JP5322636B2 - インフルエンザウイルスの増殖方法 - Google Patents
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Description
1.インフルエンザウイルス感受性細胞の培養液中に分泌されるトリプシンインヒビターを、培地又は緩衝液で洗浄することにより除去又は低減した後に、該細胞にインフルエンザウイルスを接種し、該インフルエンザウイルス接種細胞を培養することを特徴とするインフルエンザウイルスの増殖方法。
2.0.45〜2.7U/mLのトリプシンを含有する培地でインフルエンザウイルス接種細胞を培養することを特徴とする、上記1の増殖方法。
3.下記(1)ないし(5)の工程からなる上記1記載の増殖方法:
(1)細胞培養物を低速遠心又は膜ろ過により培養上清と細胞を分離する工程、
(2)細胞を培地又は緩衝液で洗浄する工程、
(3)細胞にインフルエンザウイルスを接種する工程、
(4)インフルエンザウイルス接種細胞を培養する工程、及び
(5)前記インフルエンザウイルス接種細胞の培養時に終濃度が0.45〜2.7U/mLとなるようにトリプシン液を添加する工程。
4.インフルエンザウイルスのm.o.iが0.0001〜0.01、初期ウイルス培養時におけるインフルエンザウイルス接種細胞の細胞密度が3〜11×106個/mLである、上記1ないし3の何れかの増殖方法。
5.インフルエンザウイルス感受性細胞が、MDCK細胞(イヌ腎臓由来の株化細胞)、Vero細胞(アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞)、EBx細胞(ニワトリ胚幹細胞由来の株化細胞)、PER.C6(ヒト網膜細胞由来の株化細胞)又はSK-NEP-1細胞(ヒト腎臓由来の株化細胞)からなる群より選択されることを特徴とする、上記1ないし4の何れかの増殖方法。
6.浮遊培養によりインフルエンザウイルス接種細胞を培養することを特徴とする、上記1ないし5の何れかの増殖方法。
(1)A/New Caledonia株の高密度培養
T7m培地(JRH社)で浮遊培養した犬の腎臓細胞(MDCK)を低速遠心分離(2000rpm×3min)し、初期細胞密度3.16×106cells/mLとなるように新鮮T7m培地50mLに懸濁した。これにインフルエンザウイルスA/New Caledonia株(m.o.i 0.001)と各濃度のトリプシン(DIFCO、Trypsin250)を添加し、250mLシェイカーフラスコを用いて100rpm、34℃、5%CO2の培養条件下で培養した。ウイルス量は、HAに対する抗体を用いたELISA法により測定した。すなわち、抗HA抗体液でコートした98ウェルELISAプレート(Nunc社)に各培養液100μLを加え、37℃で、1時間放置した。PBSで洗浄後、HRPで標識した抗HA抗体100μLを加え、37℃で、1時間反応後、発色液100μLを加え、10分放置した。マイクロプレートリーダー(BIO-TEK社)により、波長450nmで測定した。コントロール(あるいは検量線)は精製ウイルスを用い、吸光度の値によりウイルス量を算出した。その結果を表1に示す。培地中のウイルス量は、トリプシン(DIFCO、Trypsin250)濃度0.9〜2.7Tryp.U/mLの範囲で高い値を示した。ウイルス量の単位はμg/mL、NDは未測定を示す。
インフルエンザウイルスB/Shandon株(m.o.i 0.001)の高密度培養を行なった。トリプシン含量の変更と初期細胞密度3.83×106cells/mLを用いた以外は、実施例1−(1)と同様に行なった。その結果を表2に示す。培地中のウイルス量は、トリプシン濃度0.45〜1.8Tryp.U/mLの範囲で高い値を示した。ウイルス量の単位はμg/mL、NDは未測定を示す。
T7m培地(JRH社)で浮遊培養したMDCK細胞を低速遠心分離(2000rpm×3min)し、沈渣の細胞と培養上清を分離した。この培養上清と新鮮T7m培地とを適当に混合して沈渣細胞に添加し、初期細胞密度4.21×106cells/mLとなるように細胞懸濁液を調整した。この細胞懸濁液50mLに、終濃度1.8Tryp.U/mLトリプシン液を加え、実施例1−(1)と同じ条件でウイルス感染細胞を培養し、培養液中のウイルス量を測定した。その結果を表3に示す。75%の新鮮T7m培地交換でウイルス量はプラトウに達し、それ以上の新鮮T7m培地交換ではウイルス量は横這いであった。ウイルス量の単位はμg/mL、NDは未測定を示す。
T7m培地(JRH社)で浮遊培養したMDCK細胞を低速遠心分離(2000rpm×3min)し、初期細胞密度3〜11×106cells/mLとなるように新鮮T7m培地50mLに懸濁した。これにインフルエンザウイルスA/New Caledonia株(m.o.i 0.001)と1.8Tryp.U/mLのトリプシン(DIFCO、Trypsin250)を添加し、培養した。培養は、実施例1−(1)と同じ条件で行なった。その結果、培養液中のウイルス量は、細胞密度が3〜7×106cells/mLの範囲において細胞濃度に依存して増加し、その後プラトウに達した(図1)。
50L/50Lファーメンターを用いEX-CELL293培地(JRH社)で浮遊培養したMDCK細胞を無菌的に膜ろ過により培養上清を除去し、培地交換率が75%となるように新鮮EX-CELL293培地を添加した。初期細胞密度は5.9×106cells/mLとなった。これにインフルエンザウイルスA/New Caledonia株(m.o.i 0.001)と1.8Tryp.U/mLのトリプシン(Sigma、Trypsin cGMP)を添加し、50L/50Lファーメンターでウイルス培養した(図2)。培養条件として、50rpm、34℃、3ppm O2を用いた。培養4日目の培地中のウイルス量を実施例1と同じ方法で測定した。その結果、ウイルス量は、120μg/mL(初期細胞密度あたりの産生量:20μg/106cells)に達した。
600Lファーメンターを用いM202培地(JRH社)で浮遊培養したMDCK細胞を新鮮M202培地で2倍希釈し、初期細胞密度1.53×106cells/mLとした。この細胞希釈液646Lに、終濃度0.23U/mLトリプシン液を加え、これにインフルエンザウイルスA/New Caledonia株(m.o.i 0.001)を添加し、600L培養槽を用いて50rpm、34℃、3ppm O2の培養条件下で培養した(図4)。培養4日目の培地中のウイルス量を実施例1と同じ方法で測定した。その結果、ウイルス量は、12.8μg/mL(初期細胞密度あたりの産生量:8.5μg/106cells)であった。
Claims (3)
- インフルエンザウイルス感受性細胞を無血清培地で培養し、当該インフルエンザウイルス感受性細胞の培養液中に分泌されるトリプシンインヒビターを、無血清培地又は緩衝液で洗浄することにより除去又は低減した後に、該細胞にインフルエンザウイルスを接種し、該インフルエンザウイルス接種細胞を0.45〜1.8U/mLのトリプシンを含有する無血清培地で浮遊培養により培養することを含み、インフルエンザウイルスのm.o.iが0.0001〜0.01かつ初期ウイルス培養時におけるインフルエンザウイルス接種細胞の細胞密度が3〜11×106個/mLであり、前記無血清培地が、T7m培地、EX-CELL293培地およびM202培地よりなる群から選ばれることを特徴とする、培養液量あたりのウイルス産生量および細胞数あたりのウイルス産生量がともに増大したインフルエンザウイルスの大量増殖方法。
- 下記(1)ないし(5)の工程からなる請求項1記載の増殖方法:
(1)無血清培地で培養された細胞培養物を低速遠心又は膜ろ過により培養上清と細胞を分離する工程、
(2)前記(1)の工程により得られた細胞を無血清培地又は緩衝液で洗浄する工程、
(3)前記(2)の細胞にインフルエンザウイルスを接種する工程、
(4)前記(3)のインフルエンザウイルス接種細胞を無血清培地で培養する工程、及び
(5)前記(4)のインフルエンザウイルス接種細胞の培養時に終濃度が0.45〜2.7U/mLとなるようにトリプシン液を培養液に添加する工程。 - インフルエンザウイルス感受性細胞が、MDCK細胞(イヌ腎臓由来の株化細胞)、Vero細胞(アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞)、EBx細胞(ニワトリ胚幹細胞由来の株化細胞)、PER.C6(ヒト網膜細胞由来の株化細胞)又はSK-NEP-1細胞(ヒト腎臓由来の株化細胞)からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の増殖方法。
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