発明の浮遊細胞培養系の利点が 明らかとなってきた。 すなわち、 MEP- Fを用いた浮遊細胞培養法は、単に、物理 的に接着を阻害して浮遊細胞系を作る MPC処理フラスコを用いた浮遊細胞培養 法とは基本的に異なることが示された。 実施例 3 ：プロテア一ゼ及び血清存在下での接着性細胞由来細胞の浮遊培養によ るウィルスの生産
MDC 見株を静置培養 (Nunc フラスコ、 カタログ No.169900)し、 培養 4日目に conf 1 uent (100% sheet) の状態となったところで、 2単位トリプシン /ml含有 Dul becco' s Modi fied MEM1 Omlで培地交換をした後、 インフルエンザ A/盛岡 /H3/2000(感染価 x8， 192/100ml)を 100ml接種した。同様に、静置培養で conf 1 uent になった 6M-4を 10%FCS、 50mgMEP-F含有 Dul becco' s Modi fied MEM 10mlを用いて 本発明による方法で浮遊培養し、同量のィンフルェンザウィルスを接種した。ゥ ィルス接種後 1， 3， 5日目に培養液 1ml採取して、後に感染価を測定した。 MDCK 親株ではウィルス接種後 5日目で細胞変性効果 (CPE)が出現し、感染価 X 4,096 / 25 1のィンフルェンザウィルスが回収されたのに対し、 6M-4では接種後 3日 目ですでに CPEが出現し、感染価 xl6,384 / 25 lのインフルエンザウイルスが 回収された。従って、 6M-4の単位培養液量 (l ml)当たりのウィルス収量は親株 MDCKの 4倍に増加した。 尚、 6M-4浮遊培養系におけるインフルエンザウィル ス接種後 5日目の C P Eを図 7に示す。 以上の結果は、 通常の静置培養よりも MEP-Fを用いた浮遊培養系の方がィンフ ルェンザウィルスの増殖効率が高いことを示している。特に、本発明方法に特徴 的なことは、 MEP- Fを添加すると通常 ilJgのゥシ胎児血清を含む培地でもインフ ルェンザウィルスを十分増殖させることができる点である。 このように、 MDCI細胞の浮遊培養系はィンフルェンザウィルスワクチンの大量 培養を目的として開発してきたが、 MEP-Fを用いた 6M-4の浮遊培養系においては ィンフルェンザウィルスの増殖が、 MDC 見株の静置培養における場合よりもよく、 同じ容量の培地に対し高い収率（yield) が得られることが示された。 この点は ィンフルェンザウィルスのワクチン産生に有利であると考えられる。 更に、 MEP-Fはゥシ胎児血清と混ぜて使用するため、 細胞増殖を行いながらィ ンフルェンザウィルスを細胞に感染させて増殖させることができる。浮遊培養の スケールアップは容易であり、従来の ィ匕鶏卵を用いたィンフルェンザワクチン 作成法に比べ、より迅速で且つはるかに安価にヮクチンを提供できる可能性があ る 例えば、 ふ化鶏卵 1個から得られる漿尿液は約 5mlであり、 1 0万個の孵化鶏 卵をインフルエンザワクチン用に用いた^、得られる漿尿液は約 50万 ml、つま り約 500 Lである。タンク培養が可能になれば,この規模の浮遊培養は容易であり、 インフルエンザワクチンの大幅なコス卜ダウンを図ることが可能になり、卜リイ ンフルェンザのような畜産領域のヮクチンにも対応可能となる。 産業上の利用可能性 本発明方法においては、 プロテアーゼの存在下、 ±き養液中で細胞が固体表面に 付着せずに浮遊状態で増殖することが出来る。従って、 この方法は、 中空繊維、 中空担体又は微小担体等の特殊な装置を必要とせず、 簡単にスケールアップする ことも可能である。 更に、 単に培養液を交換する操作のみで半永久的な長期培養 が可能である。 しばしば抗原変異を示すィンフルェンザウィルスに対し有効なワクチンをタイ 厶リ一に供給することが今後のィンフルェンザ対策には不可欠であり、 そのため に本発明の培養方法が貢献できる可能性は大きいと考える。即ち、 本発明は、 ィ ンフルェンザゥィルスのような各種ゥィルスの培養によるゥィルスワクチンの製 造、 及び各種細胞成分の大量生産などの多方面に渡り、 広くバイオ産業において 応用することが可能である。

Claims

'請求の範囲
1. プロテア一ゼ存在下で接着性細胞を浮遊状態で培養する方法。
2. プロテア一ゼがセリンプロテア一ゼ、 システィンプロテア一ゼ、 ァスパラ ギン酸プロテアーゼ、 及びメタ口プロテア—ゼから成る群から選択された一種又 はそれらの組み合わせである、 請求項 1記載の方法。
3. プロテア一ゼがメタ口プロテア一ゼエンドべプチターゼである、 請求項 2記載の方法。
4. ±咅養液中にプロテア一ゼが 10>ag/m， 〜100 g/m 1の濃度で含 まれる、 請求項 1記載の方法。
5. ±咅養液中にプロテア一ゼが
Figure imgf000015_0001
〜50 9 / 1の濃度で含ま れる、請求項 1記載の方法。
6. 細胞が M D C K細胞である、 請求項 1記載の方法。
7. 細胞が、 請求項 1ないし 5のいずれか一項に記載の方法で M D C K細胞を少 なくとも 6ヶ月間継代培養し、 次にプロテア一ゼ不含培地を用いて少なくとも 7 日培養し、 浮遊状態にある細胞回収して更に同じ条件で、 少なくとも 3回継 ^咅 養し、 その後、 浮遊状態にあった細胞から通常の静置培養の条件で継代できる細 胞を回収することによって得られる細胞である、 請求項 1記載の方法。
8. 細胞が MDCK 6M— 4細胞である、 請求項 7記載の方法。
9. 請求項 1ないし 8のいずれか一項に記載の方法で培養された細胞。
10. 接着性細胞を宿主として用いて、 プロテア一ゼ及び血清存在下の浮遊培養 系でゥィルスを生産する方法。
1 1. ±き養液中にプロテアーゼが 10/xg/ml〜100 g/mlの濃度で含 まれる、 請求項 10記載の方法。
1 2. 培養液中にプロテア一ゼが 1 O g/ml〜5 OyLtgZmlの^で含ま れる、 請求項 1 1記載の方法。
1 3. プロテア一ゼがセリンプロテア一ゼ、 システィンプロテア一ゼ、 ァスパラ ギン酸プロテア一ゼ、 及びメタ口プロテア—ゼから成る群から選択された一種又 はそれらの組み合わせである、 請求項 1 0ないし 1 2のいずれか一項に記載の方 法。
1 4 . プロテア一ゼがメタ口プロテア一ゼエンドぺプチタ一ゼ Fである、 請求項 1 3記載の方法。
1 5 . 細胞が M D C K細胞である、 請求項 1 0記載の方法。
1 6 . 細胞が、 請求項 1ないし 5のいずれか一項に記載の方法で M D C K細胞を 少なくとも 6ヶ月間継ィ 咅養し、 次にプロテア一ゼ不含培地を用いて少なくとも 7曰 iき養し、 浮遊状態にある細胞回収して更に同じ条件で、 少なくとも 3回継代 培養し、 その後、 浮遊状態にあった細胞から通常の静置培養の条件で継代できる 細胞を回収することによって得られる細胞である、 請求項 1 0記載の方法。
1 7 . 細胞が M D C K 6 M— 4細胞である、 請求項 1 6記載の方法。
1 8 . ウィルスがインフルエンザウイルスである、 請求項 1 0記載の方法。
1 9 . 請求項 1 0ないし 1 8のいずれか一項に記載の方法により得られたウィル スを用いて製造されたワクチン。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007132763A1 (ja) * 2006-05-11 2007-11-22 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute インフルエンザウイルスの増殖方法
JP2008525025A (ja) * 2004-12-23 2008-07-17 メッドイミューン バクシーンズ，インコーポレイティド ウイルス増殖用の非腫瘍形成性ｍｄｃｋ細胞株
US8202726B2 (en) 2008-09-24 2012-06-19 Medimmune, Llc Methods for cultivating cells, propagating and purifying viruses
US8357376B2 (en) 2006-09-15 2013-01-22 Memimmune, LLC Method of purifying influenza virus and removing MDCK cell DNA contaminants
WO2019131941A1 (ja) * 2017-12-28 2019-07-04 株式会社カネカ 細胞凝集抑制剤
WO2024134183A1 (en) * 2022-12-20 2024-06-27 Cellularevolution Ltd Culture methods

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5678589A (en) * 1980-05-27 1981-06-27 Godo Shiyusei Kk Preparation of enzyme useful for cultivation of animal tissue cell
JPH0775570A (ja) * 1993-07-12 1995-03-20 Shigemi Fujisaki 新規メタロエンドペプチダ−ゼｆ、その製造法及びそれを有効成分とする薬剤
JP2000507448A (ja) * 1996-04-01 2000-06-20 カイロン ベーリング ゲーエムベーハー アンド カンパニー インフルエンザウイルスの複製のための動物細胞および方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5678589A (en) * 1980-05-27 1981-06-27 Godo Shiyusei Kk Preparation of enzyme useful for cultivation of animal tissue cell
JPH0775570A (ja) * 1993-07-12 1995-03-20 Shigemi Fujisaki 新規メタロエンドペプチダ−ゼｆ、その製造法及びそれを有効成分とする薬剤
JP2000507448A (ja) * 1996-04-01 2000-06-20 カイロン ベーリング ゲーエムベーハー アンド カンパニー インフルエンザウイルスの複製のための動物細胞および方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AZGHANI AO ET AL: "A bacterial proease perturbs the paracellular barrier function of transporting epithelial monolayers in culture", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 61, no. 6, June 1993 (1993-06-01), pages 2681 - 2686, XP002980319 *
KADONO Y ET AL: "Membrane type 1-matrix metalloproteinase is involved in the formation of hepatocyte growth factor/scatter factor-induced branching tubules in madin-darby canine kidney epithelial cells", BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 251, no. 3, 1998, pages 681 - 687, XP002980320 *
NOMA K. ET AL: "Endogenous protease-dependent replication of human influenza viruses in two MDCK cell lines", ARCH VIROL, vol. 143, no. 10, 1998, pages 1893 - 1909, XP002980321 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8748174B2 (en) 2004-12-23 2014-06-10 Medimmune, Llc Non-tumorigenic MDCK cell line for propagating viruses
US7670837B2 (en) 2004-12-23 2010-03-02 Medimmune, Llc Non-tumorigenic MDCK cell line for propagating viruses
US8119388B2 (en) 2004-12-23 2012-02-21 Medimmune, Llc Non-tumorigenic MDCK cell line for propagating viruses
JP2008525025A (ja) * 2004-12-23 2008-07-17 メッドイミューン バクシーンズ，インコーポレイティド ウイルス増殖用の非腫瘍形成性ｍｄｃｋ細胞株
JP5322636B2 (ja) * 2006-05-11 2013-10-23 一般財団法人化学及血清療法研究所 インフルエンザウイルスの増殖方法
US7883844B2 (en) 2006-05-11 2011-02-08 Juridical Foundation The Chemosero-Therapeutic Research Institute Method for propagating influenza virus
WO2007132763A1 (ja) * 2006-05-11 2007-11-22 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute インフルエンザウイルスの増殖方法
US8357376B2 (en) 2006-09-15 2013-01-22 Memimmune, LLC Method of purifying influenza virus and removing MDCK cell DNA contaminants
US8846032B2 (en) 2006-09-15 2014-09-30 Medimmune, Llc MDCK cell lines supporting viral growth to high titers and bioreactor process using the same
US8202726B2 (en) 2008-09-24 2012-06-19 Medimmune, Llc Methods for cultivating cells, propagating and purifying viruses
US9085753B2 (en) 2008-09-24 2015-07-21 Medimmune, Llc Methods for cultivating cells, propagating and purifying viruses
WO2019131941A1 (ja) * 2017-12-28 2019-07-04 株式会社カネカ 細胞凝集抑制剤
CN111788300A (zh) * 2017-12-28 2020-10-16 株式会社钟化 细胞聚集抑制剂
JPWO2019131941A1 (ja) * 2017-12-28 2020-12-10 株式会社カネカ 細胞凝集抑制剤
JP7257333B2 (ja) 2017-12-28 2023-04-13 株式会社カネカ 細胞凝集抑制剤
WO2024134183A1 (en) * 2022-12-20 2024-06-27 Cellularevolution Ltd Culture methods

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