KR100999345B1 - Ｍｄｃｋ 세포 현탁 배양물 중에서 약물 또는 진단제 활성 성분의 생산 방법 - Google Patents

Ｍｄｃｋ 세포 현탁 배양물 중에서 약물 또는 진단제 활성 성분의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은
a) MDCK 세포를 바이러스로 감염시키는 단계;
b) MDCK 세포를 적어도 30 L의 부피에서 배양하고, 바이러스의 증식을 허용하는 조건하에 현탁 배양물 상태에서 상업적 규모로 배양하는 단계를 포함하는, 약물 또는 진단제의 활성 성분을 생산하기 위한 방법에 관련된다.
본 발명은 활성 성분을 상기 기술된 방법에 따라서 생산하고, 적절한 애쥬번트, 보조제, 버퍼, 희석제 또는 약물 담체와 혼합하는 약물 또는 진단제를 제조하기 위한 방법에 관련된다.
MDCK 세포, 약물, 진단제

Description

ＭＤＣＫ 세포 현탁 배양물 중에서 약물 또는 진단제 활성 성분의 생산 방법{METHODS FOR PRODUCING AN ACTIVE CONSTITUENT OF A PHARMACEUTICAL OR A DIAGNOSTIC AGENT IN AN MDCK CELL SUSPENSION CULTURE}
본 발명은 현탁 배양물 상태의 MDCK 세포에서 바이러스가 상업적 규모로 증식되는 약물 또는 진단제 활성 성분의 생산 방법에 관한 것이다.
감염성 질환, 특히 바이러스 감염은 여전히 의학적으로 매우 중요하다. 따라서, 바이러스에 관한 연구와 백신의 제조를 허용하기 위하여 배양물 중에서 바이러스를 증식시킬 수 있는 보다 유용한 방법들을 고안하기 위한 필요성이 변함없이 남아 있다.
상응하는 바이러스에 따라서, 바이러스 증식을 위해 상이한 숙주 시스템 및 배양 조건이 당업계에서 사용된다. 표준 숙주 동물, 배 상태의 달걀, 일차 조직 세포 배양물 또는 확립된 항구적 세포주가 숙주 시스템으로서 사용된다(Rolle and Mayr (편저), Microbiology, Infection and Epidemic Science, 1978; Mahy (편저), Virology, A Practical Approach, 1985; Horzinek (편저), Compendium of General Virology, 1985).
배 상태 달걀에서의 바이러스 증식은 많은 비용과 시간을 요한다. 감염 전에 달걀을 인큐베이션한 다음 배의 생육성에 대해 시험해야 한다. 활동하는 배에서만 바이러스가 증식될 수 있다. 증식시킬 바이러스로 감염시키고 더 인큐베이션하면 배는 결국 죽게 된다. 달걀로부터 분리된 바이러스는 오염물질이 없으며 농축되어 있다. 인큐베이션된 달걀에서의 바이러스 증식은 엄격한 멸균 조건에서는 가능하지 않으므로, 분리주를 의료나 진단용으로 이용하고자 할 경우에는 분리주로부터 오염성 병원성 미생물을 제거해야 한다.
달걀에서의 바이러스 증식에 대한 대안이 한정된 세포주의 진핵 숙주세포에 의해서 제공된다(Gregersen, J. P., Pharmazeutische Biotechnologie, Kayser and Muller (편저), 2000, Seiten 257-281). 그러나, 항구적 외래 바이러스 오염물질로 인하여 또는 기원이나 이력이 불분명한 바이러스의 부재가 증명되지 않기 때문에 많은 세포주는 백신이나 유사한 의료용 제제의 생산에 적합하지 않다.
한편, 원숭이의 신장세포로부터 유래하는 베로(Vero) 세포가 백신 생산을 위한 개별 바이러스(폴리오 바이러스, 광견병 바이러스)의 증식에 이미 사용되고 있는 숙주 시스템이다. 이들 세포는 다양한 세포 은행들(예를 들어, American Type Culture Collection, ATCC)에서 입수가능하며, 의학연구를 위한 시험을 거친 세포 은행으로부터 세계보건기구(WHO)를 통해 입수가능하다.
이들 베로 세포는 부착성 세포주로서, 유리병, 플라스틱 배양 플레이트 또는 플라스틱 플라스크 같은 지지면이 성장하는데 필요하다. 세포는 발효기에서 해당 세포의 배양물 중에서 소위 마이크로캐리어 상에서 성장하게 되는데, 즉 일반적으로 작은 플라스틱 구체의 표면 위에서 세포가 성장할 수 있다.
앞서 말한 베로 세포에 더하여, 부착성 BHK(새끼 햄스터 신장) 세포 및 부착성 MDCK(Madine Darby 개 신장) 세포 그리고 기타 세포들도 바이러스를 활발히 증식시킬 수 있으며, 제약 제품의 생산을 위한 기질로서 사용되고 있거나, 사용이 고려되고 있다. MDCK 세포주 ATCC CRL34(NBL-2)에서는 인플루엔자 바이러스에 더하여 소낭성 구내염 바이러스, 콕사키 바이러스 B5(B3이나 B4는 아니다), 레오바이러스 2형 및 3형, 아데노바이러스 4형 및 5형, 및 우두 바이러스가 또한 실험적으로 증식되었다. 그러나, 모든 해당 출판물은 오로지 부착성 배양물만을 다루고 있는 실정이다(ATCC 제품 정보 참조). 그러나, 더 많은 양의 세포로 증식시키는 위해서는 현탁 배양이 바람직한데, 지금까지는 이 시스템에서 소수의 림프양 세포와 다수의 형질전환 세포들이 증식될 수 있었다(Lindl (편저), Cell and Tissue Culture, 2000, pp. 173 ff). 단백질-프리 배양 배지 중에서 현탁물 상태로 성장할 수 있는 MDCK 세포주가 WO 97/37000에 개시된다. 또한, 해당 숙주세포를 사용하는 인플루엔자 바이러스의 증식이 설명된다.
적절한 세포 또는 숙주 시스템을 선택하는 것에 더하여, 바이러스 균주가 증식될 배양 조건이 용인가능한 높은 수율의 달성을 위해 매우 중요하다. 원하는 바이러스 균주의 수율을 최대화하기 위해서는 숙주 시스템과 배양 조건 모두가 원하는 바이러스 균주에 대해서 우호적인 환경 조건을 달성할 수 있도록 조정되어야 한다. 상이한 바이러스 균주에 대해 높은 수율을 달성하기 위해서 최적의 성장 조건을 창출하는 시스템이 필요하다. 많은 바이러스는 고유한 숙주 시스템에만 한정되며, 이들 중 일부는 바이러스 수율에 대해 매우 비효과적이다. 생산 시스템의 효율은 해당 배양 시스템에 대한 바이러스 집단의 적응에 주로 기초하는데, 대개 다른 숙주 시스템에 의한 중간 단계를 사용하는 한편, 단백질 첨가제 - 주로 동물 또는 인간 기원의 혈청을 사용한다.
또한, 거의 모든 세포 배양물은, 혈청 또는 다른 성장 인자를 첨가하여 초기 증식한 후, 적어도 얼마 동안은 혈청이나 단백질 첨가제 없이 유지될 수 있다는 것이 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 임의의 세포 배양물은 바이러스 감염시에 또는 수거하기 바로 전에 혈청 또는 단백질 첨가제가 없는 배지로 옮겨져 수거시까지 유지될 수 있다. 이것은 외래 단백질을 회피하거나 줄이는 한편, 백신이나 진단시험용의 바이러스 물질을 획득하기 위해 수년간 통상적으로 행해져 왔다. 혈청을 첨가하는 감염 단계 동안 이러한 과정 없이 유지된 백신 및 세포 배양물은 혈청 성분이 충분히 제거될 수 없기 때문에 인체용이나 동물용으로 허용되는데 있어서 많은 문제를 가질 것이다(WHO 추천 "Proposed requirements for Measles Vaccine" (Live), Requirements for Biological Subtances No. 12, 1978 개정판 참조).
또한, 많은 바이러스가 단백질-함유 배지 중에서 매우 불량하게 증식되거나 전혀 증식될 수 없다는 것이 알려져 있다. 배양 시스템에서의 증식이 단백질분해 효소(프로테아제)의 활성에 의존하는 바이러스가 포함된다. 이들 프로테아제는 배지에 첨가되는 단백질에 의해 경쟁적으로 억제되기 때문에, 적어도 감염 시점 또는 생산 단계에서부터는 단백질의 첨가는 전연 불가능하다. 대개는 프로테아제를 첨가하여 증식되어야 하며, 가능하다면 감염 배지에 단백질 첨가제가 없어도 양호한 수율을 달성할 수 있는 바이러스의 예는 인플루엔자 바이러스와 로타바이러스이다. 또한, 파라믹소바이러스와 레오바이러스 같은 다른 타입의 바이러스도 단백질이 가능한 적은 배지 증식에서 이점을 얻을 수 있다(Ward et al.(1984) J. Clin. Micro. Biol. 748-753 "Efficiency of Human rotavirus Prop-agation in Cell Culture"). WO 96/15231은 통상의 단백질 첨가제 없이 준비된 배지를 사용한 세포 배양물 중에서의 베로 세포 및 다른 세포들의 배양을 제안한다.
광견병, 로타-, 폐렴-, 또는 A형 간염 바이러스 등의 기타 바이러스들은 배지 조성 및 배양 조건에 관계없이 잘 증식하지 못한다고 알려져 있다(Provost and Hillemann, Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 160:213-221 (1979); 및 Rolle and Mayr, loc. cit.).
마지막으로, 증식 후에 배지 및/또는 세포로부터 바이러스, 바이러스성 발현 산물 또는 기타 단백질들을 분리할 수 있는 많은 방법이 선행 기술에 공지되어 있다(Gregersen, loc. cit.; Mahy, loc. cit.; Reimer C., et al., Journal of Viro-logy, Dec. 1967, p. 1207-1216; Navarro del Canizo, A., et al., AppLied Bioch-emistry and Biotechnology, Vol. 61, 1996, 399; Prior, C., et al., BioPharm, Oct. 1996, 22; Janson, Jan-C. and Ryden, L. (편저), Protein Purification, 1997; 및 Deutscher M. (편저), Methods in Enzymology, Vol. 182, 1990).
그러나, 선행 기술에는 제약 제품이 요구하는 조건에서 취급이 용이한 현탁 배양 시스템에서 상업적 규모로 다수의 상이한 바이러스를 높은 수율로 증식시킬 수 있는 방법은 공지되어 있지 않다. 따라서, 본 발명의 임무는 제약 및 진단 용도로 적합한 바이러스를 상업적 규모로 증식시키기 위한 방법 및 세포 배양 시스템을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 약물 또는 진단제 활성 성분의 생산 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
a) MDCK 세포를 바이러스로 감염시키는 단계; 및
b) 바이러스 증식을 허용하는 조건하에 현탁 배양물 중에서 MDCK 세포를 상업적 규모로 배양하는 단계
를 포함하며, 이때 배양은 30 L 이상의 부피에서 일어난다.
현탁물에서 성장하는 능력을 가진 어떤 MDCK 세포주가 상업적 조건하에서 다수의 상이한 바이러스들의 증식에 특히 적합하다는 것이 예상외로 발견되었다. 일반적인 기간(수주 또는 수개월 기간)의 적응 단계 없이 광범위한 바이러스가 이들 세포에서 빠르게 복제될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 배지, 배지 첨가제 또는 온도 같은 특정한 배양 조건을 선택하지 않고 수행될 수 있다. 이 세포는 광범위한 바이러스의 복제에 있어 문제없이 적합하며, 광견병, 로타-, 폐렴- 또는 A형 간염 바이러스 같은 증식되기 어렵다고 알려진 것들에 대해서도 그러하다.
따라서, 본 발명은 세포 배양물 중에서 상업적 규모로 바이러스를 생산하는 신규인 동시에 개선된 가능성을 개시한다. 획득된 산물은 약물, 특히 백신 및/또는 진단 시약의 생산에 사용하는데 특히 적합하다. 본 발명에 따른 방법이 상이한 타입의 바이러스들에 대해서 이들에 맞게 특정하게 개조되지 않고 거의 변경 없이 적용될 수 있다는 것이 예상외로 증명될 수 있었다. 이것은 상이한 산물들(바이러스들)이 동일한 설비에서 또는 디자인과 세부사항이 동일한 몇 개의 설비에서 증식될 수 있다는 이점을 가진다. 이 과정에 의하면, 기본 공정이 동일하므로 상이한 산물들에 대해서 새로운 공정 또는 새로운 공정 변형을 확인하는 많은 비용이 드는 과정이 불필요하게 되기 때문에 상당한 비용 절감이 달성된다. 동시에, 본 발명에 따른 방법은 많은 비용을 들여 최적화되었던 지금까지 알려진 시스템보다 뛰어난 수율을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 공정의 언급된 이점으로부터 본 공정에서 생산된 산물들의 공식 등록이 단순화되는데, 이는 한 제품에 대해 준비되어 승인된 등록 파일의 대부분이 다른 제품 및 이들의 등록에도 사용될 수 있기 때문이다.
바이러스 증식은 부피가 30 L 이상인 현탁 배양물 중에서 일어나며, 50 L 이상 및 100 L 이상의 부피를 사용하는 방법이 바람직하다. 본 발명에 따른 방법은 활용가능한 배양 용기의 절대 크기가 제한된다는 의미에서만 부피에 관한 상한을 가진다. 선행 기술에서는, 예를 들어 5000 L 및 10,000 L 이하의 크기를 가진 스테인리스 스틸 발효기 설비가 알려져 있다. 해당 설비가 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 세포로서, 현탁 배양물 중에서 성장하는 특성을 가진 MDCK 세포가 포함된다. 또한, 발효기에서 지지 입자 없이 상업적 규모로 성장할 수 있는 세포주가 배양물의 취급, 배양물의 스케일-업 및 바이러스의 증식 동안 다른 세포들에 비해서 상당한 이점을 가진다고 한다. MDCK 세포를 현탁 배양에 적응시키는 방법이 선행 기술에 공지되어 있다(WO 97/37000). MDCK 세포는 세포주 MDCK 33016로부터 기원할 수 있다.
발명의 또 다른 구체예에 따르면, 부착성이기도 하고 현탁물 중에서도 성장할 수 있는 MDCK 세포가 사용된다. 이 구체예는 세포 발생을 위한 세포 배양 시스템과 그에 따른 배지가 실험실 규모에서부터 상업적 생산 규모까지 사용될 수 있다는 특별한 이점을 가진다. 해당 시스템에서는 개별 세포 배양 시스템의 안정성만 조사되면 되므로 약물 등록이 상당히 단순해진다.
바이러스는 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA), 이중가닥 데옥시리보핵산(ds DNA), 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 또는 단일 가닥 리보핵산으로부터의 게놈을 가질 수 있다. 단일 가닥 리보핵산 분자는 극성을 가진 메신저 RNA, RNA(+) 또는 반대 극성을 가진 RNA(-)를 가질 수 있다.
바이러스는 선행 기술에 공지된 어떤 바이러스일 수도 있다. 본 발명에 따른 방법과 관련하여 사용되는 바이러스는 ATCC(American Type Culture Collection) 또는 ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures) 같은 다양한 콜렉션으로부터 획득될 수 있다. 세포 배양물에 이미 사전 증식되어 있는 기존의 생산 균주 또는 바이러스 균주에 일반적으로 의존한다. 특정 분리주가 또한 확립될 수 있으며, 이들은 해당 용도에 더욱 적합하게 된다. 한 구체예에 따르면, 본 방법에서 사용되는 바이러스는 아데노바이러스, 오르토- 및 파라믹소-바이러스, 레오바이러스, 피코르나바이러스, 엔테로바이러스, 플라비바이러스, 아레나바이러스, 헤르페스 바이러스 및 폭스 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된다. 아데노바이러스, 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 중부유럽 뇌염 바이러스 및 관련된 동방 형태(러시아 등), 뎅그열 바이러스, 황열병 바이러스, C형 간염 바이러스, 풍진 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡 융합체 바이러스, 우두 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 로타바이러스, 랍도바이러스, 폐렴바이러스, 레오바이러스, 헤르페스 단순 바이러스 1형 또는 2형, 시토메갈로바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 개 아데노바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 및 BHV-1 같은 소 또는 돼지 헤르페스 바이러스 또는 의사광견병 바이러스가 사용될 수 있으며, 광견병 바이러스, 로타바이러스, 폐렴바이러스 또는 A형 간염 바이러스의 사용이 특히 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 바이러스 게놈은 크기가 10 kd 이상인 이종기능성 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 게놈, 예를 들어 헤르페스, 우두 또는 아데노바이러스 게놈에 기초한 이종성 단백질의 발현을 위한 다수의 벡터가 선행 기술에 공지되어 있다(Galler R., et al., Braz. J. Med. Biol. Res., 1997 Feb., 30(2):157-68; Willemse MJ., et al., Vaccine 1996 Nov., 14(16):1511-6; Efstathiou S., Minson AC., Br. Med. Bull., 1995 Jan. 51(1):45-55; Hammerschmidt W., Curr. Opin. Mol. Ther., 2000 Oct., 2(5):532-9; Graham FL., Prevec, L., Mol. Biotechnol., 1995, Jun., 3(3):207-20; Carroll MW., Moss B., Curr. Opin. Biotechnol., 1997 Oct. 8(5):573-7; Wojcik J. Acta. MicroBiol. Pol., 1995, 44(2):191-6; Ramirez JC., et al., J. Virol., 2000 Aug., 74(16): 7651-5; Hagen, Anna, et al., Biotechnol. Prog., 1996, 12, 406-408; Huyghe, Bernard, et al., Human Gene Therapy, November, 1995, 6:1403-1416).
본 발명과 관련하여, 서열의 추가 또는 치환에 의해 바이러스 게놈이 변경됨으로써 이 게놈에 의해 크기가 10 kd 이상인 이종기능성 단백질이 코딩되는, 즉 바이러스에 원래 존재하지 않는 단백질이 코딩되는 바이러스의 증식 방법이 또한 포함된다. 본 발명에 따르면, 기능성 단백질이란 적어도 해당 단백질에 대한 면역반응을 촉발할 수 있는 단백질을 말한다. 천연 상태에서 단백질은 면역학적 활성에 더하여 추가의 생물학적 활성을 가질 수 있는데, 예를 들어 단백질은 효소 또는 사이토카인으로서 작용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 바이러스는 바이러스 게놈에 개별 유전자의 결실을 가질 수 있다. 예를 들어, 백신으로 사용될 바이러스에서 병원성 인자를 코딩하는 유전자가 의도적으로 삭제될 수 있다. 해당 결실은 500개 또는 1000개 뉴클레오티드 이하를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 바이러스는 천연 상태에서 완전한 바이러스 게놈을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 현탁 배양물 중에서 바이러스의 증식은 배지 중에 혈청의 존재 유무에 관계없이 일어날 수 있다. 혈청이 존재하지 않는 경우의 세포 배양 조건은 이와 같이 제조된 제품의 의료 용도의 등록을 상당히 단순화하므로 특별한 이점이 획득된다. 또한, 배양 배지에 혈청의 첨가가 불필요하게 됨으로써 배지 오염물질을 제거하기 위한 많은 비용이 드는 정제 단계가 회피된다. 따라서, 제품의 품질에 관한 개선이 또한 달성되는 동시에 비용이 절감된다.
본 발명과 관련하여, 인간이나 동물 기원의 혈청으로부터 유래하는 어떤 첨가물도 없는 배지를 혈청-프리 배지라고 한다.
배양물 및 그것의 사용에 방해 효과를 갖지 않는 특정 단백질이 해당 배양물에 정해진 양으로 첨가될 수 있다. 이런 종류의 배양 배지를 화학적 한정 배지라고 한다. 미토겐 펩티드, 인슐린, 트랜스페린 또는 지질단백질 같은 선택된 단백질이 이 배지에 첨가되며, 이들은 당업자에게 공지된 다양한 제조자들로부터 획득될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 미토겐 펩티드는 식물의 가수분해물, 예를 들어 대두 단백질 가수분해물 또는 다른 유용한 식물의 단백질로부터 유래하는 가수분해물을 의미하는 것으로 이해하는 것이 바람직하다.
그러나, 특히 바람직한 구체예에 따르면, 배지는 완전한 단백질-프리 배지이다. 단백질-프리란 단백질, 성장 인자, 기타 단백질 첨가제 및 비-혈청 단백질의 배제하에 세포 증식이 일어나는 배양물을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 배양물 중에서 성장하는 세포는 천연 상태에서 단백질 자체를 함유한다.
공지된 혈청-프리 배지는 Iscove's 배지, Ultra-CHO 배지(BioWhittaker) 또는 EX-CELL(JHR Bioscience)를 포함한다. 일반적인 혈청-함유 배지는 Eagle Basal Medium(BME) 또는 Minimum Essential Medium(MEM)(Eagle, Science 130, 432, 1959) 또는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM 또는 EDM)를 포함하며, 이들은 통상 10% 이하의 태아 소 혈청 또는 유사 첨가제와 함께 사용된다. 또한, PF-CHO(JHR-Bioscience) 같은 단백질-프리 배지, ProCHO4CDM(Bio Whittaker) 또는 SMIF7(Gibco /BRL-Life Technologies) 같은 화학적 한정 배지 및 Primactone, Pepticase 또는 HyPep™(모두 Quest International) 같은 미토겐 펩티드 또는 락트알부민 가수분해물(Gibco 및 기타 제조자)이 선행 기술에 충분히 공지되어 있다. 식물 가수분해물 기재의 배지 첨가제는 바이러스, 미코플라스마 또는 미지의 감염원으로 인한 오염이 배제될 수 있다는 특별한 이점을 가진다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 감염된 MDCK 세포를 배양하는 도중에 신선한 배지, 배지 농축물 또는 아미노산, 비타민, 지질 분획 또는 인산염 같은 배지 성분들이 첨가된다.
본 발명에 따른 방법은 관류 시스템 또는 뱃치 시스템에서 수행될 수 있다. 배지가 연속적으로 공급 및 회수되는 배양 시스템을 관류 시스템이라고 한다. 이것의 대안으로서, 세포는 또한 뱃치 시스템에서 배양될 수 있는데, 이 시스템은 접종시부터 수거시까지 배지를 공급하지 않는 매우 밀폐된 시스템으로 운영된다.
사용되는 세포 배양 조건(온도, 세포 밀도, pH 값 등)은 본 발명에 따라서 사용되는 세포주의 적합성 덕택에 원하는 용도에 맞도록 매우 넓은 범위에 걸쳐 변화가능하며, 용도 요건에 따라 개조될 수 있다. 따라서, 이하의 정보는 단순히 가이드라인을 표시할 뿐이다.
감염 전 MDCK 세포의 증식은 원심분리나 여과 같은 일반적인 지원 방법을 사용하여 관류 시스템에서 시드 배양물 또는 작은 배양 용기로부터 출발하여 수행될 수 있다. 이러한 시스템에서는 세포의 일차 배양 동안에 하루 3회 이하의 발효기 충전 속도로 배양 배지를 교환하는 것이 유리하다고 증명되었다. MDCK 세포는 이런 조건하에서 2 x 107의 세포 밀도까지 증식될 수 있다. 배양하는 동안 바람직하게는 세포수, 글루타민, 글루코오스 또는 락테이트 함량 같은 당업자에게 잘 알려진 파라미터에 의해 관류 속도를 제어한다.
뱃치 시스템이 사용되는 경우, 37℃의 온도에서 20 내지 30시간의 발생 시간에 약 8-25 x 105 세포/㎖ 이하의 세포 밀도에 도달될 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 세포는 감염 전에 페드-뱃치 시스템에서 증식될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 세포가 초기에 뱃치 시스템에서 배양되고, 배지 중의 영양물(또는 영양물의 일부)의 고갈이 농축 영양물의 제어 공급에 의해서 보충되는 배양 시스템을 페드-뱃치 시스템이라고 한다. 페드-뱃치 시스템에서 MDCK 세포는 약 1-10 x 106의 세포 밀도로 증식될 수 있다.
또한, 감염 전 MDCK 세포의 증식 동안에 pH 값을 pH 6.6 내지 pH 7.8, 특히 pH 7.2 내지 pH 7.3으로 조정하는 것이 유리하다고 증명되었다.
감염 전 MDCK 세포의 배양은 30℃ 내지 40℃의 온도, 특히 33℃ 내지 37℃의 온도에서 일어나는 것이 바람직하다. 감염 전 배양하는 동안 산소 분압은 25% 내지 95%, 특히 35% 내지 60%의 값으로 조정되는 것이 바람직하다. 본 발명과 관련하여 언급된 산소 분압 값은 공기의 포화를 기준으로 한다.
본 발명에 따른 방법에서, 뱃치 시스템에서는 바람직하게 약 8-25 x 105 세포/㎖ 또는 관류 시스템에서는 바람직하게 약 5-20 x 106 세포/㎖의 세포 밀도에서 세포를 감염시키는 것이 유리하다고 증명되었다. 세포는 10-8 내지 10, 바람직하게는 0.0001 내지 0.5의 바이러스 용량(MOI 값, "감염 다중도"; 감염 시점에서 세포 당 바이러스 유닛의 수에 해당한다)으로 감염될 수 있다.
또한, 감염 후 MDCK 세포의 배양은 관류, 뱃치 또는 페드-뱃치 시스템에서 MDCK 세포가 배양될 수 있다. 이전에 사용된 것과 동일한 배양 조건이 사용될 수 있다(30℃ 내지 40℃의 온도, 5% 내지 100%의 산소 분압, pH 6.6 내지 pH 7.8의 배지 pH 값).
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 감염된 MDCK 세포를 배양하는 동안, 배양 배지가 신선한 배양 배지로 교체되거나, 또는 신선한 배양 배지의 첨가에 의해 배양물 부피가 증가된다. 또한, 배양 배지의 교환이나 보충은 배지 농축물 또는 아미노산, 비타민, 지질 분획, 인산염 등의 배지 성분들에 의해서 일어날 수 있다. 또한, 이들 단계는 MDCK 세포를 배양하는 동안 반복적으로 수행될 수 있다.
예상외로 MDCK 세포의 성장은 많은 바이러스 시스템에서 증식에 의해 유의하게 억제되지 않는다. 특히, A형 간염, 랍도- 및 플라비바이러스(CEE)의 증식에 있어서, MDCK 세포와 바이러스의 왕성한 성장이 배양하는 동안 관찰되었다.
이것은 배양 상청액으로부터 바이러스의 반복적 수거와, 특히 신선한 배지의 첨가에 의한 총 배양물 부피의 증가와 이에 따른 세포수 증가에 의한 바이러스 수율의 증가를 허용한다. 해당 다중 수거에 의해 시스템의 수율이 상당히 개선되므로, 이것은 본 발명에 따른 방법의 유의한 이점을 나타낸다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 배양 시스템에서 장기간에 걸친 바이러스와 세포의 증식을 최초로 허용한다. 일부 사례에서, 감염 후 28일 동안 세포가 여전히 생육성이었음이 증명될 수 있었다. 따라서, 바이러스 및 세포 증식의 지속기간이 세포 배양 조건(배지의 첨가)에 의해 광범위하게 선택될 수 있다.
또한, 바이러스 또는 바이러스에 의해 생성된 단백질의 수거 및 분리를 포함하는 방법이 본 발명에 의해서 제공된다. 바이러스 또는 단백질의 분리에 있어서, 세포는 분리, 여과 또는 한외여과 같은 표준 방법에 의해서 배양 배지로부터 분리된다. 다음에, 구배 원심분리, 여과, 침전, 크로마토그래피 등의 당업자에게 충분히 공지된 방법에 따라서 바이러스 또는 단백질이 농축되고 정제된다. 또한, 본 발명에 따르면, 바이러스는 정제 동안에 또는 정제 후에 불활성화되는 것이 바람직하다. 바이러스 불활성화는, 예를 들어 정제 과정의 어떤 지점에서 β-프로피오락톤 또는 포름알데히드에 의해 일어날 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 약물 및 진단제의 활성 성분을 활용가능하게 하므로, 약물의 생산, 특히 백신 및 진단제의 생산에 특히 적합하다.
약물 생산은 바이러스 또는 바이러스에 의해 생산된 단백질의 증식 및 분리 단계 및 적합한 애쥬번트, 보조제, 버퍼, 희석제 및/또는 약물 담체와의 혼합 단계를 포함한다. 본 발명과 관련하여, 애쥬번트는 면역반응을 증가시키는 물질을 의미하는 것으로 이해된다. 이들은 수산화 알루미늄 같은 다양한 금속 수산화물, 박테리아 세포벽 성분, 오일 또는 사포닌을 포함한다. 백신은 바이러스 감염의 예방적 또는 치료적 처치에 특히 적합하다.
감염 부하 방어 실험 또는 중화에 필요한 항체 역가의 측정 같은 당업자에게 공지된 방법에 의해 해당 백신의 면역원성 및/또는 효능이 측정될 수 있다. 바이러스 적정, 적혈구응집 시험, 항원 측정 또는 단백질 측정 같은 상이한 타입의 당업자에게 충분히 공지된 표준 방법에 따라서 항원 역가 또는 항원량을 측정함으로써 바이러스 양 또는 생산된 항체의 양이 측정될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 진단 조성물의 생산에 적합하다. 진단 조성물은 본 방법으로부터 획득된 바이러스 또는 바이러스에 의해 생산된 단백질을 포함할 수 있다. 선행 기술의 통상적인 첨가제 및 검출 시약과 조합하여, 이들 조성물은 바이러스 또는 항바이러스 항체 검출에 적합한 진단 시험에 사용될 수 있다.
다음 실시예에서 모든 바이러스 역가는 당업자에게 공지된 Spearman-Kaerber에 따른 최종 희석법 및 통계상 50% 종말점 결정법에 따라서 측정되었다(Horzinek, Compendium of general Viroloy, 2nd Edition, 1985, Parey Verlag, pp 22-33). 8개 시험 배양물을 100㎕ 양의 바이러스 희석물로 마이크로타이터 플레이트에서 감염시켰으며, 이때 바이러스 물질은 10-1 내지 10-8의 희석물을 사용하였다. 현미경으로 시험 배양물의 세포병변 효과를 관찰하거나, 또는 바이러스-특이적 항체를 이용하는 면역학적 검출법에 의해 바이러스 적정의 평가를 행하였다. 바이러스-특이적 항체의 결합은 플루오레세인-표지 항체에 의하여 면역형광으로서 시각화되거나, 또는 바이오틴-표지 이차 항체와 스트렙토아비딘/바이오틴/퍼옥시다제 증폭인자 복합체, 및 침전성 염료에 의해 시각화될 수 있다(Gregersen et al, Med. Microbiol. Immunol., 177:91-100). 바이러스 역가 단위는 50% 배양물-감염 용량(CID50)이다. 상이한 타입의 바이러스에 사용되는 바이러스-특이적 검출 세포와, 이용되는 경우, 면역학적 검출법이 바이러스-특이적 실시예에 언급된다.
실시예 1: 실험실 규모의 초기 작업 단계에서 현탁 배양물로서 세포 배양 시스템의 취급
액체 질소에 저장된 시드 세포 바이알의 MDCK 세포를 수조에 담가 신속히 해동시키고, 곧바로 배양 배지(보충된 Ultra CHO, BioWhittaker, 표준 배지)로 약 1 x 105 세포/㎖의 세포수로, 일반적으로 약 1:100으로 희석하였다. 다음에, 세포를 원심분리(800G에서 10분)하여 배지로부터 분리한 다음, 다시 신선한 배지를 가하고 교반 배양병(100㎖ 작업 부피, Bellco 또는 Techne)에 부었다. 이들 배양 롯트를 37℃에서 자기 교반기에서 50 내지 60rpm에서 인큐베이션하였다. 세포수를 조사하여 세포 성장을 모니터하였다. 세포수가 8 x 105, 최대 1.6 x 106 세포/㎖에 도달했을 때, 세포를 신선한 표준 배지에 희석하여 배양물을 전이하고, 100 내지 1000㎖ 작업 부피의 새 교반 배양병에 시딩한 다음, 상기 설명된 대로 교반하면서 최대 세포 밀도 또는 원하는 세포 밀도에 도달할 때까지 인큐베이션하였다. 이 세포 계대에서 해당 배양물의 희석은 1:4 내지 1:10 범위에서 세포 성장 타입에 맞춰 조정되었으며, 이로써 필요에 따라 3-5일 이내에 최대 세포수에 도달하였다. 대안으로서, 이 타입의 세포 배양을 배지에 보충제를 첨가하지 않고 시도하였으며, 적어도 10차 계대 동안 문제없이 유지될 수 있었다.
실시예 2: 부착성 배양물로서 세포 배양 시스템의 취급
확립된 현탁 배양물(실시예 1 참조)을 세포수가 약 1 x 105 세포/㎖가 되도록 상이한 배지들에 희석한 다음, 여러 개의 세포 배양 용기(표 1 참조)에 부었다. 세포 배양 부피는 해당 배양 용기의 일반적인 양에 상당하는데, 즉 시딩 표면 위의 약 4mm 배양 배지나 2.5㎠의 배양 표면에 대해 약 1㎖ 배지이다. 배양물은 일반적으로 대부분의 세포 배양물에 대해 공통적으로 37℃의 온도에서 인큐베이션하였지만, 주목할 만한 손실 없이 인큐베이션 온도에 유의한 편차를 두는 것도 가능하였다(표 1 참조). 시험된 배양 시스템뿐만 아니라 이들을 사용하여 달성된 세포 성장의 결과를 표 1에 나타내며, 이는 본 세포 시스템이 다양한 배지 및 배양 시스템에서 대략 동일하게 확고히 거동한다는 것을 시사한다.
이와 같이 생산된 단층 배양물을 사용하여 마이크로타이터 플레이트에서 바이러스 수거물을 적정하였고, 현미경 제어하의 바이러스 배양에 사용하거나, 또는 면역형광 조사, 혈구흡착 시험 및 현탁 배양물보다 부착성 단층 배양물에서 잘 수행될 수 있는 다른 바이러스학적 또는 면역학적 표준 방법에 사용하였다. 추가하여, 이러한 배양물은 또한 플라크 정제 또는 희석에 의해 순수한 바이러스 균주를 회수하는데 특히 적합하다. 마지막으로, 부착성 배양물을 소규모 및 대규모의 바이러스 증식에 또한 사용하였다; 대량 증식은 회전 용기에서 행하는 것이 바람직하다.
Figure 112008067148211-pct00001
실시예 3: 바이러스 분리, 회수 및 시드 바이러스 제제의 생산
바이러스-함유 기관, 조직 또는 조직액 샘플, 인후 스웝, 대변 샘플 같은 일차 분리주를 아이스배스에서 항생제(PSN: 100 U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 50㎍/㎖ 네오마이신)을 첨가한 표준 배지(어떤 다른 배지 또는 인산염 버퍼도 마찬가지로 가능하다) 중에 현탁하고, 필요한 경우 균질화하였다(막자사발, 외과용 메스 날 또는 소위 Douncer 또는 Potter 균질화기로 미세하게 분쇄). 획득한 현탁물을 기공 크기 0.45㎛(더 작은 코팅되지 않은 바이러스의 분리에는 0.2㎛)의 일반적인 실험실용 주사기 필터 어댑터로 여과하였다. 여과액을 신선한 배양 배지를 담은 작은 배양 플라스크(25㎠, 실시예 2 참조)에 접종한다. 수율을 증가시키기 위해서, 일부 배양물은 100㎕ 내지 1㎖의 접종원을 제공한 다음, 37℃에서 인큐베이션하였다. 상부 호흡관으로부터의 바이러스 분리주에 대해서는 33℃의 더 낮은 인큐베이션 온도에서 추가의 배양물을 제조하는 것이 권장된다.
배양물 중에 이미 증식된 순수한 바이러스 분리주를 사용하여 실시예 1 또는 2에 따라서 본 발명에 따른 배양 시스템을 직접 감염시켰다. 그러나, 여기서는 바이러스 제제의 바이러스 함량이 더 높다고 생각할 수 있었으므로, 일반적으로 100㎕ 이하의 더 적은 양의 접종물을 사용하였다. 본 발명에 따른 배양 시스템에서는 이러한 일차 감염에 있어 0.1 내지 0.01의 MOI(감염 다중도)가 바람직하였다; 결과가 만족스럽지 않은 경우, MOI를 10에서 0.0001까지 10배씩 단계적으로 점감시키면서 반복하여 감염시켰다.
다음에, 현미경을 사용하여 감염된 배양물을 바이러스-관련 세포 손상(CPE, 세포병변 효과)에 대해 매일 현미경으로 시험하고 대조 배양물과 비교하였다. 대안으로서, CPE를 야기하지 않는 바이러스에 대해서는 배양물을 특이적 바이러스 항원이나 이들의 유전자의 존재에 대해 시험하였다(예를 들어, 바이러스 타입에 따른 특정 HA 시험; ELISA, PCR). 3-4일 후, 또는 양성 결과(세포 수축, 세포사, 부착성 배양물 내 세포 잔디의 원순화 및 소산, 플라크 형성)가 나타난 후, 원심분리한 세포-프리 배양 상청액을 샘플로서 냉동하였고, 음성 결과나 의심스러운 결과시에는 신선한 배지를 사용하여 전체 배양물을 1 x 105 세포의 세포수로 조정한 다음(현탁 배양물의 희석이나 부착성 배양물의 트립신 처리에 따른 개별 세포의 희석), 추가 인큐베이션하여 새 배양물에 분포시켰다. 이것은 대부분의 배지에서 1:4 내지 1:20의 배양물 희석에 상당하므로, 배양물 수의 로그 증식을 피하기 위해서 늦어도 2차 계대 배양 후에는 가능한 배양물들에서 일부만을 더 지속시켰다. 3차 내지 4차 계대 후, 적합한 바이러스-함유 출발 물질로부터 바이러스 분리주를 성공적으로 분리하여 검출할 수 있었다.
대부분의 바이러스 타입에 대해서, 바이러스 함량 및 출발 물질의 품질에 따라서, 바이러스-관련 CPE는 인큐베이션 2-7일 후에 발견되었다(바이러스-특이적 실시예 참조). 그러나, 일부 바이러스는 매우 느리게 증식하거나 CPE를 나타내지 않았으며, 따라서 연장된 계대 및 인큐베이션 시간에 의해 또는 특수 시험에 의해 검출되어야 한다(필요한 방법이 특이적 바이러스 실시예에 기재된다). 역시 특수 검출 시스템을 필요로 하는 느리게 증식하는 CPE가 없는 바이러스의 예로서는 A형 간염 바이러스의 특별한 예가 언급된다. 거기 설명된 검출 시험은 다른 바이러스들, 특히 특이적 CPE가 없는 것들의 검출에 또한 적합하며, 이 경우 상응하는 항혈청을 사용한다.
실질적으로, 새로 분리된 바이러스는 소위 제한된 희석 기술에 의한 순수 분리주의 3배 플라크 정제 또는 준비 후에만 사용되어야 한다. 필요한 방법은 선행 기술에 따른 전문가의 교재로부터 얻을 수 있다(예를 들어, B.W. Mahy: Virology - A practical approach; IRL Press, Oxford, 1985 참조).
적합한 바이러스 제제가 일차 분리주로부터 또는 확립된 균주로서 이용가능하다면, 이들을 사용하여 교반 배양물을 감염시켜 생산 목적의 동종 시드 바이러스를 회수한다. 본 발명의 목적에만 제한하지 않는다면, 최초 감염은 MOI를 10 내지 0.00001, 바람직하게는 0.1 내지 0.0001로 하여 100㎖ 배양 배지의 작은 교반 배양물에서 하는 것이 초기에 권장된다. 더욱 신속하게 더 높은 바이러스 값 또는 수율을 달성할 수 있는 가장 우호적인 조건(특히 MOI 및 수거 시간과 관련하여)을 선택하고, 미리 정한 생산 규모 및 생산 가동 수에 따라서, 필요한 크기의 배양 시스템에서 추가의 바이러스 계대에서 시드 바이러스를 생산하였다. 달성된 바이러스 수율 및 정해진 생산 시간에 따라서, 이 시드 바이러스 계대의 규모는 1000㎖ 규모 이하의 몇 개 교반 배양물에서부터 약 10 L 부피 이상까지의 작은 발효기까지에 이를 수 있다. 수거한 바이러스를 여과 또는 원심분리하여 어떤 세포 잔류물을 제거하고, 제조에 적합하게 소량씩 나누어, 가능하다면 -70℃ 이하의 온도에 저장하였다.
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실시예 4: 생산 목적을 위한 부착성 마이크로캐리어 배양물로서 시스템의 취급
부착성 MDCK 세포를 실시예 2, 표 1에 따라서 3% 태아 소 혈청(FCS)을 첨가한 BME를 사용하여 회전 용기에서 배양하였다. 이 시스템에서 배양 후, 세포를 회전 용기의 표면으로부터 분리하였다. 이것은 당업자에게 알려진 일반적인 방법에 따라 적합한 트립신 용액을 사용하여 효소적으로 행하였다. 대안으로서, 실시예 1에 따라서 현탁 세포를 교반 배양물에서 배양하였고, 이것을 사용하여 직접 마이크로캐리어를 코팅하였다.
생산 발효기를 Cytodex 3 타입(Pharmacia) 마이크로캐리어로 채웠다. 마이크로캐리어(비중량 5ｇ/L)를 고압멸균한 다음 영양 배지로 조정하였다. 이 방법은 마이크로캐리어의 표면에 세포의 부착을 보장하였다. 이 방식에서 회수된 세포를 1 x 105 세포/㎖의 세포 밀도가 되도록 생산 시스템으로 옮겼다. 세포는 마이크로캐리어에 부착되었으며, 합류점까지 또는 3 x 106 세포/㎖의 세포 밀도가 달성되도록 배양하였다.
세포 배양 단계 후, 존재하는 영양 배지를 신선한 영양 배지로 교체하였다. 이것을 위해 단백질-프리 영양 배지를 사용하였다. 세척 사이클을 2번 행하였다.
세척 사이클은 교반기 중단, 마이크로캐리어 침전, 소비된 영양 배지 제거, 신선한 영양 배지 첨가 및 마이크로캐리어 재현탁으로 구성하였다. 세척 단계 후, 세포 배양물을 트립신(2.5mg/L)과 혼합하였다.
다음에, 시드 바이러스로 세포 배양물을 감염시킨다. 시드 바이러스는 실시예 3에 따라서 획득된 것을 사용하였다. MOI는 바이러스 특이적이었고, 0.1 내지 0.000001, 바람직하게는 0.01 내지 0.0001이었다. 한편으로는 특정 바이러스(특정 예 참조)에 의해 결정되고, 또 다른 한편으로는 선택된 MOI에 의해 결정되는 시간 동안의 감염 단계 종료 후, 교반기를 멈추고 마이크로캐리어를 침전시켰다. 적합한 분리 방법에 의해 세포 잔류물로부터 바이러스-함유 상척액을 제거하여 정제하였다. 세포 분리를 위해서, 당업자에게 알려진 일반적인 원심분리기 또는 분리기, 필터 및 교차흐름 여과 장치를 사용하였다.
실시예 5: 혈청-프리 배지를 사용한 1000 L 규모 생산 부피 이하의 현탁 배양물로서 시스템의 취급
1000 L 생산 부피를 위해 현탁 배양물을 1000㎖ 배양 부피의 소규모 교반 용기(Techne Co.)에서 배양하였다(실시예 1 참조). 교반 용기 내의 세포 밀도는 1 x 105 세포/㎖였다. 세포를 뱃치 과정에서 배양하였고, 신선한 배지 중에 1:10 비율로 간단히 희석하여 1 x 106 세포/㎖의 세포 밀도로 전이하였다. 세포 배양 배지로서 혈청-프리 배지(Ultra CHO, Biowhittaker)를 사용하였다. 10 L 부피로부터, 항구적 폭기 및 온도 제어(세포 배양에 대한 제어 온도 37℃), pH 값(제어 범위 7.1 내지 7.3) 및 산소 분압(45% 내지 55% pO2)을 가진 교반 발효기(분당 30회 교반 회전)를 사용하였다(상세한 기술내용은 표 2에 나타낸다). 1:10의 전이 비율에 따른 스케일-업 부피는 10 L, 100 L, 1000 L였다. 발효기는 3-4일의 시간 후 1 x 105 세포/㎖의 초기 세포 밀도에서 1 x 106 세포/㎖의 최종 세포 밀도에 도달하였다. 1000 L 규모에서 글루코오스 용액(100-200g/L)으로 페드-뱃치를 추가 수행하여 세포 밀도를 3 x 106 세포/㎖까지 증가시켰다. 달성된 세포 수율을 표 2에 비교하여 나타낸다.
실시예 6: 화학적 한정 배지를 사용한 1000 L 이하의 생산 부피까지의 현탁 배양물로서 시스템의 취급
1000 L의 생산 부피를 위해 현탁 배양물을 실시예 5에 설명된 대로 배양하였다. 한편, 세포 배양을 위해 대안으로서 화학적 한정 배지(ProCHO4CDM)를 사용하였다. 이 배지에서는 적응을 위해 3회 내지 5회의 계대를 수행하는 것이 유리하다고 증명되었다. 달성된 세포 수율을 표 2에서 비교한다.
실시예 7: 단백질-프리 배지를 사용한 1000 L 이하의 생산 부피까지의 현탁 배양물로서 시스템의 취급
1000 L의 생산 부피를 위해 현탁 배양물을 실시예 5에 설명된 대로 배양하였다. 세포 배양 배지로서 단백질-프리 배지(SMIF7, LifeTechnologies)를 사용하였다. 이 배지에서는 적응을 위해 5-10회의 계대를 수행하는 것이 유리하다고 증명되었다. 달성된 세포 수율을 표 2에서 비교한다.
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실시예 8: 혈청-프리 배지를 사용한 생산 단계에서 시스템의 취급
실시예 5에 따른 생산 규모로 현탁 배양물을 배양한 후, 세포를 동일한 3 x 1000 L 부피의 3개 발효기에 분배하고 신선한 배지를 채웠다. 각 발효기는 예비-배양물 1/3 부피와 신선한 배지 2/3 부피를 수용하였다. 배양 단계와 동일한 배지를 사용하였다(UltraCHO, BioWhittaker). 충전 후에 세포 배양물을 트립신 10mg/L와 혼합하였다. 다음에, MOI가 0.001이 되도록 시드 바이러스(인플루엔자 B/Harbin /7/94)로 세포 배양물을 감염시키고, 33℃에서 96시간 이상 세포 배양과 동일한 발효 조건에서 더 인큐베이션하였다. 다음에, 세포-함유 상청액을 회수하고, 분리기를 사용하여 세포를 분리하였다. 0.45㎛ 포어 사이즈 카트리지 필터로 추가의 여과 단계를 행하여 추가의 미세 입자들을 분리하였다.
바이러스 수거물을 0.5% 닭 적혈구 HA 시험에서 표준 방법을 사용하여 그리고 부착성 MDCK 세포에서 바이러스 적정에 의해 바이러스 함량에 대해 시험하였다: 측정된 HA 함량은 1024 U이고, 바이러스 역가는 108.2 CID50/㎖이었다.
실시예 9: 화학적 한정 배지를 사용한 생산 단계에서 시스템의 취급
실시예 8에 설명된 바와 같이 생산 세포를 생산하였다. 그러나, 신선한 배지로서 화학적 한정 배지(ProCHO4CDM, BioWhittaker)를 사용하였다. 충전 후에 세포 배양물을 2.5mg/L 트립신과 혼합하였다. 이어서 실시예 8에 설명된 대로 감염시켰다.
측정된 HA 함량은 1024 U이고, 바이러스 역가는 107.5 CID50/㎖이었다.
실시예 10: 단백질-프리 배지를 사용한 생산 단계에서 시스템의 취급
실시예 8에 설명된 바와 같이 생산 세포를 생산하였다. 그러나, 신선한 배지로서 단백질-프리 배지(SMIF7, Life Technologies)를 사용하였다. 충전 후에 세포 배양물을 2.5mg/L 트립신과 혼합하였다.
이어서 실시예 8에 설명된 대로 감염시켰다. 측정된 HA 함량은 1024 U이고, 바이러스는 역가는 107.9 CID50/㎖이었다.
실시예 11: 화학적 한정 배지를 사용한 배양 및 감염
실시예 6에 설명된 바와 같이 세포를 배양하고, 실시예 9에 설명된 대로 감염시켰다. 따라서, 전체 세포 배양물에 대해 배양에서 감염물의 수거까지 화학적 한정 배지에서 수행되었다.
실시예 12: 화학적 한정 배지를 사용한 배양 및 단백질-프리 배지에서의 감염
화학적 한정 배지에서 실시예 6에 설명된 바와 같이 세포를 배양하고, 단백질-프리 배지에서 실시예 10에 설명된 대로 감염시켰다.
실시예 13: 단백질-프리 배지에서의 배양 및 감염
실시예 7에 설명된 바와 같이 세포를 배양하고, 실시예 10에 설명된 대로 감염시켰다. 전체 세포 배양물에 대해 배양에서 감염물의 수거까지 단백질-프리 배지에서 수행되었다.
실시예 14: 바이러스 정제에 대한 일반적 설명
바이러스 증식 단계를 종결한 후, 세포 배양 수거물을 0.45 또는 0.5㎛ 포어 사이즈 딥 베드 필터로 여과하여 세포와 세포 단편들을 분리하였다. 또는, 이 분리는 분리기를 사용하여 수행하였다. 필요하다면 정제된 수거물에 함유된 바이러스를 한외여과에 의해 농축 및 정제하는데, 한외여과에서는 배제 한계가 50,000 내지 1,000,000, 바람직하게는 100,000 내지 500,000인 막을 사용하였다. 획득한 바이러스 농축물을 CS(Cellufine Sulfate, Millipore)로 충전된 크로마토그래피 칼럼에 로딩하였다. 버퍼로 세척하여 오염물을 제거한 후에 바이러스를 0.3 내지 3 M NaCl 용액으로 용출하였다. 용출물을 한외여과하여 탈염하고 추가 농축하였다. 대신하여 또는 크로마토그래피 정제와 조합하여, 추가 정제 효과가 초원심분리에 의해 달성될 수 있다. 또한, 대부분의 바이러스는 수크로오스 구배 중에서의 초원심분리와 이어진 구배 분별에 의해 바이러스 부력 밀도에 따라 정제될 수 있다. 포름알데히드 또는 β-프로피오락톤을 사용한 바이러스 불활성화가 정제 과정의 어느 지점에서 도입될 수 있으며, 불활성화 부피가 이미 상당히 감소된 다음인 농축 또는 정제 후에 사용되는 것이 바람직하다.
실시예 15: 백신 제형화를 위한 불활성화된 순수한 바이러스 제제의 회수
실시예 5, 6 및 7에 따라서 플라비바이러스(중부유럽 뇌염 바이러스, 균주 K 23)를 0.2 MOI의 접종 용량으로 상이한 배지에서 배양하였다(상세한 내용은 실시예 22 참조).
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원심분리 및 0.45㎛ 포어 사이즈 필터 여과에 의해 수거된 바이러스-함유 배양 배지에 어떤 세포 잔류물도 존재하지 않게 하였다. 안정성 때문에, 이 물질은 여과 후 1:2000 또는 1:2500으로 희석한 β-프로피오락톤을 첨가하고 2-8℃에서 24시간 동안 배양함으로써 이미 불활성화되었다. 37℃에서 불활성화제를 2시간 가수분해한 후에 불활성화된 제제의 세포 배양 시험은 0.03 감염성 유닛/㎖ 이하의 검출 한계까지 활성 바이러스가 존재하지 않았음을 나타냈다.
이어서 설명된 정제 단계의 분석을 위해서, BCA[바이신코닉산] 분석(Pierce)을 사용하여 전체 단백질 함량을 측정하였다. E-당단백질에 대한 특이적 단클론성 항체(Niedrig et al., 1994, Acta Virologica 38:141-149)와 토끼로부터 정제된 바이러스에 대한 말에서 생산된 다클론성 항혈청을 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 특이적 항원 함량을 측정하였다. 다음에, 불활성화된 출발 물질에 대한 값을 기준 값으로 사용하였다(100%에 해당).
구배 원심분리에 의한 정제:
불활성화된 바이러스 제제를 80,000 B에서 밀도 구배 초원심분리(15-60% 수크로오스)에 의해서 공지된 방법에 따라서 정제하였다. 다음에, 구배를 분별하고, 분획물 샘플에서 280nm에서의 흡광을 측정하여 바이러스 피크를 확인하였다. 급격한 흡광 증가가 30% 내지 40% 수크로스 농도 범위에서 발견되었으며, 최대값은 34% 및 35%에 있었다. 이 범위로부터, 특정 바이러스 단백질의 최고 함량 및 최고 순도(바이러스 단백질 대 전체 단백질의 비로서 측정됨)를 또한 측정하였다. 전체적으로, 출발 물질에서 측정된 특이적 항원 함량의 50% 이상이 피크 부분에서 회수되었다.
크로마토그래피 정제:
불활성화된 바이러스 제제(상기 참조)를 50mM 인산염 버퍼, pH 7.5의 5회 칼럼 부피로 미리 평형화해 둔 CS 칼럼에 적용하였다. 다음에, 10회 칼럼 부피의 인산염 버퍼로 세척하여 미결합 물질을 제거하였다. 다음에, 동일한 버퍼를 사용하여 결합된 물질을 용출하였는데, 이때 동일한 버퍼의 양을 증가시키면서 3M NaCl을 첨가하여 단계적으로 혼합하여 사용하였다. 특이적 항원의 3.2% 내지 3.9%와 전체 단백질의 79% 내지 83%가 바이러스 물질을 적용한 동안의 흐름 중에서 분석적으로 회수되었다. 전체 단백질의 6-11%와 항원의 0-2.3%가 세척 버퍼 중에서 발견되었다. 따라서, 항원의 95% 이상이 칼럼 물질에 결합된다. 0.6 내지 1.8M NaCl에 의한 용출 동안 항원의 약 60.0%이 회수되었고, 1.2M NaCl에 의한 용출 동안 최고 순도가 달성되었다. 3M NaCl까지의 높은 염 농도에서 순도가 특히 낮은 소량(< 15%)의 항원이 추가 용출되었다.
크로마토그래피와 초원심분리의 조합에 의한 정제:
0.6M 및 1.2M NaCl 용출 후, 크로마토그래피 정제로부터의 용출물을 합하여 상기 설명에 따라 80,000 G에서 2.5시간 동안 초원심분리하였다. 바이러스 펠릿을 50mM 인산염 버퍼, pH 7.5에 재현탁하여 분석하였다. 이 제제의 전체 단백질 농도는 초기 함량의 0.7%까지 감소하였으며, 순도는 이 단계에 의해 10배 증가하였다.
이 바이러스 제제를 상기 설명에 따라 구배 정제하였다. 분별 후, 직접 구배 정제 후 달성된 것과 매우 유사한 구배 프로파일이 발견되었다. 그러나, 바이러스 피크의 고점이 약간 이동하여 이제 37% 수크로오스에 있었다.
실시예 16: 바이러스 분리주의 회수 및 인간 헤르페스 바이러스의 바이러스 증식
투베르쿨린 주사기를 사용하여 수포 단계(입술 헤르페스 수포)의 새로운 헤르페스 발진을 멸균 천자하여 소량을 조직액을 획득하고, 이것을 항생제를 첨가한 표준 배지에 실시예 3에 따라서 현탁한 다음, 0.45㎛ 포어 사이즈 필터를 사용하여 여과하였다. 여과물을 표준 배지 중에서 부착성 MDCK 33016 세포가 있는 25㎠ 배양 표면의 배양 플라스크에 접종하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 4일 후에 상청액 샘플을 회수하고, 7일 후에 배양물의 전체 상청액을 회수하여 -70℃ 이하에 냉동하였다. 4일 후에 회수한 샘플을 10㎍/㎖ 트립신을 함유하는 표준 배지에 10 단계로 1:10 희석하였다; 희석물을 100㎕씩 표준 배지 중에서 MDCK 33016 세포에 도입하였다. 37℃에서 13일 인큐베이션한 후, 제1 배양 단계의 일부 배양물에서 CPE가 발견되었다. 이 배양물의 상청액을 수거하여 다시 희석하고 새 배양물에 접종하였다. 6일 내지 9일 후에 이 3차 바이러스 계대의 일부 희석 단계에서 점진적으로 더욱 뚜렷한 CPE가 전형적인 헤르페스 바이러스 플라크로서 발견되었다. 또한, 175㎠ 배양 표면을 가진 동일한 출발 물질로 병행하여 직접 감염시킨 배양물은 오직 동일한 전형적인 플라크만을 나타내었다. 추가 바이러스 클로닝을 위해, 이 희석 과정을 다시 반복했으며, 이때는 마지막 양성 희석 세포 배양물의 상청액을 사용하였다. 배양 상청액의 수거에 더하여, 남아 있는 세포를 16시간 동안 3% 포름알데히드로 고정시키고, 1% Triton X-100과 함께 30분간 인큐베이션한 다음, HSV-1에 대한 특이적, FITC-표지된 단클론성 항체(Biosoft 제품 No. 17-088)를 사용하여 표준 방법에 따라서 면역형광 조사를 수행하였다. 플라크 근처의 세포만이 면역형광을 가졌음이 판명되었다. 이 증명 및 특정 PCR 증명에 의해, 이 분리주는 헤르페스 단순 바이러스 1로 분명히 확인되었다.
클로닝된 바이러스를 현탁 배양 상태로 표준 배지에서 더 증식시키고, 실시예 3에 설명된 대로 충분한 바이러스 역가(> 10 감염 유닛/㎖)로 생산 시드 바이러스로 사용하였다. 시드 바이러스 제제는 107 내지 108 CID50/㎖ 바이러스 역가를 규칙적으로 함유하였다. 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라서 HEP-2 또는 베로 세포에서 바이러스 역가를 측정하였지만, 이것은 부착성 MDCK 세포에서도 수행될 수 있으며, 이때는 전형적인 플라크에 관하여 적정물을 평가한다. 시드 바이러스 제제를 -70℃에서 알리쿼트로 나누어 보관하거나 그 이하의 온도에서 냉동시켜 보관하고, 생산 세포의 감염에 사용하였다. 해당 제품의 등록에 필요한 서류가 상당히 감소하고 시드 바이러스의 인수가 개선되기 때문에, 이후의 생산에 있어서 동일한 MDCK 세포와 배지 및 첨가제의 관점에서 동일한 배양 조건을 사용하는 것은 상당히 유리하다.
실시예 17: 인간 헤르페스 바이러스의 생산
헤르페스 단순 바이러스 1형(선행 실시예에 설명된 분리주)을 사용한 실시예 8 내지 13에 따른 생산 세포의 감염을 위해서, 0.1 또는 0.01의 MOI와 수거 후 48 내지 96시간의 인큐베이션 시간을 선택하였다. 그러나, 더 낮은 또는 더 높은 MOI와 이에 대응하여 더 긴 또는 더 짧은 인큐베이션 시간도 사용될 수 있으며, 이때는 항상 최적 수거 시간을 알 수 없기 때문에 배양 수율이 다소 변할 수 있다. 그러나, 대개는 전술한 조건이 바람직하며, 이로써 경제적 이유 및 후속 워크업의 용이성에 알맞게 배양 수율이 50% 배양-감염 유닛/㎖(CID50/㎖)이 108 훨씬 이하로는 되지 않게 된다. 이 이상으로, 이런 시간 계획은 정상적인 작업 리듬에 유리하게 개조될 수 있다. 0.0001 이하의 매우 낮은 MOI와 연장된 인큐베이션 시간은 거의 대개는 수율을 저하시키므로 최선책이 될 수 없다.
실시예 18: 동물 헤르페스 바이러스의 증식
헤르페스 바이러스 수이스(의사광견병 바이러스)인 "Phylaxia" 균주(백신 균주)를 실시예 1에 따라서 소규모 100㎖ 교반 배양물에 접종하여 생산 배양물을 감염시켰. 0.01의 MOI와 세포수 1 x 106 세포/㎖로 생산 배양물을 감염시켰다; 37℃ 또는 33℃에서 3일 내지 5일 동안 인큐베이션한 후 감염 배양물 상청액을 수거하였다. 예상 수율은 108 감염 유닛/㎖의 범위이거나, 또는 이보다 상당히 높았다. 상이한 인큐베이션 온도에서 비교적 높은 역가가 달성될 수 있었다:
- 37℃에서 3일 후: 108.7 KID50/㎖,
- 33℃에서 3일 후: 108.6 KID50/㎖,
- 37℃에서 5일 후: 107.9 KID50/㎖,
- 37℃에서 5일 후: 108.3 KID50/㎖.
이들 사례에서 바이러스 적정은 CRFK(Crandall 고양이과 신장) 세포에서 수행하였으며, 7일 후 세포독성 효과에 대해 해석하였다.
실시예 19: 동물 아데노바이러스의 증식
아데노바이러스(개과 아데노바이러스 1, CAV-1 백신 균주 269)을 실시예 1에 따라서 소규모 100㎖ 교반 배양물에 접종하여 생산 배양물을 감염시켰다. 0.01의 MOI와 세포수 1.5 x 106 세포/㎖로 생산 배양물을 감염시켰다; 37℃ 또는 33℃에서 3일 내지 5일의 인큐베이션 시간 후 감염 배양물 상청액을 수거하였다. 인큐베이션 온도(37℃ 또는 33℃) 및 감염 단계의 기간(3일 또는 5일)과 관계없이 107.5 또는 107.6 KID50/㎖의 거의 동일한 역가가 수거물에서 판명되었다.
마이크로타이터 플레이트에서 부착성 MDCK 33016 세포에서 적정에 의해 바이러스 역가에 관하여 수율을 측정하고(실시예 2 참조), 제조 후 7일째에 CPE에 관해 평가하였다. 적정물의 감염된 배양물을 2% 중탄산염(5% 스톡 용액으로부터)을 첨가하지만 혈청이나 단백질은 첨가하지 않은 EME[sic] 배지에 유지하였다. 이 적정 시스템은 최소 희석량(달성된 역가 값에서 인식될 수 있는)에서도 여전히 매우 효과적으로 아데노바이러스를 증식시키므로 민감한 검출 시스템으로 증명되었다.
추가 감염 롯트는 동일한 타입의 부착성 배양 롯트에 비해 현탁 배양 시스템의 우수성을 증명하였다.
부착성 MDCK 33016 배양물을 Falcon 배양 플라스크(175㎠)에서 배양 합류점까지 배양하고, 합류 달성시에 CAV-1로 감염시켰다. 동일한 바이러스 제제를 동일한 양(MOI = 0.01)으로 감염에 사용하였고, 이것을 또한 병행 배양 현탁 배양물의 감염에 사용하였다. 벌크 배양물을 동일한 배지(표준 배지)에서 배양하고, 감염시에 보충제-프리 배지로 배지 교환하여 전환시켰다. 두 배양 시스템을 37℃에서 인큐베이션하고, 감염 후 5일째에 배양 상청액을 수거하였다. 세포-프리 배양 상청액을 상기 설명된 대로 MDCK 세포에서 적정하였다. 부착성 시스템의 바이러스 수율은 106.3 KID50/㎖에 이르렀으며, 현탁 배양 롯트의 수율은 107.8 KID50/㎖로, 약 30배 이상이었다.
실시예 20: 파라믹소바이러스의 증식
아데노바이러스에 대한 선행 실시예와 거의 동일한 방식으로, 대표적인 파라믹소바이러스를 사용하였다(ATCC, 균주 VR-288). 이 바이러스가 매우 빠르게 복제되고 평가 및 적정 또한 곧바로, 즉 5일 후에 일어나므로, 수거 시점이 3일 후라는 점만이 차이가 있었다. 37℃에서 인큐베이션 후에 더 인큐베이션한 배양물은 107.4 CID50/㎖의 수율을 제공하였다; 감염 온도가 감염 시점에서 33℃로 감소했을 때 동일한 역가가 측정되었다.
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아데노바이러스와 유사하게, MDCK 33016 세포는 파라믹소바이러스에 대해서도 매우 적합한 적정 시스템인 것으로 증명되었으며, 혈청이나 단백질을 첨가한(또한 여기서는 중탄산염 첨가) MEM 배지에서 효과적인 바이러스 복제를 나타내었다. 아데노바이러스에 대한 실시예에 설명된 대로, 부착성 배양과 현탁 배양의 직접 비교를 여기서도 수행하였다. 부착성 시스템에서 최대 수율은 감염 시점에서 96시간 후에 106.6 CID50/㎖이었고, 현탁 배양 시스템은 72시간 후에 107.3 CID50/㎖의 수율을 제공했으며, 이것은 비교하면 더욱 우수하고 더욱 빠른 것이었다.
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또는 달리, 실시예 2에 따라서 부착성 MDCK 33016 세포를 동일한 과의 다른 바이러스(PI-3, ATCC VR-93)를 사용하여 5% FCS를 첨가한 MEM에서 감염시켰다. 37℃에서 1주일간 인큐베이션한 후, 상청액은 CV-1 세포(ECACC 87032605)에서의 적정 후 적어도 106 CID50/㎖을 함유했으며, 기니아 피그 적혈구에서 양성 적혈구응집을, 그리고 특정 항체(Biosoft Co. 사의 항-PI-3 MAb-FICT)에서 양성 면역형광을 나타내었다.
또한, 동일한 바이러스 균주(PI-3, ATCC VR-93)를 실시예 12와 유사한 방식으로 화학적 한정 배지 및 단백질-프리 배지에서 사용하여 MDCK 33016 배양물을 감염시켰다. 감염일 3, 5, 9 및 12일에서, 배양물 부피의 22%를 제거하고 신선한 배지로 대체하였다. 7일째에 세포를 포함하는 배양물 부피 50%를 제거하고 새 배지로 대체하였다. 전체적으로, 감염 도중 배양물 부피를 1회 이상 완전히 교환함으로써, 희석함에 따라서 세포가 더욱 증식될 수 있는 기회를 배지 보충에 의해 제공하였다. 사용된 방법은 전체적으로 배양물의 약 1:2.4 계대에 해당하며, 여기서는 단지 초과량만을 제거하였다. 초기 단계에서 특히 가능한, 상당히 더 높은 배양물 계대 및 희석은 여기서는 그다지 충분히 활용되지 않았다.
다음의 바이러스 수율이 측정되었다.
감염일: 3 5 7 9 12 14
로그 CID50/㎖: 7.9 8.05 8.25 7.45 6.7 7.0
(중복 시험의 평균값)
실시예 21: 레오바이러스의 증식
표준 배지에서 MDCK 33016 세포의 현탁 배양물을 레오바이러스 타입 3(Bio Doc, Hannover 사에서 획득)으로 MOI 0.01로 감염시키고, 33℃ 또는 37℃에서 3일 또는 5일간 더 인큐베이션하였다. 5일 및 7일 후에 배양 상청액 샘플을 회수하고, 3% FCS를 첨가한 MEM 배지 중에서 BHK 세포를 사용하여 주어진 시스템에서 적정하였다. 7일 후에 적정물을 평가하였다.
37℃에서 5일 후 현탁 배양물의 바이러스 수율은 108.1 CID50/㎖이고, 33℃에서는 108.0 CID50/㎖이었다. 7일 후 두 온도 롯트에서 역가는 108.0 CID50/㎖이었다.
동일한 바이러스 균주를 MDCK 33016 배양물에서 실시예 12와 유사하게 화학적 한정 배지 및 단백질-프리 배지에서 사용하여 0.01의 MOI로 감염시켰다. 감염일 3, 7 및 10일에서 배양물 부피의 22%를 제거하고 신선한 배지로 대체하였다. 7일째에 세포를 포함하는 배양물 부피 50%를 제거하고 새 배지로 대체하였다. 전체적으로, 감염 도중 배양물 부피를 1회 이상 완전히 교환함으로써, 희석함에 따라서 세포가 더욱 증식될 수 있는 기회를 배지 보충에 의해 제공하였다. 사용된 방법은 전체적으로 배양물의 약 1:2 계대에 해당하며, 여기서는 단지 초과량만을 제거하였다. 초기 단계에서 특히 가능한, 상당히 더 높은 배양물 계대 및 희석은 여기서는 그다지 충분히 활용되지 않았다.
다음의 바이러스 수율이 측정되었다.
감염일: 3 7 10 14
로그 CID50/㎖: 5.4 7.1 6.6 6.6
(중복 시험의 평균값)
실시예 22: 플라비바이러스의 증식
1-1.5 x 106 세포/㎖의 세포 밀도를 갖는 MDCK 33016 세포의 현탁 배양물을 표준 조건(표준 배지, 배양 및 감염 온도 37℃)하에서 중앙 유럽 뇌염 바이러스(균주 K23, Niedrig et al., 1994, Acta Virologica 38:141-149)로 감염시켰다. 선행 실시예와의 차이점은 감염에 매우 가변적인 MOI를 사용했다는 점이다. 더욱이, 감염 배양물을 화학적 한정 배지 또는 단백질-함유 첨가제가 없는 배지에서 부분적으로 유지하였다. 상이한 배양 및 수거 방법을 사용하였으며, 이것은 상이한 파라미터를 변화시켰을 때에도 이 시스템에서 높은 수율이 달성될 수 있으며, 심지어 다중 수거도 가능함을 나타낸다. 이들 변화를 표 3에 요약한다. 바이러스 적정을 A 549 세포(ECACC No. 86012804)에서 수행하고 5일 후에 CPE에 관해 평가하였다. 동일 배양물의 반복 수거가 배양 배지의 교환에 의해 달성되고, 이로써 각 수거 동안 세포에 새로운 배지가 공급되며, 이에 따라 더 성장할 수 있다는 사실은 가치있는 것이다. 이와 같이 수거하지 않는다면, 배양물은 장기간에 걸쳐 생육성 및 생산성을 유지할 수 없을 것이다. 짧은 간격의 빈번한 배지 교환은 배양물의 높은 대사성 배출을 보상할 수 없었으며, 감염 시점에서 4일 또는 5일 후에 추가의 배지 보충 및 배양물의 증량을 수행하였다.
Figure 112008067148211-pct00003
실시예 23: 피코르나바이러스의 증식
부착성 MDCK-33016 배양물을 배양하고 5% 태아 소 혈청 및 중탄산염을 첨가한 MEM 배지에서 A형 간염 바이러스(HAV, 균주 HM 175, ATCC VR-1358)로 감염시켰다(실시예 2 참조). 실험에 관하여, 추가의 "Munich" 바이러스 분리주를 사용하였다(Frosner et al. 1979; Infection 7:303-305 참조). 희석된 바이러스를 신선하게 제조된 배양물에 접종하고, 배양물을 37℃에서 인큐베이션하였다. 배양물을 3일 내지 4일 로테이션으로 교대하면서 1:4의 추가 계대를 행하였다.
MDCK 33016 세포의 현탁 배양물을 실시예 1에 따라서 표준 배지에서 배양하고, HM 175로 접종하고 33℃에서 인큐베이션한 다음, 매주 1:10 계대를 행하였다. 감염 후 부착성 세포를 현탁 배양물 중에 최고 35일 동안 더 유지시켰다. 다음에, CPE(균주 HM 175)에 의해, 또는 설명된 방법(Virus titration, 93 in Gregersen et al. 1988; Med. MicroBiol. Immunol. 177:91-100 참조)에 따라서 활성 바이러스 복제를 검출하였다. 차이점은 정제된 IgG로서 인간 항-HAV 항체를 바이러스-특이적 항체로 사용했다는 점이다(명칭 F 86012, Dade Behring에 의해 공급됨). 제품 No. 39015(Sigma Co.)를 바이오틴으로 표지하여 항-인간 IgG 항체로 사용하였다. 이 시스템에서 활성 바이러스 증식의 특정한 검출은 갈색이 나는 분홍색 세포를 제공하며, 이것은 현미경에서 낮은 배율에서도 쉽게 인식된다. 한편, 바이러스-음성 세포는 무색으로 나타나거나, 단지 엷은 색을 가질 뿐이다. 또한, 제조 3주 후의 바이러스 적정을 동일한 검출 방법에 의해 평가하였으며, 이때는 인간 배수염색체 세포(MRC-5)를 배양 시스템으로 사용하였다.
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상기 설명된 모든 감염 롯트에서 그리고 사용된 두 바이러스 분리주에 있어서, MDCK 세포에서 활성 HAV 복제가 검출될 수 있다. 현탁 배양물 중에서 균주 HM 175를 사용하여 예상외로 빠른 바이러스 증식이 검출되었다. 감염 후 7일째에 상청액에서 측정된 바이러스 역가는 105.4 CID50/㎖이었다; 이 배양물을 단순한 희석에 의해 매주 1:10 계대를 행했으며, 7일 후 결과의 배양물에서 다시 유사한 바이러스 역가가 산출되었다. 배양 종료시에 그리고 2회의 추가 세포 계대 후에, 세포-프리 배지의 한 샘플에서 바이러스 역가를 측정하였다. 또한, 전체 배양물의 샘플을 회수하였고, 그것에 함유된 세포를 -20℃에서 2배 냉동하고 해동하여 파괴하였다. 샘플을 적정하기 전에 원심분리하여 세포 성분을 제거하였다. 이 롯트로부터 획득된 바이러스 수율을 표 4에 요약하며, 이것은 특정한 수율에 대한 부작용 없이 배양물의 매주 10배 증식이 가능하며, 이때 대규모 증량에도 불구하고 부피 단위 당 양호한 바이러스 역가가 수거될 수 있음을 나타낸다. 상청액에서 바이러스의 상당 부분이 발견된다는 사실은 가치있는 것이며, 이것은 또한 이 강하게 세포-결합된 바이러스에 대해 역시 예상외이다(표 4 참조).
Figure 112008067148211-pct00004
실시예 24: 폐렴 바이러스의 증식
5% FCS와 중탄산염을 첨가한 MEM 배지에서 부착성 MDCK 33016 배양물(실시예 2 참조)을 인간 RSV-A(균주 A-2; ATCC VR-1302)를 사용한 감염에 사용하였다. 로 감염하는 동안 사용하였다. 바이러스를 1:100으로 희석하고, 신선하게 제조한 배양물에 접종한 다음, 37℃에서 인큐베이션하였다. 1주일 후 배양 상청액 1㎖를 새 배양물로 옮기고 다시 7일간 인큐베이션하였다. MA-104 세포에서 수거한 배양 상청액은 적정하였을 때 정적물의 평가 동안 CPE에 의해 105.5 CID50/㎖의 바이러스 역가를 나타낸다.
바이러스 균주 A-2, ATCC VR-1302를 MDCK 33016 배양물에서 실시예 12와 유사하게 화학적 한정 배지 및 단백질-프리 배지에서 감염에 사용하였다. 감염일 3, 5, 7 및 9일에서 배양물 부피의 22%를 회수하고 신선한 배지로 대체하였다. 7일째에 세포를 포함하는 배양물 배지의 50%를 제거하고 새 배지로 대체하였다. 전체적으로 감염 도중 배양물 부피를 1회 이상 완전히 교환함으로써, 희석함에 따라서 세포가 더욱 증식될 수 있는 기회를 배지 보충에 의해서 세포에 제공하였다. 사용된 방법은 전체적으로 배양물의 약 1:2.4 계대에 해당하며, 여기서는 단지 초과량만을 제거하였다. 초기 단계에서 특히 가능한, 상당히 더 높은 배양물 계대 및 희석은 여기서는 그다지 충분히 활용되지 않았다.
다음의 바이러스 수율이 측정되었다.
감염일: 3 5 7 9 12 14
로그 CID50/㎖: 7.85 8.5 7.55 6.55 4.45 n.t.
(중복 시험의 평균값) n.t.: 비-멸균이어서 시험하지 않은 샘플
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바이러스 균주 RSV-B, ATCC VR-1401을 동등한 롯트에서 시험하였다. 바이러스 적정을 위해 Hep-2 세포(서브라인 Hep-2C, 이전에 Frankfurt였던 Paul Ehrlich Institute 사에서 공급됨)를 사용하였으며, 이 세포에서는 전형적인 바이러스 합포체가 더욱 잘 발생하므로 평가가 용이하다.
다음의 바이러스 수율이 측정되었다.
감염일: 3 5 7 9 12 14
로그 CID50/㎖: 3.7 4.75 7.45 6.3 3.2 3.75
(중복 시험의 평균값)
실시예 25: 로타바이러스의 증식
5% 보충제와 중탄산염을 첨가한 MEM 배지(실시예 2 참조)에서 부착성 MDCK-33016 배양물을 유인원 로타바이러스 SA-11(ATCC, VR-899)로의 감염에 사용하였다. 바이러스를 신선하게 제조된 배양물에 1:100으로 접종하고, 트립신(0.5-10㎍/㎖, 바람직하게 5㎍/㎖)를 보충한 다음, 배양물을 37℃에서 인큐베이션하였다. 배양물을 3-4일 로테이션으로 교대하면서 다시 1:4 계대하였다.
트립신화 후 배양물의 샘플을 연속하여 3회 냉동(-20℃)하고 다시 해동한 다음, 바이러스 적정에 사용하였다. 바이러스 적정은 MA-104 세포(ECACC 85102918)에서 행하였다. 10일 후에 CPE에 의해 적정물을 평가하였다. 초기 물질의 바이러스 함량에 따라서, 이 바이러스에서 최적의 바이러스 역가는 5 내지 10회 세포 계대 후에 발견된다.
다음에, 시드 바이러스 생산을 위해 초기 물질을 선택하는데, 이것은 실시예 3에 설명된 과정과 유사하게 제조된다. 다음에, 실시예 8, 9 또는 10에 설명된 대로 시드 바이러스를 생산에 사용하며, 이때 기술된 트립신 농도가 상이한 배지에서 유지된다.
추가 실험에 따라서 더 나은 결과를 가져왔던 다소 상이한 경로를 선택했다. 처음에 사용할 트립신 농도를 MA-104 세포에서 시험하여 더욱 최적화한 다음 8-20㎍/㎖로 설정하였다. 또한, 1.6 내지 4.4㎍/㎖(8㎍/㎖ 트립신에서 1.6 또는 20㎍/㎖ 트립신에서 4.4) 농도의 EDTA를 보충하였다. 이러한 최적화된 조건으로부터 바이러스를 상기 설명된 대로 적정하였는데, EDTA 존재하에 트립신 농도를 증가시키자(8 또는 16㎍/㎖), 배양물 해석 동안 단지 5일 후에 이미 최적 역가가 나타났다. 이들 최적화된 조건하에서 회수된 바이러스를 MDCK-33016 현탁 배양물에서 MOI 0.1 내지 0.01까지 감염 용량을 조정한 후 혈청-프리 배지에 접종하였다(실시예 5와 유사하지만, 100㎖ 규모에 8㎍/㎖ 트립신, 1.6㎍/㎖ EDTA). 37℃에서 1일 인큐베이션 후 이들 배양물의 상청액 바이러스 역가는 106.0 또는 106.1 CID50/㎖, 2일 후에는 107.6 또는 106.4 CID50/㎖이었다. 20㎍/㎖ 트립신과 4.4㎍/㎖ EDTA에서는 1일 내지 3일 후에 105.8 내지 106.0 CID50/㎖의 역가가 나타났다.
2일째에 수거한 샘플을 사용하여 2회 추가 계대하자 MOI 0.01 및 8㎍/㎖ 트립신/1.6㎍/㎖ EDTA에서는 107.5 또는 107.9 CID50/㎖의 최대 역가가 나타난바, 아마도 어떤 조정이 일어났으며, 이들 배양물에서는 단지 적은 수의 바이러스 계대만이 필요하였다.
실시예 26: 우두 바이러스의 증식
5% FCS와 중탄산염을 첨가한 MEM-배지(실시예2 참조)에서 부착성 MDCK-33016 배양물을 우두 바이러스(균주 WR, ATCC VR-119)로의 감염에 사용하였다. 바이러스를 신선하게 제조된 배양물에 접종한 다음, 37℃에서 인큐베이션하였다. 5일 후에 수거된 배양 상청액의 샘플을 사용하여 바이러스 적정하였다.
MDCK-33016 세포의 현탁 배양물을 실시예 1에 따라써 표준 배지에서 배양하고, 우두 바이러스를 1:1000 희석하여 접종하였다. 감염된 배양물을 추가 인큐베이션하면서 2일 간격으로 샘플을 회수하여 적정하였다.
베로 세포(WHO 시드, ECACC에서 획득함)에서 바이러스 적정을 행하였다. 5일 후에 CEP에 의해 적정물을 평가하였다. 2일 내지 3일 후에 이미 MOI 0.01에서 106 CID50/㎖ 이상의 바이러스 역가가 나타났다.
실시예 27: 랍도바이러스의 증식
실시예 1에 따라서 표준 배지 중의 현탁 배양물을 배지 ㎖ 당 1 x 106 세포의 세포 밀도로 세포 배양 플라스크에 시딩하였다. 배양물을 성장시킨 후, 2개 배양물은 광견병 바이러스(균주 Pitman-Moore, 백신 바이러스 균주)로 MOI 0.01로 감염시키고, 1개 배양물은 MOI 0.001로 감염시켰다. 배양물을 37℃에서 인큐베이션하고, 4일 또는 3일마다 트립신으로 박리시키면서 1:10 비율(4일 후) 또는 1:8 비율(3일 후)로 계대하는데, 이러한 방식을 18일간 유지하였다(표 5 참조). 각 계대에서 감염 성공을 추적하였다. 배양물에 3.5% 포르말린 용액을 제공하고 이 용액 중에서 실온에서 3일간 인큐베이션하여 바이러스를 불활성화하였다. 포르말린 용액을 제거한 후 배양물을 PBS로 세척하고 실온에서 PBS 중의 1% Triton X-100과 함께 25분간 인큐베이션하였다. 용액을 제거한 후, PBS로 3번 세척하고 광견병 바이러스에 대한 FITC-표지된 항체를 적용하였다(50㎕ 1:400 희석된 토끼 항광견병 IgG FITC, Dade Behring, OSHY 005). 37℃에서 90분간 인큐베이션한 후 PBS로 다시 세척하고, 도립 형광현미경 아래에서 배양물을 평가하였다.
대안으로서, MRC-5 세포에서 표준 방법에 따라서 배양 상청액의 바이러스 적정을 수행한 다음, 포르말린/Triton 전처리 후에 상기 설명된 대로 면역형광에 의해 평가하였다. 이 시스템에 의해 달성된 바이러스 역가에 의해, 승인된 인간 백신(Rabivac)에 대해 MRC-5 배양물을 사용하여 상응하는 생산 방법에 따른 수율과의 대략적인 상호관련성을 설정하였으며, 이것은 배양 수거물 ㎖ 당 얼마나 많은 백신 항원이 함유되는가에 관한 사전 인식을 허용한다(표 5 참조).
단지 4일 후에 두 롯트(MOI 0.01과 0.001)는 모두 양성 결과를 나타냈으며, 유사한 감염 경로이지만 더 낮은 MOI 감염 경로는 - 바이러스 역가가 11일까지 약 1.2 내지 0.5 로그 CID50으로 더 낮았다는 것에서 알 수 있다 - 약간의 지연을 나타내었다. 11일째 배양물을 3차 계대로부터, 초기 세포 파괴에 의한 매우 강한 특이적 면역형광이 모든 배양물에서 나타났으며, 이것은 이후 18일째 5차 계대까지에서 대부분의 세포가 완전히 파괴되어 감염이 종결될 때까지 점점 증가하였다. 특이적 바이러스의 함량은 14일까지 계속 상승한 다음 세포 파괴가 증가함에 따라 다시 감소하였다. 이 감염 경로의 결과를 하기 표에 요약하며, 이것은 (광견병 바이러스의 공지된 느린 바이러스 증식에 의거 판단하면) 이들 세포에서 적응 과정 없이도 매우 빠른 바이러스 증식이 예상되며, 이때 규칙적인 간격으로 반복적으로 세포가 계속해서 재증식함에도 불구하고 양호한 항원 수율이 수거될 수 있음을 나타낸다.
Figure 112008067148211-pct00005
유사한 방식으로, 동일한 바이러스를 실시예 1에 따라서 현탁 배양물 중에서 직접 접종하였으며, 이때는 MOI 0.0001을 추가로 사용하였다. 전체 감염 경로에서 오직 표준 배지만을 다시 사용하였고, 배양물은 역시 1:8 또는 1:10으로 주 2회 전달되었다. 전달은 신선한 배지 중에 세포를 단순히 희석함으로써 행하였으며, 새로 시딩하였다. 상기 설명된 대로 MRC-5 세포에서의 바이러스 적정을 참조하여 오직 여기서만 감염 성공을 추적하였다. 모든 3개 MOI에서 감염은 단지 4일 후에 배양 상청액에서 양성 바이러스 역가를 산출하였다. 바이러스 역가는 초기 희석 손실 후 상승하였고, 계대하면서 7일 후 다시 지수 방식 희석을 수행하였음에도 계속 상승하였으며, 현탁 배양물에서 대량의 세포 파괴는 없었다. 8차 계대(감염 28일 후)까지 감염을 추적한 다음 중단하였다.
이들 감염으로부터의 바이러스 샘플을 시드 바이러스로 냉동하고, 새로운 현탁 배양물 감염에 사용하였는데, 역시 표준 배지에서 상기 설명된 것과 동일한 계대 조건에서 100㎖를 사용하여 시작하였다. 이 경우에 MOI는 0.000025로 감소하였다. 감염은 6차 세포 계대(21일) 동안 유지되었다. 배양 상청액 ㎖ 당 약 0.3 백신 용량을 제공하는 전환된 바이러스 역가가 이 감염 경로의 종료 지점에서 측정되었으며, 대량의 계대 희석에도 불구하고 바이러스 역가는 서서히 상승하였다. 만일 단지 일부가 아닌 전체 배양 부피에 추가 계대를 수행했다면, 약 500 L 배양물이 6차 계대 후 수거되었을 것이고, 이것은 약 150,000 백신 용량에 해당하는 바이러스 수율이었을 것이다.
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실시예 28: 토가바이러스의 증식
표준 배지에서 또는 5% FCS와 중탄산염을 첨가한 MEM 배지(실시예2 참조)에서 부착성 MDCK-33016 배양물을 일본 뇌염 바이러스(ATCC VR-343)로의 감염에 사용하였다. 바이러스를 MOI 0.1 내지 0.001로 희석하고 신선하게 제조된 배양물에 접종한 다음, 배양물을 33℃에서 아니면 37℃에서 인큐베이션하였다. 활성 바이러스 증식을 아세톤 고정된 세포에서 특이적 항혈청을 사용한 면역형광에 의해, 그리고 사용된 MOI에 따라서 최대 바이러스 항원 제시 시간에 의해 측정하였다. 상청액으로부터 수거한 바이러스 수거물의 바이러스 적정을 베로 세포에서 행하고, 역시 면역형광에 의해 평가하였다. 면역형광에 대한 대안으로서, 아비딘-바이오틴 퍼옥시다제 시스템을 사용하여 바이러스를 검출할 수 있으며, 실시예 23과 유사하게 적정을 평가할 수 있다(A형 간염 바이러스에 대해 설명된 피코르나바이러스의 증식).

Claims (36)

  1. 하기의 단계를 포함하는 백신의 제조방법:
    a) 마딘 다비 카닌 신장(Madin-Darby canine kidney; MDCK) 세포의 현탁 배양물을 혈청-프리 배지, 단백질-프리 배지 또는 화학적 한정 배지에서 배양하는 단계로서, 여기서
    (i) 상기 배양은 페드-뱃치(fed-batch) 시스템에서 수행하고,
    (ⅱ) 상기 배양물의 부피를 신선한 배지의 첨가에 의해 증가시키고,
    (ⅲ) 상기 배양물의 생산 부피를 100L 이상으로 하는 단계,
    b) 상기 MDCK 세포의 현탁 배양물을 바이러스로 감염시키는 단계, 및
    c) 상기 바이러스를 MDCK 세포의 현탁 배양물에서 증식시키는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 셀루파인 설페이트(Cellufine Sulfate; CS)로 충전된 크로마토그래피 및 수크로오스 구배 중에서의 초원심분리 중 하나 이상을 통해 바이러스를 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 정제 단계 이전 또는 이후에 바이러스를 β-프로피오락톤으로 불활성화시키는 것을 특징으로 하는 백신의 제조방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 감염 단계 이전에 MDCK 세포를 화학적 한정 배지에서 배양하고, 상기 감염 단계 이후에 MDCK 세포를 단백질-프리 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 백신의 제조방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 MDCK 세포는 MDCK 33016 세포주에서 기원하는 것을 특징으로 하는 백신의 제조방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 ssDNA, dsDNA, RNA(+), RNA(-) 또는 dsRNA 바이러스인 것을 특징으로 하는 백신의 제조방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스, 오르토바이러스 또는 파라믹소바이러스, 레오바이러스, 피코르나바이러스, 엔테로바이러스, 플라비바이러스, 아레나바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 폭스 바이러스에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 MDCK 세포는 아데노바이러스, 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 중부유럽 뇌염 바이러스 및 관련된 동방 형태(러시아 등), 뎅그열 바이러스, 황열병 바이러스, C형 간염 바이러스, 풍진 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡 융합체 바이러스, 우두 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 로타바이러스, 랍도바이러스, 폐렴바이러스, 레오바이러스, 헤르페스 단순 바이러스 1형 또는 2형, 시토메갈로바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 개 아데노바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 소 또는 돼지 헤르페스 바이러스, BHV-1 바이러스, 의사광견병 바이러스, 또는 광견병 바이러스로 감염되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 백신은 애쥬번트, 보조제, 버퍼, 희석제 또는 약물 담체와 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
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