PT1427815E - Métodos para a produção industrial de vacinas - Google Patents

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Holger Luebben
Christian Frech
Jens-Peter Gregersen
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Novartis Vaccines & Diagnostic
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Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO INDUSTRIAL DE VACINAS" A invenção refere-se a métodos de produção de vacinas em grande escala.
As doenças infecciosas, especialmente as infecções virais, continuam a ter um grande significado na medicina. Assim, persiste a necessidade de disponibilizar métodos melhores, através dos guais se possa multiplicar virus em cultura, para possibilitar a investigação dos virus e a produção de vacinas.
Especialmente a produção de vacinas contras infecções virais necessita habitualmente da multiplicação e isolamento de grandes quantidades do respectivo virus.
Dependendo do virus são utilizados, no estado da arte, diversos sistemas de hospedeiro e condições de cultivo para a multiplicação dos virus. Como sistemas hospedeiros padrão utilizam-se animais hospedeiros, ovos de galinha embrionados, culturas de células de tecidos primários ou linhas celulares permanentes estabelecidas (Rolle e Mayr (editores), microbiologia, ciência infecciosa e epidémica, 1978; Mahy (editor), Virology, A Practical Approach, 1985; Horzinek (editor) compêndio de virologia geral, 1985). A multiplicação de virus em ovos de galinha embrionados está associada a elevadas exigências de tempo e de custos. Os ovos têm de ser incubados antes da infecção e só depois testados quando à viabilidade dos embriões. Apenas os embriões vivos estão em 1 condições de multiplicar os vírus. Após uma infecção bem sucedida com o vírus a multiplicar e posterior incubação é que os embriões são finalmente mortos. Os vírus isoláveis a partir dos ovos são libertados de impurezas e concentrados. Uma vez que a multiplicarão de vírus em ovos incubados não é possível em condições de esterilidade máximas, têm de se remover os microrganismos patogénicos contaminantes dos isolados, se se pretender que estes fiquem disponíveis para uma aplicação médica ou de diagnóstico.
Uma alternativa à multiplicação de vírus em ovos de galinha é oferecida pelas células anfitriãs eucarióticas de linhas celulares definidas (Gregersen, J.P., Pharmazeutische Biotechnologie, Kayser e Muller (editores), 2000, páginas 257-281) . Inúmeras linhas celulares, devido às contaminações persistentes por vírus estranhos, devido a falta de provas da ausência de vírus ou devido à origem e história pouco claras, não são adequadas à produção de vacinas ou de preparados semelhantes utilizáveis em medicina.
Por outro lado, existe um sistema de anfitrião de células Vero derivadas de células de rins de macacos, que já está a ser utilizado na multiplicação de vírus individuais (poliovírus, vírus da raiva) para a produção de vacinas. Estas células podem ser obtidas em diversos bancos de células (como, por exemplo a American Type Culture Collection, ATCC) e são ainda disponibilizadas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) a partir de um banco de células aprovado para a investigação na medicina.
Estas células Vero tratam-se de linhas aderentes, que para o seu crescimento precisam de superfícies de suporte como, por exemplo, frascos de vidro, recipientes de cultura em plástico ou frascos de plástico. No caso de uma cultura de células em 2 fermentador, o crescimento ocorre nos denominados microportadores, ou seja, em regra, pequenas esferas de plástico sobre cuja superfície as células podem crescer.
Sabe-se que, além das células Vero acima referidas, existem também células que conseguem multiplicar de forma activa diversos tipos de virus como, por exemplo, as células aderentes BHK ("Baby Hamster Kidney" - de rim de hamster bébé) e as células aderentes MDCK ("Mandine Darby Canine Kidney" de Madin Darby de rim canino) e outros tipos de células e que são utilizadas ou cuja utilização é considerada para aplicação como substrato para produção de produtos farmacêuticos. Na linha celular MDCK ATCC CRL34 (NBL-2) além dos virus da gripe são multiplicados experimentalmente o virus da estomatite vesicular, o virus coxsackie B5 (contudo não ο B3 nem ο B4), o reovirus tipo 2 e 3, o adenovírus tipo 4 e 5 bem como virus vaccinia. Todas as publicações relevantes orientam-se, contudo, exclusivamente para as culturas aderentes (ver. Informação na ATCC). Para a multiplicação de grandes quantidades de células é contudo preferível a cultura em suspensão, na qual apenas os linfóides e muitas células transformadas se conseguiam até agora multiplicar neste sistema (Lindl (editor), Cultura de células e tecido, 2000, páginas 173 ff.). Uma linha celular MDCK, que possibilitava o crescimento em suspensão num meio de cultura isento de proteínas, é revelada na WO 97/37000. A multiplicação dos vírus da gripe utilizando as células anfitriãs correspondentes encontra-se igualmente descrita.
Além da selecção de um sistema de células ou anfitrião adequado são igualmente de extrema importância as condições de cultivo sob as quais se vai multiplicar uma estirpe de vírus, para a obtenção de uma elevada produção aceitável. Para maximizar 3 a produção da estirpe de vírus desejada, devem adaptar-se de forma específica tanto o sistema de anfitrião como as condições de cultivo para se obter as condições ambientes favoráveis para a estirpe de vírus pretendida. Para se obter uma produção elevada das diversas estirpes de vírus é necessário um sistema que ofereça condições de crescimento óptimas. Muitos vírus estão limitados a sistemas de anfitrião especiais, entre os quais alguns são muito ineficientes no que respeita à produção de vírus. Sistemas de produção eficientes baseiam-se além disso, frequentemente em adaptações da população de vírus ao sistema de cultura respectivo, frequentemente mediante utilização de níveis intermédios com utilização de outros sistemas de anfitrião e mediante utilização de aditivos proteicos, na maior parte das vezes soro, de origem animal ou humana.
As pessoas com experiência sabem que quase todas as culturas de células, após uma multiplicação inicial mediante adição de soro ou outros factores de crescimento, conseguem ser mantidas, pelo menos por um determinado tempo, sem adição de soro ou de proteínas. Então, por exemplo, uma qualquer cultura de células pode ser transferida na altura da infecção por vírus ou imediatamente antes da colheita para um meio sem soro ou aditivos proteicos, e mantida até à colheita. Esta é, desde há anos a prática habitual para, evitando ou reduzindo as proteínas estranhas, se obter material de vírus para vacinas ou testes de diagnóstico. As vacinas de culturas de células, que sem esta prática eram mantidas durante a fase de infecção sob adição de soro, terão grandes problemas, de obterem autorização para utilização em seres humanos ou animais uma vez que os componentes de soro dificilmente se conseguem remover de forma suficiente (ver. recomendações OMS "Proposed requirements for Measles 4
Vaccine" (Live), Requirements for Biological Subtances No.12, Revised 1978) .
Também se sabe que muitos vírus apenas se conseguem multiplicar muito mal ou não se conseguem multiplicar de todo em meios contendo proteína. Trata-se aqui daqueles vírus que para a multiplicação em sistemas de cultura dependem da actividade de enzimas proteolíticas (proteases). Uma vez que estas proteases são competitivamente inibidas pelos aditivos proteicos do meio, esta situação impossibilita logicamente a adição de proteínas pelo menos a partir do momento da infecção ou fase de produção. Exemplos de vírus que têm de ser habitualmente multiplicados sob adição de proteases e logo para obtenção de boas produções o mais possível sem aditivos proteicos ao meio de infecção são os vírus da gripe e os rotavírus. Outros tipos de vírus como, por exemplo, paramixovírus e reovírus podem igualmente beneficiar da multiplicação em meios que sejam o mais pobres possível em proteínas (Ward et al. (1984) J.Clin.Microbiol. 748-753 "Efficiency of Human Rotavírus Propagation in Cell Culture"). A WO 96/15231 propõe o cultivo de células Vero e outras células em cultura de células em que se deve utilizar um meio que funciona sem os aditivos de proteínas habituais.
Outros vírus multiplicam-se de forma notoriamente pior independentemente da composição do meio e das condições da cultura, por exemplo, vírus da raiva, rotavírus, pneumovírus ou vírus da hepatite A (Provost und Hillemann, Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 160:213-221 (1979); und Rolle und Mayr, obra citada).
Por fim, no estado da técnica, são conhecidos inúmeros processos, através dos quais os vírus, os produtos de expressão virai ou outras proteínas podem ser isolados, após a multiplicação, do meio e/ou das células, (Gregersen obra citada; 5
Mahy obra citada; Reimer C., et al., Journal of Virology, Dez. 1967, p. 1207-1216; Navarro del Canizo, A., et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 61, 1996, 399; Prior, C., et al., BioPharm, Out. 1996, 22; Janson, Jan-C. and Rydén, L. (editor), Protein Purification, 1997; e Deutscher M. (editor), Methods in Enzymology, Vol. 182, 1990).
Contudo, no estado da técnica, não são conhecidos métodos com os quais se possa multiplicar uma série de virus diferentes com produção elevada e em grande escala, num sistema de cultura em suspensão fácil de utilizar, em condições que são necessárias para um produto farmacêutico. O objectivo da presente invenção é assim disponibilizar métodos e sistemas de culturas de células para multiplicação de virus que sejam adequados para a utilização farmacêutica e de diagnóstico, em grande escala. A invenção refere-se a um método de produção de vacinas em grande escala, no qual: (a) se multiplica uma cultura em suspensão de MDCK num meio isento de soro, isento de proteínas ou definido quimicamente, em que (i) a multiplicação é efectuada num sistema fed-batch, (ii) o volume da cultura é aumentado através da adição de um meio fresco, e (iii) se obtém um volume de produção de 100-10.000 1, (b) a cultura em suspensão MDCK é infectada com um vírus, (c) os vírus se multiplicam na cultura em suspensão MDCK, e 6 (d) são isolados os vírus ou uma proteína gerada por eles a partir da cultura de células.
Preferencialmente, a multiplicação das células ocorre, no método acima, ocorre antes da infecção num meio definido quimicamente e após a infecção num meio isento de proteínas.
Foi ainda surpreendentemente determinado, que determinadas linhas celulares MDCK, que apresentam a capacidade de crescer em suspensão, são especialmente adequadas para a multiplicação de uma série de vírus diferentes em condições técnicas. Nestas células podem replicar-se rapidamente os mais diversos tipos de vírus sem a fase de adaptação habitualmente prolongada (com duração de semanas ou meses). 0 método, de acordo com a invenção, pode ser efectuado sem a selecção de condições de cultura especiais, como meios, aditivos de meios ou temperaturas. As células são adequadas, sem qualquer problema, para a réplica dos mais diversos vírus mesmo os mais difíceis de multiplicar, como por exemplo o vírus da raiva, o rotavírus, o pneumovírus ou o vírus da hepatite A. A invenção abre assim possibilidades novas e ao mesmo tempo melhoradas de criar vírus em cultura de células em escala industrial. Os produtos obtidos desta forma são especialmente adequados para utilização na produção de medicamentos, especialmente de vacinas. Conseguiu-se demonstrar de forma surpreendente que o método, de acordo com a invenção, pode ser utilizado de forma praticamente inalterada para diversos tipos de vírus sem ter de se adaptar especificamente a estes. Isto tem a vantagem de se poder multiplicar diferentes produtos (vírus) no mesmo sistema ou em diversos sistemas que tenham o mesmo equipamento e especificação. Com este procedimento podem obter-se 7 poupanças de custos significativas, uma vez que utilizando o mesmo processo base para diversos produtos, deixa de ser necessária uma validação dispendiosa de um novo processo ou uma nova variante do processo. Ao mesmo tempo, o processo de acordo com a invenção oferece produções que ultrapassam as dos sistemas até agora conhecidos que foram optimizados de forma muito dispendiosa. Entre as vantagens referidas do método de acordo com a invenção, conta-se ainda uma autorização oficial facilitada dos produtos resultantes do método, uma vez que uma grande parte de um dossier de autorização preparado e aceite para um produto pode ser utilizada para a autorização de outros produtos. A multiplicação dos virus ocorre numa cultura em suspensão com um volume de mais de 30 1, sendo preferidos métodos, que utilizam um volume de mais de 50 1 e mais de 100 1. O método de acordo com a invenção apresenta, no que respeita ao volume, unicamente um limite superior, como limitação do tamanho absoluto do recipiente de cultura disponível. No estado da técnica são conhecidas instalações como, por exemplo, fermentadores de aço inoxidável, com um tamanho até 5.000 e 10.000 1. Sistemas correspondentes podem ser aplicados ao método de acordo com a invenção.
As células que se utilizam no método, de acordo com a invenção, são células MDCK, que têm a propriedade de crescer em cultura em suspensão. Assim são designadas linhas celulares que mesmo na ausência de partículas portadoras no fermentador conseguem crescer em grande escala, o que em relação a outras células apresenta vantagens significativas no manuseamento de culturas, no aumento da escala das culturas e na multiplicação de vírus. Métodos para adaptação de células MDCK à cultura em suspensão são conhecidos no estado da técnica (WO 97/37000). As 8 células MDCK podem, por exemplo, derivar da linha celular MDCK-33016.
De acordo com uma outra forma de execução da invenção são utilizadas células MDCK que estão em posição de crescer tanto em forma aderente como em suspensão. Esta forma de execução apresenta a vantagem especial de se poder utilizar um sistema de cultura único e logo também um único meio para o desenvolvimento das células desde a escala laboratorial até à produção em grande escala. Os sistemas correspondentes facilitam significativamente a autorização de introdução no mercado uma vez que apenas se tem que comprovar a segurança de um único sistema de cultura de células individual. O virus pode apresentar um genoma de ácido desoxirribonucléico monocatenário (ssADN), de ácido desoxirribonucléico bicatenário (dsADN), de ácido ribonucleico bicatenário (dsARN) ou de ácido ribonucleico monocatenário. As moléculas de ácido ribonucleico monocatenário podem assim apresentar a polaridade de um ARN mensageiro (messenger-RNS) ARN(+), ou ser de polaridade inversa, ARN(-). O virus pode tratar-se de qualquer virus conhecido no estado da técnia. Os virus que são utilizados no âmbito do método de acordo com a invenção, podem ser obtidos em diversas colecções como, por exemplo a ATCC (American Type Culture Collection) ou a ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures). Em regra, recorre-se a estirpes de produção já existentes ou a estirpes de virus previamente multiplicados em cultura celular. Além disso, podem ainda estabelecer-se isolados próprios desde que estes se adeqúem melhor à aplicação pretendida. De acordo com uma forma de execução, o virus, que vai ser utilizado no processo, é seleccionado a partir do grupo constituído por: adenovírus, 9 ortomixovírus e paramixovírus, reovírus, picornavírus, vírus entéricos, flavivírus, arenavírus, vírus do herpes e vírus da varíola. Pode utilizar-se, de forma especialmente vantajosa, para infecção das células um adenovírus, poliovírus, vírus da hepatite A, vírus da encefalite japonesa, vírus da meningoencefalite europeia da primavera-verão bem como as formas de leste relacionadas (russa ou outras), vírus dengue, vírus da febre-amarela, vírus da hepatite C, vírus da rubéola, vírus da papeira, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório, vírus vaccinia, vírus da gripe, rotavírus, rhabdovírus, pneumovírus, reovírus, vírus do herpes simples 1 ou 2, citomegalovírus, vírus varicela-zoster, adenovírus canino, vírus de Epstein Barr, bem como vírus do herpes bovino ou suíno como BHV-1 ou vírus da pseudo-raiva sendo preferida a utilização de um vírus da raiva, rotavírus, pneumovírus ou vírus da hepatite A.
De acordo com uma outra forma de execução da presente invenção, o genoma do vírus pode abranger uma sequência de ácidos nucleicos que codificam para uma proteína heteróloga, funcional com um tamanho de 10 kDa no mínimo. No estado da técnica são conhecidos inúmeros vectores para a expressão de proteínas heterólogas que se baseiam num genoma virai, por exemplo num genoma do vírus do herpes, do vírus vaccinia ou adenovírus (Galler R. et al.,Braz.J.Med.Biol. Res., Fev. 1997, 30(2): 157- 68; Willemse MJ. et al., Vaccine Nov. 1996 , 14(16): 1511-6;
Efstathiou S.; Minson AC., Br.Med.Bull., Jan. 1995 51(1): 45-55; Hammerschmidt W., Curr. Opin. Mol. Ther., Out. 2000, 2(5):532-9; Graham F1.; Prevec, L., Mol. Biotechnol., Jun. 1995, 3 (3):207-20; Carroll MW., Moss B.;Curr. Opin. Biotechnol., Out. 1997.; 8(5):573-7,- Wojcik J., Acta .Microbiol. Pol., 1995, 44(2):191-6,-
Ramirez JC. et al., J.Virol., Ag. 2000; 74(16): 7651-5; Hagen , 10
Anna, et al., Biotechnol. Prog., 1996, 12, 406-408/ Huyghe,
Bernard, et al., Human Gene Therapy, Nov. 1995., 6:1403-1416).
No âmbito da presente invenção estão também abrangidos métodos para multiplicação dos virus, nos quais o genoma virai foi de tal forma alterado por adição ou substituição de sequências, que o genoma codifica para uma proteína heteróloga funcional, não originalmente pertencente ao vírus, com um tamanho de pelo menos 10 kDa. De acordo com a invenção, uma proteína é designada como proteína funcional quando a proteína está, pelo menos, em posição de iniciar uma reacção imunológica contra esta proteína. Como se pode compreender, a proteína consegue, além da actividade imunológica, apresentar outras actividades biológicas como, por exemplo, actuar como enzima ou citocina.
Os vírus que são utilizados no método de acordo com a invenção, podem ainda apresentar delecções de genes individuais no genoma virai. Assim pode, por exemplo, fazer-se a delecção deliberada de genes de um vírus, que deverá ser utilizado como vacina, que codifique para factores de patogenecidade. As delecções respectivas abrangem preferencialmente não mais de 500 ou 1000 nucleótidos. O vírus utilizado para o método, de acordo com a invenção, pode, obviamente, incluir também um genoma virai completo. A multiplicação dos vírus na cultura em suspensão pode ocorrer, de acordo com o método de acordo com a invenção, na presença ou na ausência de soro no meio. Existem especiais vantagens na ausência de soro, uma vez que estas condições de cultura de células facilitam significativamente a autorização para aplicações médicas dos produtos assim gerados. Prescindindo-se dos aditivos de soro ao meio de cultura, evitam-se também passos de purificação dispendiosos para a remoção das 11 contaminações do meio. Desta forma, obtêm-se melhorias no que respeita à qualidade do produto e ainda se evitam custos.
Como "meio isento de soro", no âmbito da presente invenção, designa-se um meio que não apresente quaisquer aditivos de soro de tipo humano ou animal.
Consoante as culturas, podem adicionar-se quantidades definidas de determinadas proteínas, que actuam sem perturbar sobre a cultura e a aplicação associada. Um meio de cultura desse tipo é designado como meio definido quimicamente. A este meio são adicionadas proteínas seleccionadas como péptido mitógeno, insulina, transferrina ou lipoproteína que podem ser obtidas em diversos fabricantes conhecidos por um perito na especialidade.
Por péptidos mitógenos entendem-se, no âmbito da presente invenção preferencialmente hidrolisatos vegetais como, por exemplo, hidrolisato de proteína de rebentos de soja ou lisatos de proteínas de outras plantas úteis.
De acordo com uma forma de execução preferencial os meios são contudo completamente "isentos de proteínas". Por "isento de proteínas" entende-se culturas, nas quais a multiplicação de células ocorre excluindo proteínas, factores de crescimento, outros aditivos proteicos e proteínas não do soro. Compreensivelmente, as células que crescem nessas culturas contêm elas próprias proteínas.
Os meios conhecidos isentos de soro são, por exemplo, meio de Iscove, meio Ultra-CHO (BioWhittaker) ou EX-CELL (JHR Bioscience). Os meios habituais com teor de soro são, por exemplo, meio basal de Eagle (BME) ou Meio Mínimo Essencial (MEM) (Eagle, Science 130, 432, (1959)) ou meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM ou EDM) , que são utilizados normalmente com até 10% de soro fetal de vitelo ou aditivos semelhantes. Meios isentos de 12 proteínas como, por exemplo PF-CHO (JHR-Bioscience), meios definidos quimicamente, como ProCHO 4CDM (Bio Whittaker) ou SMIF 7 (Gibco/BRL-Life Technologies), e péptido mitógeno como, por exemplo Primactone, Pepticase ou HyPep™ (todos da Quest International) ou hidrolisado de lactoalbumina (Gibco e outros fabricantes), são também suficientemente conhecidos do estado da técnica. Especialmente os aditivos de meios à base de hidrolisados vegetais apresentam a vantagem de se conseguir excluir uma contaminação com vírus, microplasmas ou agentes infecciosos desconhecidos.
Segundo uma forma de execução preferencial da presente invenção, durante a cultura das células MDCK infectadas, é adicionado meio fresco, concentrado de meio ou componentes do meio como, por exemplo, aminoácidos, vitaminas, fracções de lipidos ou fosfatos. 0 processo de acordo com a invenção pode assim, ser efectuado num sistema de perfusão ou num sistema de batch. Por "sistemas de perfusão" entendem-se sistemas de cultura, nos quais o meio é adicionado ou retirado de forma continua. Em alternativa, podem cultivar-se células também num "sistema de batch", no qual o sistema é executado como um sistema largamente fechado sem adição de meio desde a inoculação à colheita.
As condições de cultura de células a utilizar para a aplicação pretendida (temperatura, densidade celular, valor pH, etc.) são largamente variáveis de acordo com a adequação da linha celular utilizada, de acordo com invenção, e podem ser adaptadas às necessidades da aplicação. As seguintes indicações apresentam assim unicamente valores de orientação. A multiplicação das células MDCK antes da infecção ocorre num sistema fed-batch. Por "sistema fed-batch" entende-se, no 13 âmbito da presente invenção, um sistema de cultura, no qual as células são inicialmente cultivadas num sistema de batch, e a depleção de nutrientes (ou parte dos nutrientes) no meio é compensada através de uma alimentação suplementar controlada de nutrientes concentrados. Num sistema fed-batch podem multiplicar-se as células MDCK, por exemplo, até uma densidade celular de cerca de 1-10 x 106.
Revelou-se vantajoso definir o valor do pH do meio durante a multiplicação das células MDCK antes da infecção, para um valor entre pH 6,6 e pH 7,8, e preferencialmente para um valor entre pH 7,2 e pH 7,3. A cultura das células MDCK antes da infecção ocorre preferencialmente a uma temperatura entre 30° e 40°C, e de forma especialmente vantajosa a uma temperatura entre 33° e 37°C. A pressão parcial do oxigénio é ajustada durante a cultura antes da infecção de forma vantajosa para um valor entre 25% e 95%, e preferencialmente para um valor entre 35% e 60%. Os valores indicados, no âmbito da invenção, para a pressão parcial do oxigénio baseiam-se na saturação do ar.
Para o processo, de acordo com a invenção, comprovou-se ser vantajoso que a infecção das células MDCK ocorresse numa densidade celular de preferencialmente cerca de 8-25 x 105 células/ml em sistema de batch. As células podem ser infectadas no processo de acordo com a invenção, com uma dose virai (valor m.o.i., "multiplicity of infection"; corresponde ao número de unidades de virus por célula no momento da infecção) entre IO"8 e 10, preferencialmente entre 0,0001 e 0,5. A cultura das células MDCK, após a infecção, pode ocorrer através de sistema de perfusão, de batch ou de fed-batch. 14
Aqui podem utilizar-se as mesmas condições de cultura tal como anteriormente (temperatura entre 30 e 40°C, pressão parcial de oxigénio entre 5 e 100%, valor de pH do meio entre pH 6,6 e pH 7,8) .
De acordo com outra forma de execução preferencial da presente invenção, durante a cultura das células MDCK infectadas, o meio de cultura foi trocado por meio de cultura fresco ou o volume da cultura foi aumentado através da adição de um meio de cultura fresco. A substituição e o complemento do meio de cultura pode também ocorrer através de concentrado do meio ou ingredientes do meio como, por exemplo, aminoácidos, vitaminas, fracção de lipidos, fosfatos, ou substâncias semelhantes. Estes passos podem também ser efectuados várias vezes durante a cultura das células MDCK.
Surpreendentemente, o crescimento das células MDCK não é significativamente inibido através da multiplicação de diversos sistemas de vírus. Especialmente na multiplicação da hepatite A, rhabdovírus e flavivírus (encefalite primavera-verão russa), observou-se um crescimento forte de células MDCK e dos vírus durante a cultura.
Isto possibilita o aumento da produção de vírus através de colheitas repetidas de vírus de sobrenadantes de culturas e especialmente através do aumento de todo o volume de cultura e assim a contagem de células através da adição de meio fresco.
De forma correspondente, as colheitas múltiplas apresentam uma vantagem significativa do método de acordo com a invenção uma vez que a produção do sistema é significativamente melhorada.
Os métodos, de acordo com a invenção, possibilitam assim, pela primeira vez, a multiplicação dos vírus e das células num sistema de cultura ao longo de um maior período de tempo. Assim 15 conseguiu mostrar-se, em alguns exemplos, que as células ainda estavam viáveis mesmo 28 dias após a infecção. A duração da multiplicação dos virus e das células é assim seleccionável entre uma vasta gama através das condições da cultura de células (adição de meio).
De acordo com a invenção são ainda disponibilizados métodos que abrangem uma colheita e isolamento dos virus ou das proteínas por estes geradas. No isolamento de vírus ou proteínas, as células são separadas do meio de cultura através de métodos padrão como, por exemplo, por separação, filtração ou ultrafiltração. Em seguida, os vírus ou proteínas são concentrados de acordo com processos suficientemente conhecidos para um perito da especialidade como, por exemplo, centrifugação de gradientes, filtração, precipitação, cromatografia, entre outros, e depois purificados. De acordo com a invenção é ainda preferencial que os vírus sejam inactivados durante ou após a purificação. Uma desactivação dos vírus pode ocorrer, por exemplo, através de β-Propiolactona ou formaldeído, em qualquer altura durante o processo de purificação.
Os métodos, de acordo com a invenção, são assim especialmente adequados ao fabrico de vacinas. A produção da vacina pode assim abranger a multiplicação e isolamento de um vírus ou da proteína por este gerada e a mistura com um adjuvante, substância auxiliar, tampão, diluente e/ou excipiente. Por adjuvantes, no âmbito da presente invenção, entendem-se substâncias que aumentam a resposta imunológica. Entre estas contam-se, por exemplo, os hidróxidos de diversos metais, como hidróxido de alumínio, componentes da parede celular bacteriana, óleos ou saponinas. As vacinas são especialmente 16 adequadas para tratamentos profilácticos ou terapêuticos de infecções virais. A propriedade imunogénica e/ou eficácia das vacinas respectivas pode ser determinada por métodos conhecidos para um perito na especialidade, como por exemplo, experiências de protecçao com infecção por carga ou determinação da titulação de anticorpos necessária para a neutralização. A determinação da quantidade de virus e da quantidade de anticorpos produzidos pode ocorrer, por exemplo, através da determinação da titulação ou quantidade de antigénios de acordo com métodos padrão suficientemente conhecidos para um perito da especialidade, como, por exemplo, titulação de virus, teste de hemaglutinação, determinação de antigénios ou determinação de proteínas dos mais diversos tipos.
Nos seguintes exemplos todas as titulações de vírus foram determinadas de acordo com métodos de diluição final conhecidos para um perito da especialidade e determinação de ponto final estatística de 50% de acordo com Spearman-Kaerber (ver. Horzinek, Kompendium der allgemeinen Virologie, 2a edição, 1985, Parey Verlag, páginas 22-33) . Foram infectadas 8 culturas de teste em placas de microtitulação com quantidades de 100 μΐ de uma diluição de vírus, em que se utilizaram diluições do material de vírus de 10”1 a 10”8. A avaliação das titulações de vírus ocorreu quer de forma microscopia com a ajuda do efeito citofástico das culturas de teste quer com a ajuda de métodos de detecção imunológicos mediante utilização de anti-corpos específicos do vírus. A ligação dos anticorpos específicos do vírus foi tornada visível sob a forma de imunofluorescência com anticorpos marcados com fluoresceína ou com a utilização de anticorpos secundários marcados com biotina e um complexo intensificador de 17 streptavidina/biotina/peroxidase bem como um corante precipitável (Gregersen et al., Med. Microbiol. Immunol., 177: 91-100). A unidade de titulação do virus é a dose infecciosa da cultura de 50% (DIC50) . As células de detecção e, caso se aplique, os processos de detecção imunológica específicos de vírus utilizados para as diversas espécies de vírus estão referidos nos exemplos específicos dos vírus.
Exemplos
Exemplo 1: Manuseamento do sistema de cultura de células sob a forma de cultura em suspensão nas fases de trabalho iniciais e à escala reduzida
As células MDCK de ampolas de células de semente, que são armazenadas em nitrogénio liquido, foram rapidamente descongeladas por imersão num banho de água e foram imediatamente diluídas num meio de cultura (Ultra CHO com suplemento, BioWhittaker, "meio padrão") para uma contagem de células de cerca de 1 x 105 células/ml em regra cerca de 1:100. Em seguida, as células foram separadas por centrifugação (10 minutos a 800 x g) do meio, novamente colocadas em meio fresco e cheias em frascos de cultura spinner (100 ml volume de trabalho, Bellco ou Techne). Estes lotes de culturas foram incubados a 37°C num agitador magnético com 50-60 rotações/minuto. O crescimento da célula foi monitorizado controlando a contagem de células. Atingindo contagens de células de 8 x 105 até ao máximo de 1,6 x 106 células/ml, as culturas foram transferidas por diluição das células em meio padrão fresco, e semeando em novos frascos de cultura Spinner de 100 a 1000 ml de volume de trabalho, e incubando até obtenção da densidade celular máxima ou desejada, 18 sob agitação tal como descrito acima. Nestas passagens de células, a diluição da cultura respectiva, no intervalo entre 1:4 e 1:10, foi adaptada ao tipo de crescimento da célula, de forma a que a contagem máxima de células foi atingida, conforme pretendido, dentro de 3 a 5 dias. Em alternativa, foi experimentado o mesmo tipo de cultivo de células sem adição de suplementos ao meio e foi mantido sem qualquer problema durante mais de 10 passagens, pelo menos.
Exemplo 2: Manuseamento do sistema de cultura de células sob a forma de cultura aderente
As culturas em suspensão estabelecidas (ver exemplo 1) foram diluidas em diversos meios, de forma que a contagem de células foi de cerca de 1 x 105 células/ml e, em seguida, foram colocadas nos mais diversos recipientes de cultura de células (ver tabela 1) . O volume da cultura de células correspondia na altura às quantidades habituais para os recipientes de cultura respectivos, ou seja, cerca de 4 mm de meio de cultura acima da superfície de sementeira ou cerca de 1 ml de meio por 2,5 cm2 de superfície de cultura. As culturas foram em regra incubadas à temperatura habitual de 37°C para a maioria das culturas de células, contudo foram também possíveis desvios significativos da temperatura de incubação sem perdas significativas (ver tabela 1) . Os sistemas de cultura comprovados bem como os resultados com eles obtidos de crescimento celular encontram-se representados na tabela 1 e mostram, como este sistema celular se comporta de forma semelhante e consistente em diversos meios e sistemas de cultura.
As culturas Monolayer, produzidas desta forma, foram utilizadas para a titulação de colheitas de vírus em placas de microtitulação, bem para como a propagação de vírus sob controlo 19 microscópico ou para investigação de imunofluorescência, ensaios de hemadsorção e outros métodos Standard virológicos ou imunológicos, que são executados de forma melhor em culturas aderentes de uma camada do que em culturas de suspensão. Além disso, essas culturas foram especialmente adequadas à recuperação de estirpes de virus puras através da purificação em placas ou diluição. Por fim, as culturas aderentes foram também utilizadas para multiplicação de virus em pequena e grande escala; as quantidades maiores são feitas preferencialmente em frascos rotativos.
Tabela 1: Crescimento das células em diferentes sistemas de cultura aderentes
Sistema de cultura de células Sementeira de células (x 105 células/ ml) Meios utilizados Aditivos utilizados Incubação* cultura confluente após... dias (8-20 X 105 células/ml) Frascos de cultura em plástico 0,8-1,0 MEM, EDM, Opti-MEM*, Ultra CHO* 1-5% FCS ou Sup.* 33 ou 37°C 4-5 Frascos de cultura em plástico 2,0 MEM, EDM, Opti-MEM*, Ultra CHO*, 1-5% FCS ou Sup.* 33 ou 37°C 2-3 Placas de microtitulação 2,0-4,0 MEM, EDM, Opti-MEM*, Ultra CHO* 0,5-3% FCS ou Supl.* 33 ou 37°C 1-2 Placas de microtitulação 2,0-4,0 MEM, EDM, Opti-MEM*, Ultra CHO* 1% FCS durante 1 dia, e depois em utilizados 37 °C 1 Frascos rotativos 1,0 EDM, Opti-MEM*, Ultra CHO*, 0,5-3% FCS ou Sup.* 33 ou 37°C 4-5 Frascos rotativos 1,0 EDM, Opti-MEM*, Ultra CHO*, 1% FCS ou Sup. * durante 3 dias, e depois sem utilizados 33 ou 37°C 5-7 Spinner + 2,0 BME MEM EDM 0,5-3% FCS 33 ou 37°C 5-7 20
Microportador ou Sup.* BME: Meio basal de Eagle; Suplemento de bicarbonato (2-2,5% de uma solução de reserva 5%) MEM: Meio Mínimo Essencial; Suplemento de bicarbonato (2-2,5% de uma solução de reserva 5%) EDM: Meio Dulbecco modificado por Eagle; Suplemento de bicarbonato (2-2,5% de uma solução de reserva 5%)
FCS: Soro fetal de vitelo Sup.: Suplemento Ultra CHO #): valores regulados; valores efectivamente medidos com desvios de +2°C e -3°C *): Fabricante: Bio-Whittaker
Exemplo 3: Isolamento de vírus, ganho e fabrico de preparados de vírus semente
Os isolados primários como, por exemplo, amostras de órgãos, tecidos ou líquido tecidular contendo vírus, colheita de exsudado faríngeo ou amostras de fezes foram suspensos em banho de gelo em meio padrão (são igualmente possíveis outros meios ou tampão fosfato) com adição de antibiótico (PSN: 100 unidades/ml de penicilina, 100 yg/ml de streptomicina, 50 Pg/ml de neomicina) e, se necessário, homogeneizados (finamente fragmentados com auxílio de almofarizes, lâminas cirúrgicas ou um denominado homogeneizador "Douncer" ou "Potter"). A suspensão obtida foi filtrada com a ajuda de um filtro de seringa comum de laboratório com um tamanho de poro de 0,45 ym (para isolamento de vírus pequenos e não revestidos também 0,2 ym) . O filtrado foi Λ inoculado em pequenos frascos de cultura (25 cm , ver exemplo 2) com meio de cultura fresco e adição de antibiótico. Para aumentar a produção, foram previstas diversas culturas com uma inoculação de, por exemplo, 100 yl a 1 ml e seguidamente incubadas a 37°C. Para isolados de vírus provenientes das vias respiratórias superiores aconselha-se preparar culturas adicionais numa temperatura de incubação mais baixa de 33°C. 21
Os isolados de vírus puros já multiplicados em cultura foram aplicados para infecção directamente no sistema de cultura, de acordo com a invenção, de acordo com o exemplo 1 ou 2. Uma vez que aqui, em reqra, se pode prever um maior teor de vírus do preparado de vírus, foram utilizadas pequenas quantidades de inoculação de 100 μΐ ou inferiores. Para as primeiras infecções desse tipo no sistema de cultura, de acordo com a invenção, foi preferencial uma MOI (multiplicity of infection) de 0,1 e 0,01; no caso de um resultado insatisfatório a infecção foi repetida com MOIs em níveis decrescentes de 10 desde 10 a 0, 0001.
As culturas infectadas foram em seguida investigadas diariamente ao microscópio para ver se havia danos nas células relacionados com o vírus (CPE, efeito citopático) e comparadas com as culturas de controlo. Em alternativa, no caso de vírus, que não provocam CPE, a cultura foi investigada quanto à presença de determinados antigénios de vírus ou respectivos genes (por exemplo, testes de HA específicos consoante o tipo de vírus; ELISA, PCR). Passados 3 a 4 dias ou após uma descoberta positiva (encolhimento de células, morte de células, arredondamento e dissolução da camada simples de células em culturas aderentes, formação em placas) foram congelados sobrenadantes de culturas centrifugados e isentos de células e, por outro lado, no caso de descobertas negativas ou duvidosas, toda a cultura foi ajustada com meio fresco para uma contagem de células de 1 x 105 (diluição das culturas em suspensão ou tratamento com tripsina das culturas aderentes com posterior diluição das células isoladas) e posteriormente incubada distribuída em novas culturas. Uma vez que isto, na maior parte dos meios, correspondeu a uma diluição das culturas de 1:4 bis 1:20, para se evitar uma multiplicação logarítmica do número de culturas, foi mantida, o mais tardar 22 após a segunda passagem de cultura do mesmo tipo, apenas uma parte das culturas possíveis. Após 3 a 4 passagens conseguiu-se em regra, partindo de material inicial contendo vírus, isolar e detectar, com sucesso, os isolados de vírus.
Para a maior parte dos tipos de vírus, consoante o teor de vírus e a qualidade do material inicial, passados 2 a 7 dias de incubação, determinou-se CPE relativo ao vírus (ver também exemplos específicos dos vírus). Alguns tipos de vírus multiplicam-se contudo de forma muito lenta ou não exibem CPE e devem por isso ser detectados através de passagens e tempos de incubação prolongados ou testes específicos (os métodos necessários encontram-se nos exemplos específicos dos vírus). Como exemplo de um vírus sem CPE com multiplicação lenta, que necessita ainda de um sistema de detecção especial, refere-se o exemplo especial do vírus da hepatite A. 0 teste de detecção aqui descrito adequa-se, mediante utilização de anti-soros correspondentes, igualmente para detecção de outros vírus, especialmente os que não têm CPE específico. 0 mais sensato é continuar a utilizar um novo vírus isolado apenas depois de se efectuar a terceira purificação ou preparação em placas de um isolado puro através da técnica denominada "diluição limitada". Para saber os métodos necessários para este efeito que correspondem ao estado da técnia, consulte os manuais vigentes (ver por exemplo, Mahy: Virology - A practical approach; IRL Press, Oxford, 1985).
Se os preparados de vírus adequados estiverem agora disponíveis a partir de um isolado primário ou como estirpe estabelecida, estes serão seguidamente utilizados para infecção de culturas spinner para se ganhar um vírus semente homogéneo para efeitos de produção. Sem limitar assim o objecto da 23 invenção, aconselha-se a efectuar primeiramente uma primeira infecção em pequenas culturas spinner com 100 ml de meio de cultura com MOIs de 10 a 0,00001, preferencialmente 0,1 a 0,0001. As condições mais favoráveis (especialmente no que respeita a MOIs e tempos de colheita) para obtenção de titulações e produções de virus rápidas e elevadas foram seleccionadas, de forma a criar um virus semente num sistema de cultura do tamanho necessário numa posterior passaqem de virus, consoante a escala de produção prevista e número de processos de produção. Consoante as produções de virus obtidas e as qrandezas de produção previstas, a escala desta passaqem de virus semente poderia ser de algumas culturas Spinner até uma escala até 1000 ml até pequenos fermentadores até cerca de 10 litros de volume ou mais. 0 virus colhido foi libertado, através de filtração ou centrifugação, de eventuais restos de células e aliquotado em pequenas quantidades adequadas à produção e armazenado a temperaturas preferencialmente abaixo de -70°C.
Exemplo 4: Manuseamento do sistema sob a forma de cultura de microportador aderente para efeitos de produção A propagação das células MDCK aderentes ocorreu em frascos rotativos de acordo com o exemplo 2, tabela 1 com BME mais 3% de soro fetal de vitelo (FCS). Após propagação neste sistema, as células foram separadas da superfície dos frascos rotativos. Isto acontece de forma enzimática com a ajuda de uma solução de tripsina apropriada, com processos conhecidos para um perito na especialidade. Em alternativa, as células de suspensão do exemplo 1 foram propagadas em culturas de spinner e directamente utilizadas para popular os microportadores. 24 0 fermentador de produção foi cheio com microportadores do tipo Cytodex 3 (Pharmacia). Os microportadores (peso especifico 5 g/1) foram autoclavados e condicionados com meio nutriente. 0 método garantiu uma adesão das células à superfície dos microportadores. As células ganhas da forma acima descrita foram inseridas no sistema de produção, de forma a que a densidade celular foi de 1 x 105 células/ml. As células aderiram aos microportadores e foram cultivadas até à confluência ou até atingirem uma densidade celular de 3 x 106 células/ml.
Após a fase de propagação das células o meio nutriente existente foi substituído por um meio nutriente fresco. Acrescentaram-se ainda meios nutrientes isentos de proteínas. Foram efectuados 2 ciclos de lavagem.
Um ciclo de lavagem consistiu em desligar o agitador, depositar o microportador, retirar os meios nutrientes consumidos, adicionar meio nutriente fresco e voltar a suspender o microportador.
Depois do passo de lavagem, a cultura de células foi misturada com tripsina (2,5 mg/1).
Em seguida ocorreu a infecção da cultura de células com vírus semente. Este vírus semente foi obtido e aplicado de acordo com o exemplo 3. A MOI era assim específica do vírus e foi entre 0,1 e 0,000001 preferencialmente entre 0,01 a 0,0001. Após terminada a fase de infecção, cuja duração foi determinada por um lado pelo vírus específico (ver exemplos específicos), por outro lado também pela MOI, o agitador parou e os microportadores sedimentaram. O sobrenadante contendo vírus foi retirado e limpo dos restos de células através de processos de separação adequados. Para separação das células utilizou-se centrifugadores 25 ou separadores, filtros e sistemas de filtração de corrente transversal habituais conhecidos para um perito da especialidade.
Exemplo 5: Manuseamento do sistema sob a forma de cultura em suspensão até volumes de produção numa escala de 1000 1 mediante utilização de um meio isento de soro A propagação de culturas em suspensão para um volume de produção de 1000 1 ocorreu com a ajuda de frascos Spinner (Firma Techne) em pequena escala até 1000 ml do volume de cultura (ver exemplo 1). A densidade celular na altura da aplicação do Spinner foi de 1 x 105 células/ml. As células foram cultivadas no método de batch e transferidas a uma densidade celular de 1 x 106 células/ml através de diluição simples em meio fresco numa proporção de 1:10. Como meio, para a propagação de células, foi
utilizado um meio isento de soro (UltraCHO, BioWhittaker). A partir de um volume de 10 1 foram utilizados os fermentadores agitados (30 rotações do agitador por minuto) com ventilação e controlo permanente da temperatura (temperatura de regulação de 37°C para a propagação de células), valor de pH (intervalo de regulação 7,1 a 7,3) e pressão parcial de oxigénio (45 a 55% pCb) (detalhes técnicos como na tabela 2) . Segundo uma proporção de transferência de 1:10 os volumes de Scale-up foram de 10 L, 100 L, 1000 L. Os fermentadores atingem, numa densidade celular inicial de 1 x 105 células/mL a densidade celular final de 1 x 106 células/mL num período de tempo de 3 a 4 dias. Na escala de 1000 L foi adicionalmente efectuado um fed-batch com solução de glucose (100-200 g/L), para aumentar a densidade celular para 3 x 106 células/mL. As produções de células obtidas estão apresentadas na tabela 2 para efeitos comparativos. 26
Exemplo 6: Manuseamento do sistema sob a forma de cultura em suspensão até volumes de produção até um volume de 1000 1 mediante utilização de um meio definido quimicamente. A propagação de culturas em suspensão para um volume de produção de 1000 1 ocorreu tal como descrito no exemplo 5. Como meio, foi utilizado alternativamente um meio definido quimicamente (ProCH04CDM) para a propagação das células. Revelou-se vantajoso efectuar 3 a 5 passagens prévias para adaptação neste meio. As produções de células obtidas estão apresentadas na tabela 2 para efeitos comparativos.
Exemplo 7: Manuseamento do sistema sob a forma de cultura em suspensão até volumes de produção numa escala de 1000 1 mediante utilização de um meio isento de proteína A propagação de culturas em suspensão para um volume de produção de 1000 1 ocorreu tal como descrito no exemplo 5. Como meio, foi utilizado um meio isento de proteína (SMIF7, Life Technologies) para a propagação das células. Revelou-se vantajoso efectuar 5 a 10 passagens prévias para adaptação neste meio.
As produções de células obtidas estão apresentadas na tabela 2 para efeitos comparativos. 27
Tabela 2: Propagação de células (MDCK 33016) para escala de produção em fermentador mediante utilização de diversos processos e meios
N. 0 Processo Meio N/T/pOVpH Xo X 1 Batch UltraCHO 30 min"1 37°C 45-55% 7,1-7,3 1 x 10b ml"1 1 x 106 ml"1 2 Fed-Batch UltraCHO 30 min"1 37°C 45-55% 7,1-7,3 1 x 10b ml"1 3,1 x 10b ml'1 3 Batch ProCH04CDM 30 min"1 37°C 45-55% 7,1-7,3 1 x 10b ml"1 1 x 10b ml'1 4 Fed-Batch ProCH04CDM 30 min'1 37°C 45-55% 7,1-7,3 1 x 105 ml"1 3,3 x 10b ml'1 5 Batch SMIF7 30 min"1 37°C 45-55% 7,1-7,3 1 x 10b ml"1 1 x 106 ml"1 6 Fed-Batch SMIF7 30 min"1 37°C 45-55% 7,1-7,3 1 x 105 ml"1 3,0 x 10b ml'1 X0: Densidade celular inicial X: Densidade celular final N/T/p02/pH: Rotações do agitador, temperatura, pressão parcial de oxigénio, valor de pH
Exemplo 8: Manuseamento do sistema na fase de produção em meio isento de soro
Após a propagação de culturas em suspensão até uma escala de produção de acordo com o exemplo 5, as células foram divididas por três fermentadores com o mesmo volume 3 x 1000 1 e cheias com meio fresco. Cada fermentador obteve 1/3 do volume de pré-cultura e 2/3 do volume de meio fresco. Foi utilizado o mesmo meio que na fase de propagação (UltraCHO, BioWhittaker). Depois do enchimento a cultura de células foi misturada com 10 mg/1 de tripsina.
Seguidamente ocorreu a infecção da cultura de células com um virus semente (Influenza B/Harbin/7/94) com uma MOI de 0,001 e posterior incubação sob as mesmas condições de fermentação da propagação de células, contudo a 33°C, durante 96 horas. O sobrenadante contendo células foi em seguida retirado e as células em seguida separadas através de um separador. Ocorreu uma 28 outra fase de filtração através de um filtro de cartucho com um tamanho de poro de 0,45 ym para separação de outras partículas finas.
As colheitas de virus são testadas quanto ao seu teor de virus com a ajuda de métodos padrão em teste HA com 0,5% de eritrócitos de galinhas e através de titulação de virus em células MDCK aderentes: O teor de HA medido foi de 1024 unidades, a titulação dos virus foi de 108'2 DICso/ml.
Exemplo 9: Manuseamento do sistema na fase de produção em meio quimicamente definido A preparação de células de produção ocorreu tal como descrito no exemplo 8. Como meio fresco utilizou-se contudo um meio definido quimicamente (ProCH04CDM, BioWhittaker). Depois do enchimento a cultura de células foi misturada com 2,5 mg/1 de tripsina. A posterior infecção foi efectuada conforme descrito no exemplo 8. O teor de HA medido foi de 1024 unidades, a titulação dos virus foi de 107'5 DICso/ml.
Exemplo 10: Manuseamento do sistema na fase de produção em meio isento de proteína A preparação de células de produção ocorreu tal como descrito no exemplo 8. Como meio fresco utilizou-se contudo um meio isento de proteína (SMIF7, Life Technologies). Depois do enchimento a cultura de células foi misturada com 2,5 mg/1 de tripsina. A posterior infecção foi efectuada conforme descrito no exemplo 8. O teor de HA medido foi de 1024 unidades, a titulação dos vírus foi de 107'9 DIC50/ml. 29
Exemplo 11: Propagação e infecção com meio quimicamente definido A propagação das células ocorreu, tal como descrito no exemplo 6 e a infecção ocorreu conforme descrito no exemplo 9. Desta forma ocorreu toda a cultura de células desde a propagação até à colheita da infecção, em meio definido quimicamente.
Exemplo 12: Propagação com meio definido quimicamente e infecção em meio isento de proteína A propagação das células ocorreu, tal como descrito no exemplo 6, em meio definido quimicamente e a infecção ocorreu conforme descrito no exemplo 10 em meio isento de proteina.
Exemplo 13: Propagação e infecção em meio isento de proteina A propagação das células ocorreu conforme descrito no exemplo 7. A infecção ocorreu conforme descrito no exemplo 10. Desta forma ocorreu toda a cultura de células desde a propagação até à colheita da infecção, em meio isento de proteina.
Exemplo 14; Descrição geral da purificação do vírus
Depois de terminada a fase de multiplicação dos vírus, a colheita da cultura de células foi filtrada através de um filtro profundo com um tamanho de poro de 0,45 ou 0,5 pm, para separar as células e os fragmentos de células. Em alternativa, esta separação pode ser feita com ajuda de um separador. Os vírus contidos na colheita clarificada foram, em caso de necessidade, concentrados e limpos por ultrafiltração, na qual foi utilizada uma membrana com um limite de exclusão entre 50. 000 e 1.000.000, preferencialmente 100.000 a 500.000. O concentrado de vírus obtido foi carregado numa coluna de cromatografia, cheia com CS 30 (Cellufine, Sulfato, Millipore). Depois de removidas as impurezas através de lavagem com tampão, os vírus foram eluídos com uma solução de sal de cozinha 0,3 a 3 M. 0 eluato foi dessalinizado através de ultrafiltração e posteriormente concentrado. Em alternativa ou em combinação com uma purificação por cromatografia pode obter-se um efeito de purificação adicional através de ultracentrifugação. A maioria dos tipos de vírus pode, acima de tudo, consoante a sua densidade de flutuação, serem purificados por ultracentrifugação num gradiente de sacarose com subsequente fraccionamento do gradiente. Uma inactivação do vírus com formaldeído ou β-propiolacotna pode ocorrer, a qualquer momento dentro do processo de purificação, sendo contudo utilizada preferencialmente após a concentração ou após a aplicação, uma vez que o volume a inactivar está na altura já significativamente reduzido.
Exemplo 15: Ganho de preparados de vírus inactivados, puros para formulação da vacinas
Flavivirus (Vírus da meningoencefalite da primavera-verão, estirpe K 23) foram propagados de acordo com o exemplo 5, 6 e 7 em diversos meios numa dose de inoculação de 0,2 MOI (para mais detalhes, ver exemplo 22). O meio de cultura contendo vírus colhido foi libertado de eventuais restos de células por centrifugação e filtração através de filtros com tamanho de poro de 0,45 ym. Por motivos de segurança, este material já estava inactivado após a filtração, através da adição de β-Propiolactona numa diluição de 1:2000 e 1:2500 e incubação a 2-8°C durante 24 horas. Um teste da cultura de células dos preparados inactivados após a hidrólise da 2a hora do meio de inactivação a 37 °C revelou que até um limite de 31 detecção inferior a 0,03 de unidades infecciosas/ml já não estava disponível qualquer vírus activo.
Para a análise dos passos de limpeza em seguida descritos, utilizou-se para a determinação do teor de proteína total, um ensaio BCA (Pierce). O teor de antigénios específico foi determinado com a ajuda de uma Sandwich ELISA utilizando anticorpos monoclonais específicos contra a glicoproteína E (Niedrig et al., 1994, Acta Virologica 38: 141-149) e um anti- soro policlonal auto fabricado contra um vírus purificado de coelho. Os valores do material inicial inactivado foram utilizados como valor de referência (correspondentemente 100%) .
Purificação por centrifugação de gradientes:
Os preparativos de vírus inactivos foram purificados de acordo com métodos conhecidos através de uma ultracentrifugação de gradientes densos (15-60% sacarose) a 80.000 x g. Em seguida, o gradiente foi fraccionado e em amostras das fracções, foi determinada a extinção a 280 nm para identificação do pico do vírus. Um forte aumento da extinção foi determinado na gama de uma concentração de sacarose entre 30 e 40%, o máximo foi entre 34 e 35%. Nesta gama foi também medido o teor mais elevado de proteína de vírus específica e a mais elevada pureza (determinada como a proporção de proteína do vírus em relação à proteína total). No total foram determinadas, nestas fracções de pico, mais de 50% do teor de antigénio específico determinado no material inicial.
Purificação por cromatografia:
Os preparados de vírus inactivos (ver em cima) foram colocados numa coluna CS, a qual foi equilibrada anteriormente 32 com 5 volumes de colunas de 50 mM de tampão fosfato, pH 7,5 . Em seguida foi lavado com 10 volumes de coluna de tampão fosfato para remover o material não agregado. O material agregado foi em seguida eluido com o mesmo tampão fosfato sob mistura escalonada de quantidades crescentes do mesmo tampão com adição de 3 M NaCl. Na aplicação do material de virus foram recuperados analiticamente no fluxo entre 3,2 e 3,9% do antigénio especifico e 79 a 83% da proteina total. No tampão de lavagem encontrou-se 6-11% da proteina total e 0-2,3% do antigénio. Mais de 95% do antigénio estava assim agregado ao material da coluna. No caso da eluição com 0,6 a 1,8 M NaCl recuperou-se novamente cerca de 60,0% do antigénio, a maior pureza obteve-se com uma eluição de 1,2 M NaCl. Concentrações de sal mais elevadas até 3 M NaCl eluiram outras quantidades mais reduzidas (< 15%) de antigénio com pureza especifica mais reduzida.
Purificação por combinação de cromatografia e ultracentrifugação
Os eluatos combinados após eluição de 0,6 e 1,2 M NaCl a partir de uma purificação por cromatografia, tal como acima descrito, foram submetidos a ultracentrifugação durante 2,5 horas a 80.000 x g. O pellet do virus foi resuspenso e analisado em 50mM de tampão fosfato pH 7,5. A concentração total de proteínas deste preparado foi reduzida a 0,7% do teor inicial, o grau de pureza foi aumentado dez vezes devido a este passo.
Esta preparação de virus foi submetida a uma purificação de gradientes tal como descrito acima. Após o fraccionamento descobriu-se um perfil de gradientes muito semelhante tal como foi obtido após purificação directa de gradientes. O pico do virus desviou-se ligeiramente e estava agora a 37% de sacarose. 33
Exemplo 16; Recuperação de um isolado de vírus e multiplicação de vírus de um vírus de herpes humano
Através da punção estéril da eflorescência do herpes fresco em fase de bolha (bolhas do herpes labial) com uma seringa de tuberculina, obteve-se uma quantidade mínima de líquido tecidular e, de acordo com o exemplo 3, foi suspensa em meio padrão com adição de antibiótico e filtrada com um filtro com tamanho de poro de 0,45 Pm. O filtrado foi inoculado num frasco de cultura com 25 cm2 de superfície de cultura com células MDCK 33016 aderentes num meio padrão e incubado a 37°C. Passados 4 dias, foram retiradas amostras dos sobrenadantes e passados 7 dias foi retirado todo o sobrenadante das culturas e congelado a menos de -70°C. Uma amostra retirada passados 4 dias foi diluída a 1:10 e depois em passos de 10, em meio padrão contendo 10 yg/ml de tripsina; 100 μΐ destas diluições foi adicionado às células MDCK 33016 num meio padrão. Passados 13 dias de incubação a 37°C descobriu-se CPE em algumas culturas do primeiro nível de diluição. Os sobrenadantes destas culturas foram colhidos e novamente diluídos inoculados em novas culturas. Passados 6 a 9 dias descobriu-se, em diversas fases de diluição desta terceira passagem de vírus, um CPE mais visível sob a forma de placas típicas de vírus do herpes. Uma cultura que foi directamente infectada em paralelo com o mesmo material inicial com 175cm2 de superfície de cultura mostrou exclusivamente as mesmas placas típicas. Para posterior clonagem do vírus este processo de diluição foi novamente repetido em que se utilizaram sobrenadantes das culturas de células da última diluição positiva. Além de uma colheita dos sobrenadantes de culturas, as células restantes foram fixadas com 3% de solução de formaldeído durante 16 horas, em seguida incubadas com 1% Triton 34 X-100 durante 30 minutos e, em seguida, submetida ama investigação de imunofluorescência de acordo com os métodos Standard com anticorpos monoclonais específicos, marcados com FITC contra HSV-1 (Número de produto Biosoft 7-088) . Revelou-se que apenas as células nas proximidades da placa apresentavam imunofluorescência. Através desta demonstração, bem como através de uma detecção de PCR específica, o isolado foi claramente identificado como vírus do herpes simples 1. O vírus clonado foi posteriormente multiplicado em meio padrão em culturas em suspensão e feito crescer com uma titulação de vírus suficiente (>106 unidades infecciosas/ml), como descrito no exemplo 3, para produção de vírus semente. Os preparados de vírus semente continham regularmente titulações de vírus entre 107 e 108 DICso/ml. A determinação da titulação de vírus ocorreu de acordo com métodos Standard conhecidos para um perito da especialidade em células HEP-2 ou Vero, mas pode também ocorrer em células MDCK aderentes em que a avaliação das titulações é efectuada com a ajuda da placa típica. Os preparados de vírus semente foram aliquotados a -70°C ou congelados abaixo deste valor e aplicados para infecção das células de produção. A possibilidade da utilização das mesmas células MDCK e as mesmas condições de cultura relativamente a meios e aditivos como para a posterior produção é assim significativamente vantajosa, uma vez que a exigência de documentação durante a autorização do produto correspondente é significativamente reduzida e a aceitação do vírus semente é melhorada.
Exemplo 17; Produção de vírus do herpes humano
Para infecção das células de produção de acordo com os exemplos 8 a 13 com vírus do herpes simples 1 (Isolado como 35 descrito no exemplo acima), seleccionou-se uma MOI de 0,1 ou 0,01 e um tempo de incubação de 48 a 96 horas até à colheita. Podem, contudo, utilizar-se MOIs menores ou maiores consoante o tempo de incubação é maior ou menor, em que as produções podem variar uma vez que nem sempre se descobre o momento de colheita ideal. Em regra preferem-se as condições acima, de forma a que as produções de cultura, por motivos económicos e para facilitar o posterior processamento não ficam significativamente abaixo de 108, 50% de unidades de culturas infecciosas/ml (DICso/ml). Além disto, este esquema de tempo adapta-se de forma favorável em ritmos de trabalho normais. MOIs reduzidas inferiores a 0,0001 e tempos de incubação prolongados levam quase sempre a produções mais reduzidas e não são por isso ideais.
Exemplo 18; Multiplicação de virus do herpes animal O virus do herpes suis (virus da pseudo-raiva), estirpe "Phylaxia" (estirpe vacinai) foi inoculado para infecção de uma cultura de produção em pequena escala em culturas spinner de lOOml de acordo com o exemplo 1. A infecção da cultura de produção ocorreu com uma contagem de células de 1 x 106 células/ml com uma MOI de 0,01/ a colheita do sobrenadantes de cultura infecciosa ocorreu após um tempo de incubação de 3 a 5 dias a 37°C ou a 33°C. As produções esperadas ficaram dentro do intervalo ou significativamente acima de 108 unidades infecciosas/ml . Conseguiu-se obter titulações comparativamente elevadas com temperaturas de incubação diferentes: - após 3 dias a 37 °C: 108'7 DICso/ml, - após 3 dias a 33 °C: 108'6 DICso/ml, - após 5 dias a 37 °C: 107'9 DICso/ml, - após 5 dias a 37 °C: 108'3 DICso/ml. 36 A titulação dos vírus foi, nestes casos, executada em células CRFK (Crandall feline kidney) e lida após 7 dias utilizando o efeito citopático.
Exemplo 19: Multiplicação de adenovírus animais 0 adenovírus (adenovírus canino 1, CAV-1 estirpe vacinai 269) foi inoculado para infecção de uma cultura de produção em pequena escala em culturas spinner de 100 ml de acordo com o exemplo 1. A infecção da cultura de produção ocorreu numa contagem de células de 1 a 1,5 x 106 células/ml com uma MOI de 0,01, a colheita do sobrenadante de cultura infecciosa após um tempo de incubação de 3 ou 5 dias a 37°C ou a 33°C. Independentemente da temperatura de incubação (33 ou 37°C) e da duração da fase de infecção (3 ou 5 dias) foram descobertas titulações praticamente idênticas de 107'5 ou 107'6 DIC5o/ml nas colheitas. A determinação da produção com base na titulação de vírus ocorreu através da titulação de células aderentes MDCK-33016 em placas de microtitulação (ver exemplo 2) e foi avaliada 7 dias após preparação através de CPE. As culturas infectadas da titulação foram mantidas em meio EME com adição de 2% de bicarbonato (a partir de uma solução de reserva de 5%) , contudo sem adição de soro ou de proteína. Este sistema de titulação revelou-se como um sistema de detecção sensível uma vez que ele continua a multiplicar o adenovírus de forma muito eficiente mesmo em pequenas quantidades diluídas (reconhecível nos valores de titulação obtidos).
Outros lotes de infecções comprovam a superioridade do sistema de cultura em suspensão em relação a uma cultura aderente do mesmo tipo: 37
As culturas MDCK 33016 aderentes foram cultivadas em frascos de cultura Falcon (175 cm2) até confluência da cultura e ao se atingir a mesma, foram infectadas com CAV-1. Para efeitos de infecção foi colocada a mesma quantidade (MOI=0,01) do mesmo preparado de vírus que foi também aplicada para infecção de culturas em suspensão cultivadas de forma paralela.
Ambas as culturas foram cultivadas no mesmo meio (meio padrão) e trocadas, a partir do momento da infecção através de uma troca de meio para um meio isento de suplemento. Ambos os sistemas de cultura foram incubados a 37°C e os sobrenadantes de cultura foram colhidos 5 dias após a infecção. Os sobrenadantes de cultura isentos de células foram titulados, como acima descrito, em células MDCK. A produção de vírus do sistema aderente foi de 106'3 DICso/ml e o do lote de cultura de suspensão foi de 107'8 DIC5o/ml, ou seja cerca de 30 vezes mais.
Exemplo 20: Multiplicação de paramixovírus
De forma praticamente idêntica ao exemplo anterior descrito para o adenovírus, foi utilizado um representante dos paramixovírus (ATCC, estirpe VR-288) . A diferença registou-se no momento da colheita logo após 3 dias, uma vez que este vírus se replica de forma muito rápida o que se verificou também na avaliação da titulação que ocorreu mais cedo, nomeadamente após 5 dias. As culturas que, após a infecção foram incubadas a 37°C, originaram produções de 107'4 DIC50/ml/ as mesmas titulações foram medidas quando, a partir do momento da infecção a temperatura de incubação foi reduzida para 33°C.
Tal como para o adenovírus, as células MDCK 33016 comprovaram ser um sistema de titulação adequado também para o 38 paramixovírus com replicação de vírus eficiente em meio MEM sem adição de soro nem de proteínas (ocorreu também adição de bicarbonato) .
Tal como descrito no exemplo dos adenovírus, foi também aqui efectuada uma comparação directa entre culturas aderentes e de suspensão. A produção máxima em sistemas aderentes foi de 106'6 DIC5o/ml após um tempo de infecção de 96 horas, o sistema de cultura em suspensão originou, comparativamente, produções significativamente melhores e mais rápidas de 107'3 DIC5o/ml após 72 horas.
Em alternativa, as células aderentes MDCK 33016, foram infectadas, de acordo com exemplo 2, em MEM com 5% de FCS com um outro vírus da mesma família (PI-3, ATCC VR-93). Os sobrenadantes, passada uma semana de incubação a 37°C continham, após titulação em células CV-1 (ECACC 87032605) pelo menos 105 DIC5o/ml, exibiam uma hemaglutinação positiva com eritrócitos de cobaia e uma imunofluorescência positiva com anticorpos específicos (anti PI-3 MAK-FITC da firma Biosoft). A mesma estirpe do vírus (PI-3, ATCC VR-93) foi também utilizada para infecção com meios definidos quimicamente e isentos de proteínas, tal como no exemplo 12, em culturas MDCK-33016. Nos dias de infecção 3, 5, 9 e 12 foi retirado 22% do volume da cultura e substituído por meio fresco. No dia 7 foi retirado 50% do volume de cultura incluindo as células e substituído por um meio novo. No total, o volume da cultura, no decorrer da infecção foi substituído completamente mais do que uma vez e através da adição de meio foi dada oportunidade às células de se multiplicarem mais de acordo com a diluição. O processo utilizado corresponde no total a uma passagem aproximada de 1:2,4 da cultura em que foram unicamente removidas as 39 quantidades em excesso. As passagens e diluições de culturas significativamente elevadas especialmente possíveis na fase inicial não foram completamente utilizadas.
Foram medidas as seguintes produções de virus.
Dia da infecção: 3 5 7 9 12 14 log DIC50/ml: 7,9 8,05 8,25 7,45 6,7 7,0 (média de testes c uplicados)
Exemplo 21: Multiplicação de reovírus
Culturas em suspensão das células MDCK 33016 em meio padrão foram infectadas com reovirus tipo 3 (obtém-se na firma Bio Doc, Hannover) a uma MOI de 0,01 e incubadas mais 3 ou 5 dias a 33°C ou 37°C. As amostras dos sobrenadantes de cultura foram colhidas passados 5 e 7 dias e tituladas no sistema fornecido mediante utilização de células BHK em meio MEM com 3% de FCS. A avaliação das titulações ocorreu passados 7 dias.
As produções dos vírus das culturas em suspensão passados 5 dias foram de 108'1 DIC5o/ml a 37°C e de 108'° DIC5o/ml a 33°C. Passados 7 dias, as titulações em ambos os lotes de temperaturas foram de IO8,0 DIC5o/ml. A mesma estirpe do vírus foi utilizada para infecção com meios definidos quimicamente e isentos de proteínas, tal como no exemplo 12, em culturas MDCK-33016 numa MOI de 0,01. Nos dias de infecção 3, 7 e 10 foi retirado 22% do volume da cultura e substituído por meio fresco. No dia 7 foi retirado 50% do volume de cultura incluindo as células e substituído por um meio novo. No total, o volume da cultura, no decorrer da infecção foi substituído quase completamente e através da adição de meio foi dada oportunidade às células de se multiplicarem mais de acordo 40 com a diluição. 0 processo utilizado corresponde no total a uma passagem aproximada de 1:2 da cultura em que foram unicamente removidas as quantidades em excesso. As passagens e diluições de culturas significativamente elevadas especialmente possíveis na fase inicial não foram completamente utilizadas.
Foram medidas as seguintes produções de vírus:
Dia da infecção: 3 7 10 14 log DICso/ml: 5,4 7,1 6, 6 6, 6 (média de testes d uplicados)
Exemplo 22: Multiplicação de flavivírus
As culturas em suspensão da célula MDCK 33016 com uma densidade celular de 1-1,5 x 106 células/ml foram infectadas sob condições Standard (meio padrão, temperatura de cultura e infecção de 37 °C) com o vírus da meningoencefalite da primavera-verão (estirpe K23, Niedrig et al., 1994, Acta Virologica 38: 141-149) . Ao contrário dos exemplos acima foram utilizadas MOIs fortemente variáveis para infecção. Além disso as culturas de infecção foram parcialmente mantidas num meio quimicamente definido ou num meio sem aditivos contendo proteínas. Foram utilizados diversos processos de cultura e colheita que mostram, por exemplo, que mesmo alterando diversos parâmetros, se podem obter elevadas produções com o sistema e que são ainda possíveis colheitas múltiplas. Estas alterações estão resumidas na tabela 3. A titulação dos vírus ocorreu em células A 549 (ECACC N.° 86012804) e foi avaliada passados 5 dias com base na CPE. É digno de nota o facto de a colheita repetida da mesma cultura ser acompanhada da mudança do meio de cultura de forma a que as células, em cada colheita, receberam meio novo e puderam assim 41 crescer mais. Sem estas colheitas, a cultura não permaneceria viável e produtiva durante um período prolongado. Uma vez que as trocas frequentes de meio em intervalos curtos não possibilitavam a compensação do elevado rendimento metabólico das culturas, ocorreram suplementos de meio adicionais e aumento das culturas passados 4 ou 5 dias do momento da infecção.
Tabela 3: Multiplicação de vírus da encefalite primavera-verão russa/K23 em culturas MDCK 33016 em meio padrão e em meios alternativos utilizando diferentes MOI e variantes de colheitas MOI Produção (log 10 DIC50/ml) com colheita passados. ..dias Meio 1 2 3 4 5 6 7 8 Meio utilizado Lotes com colheitas múltiplas com troca total do mei o: 2, 0 9, 0 8, 8 8, 8 Meio padrão 2, 0 9, 0 (M- 8,4 Meio padrão +30)+ 2, 0 6,1 (M+30) 6,1 Meio isento de proteína 0,2 7,8 (M+30) 7,8 Meio definido quimicamente 0,2 8, 7 8,0 7, 7 Meio padrão 0,2 8,3 (M+30 ) 8, 6 Meio padrão 0,2 9, 0 (M+30) 9, 0 Meio padrão 0,2 8, 6 9,2 9, 0 Meio padrão 0,2 9, 0 9,0 8, 6 Meio padrão 0,2 7,3 (M+30) 8,2 Meio isento de proteína 0,2 7,2 (M+30) 8, 6 Meio definido quimicamente Lotes com amostragem sem troca de meio nem suplementação 10~°'3 1,1 8,3 9,2 9 9,3 Meio padrão (=-0,5) f 4 42 continuação 10-°'3 6,3 7,5 8,4 8 8,9 Meio MEM, cultura / aderente, 1% FCS 6 10-1'3 5,2 6,3 6, 6 6 6,8 Meio padrão, ί r Temperatura ο, 05) 8 ultrapassada pelo agitador 10-1'3 5,1 6,2 7,1 8 8,4 Meio padrão r 0 10-2,3 4,8 6,2 7,6 7 8,1 Meio padrão r 5 10~3'3 3,4 4, 7 4, 9 5 6, 0 Meio padrão r 6 10~4’3 2, 7 3, 7 4,3 4 4,4 Meio padrão r 3 10-5'3 2,5 2, 6 3,4 3 4,3 Meio padrão 7 +> (M+30) significa suplementação de meio +30% do volume de cultura no dia indicado
Exemplo 23: Multiplicação de picornavírus
As culturas aderentes MDCK-33016 foram cultivadas para infecção com o vírus da hepatite A (HAV, estirpe HM 175, ATCC VR-1358) em meio MEM com adição de 5% de soro fetal de vitelo e bicarbonato (ver exemplo 2) . No âmbito da experiência foi ainda utilizado um outro isolado de vírus "Munique" (ver Frõsner et al. 1979; Infection 7: 303-305). O vírus foi diluído e inoculado na 43 cultura preparada de fresco e as culturas foram incubadas a 37°C. Em turnos alternados de 3 a 4 dias as culturas foram submetidas a posterior passagem de 1:4.
Culturas de suspensão de células MDCK-33016 foram cultivadas em meio padrão de acordo com o exemplo 1, e inoculadas com HM 175 e incubadas a 33°C e em seguida submetidas a passagem 1:10 semanalmente. As células aderentes e as culturas em suspensão foram mantidas após a infecção até 35 dias. Em seguida ocorreu a detecção da réplica do virus activa com a ajuda do CPE (estirpe HM 175), ou de acordo com um método já descrito (ver titulação de virus, página 93 em Gregersen et al. 1988; Med. Microbiol. Immunol. 177: 91-100). Como desvio, foi utilizado um anticorpo humano anti-HAV como anticorpo especifico do virus como IgG purificado (designação F 86012, gentilmente fornecido pela Dade Behring). Como anticorpo IgG anti-humano marcado com biotina utilizou-se o produto N°.39015 (Firma Sigma). A detecção especifica da multiplicação do virus activo com este sistema forneceu células de cor rosa acastanhado que são fáceis de identificar com uma ampliação reduzida do microscópio. As células com virus negativo por seu lado, não tinham cor ou apenas tinham um leve colorido. Com os mesmos métodos de detecção foram também avaliadas titulações de virus, três semanas após a preparação, para células diplóides humanas (MRC-5) como sistema de cultura.
Em todos os lotes de infecções descritos acima e com ambos os isolados de virus utilizados pode detectar-se uma replicação de HAV activa nas células MDCK. Nas culturas em suspensão, com a estirpe HM175 detectou-se uma multiplicação de virus surpreendentemente rápida. No dia 7 após a infecção, a titulação de virus medida no sobrenadante era de 105'4 DIC50/ml; esta cultura foi passada 1:10 semanalmente através de diluição simples 44 e produziu titulações de virus semelhantes, nas culturas dai resultantes, novamente passados outros 7 dias. No fim do cultivo e após mais duas passagens de células, as titulações de virus foram determinadas numa amostra do meio isento de células. Adicionalmente foi colhida uma amostra da cultura total e as células ai contidas foram decompostas através de uma segunda congelação a -20°C e descongelação. Os componentes das células foram removidos por centrifugação antes destas amostras serem tituladas.
As produções de virus obtidas a partir deste lote estão reunidas na tabela 4 e mostram que, sem um efeito adverso nas produções especificas, é possível uma multiplicação semanal das culturas por 10, em que, apesar do aumento massivo de quantidades, se podem colher boas titulações de vírus por unidade de volume. De notar é o facto de se ter encontrado uma proporção significativa de vírus no sobrenadante, o que é surpreendente para este vírus fortemente ligado a células (ver tabela 4).
Tabela 4: Multiplicação do virus da hepatite A (estirpe HM 175) em culturas em suspensão MDCK 33016 com multiplicação e aumento contínuos do volume de cultura.
Dia após infecção Passagem de células (Aumento do volume de cultura) Volumes de colheita relativos (dia 0=1) Produção total de virus (DIC50)em meio após passagem de célula 7 1:10 1 10''4 10'.» 14 1:10 10 LD CO O '—* 109'2 21 1:10 100 n.d n.d. 28 1:10 1000 1010'8 1011'4 35 Fim 10000 1012'b Tõ1^ n.d: não determinado 45
Exemplo 24: Multiplicação de pneumovirus
Culturas aderentes MDCK-33016 em meio MEM com adição de 5% de FCS e bicarbonato (ver exemplo 2) foram utilizadas para infecção com RSV-A humano (estirpe A-2; ATCC VR-1302) . O vírus foi diluído a 1:100 e inoculado na cultura preparada de fresco e a cultura foi depois incubada a 37°C. Passada uma semana, 1 ml do sobrenadante da cultura foi transferido para uma nova cultura e novamente incubado durante 7 dias. O sobrenadante de cultura colhido em células MA-104 (ECACC 85102918) titulado revelou, na avaliação da titulação com CPE, uma titulação de vírus de 105'5 DICso/ml. A estirpe do vírus A-2, ATCC VR-1302 foi utilizada para infecção com meios definidos quimicamente e isentos de proteínas, tal como no exemplo 12, em culturas MDCK-33016. Nos dias de infecção 3, 5, 7, 9 e 12 foi retirado 22% do volume da cultura e substituído por meio fresco. No dia 7 foi retirado 50% do volume de cultura incluindo as células e substituído por um meio novo. No total, o volume da cultura, no decorrer da infecção foi substituído completamente mais do que uma vez e através da adição de meio foi dada oportunidade às células de se multiplicarem mais de acordo com a diluição. O processo utilizado corresponde no total a uma passagem aproximada de 1:2,4 da cultura em que foram unicamente removidas as quantidades em excesso. As passagens e diluições de culturas significativamente elevadas, especialmente possíveis na fase inicial, não foram completamente utilizadas.
Foram medidas as seguintes produções de vírus: 46
Dia da infecção: 3 5 7 9 12 14 log DICso/ml: 7,85 8,5 7,55 6,55 4,45 n. t (média de testes duplicados) n.t: amostras não testadas pois não estéreis A estirpe de vírus RSV-B, ATCC VR-1401 foi testada num lote equivalente. Para a titulação de vírus utilizaram-se aqui células Hep-2 (Sublinha Hep-2 C, gentilmente fornecida pelo Instituto Paul-Ehrlich, anteriormente de Frankfurt) , uma vez que a sincitina típica de vírus se desenvolveu melhor facilitando assim a avaliação.
Foram medidas as seguintes produções de vírus:
Dia da infecção: 3 5 7 9 12 14 Log DIC50/ml: 3,7 4,75 7,45 6,3 3,2 3,75 (média de testes duplicados)
Exemplo 25: Multiplicação de rotavírus
Culturas aderentes MDCK-33016 em meio MEM com adição de 5% de suplemento e bicarbonato (ver exemplo 2) foram utilizadas para infecção com rotavírus de símios SA-11 (ATCC VR-899). O vírus foi inoculado 1:100 na cultura preparada de fresco e esta foi suplementada com tripsina (0,5-10 yg/ml, preferencialmente 5 yg/ml), a cultura foi seguidamente incubada a 37°C. Em turnos alternados de 3 a 4 dias as culturas foram posteriormente passadas a 1:4.
As amostras da cultura após tripsinização foram congeladas três vezes seguidas (-20°C) e novamente descongeladas e depois utilizadas para a titulação de vírus. A titulação de vírus ocorre 47 em células MA-104 (ECACC 85102918). A avaliação da titulação ocorre utilizando o CPE passados 10 dias. As titulações de vírus óptimas, neste vírus e consoante o teor de vírus do material inicial, são obtidas apenas passadas 5 a 10 passagens de células.
Em seguida ocorre a selecção do material inicial para a criação de vírus semente, o qual é preparado de forma análoga ao procedimento previamente descrito no exemplo 3. O vírus semente é utilizado em produção conforme descrito nos exemplos 8, 9 ou 10 em que as concentrações de tripsina aí indicadas são mantidas para os diversos meios.
As amostras da cultura após tripsinização foram congeladas três vezes seguidas (-20°C) e novamente descongeladas e depois utilizadas para a titulação de vírus. A titulação de vírus ocorre em células MA-104 (ECACC 85102918). A avaliação da titulação ocorre utilizando o CPE passados 10 dias. As titulações de virus óptimas, neste vírus e consoante o teor de vírus do material inicial, são obtidas apenas passadas 5 a 10 passagens de células.
Em seguida ocorre a selecção do material inicial para a criação do virus semente, o qual é preparado de forma análoga ao procedimento descrito no exemplo 3. O virus semente é utilizado, em seguida, em produção conforme descrito nos exemplos 8, 9 ou 10, em que as concentrações de tripsina aí indicadas são mantidas para os diversos meios.
Em outras experiências adicionais percorreu-se outro caminho que levou a melhores resultados. Primeiramente, a concentração de tripsina utilizada foi ainda mais optimizada através de testes em células MA-104 e posteriormente ajustada para 8-20 pg/ml. Além disso as concentrações de EDTA entre 1,6 e 4,4 yg/ml (1,6 a 8 pg/ml de tripsina ou 4,4 a 20 yg/ml de tripsina) foram suplementadas. O vírus que resultou destas condições optimizadas 48 foi titulado, tal como acima descrito, contudo com concentração de tripsina aumentada (8 ou 16 yg/ml) e na presença de EDTA e forneceu titulações óptimas logo após 5 dias apenas durante a monitorização de culturas. 0 virus que foi recuperado sob estas condições optimizadas foi inoculado num meio isento de soro, após ajuste da dose infecciosa para uma MOI de 0,1 ou 0,01 em células de suspensão MDCK 33016 (semelhante ao exemplo 5, mas numa escala de 100 ml, 8 yg/ml tripsina, 1,6 yg/ml EDTA). A titulação do virus sobrenadante destas culturas após 1 dia de incubação a 37°C foi de IO6,0 ou 106'1 DICso/ml/ respectivamente e 107'6 ou 10b'4 DIC50/ml respectivamente após 2 dias. No caso de 2 0 yg/ml de tripsina e 4,4 yg/ml EDTA as titulações foram após 1 a 3 dias entre 105'8 e 106'° DICso/ml.
Mais duas passagens com as amostras colhidas no segundo dia indicaram, no caso de uma MOI de 0,01 e 8 yg/ml tripsina/ 1,6 yg/ml EDTA, titulações máximas de 107'5 ou 107'9 DICso/ml, de forma a que ocorreu provavelmente uma determinada adaptação que, contudo, apenas necessitou de poucas passagens de virus nestas culturas.
Exemplo 26: Multiplicação de virus vaccinia
As culturas aderentes MDCK-33016 em meio MEM com adição de 5% FCS e bicarbonato (ver exemplo 2) foram utilizadas para infecção com o virus vaccinia (estirpe WR, ATCC VR-119). O virus é inoculado na cultura preparada de fresco e a cultura é depois incubada a 37°C. Passados 5 dias utiliza-se uma amostra do sobrenadante da cultura colhido para uma titulação de virus.
Culturas de suspensão de células MDCK-33016 são cultivadas em meio padrão, de acordo com exemplo 1, e inoculadas com virus vaccinia numa diluição de 1:1000. Numa posterior incubação da 49 cultura infectada foram retiradas e tituladas amostras a intervalos de 2 dias. A titulação de virus ocorre em células Vero ("WHO Seed", que se obtêm no ECACC). A avaliação da titulação ocorre utilizando o CPE passados 5 dias. Titulações dos virus acima de 106 DIC50/ml foram descobertas numa MOI de 0,01 logo passados 2 a 3 dias.
Exemplo 27: Multiplicação de rhabdovirus
Culturas em suspensão em meio padrão, de acordo com o exemplo 1, foram semeadas em frascos de cultura de células com uma densidade celular de 1 x 106 células por ml de meio. Após o crescimento das culturas foram infectadas duas culturas com uma MOI de 0,01 e uma cultura com uma MOI de 0,001 com um virus da raiva (estirpe Pitman-Moore, estirpe de virus vacinai). As culturas foram incubadas a 37°C e separadas todos os 4 ou 3 dias com tripsina e submetidas a passagens numa proporção de 1:10 (passados 4 dias) ou 1:8 (passados 3 dias) e assim mantidas durante 18 dias (ver tabela 5) . O sucesso da infecção ocorreu a cada passagem. Uma cultura foi prevista com uma solução de formalina de 3,5% e incubada durante três dias à temperatura ambiente, nesta solução, para se obter uma inactivação dos virus. Após remoção da solução de formalina, a cultura foi lavada com PBS e incubada durante 25 minutos com 1% Triton X100 em PBS à temperatura ambiente. Após remoção da solução foi lavada três vezes com PBS e foi aplicado um anticorpo marcado com FITC contra o virus da raiva (50 μΐ diluído a 1:400 de IgG-FITC anti-raiva de coelho, Dade Behring, OSHY 005) . Passados 90 minutos de incubação a 37°C lavou-se novamente com PBS e a cultura foi avaliada sob um microscópio de fluorescência inversa. 50
Em alternativa, segundo métodos padrão, forem efectuadas titulações de vírus dos sobrenadantes de cultura em células MRC-5 que foram igualmente avaliadas através de imunofluorescência após pré-tratamento de formalina/triton. Com base na titulação de vírus obtida com este sistema foi efectuada uma correlação grosseira com as produções nos processos de produção correspondentes mediante utilização de culturas MRC-5 para uma vacina humana autorizada (Rabivac), o que possibilita uma orientação sobre quanto antigénio de vacina existe por ml de colheita de cultura (ver tabela 5).
Passados apenas 4 dias ambos os lotes (MOI 0,01 e 0,001) mostraram resultados positivos e depois um processo de infecção semelhante, na MOI mais reduzida - reconhecível nas titulações de virus que foram inferiores até ao dia 11 em cerca de 1,2 a 0,5 log DIC50 - tornou-se ligeiramente mais lento. A partir da terceira passagem das culturas no dia 11 revelou-se em todas as culturas uma imunofluorescência muito intensa e específica com inicio da destruição celular, que crescia, até no decorrer da 5a passagem no dia 18, uma parte significativa das células ter sido completamente destruída de forma que a infecção terminou. O teor de vírus específico cresceu até ao dia 14 para, em seguida voltar a decrescer na sequência da destruição crescente das células. Os resultados deste processo de infecção estão resumidos na tabela seguinte e mostram, que - medido na multiplicação lenta de vírus de vírus da raiva - se espera uma multiplicação de vírus muito rápida sem adaptação nestas células, em que apesar da multiplicação continuada das células em intervalos regulares e repetidamente se podem colher boas produções de antigénios. 51
Tabela 5: Multiplicação do vírus da raiva em culturas MDCK 33019 com aiimento continuado do volume de cultura
Dia após infecção Passagem das células Volume de cultura relativo Antigénio da da raiva (doses de vacina/ml) 4 1:4 1 não 7 1:3 4 determinado 11 1:4 12 não 14 1:3 36 determinado 18 não se aplica 108 0,2-0,4 0,4-0,5 0,5-0,5
De forma semelhante, o mesmo vírus foi directamente inoculado em culturas de suspensão, de acordo com o exemplo 1, no qual foi adicionalmente utilizada uma MOI de 0,0001. Utilizou-se novamente exclusivamente meio padrão para todo o processo de infecção e as culturas foram igualmente transferidas duas vezes por semana a 1:8 ou a 1:10. A transferência ocorreu através da diluição simples das células em meio fresco e nova sementeira. O sucesso da infecção ocorreu assim apenas com a ajuda de titulações de vírus em células MRC-5 tal como acima descrito. As infecções forneceram em todas as três MOIs, logo passados 4 dias, uma titulação de vírus positiva no sobrenadante da cultura. As titulações de vírus aumentaram após perdas de diluição iniciais após o dia 7 de passagem para passagem e apesar da diluição efectuada repetidamente de forma exponencial, continuaram a aumentar mas não levaram contudo a uma destruição das células em massa nas culturas em suspensão. A infecção ocorreu até à oitava passagem (dia 28 após a infecção) e foi depois interrompida. 52
Amostras de vírus destas infecções foram congeladas como vírus semente e utilizadas para uma nova infecção de culturas de suspensão a começar com 100 ml e igualmente em meio padrão e sob condições de passagem idênticas conforme descrito acima. A MOI foi neste caso reduzida para 0,000025. A infecção foi mantida ao longo de 6 passagens de células (21 dias). Apesar das diluições de passagens massivas, foram medidas titulações de vírus de crescimento lento no final deste curso de infecção, que convertidas, forneciam cerca de 0,3 doses de vacinas por ml de sobrenadante de cultura. Se se continuasse a submeter a passagens todo o volume da cultura e não apenas uma parte do mesmo, poderia ter-se colhido cerca de 500 litros de cultura, após as seis passagens, o que corresponderia a uma produção de vírus de cerca de 150 000 doses de vacinas.
Exemplo 28: Multiplicação de togavírus
Culturas aderentes MDCK-33016 em meio padrão ou em EME com adição de 5% FCS e bicarbonato (ver exemplo 2) foram utilizadas para infecção com o vírus da encefalite japonesa (ATCC VR-343). O vírus foi diluído com uma MOI de 0,1 a 0, 001 e inoculado numa cultura preparada de fresco e a cultura posteriormente incubada a 33°C ou, em alternativa a 37°C. A multiplicarão de vírus activa é determinada com a ajuda de imunofluorescência com anti-soro específico em células fixadas em acetona e dependendo da MOI utilizada foi determinado o momento da presença de antigénios do vírus máxima. A titulação de vírus de colheitas de vírus a partir do sobrenadante ocorreu em células Vero e foi igualmente avaliada com a ajuda da imunofluorescência. Em alternativa à imunofluorescência pode utilizar-se, de forma análoga ao exemplo 23 (multiplicação de picornavírus descrita para vírus da hepatite 53 A) um sistema de avidina-biotina-peroxidase para detecção de vírus e avaliação das titulações.
Lisboa, 29 de Novembro de 2010 54

Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para produção em grande escala de vacinas, caracterizado por: (a) se multiplicar uma cultura em suspensão de MDCK num meio isento de soro, isento de proteinas ou definido quimicamente, em que (i) a multiplicação é efectuada num sistema fed-batch, (ii) o volume da cultura é aumentado através da adição de um meio fresco, e (iii) se obtém um volume de produção de 100-10.000 1, (b) a cultura em suspensão MDCK ser infectada com um virus, (c) os virus se multiplicarem na cultura em suspensão MDCK, e (d) serem isolados os virus ou uma proteína gerada por eles a partir da cultura de células.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizado por os vírus serem inactivados com a utilização de β- Propiolactona.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação N°.l ou N°.2, caracterizado por a multiplicação de células ocorrer antes da infecção num meio definido quimicamente e após a infecção num meio isento de proteínas.
  4. 4. Método, de acordo com as reivindicações N°.l a N°.3, caracterizado por as células MDCK derivarem da linha celular MDCK-33016.
  5. 5. Método, de acordo com as reivindicações N°.l a N°.4, caracterizado por o vírus se tratar de um vírus ssADN, dsADN, ARN(+), ARN(-) ou dsARN. 1
  6. 6. Método, de acordo com as reivindicações N°.l a N°.5, caracterizado por o vírus ser seleccionado a partir de adenovírus, ortomixovírus ou paramixovírus, reovírus, picornavírus, vírus entéricos, flavivírus, arenavírus, vírus do herpes ou vírus da varíola.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação N°.6, caracterizado por o vírus se tratar de um adenovírus, poliovírus, vírus da hepatite A, vírus da encefalite japonesa, um vírus meningoencefalite europeia da primavera-verão bem como das formas de leste utilizadas, Vírus dengue, vírus da febre-amarela, vírus da hepatite C, vírus da rubéola, vírus da papeira, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório, vírus vaccinia, vírus da gripe, rotavírus, rhabdovírus, pneumovírus, reovírus, vírus do herpes simples 1 ou 2, citomegalovírus, vírus variela-zoster, adenovírus canino, vírus Epstein-Barr, um vírus de herpes bovino ou suíno e um vírus da pseudo-raiva.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizado por a vacina ser misturada com um adjuvante, substância auxiliar, tampão, diluente ou excipiente.
  9. 9. Método, de acordo com as reivindicações N°.l a N°.8, caracterizado por englobar ainda um passo (d) no qual os vírus são purificados através da utilização de uma coluna de cromatografia CS e/ou por ultracentrifugação num gradiente com sacarose. Lisboa, 29 de Novembro de 2010 2
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