JP2014521353A - ワクシニアウィルスの生成のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

特定の実施形態は、ワクシニアウィルスの大規模生産のためのウィルス生成方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１１年８月５日出願の米国特許仮出願第６１／５１５，７２４号の優先権の利益を主張するものであり、同仮出願の全体が参考として本明細書に援用される。

Ｉ．発明の分野
本発明の実施形態は、全体として、ウィルス学、医学およびウィルス治療学に関する。特定の実施形態は、ウィルス生成に関する。

ＩＩ．背景
腫瘍退縮ウィルス（ＯＶ）は、腫瘍細胞内で特異的に成長して、腫瘍細胞を死滅させるように設計または選択される複製治療である。前臨床の動物モデルおよびヒトに対する初期の臨床データに基づいて、商業化の初期段階にある群も幾つか存在する。しかしながら、患者に供給できる医薬品グレードのウィルスを大量に生産する点でまだ問題がある。ウィルスは合成薬物ではなく生物体であるため、その製造工程には、感染力を維持したまま細胞内でウィルスを生産する工程およびその後の汚染細胞デブリを除去する工程を伴う。今日まで、全てではないが、ヒト使用のためのワクシニアウィルス製品の商業的製造は、ヒト以外の細胞培養物中のワクチンとしてであった。一般に、ワクチンの投与では、患者は、局所部位（筋肉内が多い）に低い供与量のウィルスを投与されるが、その際、汚染細胞タンパク質が、実際にアジュバントとして機能し、調製物の免疫原性を増加させる。これとは対照的に、腫瘍退縮ウィルス治療法では、ウィルスの供与量は、ワクチン投与と比べると、最高で１，０００，０００倍が必要であり、静脈内に、頭蓋内に、腹膜内に、または直接的腫瘍注入によって投与されうる。ＯＶの場合、汚染非ヒト細胞デブリを出さずに、大量のウィルス製造を可能にすることが重要である。さらに、ワクシニアウィルスは、ウィルス膜中に宿主細胞タンパク質を組み入れるエンベロープウィルスである。ウィルス体膜内にヒトタンパク質が取込まれると、ヒト宿主免疫系によって検出されることなく、その移動能力が高められる。

腫瘍退縮ウィルスの大規模生産のためのさらなる方法および組成物が必要である。

ワクシニアウィルスは、懸濁培養で成長するＨｅＬａ細胞の中で生成していた。しかしながら、懸濁培養の条件は、今日のウィルスの大規模生産には適していない。したがって、ＨｅＬａ細胞を用いたワクシニアウィルスの大規模または商業規模生産は、成功していなかった。さらに、接着ＨｅＬａ細胞を用いて大規模生産に必要な数のワクシニアウィルスを生成することを保証するような、十分な数の細胞を生成する接着ＨｅＬａ細胞株は予期されなかった。本出願は、接着ＨｅＬａ細胞を用いたワクシニアウィルスの大規模生産プロセスを提供するものである。

特定の実施形態は、下記ステップの一つ以上を含むワクシニアウィルスを生成するための方法に関する。

特定の態様では、方法は、表面に接着したＨｅＬａ細胞をワクシニアウィルスと接触させることにより、接着ＨｅＬａ細胞をワクシニアウィルスに感染させるステップを含む。好ましくは、ワクシニアウィルスは、米国特許出願公開第２００９／０００４７２３の段落［００２８］〜［００５２］に記載されるような組換え型ワクシニアウィルスであり、この文献の全体は、参考として本明細書に援用される。実施形態において、ペトリ皿に接着したＨｅＬａ細胞は、特許請求の範囲から特に除外される。実施形態において、本発明は、（ａ）表面に接着したＨｅＬａ細胞をワクシニアウィルスで感染させるステップと、（ｂ）後代ウィルスの生成が可能な条件下で、感染させた細胞を培養するステップと、（ｃ）培養物からワクシニアウィルスを取り入れるステップとを含む、ワクシニアウィルスを生成するための方法を提供する。

ある実施形態では、本発明は、（ａ）以下の全ての値および以下の間の範囲を含む、少なくとも１×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、５×１０^１１、１×１０^１２、５×１０^１２、１×１０^１３、５×１０^１３個またはそれ以上の接着ＨｅＬａ細胞を、ワクシニアウィルス組成物と接触させることにより、表面に接着したＨｅＬａ細胞を組換え型ワクシニアウィルスに感染させるステップと、（ｂ）細胞１個当たり、以下の全ての値および以下の間の範囲を含む５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはそれ以上の組換え型ワクシニアウィルスの生成が可能な条件下で、感染させた細胞を培養するステップとを含む、ワクシニアウィルスを生成するための方法を提供する。好ましくは、上記方法に従いＨｅＬａ細胞１個当たり少なくとも５０プラーク形成単位（ｐｆｕ）のワクシニアウィルスを製造し、より好ましくは、ＨｅＬａ細胞１個当たり少なくとも７５ｐｆｕのワクシニアウィルスを製造する。

別の実施形態では、表面に接着したＨｅＬａ細胞は、０．００１〜１．０、好ましくは０．００５〜０．５、より好ましくは０．０１〜０．１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でワクシニアウィルスに感染する。特に好ましい実施形態では、ｍ．ｏ．ｉ．は、０．０１〜０．０５であり、この全ての値および範囲を含むものである。別の好適な実施形態ではｍ．ｏ．ｉ．は、０．０１５〜０．０３である。用語「感染多重度」または「ｍ．ｏ．ｉ．」とは、感染の間にＨｅＬａ細胞１個当たり加えられるウィルスのプラーク形成単位（ｐｆｕ）の割合をいう。

関連する実施形態では、接着したＨｅＬａ細胞は、上記方法に従い、約１０^４〜約１０^６個のＨｅＬａ細胞／ｃｍ^２の密度、好ましくは約１０^５個のＨｅＬａ細胞／ｃｍ^２の密度でワクシニアウィルスに感染し、その際、ワクシニアウィルスの濃度は、１０^３〜１０^５ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは約１０^４ｐｆｕ／ｍｌである。

接着ＨｅＬａ細胞の培養
本方法に従ったワクシニアウィルスによる感染のための接着ＨｅＬａ細胞は、あらゆる適切な方法により培養することができ、ガラス容器およびプラスチック容器内での成長を含む（ただしこれに限定されない）ものであり、この場合の容器とは、例えば、培養フラスコ、ヌンクロン（Ｎｕｎｃｌｏｎ）（登録商標）セルファクトリー（Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ）（商標）等のセルファクトリー、コーニングライフサイエンス社のセルキューブ（ＣＥＬＬＣＵＢＥ）（登録商標）システム等のセルキューブ、ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）（登録商標）またはランパイア社（Ｌａｍｐｉｒｅ）（登録商標）の細胞培養用バッグ等の、細胞支持マトリックスを充填した（注入液バッグのような）軟質プラスチックバッグ；ローラーボトル；マグナフレックス（Ｍａｇｎａ−Ｆｌｅｘ）（登録商標）スピナーフラスコ等のスピナーボトル；あるいは発酵用容器；セレックス・バイオサイエンス社（Ｃｅｌｌｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（アキュシスト（ＡｃｕＳｙｓｔ）（登録商標）中空線維リアクター、バイオヴェスト社（ＢｉｏＶｅｓｔ）（セルファーム（Ｃｅｌｌ−Ｐｈａｒｍ）(登録商標）システム１００またはシステム２５００）、ファイバーセル（Ｆｉｂｅｒｃｅｌｌ）（商標）の各社による細胞培養システム等各種材料の中空線維をはじめとするバイオリアクターが含まれる。バイオリアクターは温度およびｐＨ等のパラメータを正確にモニターし制御できる点で、バイオリアクター内で培養を行うことが好ましい。特定の態様では、セルバインド社（ＣｅｌｌＢｉｎｄ）（商標）のプラスチックウェア（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）を用いることが可能である。細胞培養は、細胞集団の形態、例えばマイクロキャリアビーズ上のスフェロイド、スカフォード（例えば生物分解可能なスカフォード）上の細胞、組織、または組織オルガノイド等の形態であってもよい。特定の態様では、接着ＨｅＬａ細胞は、マイクロキャリア、セルキューブ、セルファクトリー、Ｔ型フラスコ、またはローラーボトルベッセル内で培養される。好適な実施形態では、接着ＨｅＬａ細胞は、例えばローラセル４０装置（セロン社，ルクセンブルク）を用いて、一つ以上のローラーボトル内で培養される。用いられる容器は、以下の間の全ての範囲および値を限定なしで含む、およそ、少なくとも、あるいは多くても１，７００；５，０００；１０，０００；２５，０００；５０，０００；１００，０００；１５０，０００；２００，０００；５００，０００ｃｍ^２の累積培養面積を備えていてもよい。特定の態様では、容器は少なくとも１６８，０００ｃｍ^２の累積培養面積を有する。

ワクシニアウィルスに感染させようとする接着ＨｅＬａ細胞は、成長、維持および細胞支持体表面への付着を促進する全ての適切な培地中で培養することができ、非限定的な例としては、ＢＭＥ（イーグル基礎培地）、ＭＥＭ（イーグル最小培地）、１９９培地、ＤＭＥＭ（ダルベッコイーグル改変培地）、ＧＭＥＭ（グラスゴー改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ−ＨａｍＦ１２およびＨａｍ−Ｆ１０、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、またはＲＰＭＩ １６４０を挙げることができる。この培地は、規定の培地であることが好ましい。一つの態様では、この培地は実質的に無血清である。ＨｅＬａ細胞の用途に最適化された無血清培地の非限定的な例としては、ＶＰ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ／ライフテクノロジー社）、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）ＨｅＬａ無血清培地（ＳＦＭ）（シグマアルドリッチ社）、およびＱｕａｎｔｕｍ １０１（ＧＥヘルスケア社）を挙げることができる。他の実施形態では、この培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の動物血清を含んでいてもよい。例えば、培地は、５％〜１０％の血清（例えばＦＢＳ）を含んでもよいかまたは５％未満の血清（例えばＦＢＳ）含んでもよいか、あるいは、これらの間の全ての範囲または値であってもよい。一つの実施形態としては、培地は、５％〜１０％のＦＢＳ、例えば１０％のＦＢＳが補充されたＤＭＥＭである。

用語「マイクロキャリア」とは、細胞の培養用および細胞の付着用に用いられる小さい個々の粒子のことをいう。マイクロキャリアは、例えば棒状、球状等、全ての適切な形状をとることができる。多くの実施形態においては、マイクロキャリアは、細胞培養に適する表面を提供するようにコーティングされているマイクロキャリアベースを含む。ポリペプチドは、結合、グラフトその他の方法で、表面コーティングに付着される。マイクロキャリアは、付着依存細胞を高収率で提供する目的で、細胞培養に使われる。マイクロキャリアは通常、細胞培養培地中で撹拌されるかまたは激しくかき混ぜられ、従来の培養機器に対して体積比で非常に大きな付着成長表面積を提供する。マイクロキャリアの詳細な例としては、米国特許出願公開公報２０１１／００２７８８９号を参照すべきであり、この全体が参考として本明細書に援用される。

特定の実施形態では、ワクシニアウィルスは、ワクシニアウィルスのＩＨＤ−Ｊ株、ワイス(Ｗｙｅｔｈ)株、ウェスタンリザーブ株、またはコペンハーゲン株である。特定の態様では、ワクシニアウィルスが組換え型ワクシニアウィルスである。組換え型ワクシニアウィルスは、異種のコード領域を含んでもよい。本明細書で用いられる場合、この異種のコード領域とは、ワクチニアウィルスのゲノムには自然に存在しないコード領域である。特定の態様では、異種のコード領域は、免疫促進性ポリペプチドをコードすることができる。免疫促進性ポリペプチドは、サイトカインであってもよく、非限定的な例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を挙げることができる。

特定の態様では、組み換え型ワクシニアウィルスは、腫瘍細胞において選択的に複製する。この組み換え型ワクシニアウィルスは、内因性遺伝子中に突然変異を含んでいてもよい。突然変異は、核酸配列の欠失、核酸残基の置換、またはワクシニアウィルスの機能もしくは発現に影響を及ぼす一つ以上の核酸残基の組込みであってもよい。この突然変異の結果として、腫瘍細胞中の選択的成長、非腫瘍細胞中の成長の低下、または腫瘍細胞中の成長の増大、あるいはこれらの組み合せが生じうる。内因性遺伝子中に突然変異を含む組み換え型ワクシニアウィルスは、チミジンキナーゼ欠損（Ｔｋ⁻）ワクシニアウィルス（すなわち、チミジンキナーゼをコードする遺伝子中にコードされたポリペプチドを機能不全にする突然変異を有しているワクシニアウィルス）であってもよい。特定の態様においては、内因性遺伝子中に突然変異を含む組み換え型ワクシニアウィルスとしては、ワクシニアウィルスのＩＨＤ−Ｊ株、ワイス株、ウェスタンリザーブ株、またはコペンハーゲン株であり、かつ／あるいは、異種のコード領域を含む。さらなる実施形態では、内因性遺伝子中に突然変異を含むワクシニアウィルスは、異種のコード領域を含み、非限定的な例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ポリペプチドコード領域を挙げることができる。

感染したＨｅＬａ細胞の培養
ワクシニアウィルスと接触させられた接着ＨｅＬａ細胞は、後代ワクシニアウィルスの生成が可能な条件下で培養される。培養条件は、非限定的な例としては、規定の感染培地、規定のｐＨ、規定の培養容器、規定の温度または温度範囲、規定の菌体数、規定の細胞集密度、規定の物理操作（例えば、酵素処理または化学処理、回転数、振盪速度その他）、規定の気相条件、規定の培養時間、規定の細胞播種密度、および規定の細胞継代数を挙げることができる。一つの態様では、用いられるＨｅＬａ細胞培地にウィルスを単に加えて接着ＨｅＬａ細胞を調製してもよく、その場合には、培地および感染培地を同じものにすればよい。他の態様では、接着ＨｅＬａ細胞の調製に用いた培地を感染ステップで除去し、ワクシニアウィルスと接触させられたＨｅＬａ細胞を新たな感染培地とともに、後代ウィルスが生成されるまで培養するが、この感染培地は血清を含んでもまたは実質的に無血清であってもよい。非限定的な適切な感染媒質の例としては、ＢＭＥ、ＭＥＭ、１９９培地、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＤＭＥＭ−ＨａｍＦ１２およびＨａｍ−Ｆ１０、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、またはＲＰＭＩ １６４０を挙げることができ、これらのいずれかは、任意で、血清が添加されていてもよい。例えばＶＰ−ＳＦＭ、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（登録商標）ＨｅＬａ無血清培地（ＳＦＭ）およびＱｕａｎｔｕｍ １０１等の無血清培地も、感染培地としての使用に適している。

特定の態様では、感染させた細胞は、ｐＨ約７、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８、好ましくはｐＨ７．１超、より好ましくはｐＨ７．２超、最も好ましくはｐＨ約７．３で、血清（例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ））５〜１０％を含む感染培地中で培養される。別の態様では、細胞は、約７、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８、好ましくはｐＨ７．１超、より好ましくはｐＨ７．２超、最も好ましくはｐＨ約７．３で、血清（例えばＦＢＳ）５％未満、例えば血清（例えばＦＢＳ）０％を含む感染培地中で培養される。関連する態様では、細胞は、血清（例えばＦＢＳ）０％〜１０％を含む感染培地中で、ｐＨ約７．３で培養される。別の実施形態では、細胞は、血清（例えばＦＢＳ）０％〜１０％を含む感染培地中で、ｐＨ７．２以上７．６未満で培養される。好適な実施形態では、感染培地は、ＤＭＥＭ、任意で１００〜３００ｍＭのグルタミンを含む。細胞は、約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、または４０℃の温度で培養してもよい。好適な実施形態では、細胞は、３６℃〜３７．５℃の温度、好ましくは３７℃で培養される。特定の態様では、感染培地は、硫酸デキストラン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、Ｔｗｅｅｎ−８０および／または大豆タンパク質加水分解物の一つ以上を特に排除する。好適な実施形態では、感染培地は、特に、硫酸デキストランを排除し、また、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、Ｔｗｅｅｎ−８０および／または大豆タンパク質加水分解物のうちの少なくとも一つを排除する。別の好適な実施形態では、感染培地は、これらの成分全てをほぼ含まない。

本方法は、感染の前、最中または後に、ＨｅＬａ細胞培養物を増大させるステップをさらに含んでもよい。ＨｅＬａ細胞は、少なくとも１本、２本、３本、４本、５本、またはそれ以上の培養容器、例えば、ローラーボトル培養容器を通過させてもよい。特定の態様では、細胞は、例えばＨｙＱｔａｓｅ（登録商標）等のプロテアーゼおよび／またはコラーゲン分解酵素を含む剥離溶液と処理することにより表面から剥離させる。各容器は、直前の培養容器に比べて増加した培養面積を有してもよい。特定の態様では、これら培養容器の全培養面積は、少なくとも８４，０００ｃｍ^２〜１，０００，０００ｃｍ^２である。特定の態様では、最終通路は、少なくとも１６８，０００ｃｍ^２の培養面積を有する培養容器である。

特定の実施形態では、培養容器の播種と、感染との間の時間間隔は、以下の間の全ての値および範囲を含み、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、またはそれ以上である。特定の態様では、接着ＨｅＬａ細胞は、以下の間の全ての値および範囲を含む１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９ｐｆｕ／ｍｌのワクシニアウィルスと接触させる。好適な実施形態では、約１０^４〜約１０^６個のＨｅＬａ細胞／ｃｍ^２の密度、好ましくは約１０^５個のＨｅＬａ細胞／ｃｍ^２の密度の接着ＨｅＬａ細胞は、１０^３〜１０^５ｐｆｕ／ｍｌのワクシニアウィルス、さらに好ましくは約１０^４ｐｆｕ／ｍｌのワクシニアウィルスと接触させる。

特定の態様では、本方法は、接着ＨｅＬａ細胞により生成されるワクシニアウィルスを分離するステップを含む。採取されたワクシニアウィルスは、当業者に知られた方法に従い、濃縮および精製されてもよい。本発明の他の実施形態としては、米国特許出願公開第２００９／０００４７２３の段落［０２９５］〜［０３０３］に記載されている方法によって生成されるワクシニアウィルス組成物に関するものであり、この文献の全体は、参考として本明細書に援用される。

本発明の別の実施形態は、本出願の全体を通して検討される。本発明の一つの態様に関して検討されるあらゆる実施形態は、本発明の別の態様にも適用され、その逆も適用される。実施例の項における実施形態は、本発明の全ての態様に適用可能な本発明の実施形態であると理解されるべきである。

特許請求の範囲および／または明細書における用語「含む(ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ)」とともに用いる語「一つの(ａ)］、「一つの(ａｎ)」の使用は、「一つ」という意味を持つ場合もあるが、「一つ以上」、「少なくとも一つ」、「一つまたは複数の」の意味を持つ場合もある。

本明細書で検討される全ての実施形態は、本発明の全ての方法または組成物に対して適用可能であり、またその逆も適用可能であることを意図するものである。さらに、本発明の組成物およびキットを、本発明の方法を実現するために用いてもよい。

本出願全体を通して、用語「約」は、その値が、その値を決定するために使用される装置または方法に起因する誤差の標準偏差を含むことを示すために用いるものである。

特許請求の範囲における用語「または」の使用は、別の意味のみが明確に示されない限りあるいはこの別の意味が相互排除的でない限り、「および／または」を意味するために用いられるものであるが、本願の開示が、別の意味だけを意味する場合と「および／または」を意味する定義を支持している。また、用語「または」を用いて列挙されるどの名詞も、特定的に除外できると意図されるものである。

本明細書および特許請求の範囲で用いられる語「含む(ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ)」（および、「含む(ｃｏｍｐｒｉｓｅ)」および「含む(ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ)」などを含む任意の形）、「有する(ｈａｖｉｎｇ)」の語（および、「有する(ｈａｖｅ)」および「有する(ｈａｓ)」などを含む任意の形）、「含む(ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ)」（および、「含む(ｉｎｃｌｕｄｅｓ)」および「含む(ｉｎｃｌｕｄｅ)」などを含む任意の形）、または「含有する(ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ)」（および、「含有する(ｃｏｎｔａｉｎｓ)」および「含有する(ｃｏｎｔａｉｎ)」などを含む任意の形）は、非排他的または非制限的であり、記載していない成分または方法のステップまたは工程を排除するものではない。

本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、本発明では特定の実施形態を示しているが、詳細な説明および特定の各実施例は、例示目的にのみ示すものであると理解されるべきであり、この理由は、本発明の主旨およびその範囲内での各種の変形および変更は、この詳細な説明から当業者に明らかになるからである。

以下の図面は、本明細書の一部を成し、本発明の特定の態様をさらに明示するものである。これらの図面のうち一つ以上を、ここに示される特定の実施形態の詳細な説明と共に参酌すれば、本発明がさらに理解されよう。
各種ヒト細胞系における組み換え型ワクシニアウィルス株ＪＸ−５９４（ｐｆｕ／細胞）の生産を例示する図である。細胞の感染を、感染多重度０．１および感染後７２時間において行い、溶菌液を収集し、力価をＵ−２ ＯＳ細胞で測定した。 接着ＨｅＬａ細胞における組み換え型ワクシニアウィルス株ＪＸ−５９４の生産性に対する感染培地のｐＨの影響を例示する図である。細胞の感染を、示したｐＨの培地中で感染多重度０．１および感染後７２時間において行い、溶菌液を収集し、ウィルス力価をＵ−２ ＯＳ細胞で測定した。

発明の詳細な説明
ワクシニアウィルスは、外側膜中に異なる４種の感染型を発する外膜ウィルスであり、これら４種の感染型は、細胞内成熟ウィルス粒子（ＩＭＶ）、細胞内外膜ウィルス粒子（ＩＥＶ）、細胞関連外膜ウィルス粒子（ＣＥＶ）、および細胞外の外膜ウィルス粒子（ＥＥＶ）である。ＥＥＶ型は、補体活性化の宿主調節因子を外側のＥＥＶ膜に取り込む宿主細胞取込みを行うため、補体に耐性を示す（Ｖａｎｄｅｒｐｌａｓｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， （１９９７） ＰＮＡＳ ９５：７５４４−７５４９）。補体失活を回避する能力および宿主免疫系による認識を回避する能力は、患者での全身送達における有効性に関する重要な特徴となっている。

ＩＭＶの原形質膜は、その構築の間、多数の宿主細胞タンパク質を組み入れる。ＩＭＶが感染性後代の大部分ということになるので、腫瘍退縮ウィルス療法標的患者と同じ生物種由来の生成細胞は、ウィルスの免疫原性が低いため患者の体内への全身拡散に有利である。また、これらＩＭＶ原形質膜の宿主細胞タンパク質は、感染プロセスに対しても有利である。

ＩＭＶが感染性後代の大部分をなすが、ウィルスのＥＥＶ型は細胞培養調製物中に含まれないということが明確に確定されたわけではない。標的患者と同じ生物種からの補体活性化調節タンパク質は、補体活性化の抑制、すなわち宿主免疫系による免疫クリアランスの回避に対して、大きな役割を演じうる。したがって、本発明者らは、ヒト細胞成分を用いてワクシニアウィルスを大量生成するためのシステムを開発した。

歴史的に、ワクチンとして用いるワクシニアウィルスは、ヒトのかさぶたより生成していたが、その後、仔ウシ、ヒツジおよび水牛の皮膚上、ニワトリ胚の漿尿膜中、あるいは初代ウシ胚繊維芽細胞上で生成するようになった（Ｅｌｌｎｅｒ， １９９８）。痘瘡根絶という全世界の一致団結した取り組みにおいては、仔ウシの皮膚の乱切法による感染により、株を生成していた（Ｆｅｎｎｅｒ， １９７７）。ウィルス株を仔ウシリンパから調製していたが、この製剤は、ライセンスを受けかつ利用可能な唯一ワクチンであり、ＤＲＹＶＡＸ（登録商標）（ワイス社）として知られている。ウィルス調製物を濃縮して凍結乾燥することで、その安定性を確保していた（Ｆｅｎｎｅｒ， １９７７）。それは、少なくとも１０^８ｐｆｕ／ｍｌの凍結乾燥材料濃度で生成されていた。これを、５０％グリセリンおよび０．２５％フェノールを含む注射用無菌水中で再構成し、分岐針を用いることによって４００人ものワクチン接種を受けた人へ皮内に送達されていた（Ｆｅｎｎｅｒ， １９７７）が、この際の供与量は約２．５×１０^５ｐｆｕであり、これは、腫瘍退縮ウィルスとしてのワクシニアウィルスの標準的な供与量である１０^９ｐｆｕ（またはこれ以上）より少なくとも１０^４倍低い値であった。

腫瘍退縮ワクシニアウィルスの有力な臨床的候補は、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｊｅｎｎｅｒｅｘ、ＪＸ−５９４）を発現するチミジンキナーゼ不活化ワクシニアウィルスである。しかしながら、別のワクシニアウィルス変異株および菌種を、ここに記載される方法により生成してもよい。例えば、ＪＸ−９６３は、組み換え型ワクシニアウィルスであり、Ｔｋ遺伝子の除去に伴って、ウェスタンリザーブ社のワクシニアバックボーン上で構成されるワクシニア成育因子（ＶＧＦ）遺伝子の付加的な欠失を有している。この二重欠失ワクシニアウィルス（ｖｖＤＤ）は、腫瘍に特異的かつ動物モデルの抗腫瘍活性を有していることが示された（ＭｃＣａｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｔｈｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。第２のｖｖＤＤ変異株は、ＪＸ−９２９であり、全身送達の後の^１１１Ｉｎ−ペンテトレオチドを用いた分子イメージングを容易にするヒトソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ２）を感染細胞中に有しかつ発現する（ＭｃＣａｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。

Ｉ．細胞培養
ＤＲＹＶＡＸ（登録商標）ワクチン接種の代替およびウィルス性免疫療法ならびに遺伝子治療分野に用いるワクシニアウィルスの産生の目的で、細胞ベースのウィルス産生の試験を行った。ＡＣＡＭ２０００と称されるサル腎臓細胞ラインベロ細胞中で成長する、第二世代のワクシニアウィルスワクチン株を、開発した。これらの研究において、細胞培養物からウィルスを効果的に精製した。さらに、腫瘍特異性抗原（すなわちＰＳＡ、ＣＥＡ）および免疫促進性分子（すなわちＢ７．１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１）と組み合せてワクシニアウィルスを使用する癌ワクチンを、細胞中に生成し、臨床試験の第Ｉ相および第ＩＩ相の患者に投与した（Ｌｉ， ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｇｕｏ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ， ２００４）。しかしながら、これら上記ケースの双方ともに、患者は、ウィルス調製物の全身投与よりも局所投与を受け、しばしば、全ウィルス供与量のうちインビボにおける腫瘍退縮効率に必要な分を受けていた。

腫瘍退縮ウィルス候補として提案された別のウィルスと比較すれば、ワクシニア等のポックスウィルスは、大規模な生産および精製における固有の課題を露呈する。自然界の最も大きい種類のウィルスとしてのポックスウィルスは、光学顕微鏡法によって可視であり、かつ、２００〜４００ｎｍの長さで測定される（Ｍｏｓｓ， Ｆｉｅｌｄｓ' ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｂ． Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ， Ｄ． Ｍ． Ｋｎｉｐｅ， Ｐ． Ｍ． Ｈｏｗｌｅｙ， Ｄ． Ｅ． Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｅｄｓ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ２００１）ｐｐ． ２８４９−２８８３）。その大型のサイズのため、ワクシニアウィルスは、濾過による滅菌はできず、そのため、全ての製造プロセスは、通常閉鎖されている。

宿主細胞原形質内で生じる生活環全体において、感染性粒子のバルクは、細胞の培地に放出されずに感染細胞内に保持されるので、精製は、感染細胞の細胞溶解、および細胞デブリからのウィルス粒子の精製を必要とする。

ポックスウィルスの形態形成においては、形態形成の早い段階でデノボ膜合成から膜を取得するとともに、後の段階でも、宿主ゴルジ体から付加的な膜を取得する（Ｍｏｓｓ， ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ' ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｂ． Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ， Ｄ． Ｍ． Ｋｎｉｐｅ， Ｐ． Ｍ． Ｈｏｗｌｅｙ， Ｄ． Ｅ． Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｅｄｓ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ２００１）ｐｐ． ２８４９−２８８３）。

本方法は、癌試験用ＧＭＰグレードウィルスを生成するために開発された接着細胞プロセスに関する。接着細胞処理は、血清なしの条件下で行ってもまたは血清の存在下で行ってもよい。本明細書で説明した製造プラットフォームの生産目標値は、少なくとも３０、１００、１２５、１５０、２００ｐｆｕ／細胞またはそれ以上であり、１供与量当たりの推定ウィルス濃度は、約１０^９ｐｆｕ／ｍｌである。

本発明の一実施形態は、細胞培養における高力価ＪＸ−５９４の産生手順に関する。様々なヒト細胞系を試験し、ＨｅＬａ細胞、すなわちヒト子宮頸部癌細胞系が、接着培養物中でのウィルス複製を着実に行うことを支援することが見出された。本方法はＨｅＬａ細胞に限定されず、別の接着細胞を産生プロセスに用いてもよいが、現時点では、ＨｅＬａ細胞は、ワクシニアウィルスの産生における最良の形態の細胞系を提供するものである。

ウィルス生産性を評価するための代表的なアプローチは、系列希釈を行った後、２〜３日間プラークが形成するまで待機し、その後、力価を算出することを含む、標準的なプラークアッセイ法を実施することである。代替的な方法としては、定量的ＰＣＲアプローチ（Ｑ−ＰＣＲ）を規格化することにより、感染の後に生成されるウィルスゲノムの数の定量を可能にする方法が挙げられる。増幅プライマーを最適化することにより、感染細胞中のウィルスのＥ９Ｌ遺伝子の複写の数を定量化することが可能になり、また、これらの結果を本発明者らの標準的なプラークアッセイ法データに関連させることが可能になる。このアプローチの利点は、それが９６個のウェルのフォーマットに適合することが可能であること、および、数日かかるデータが数時間で入手可能であることである。したがって、９６個のウェルプレートを用いて、培地および補充物の標準的な初期スクリーニング、採取までの時間および入力ウィルスの濃度の影響を、迅速に実施し分析することが可能となる。初期スクリーニングに続いて、全ての陽性「ヒット」を古典的なプラークアッセイ法で確認した。

市販の無血清培地に見出される成分を、ウィルス生産性へのそれらの影響について試験した。ＨｅＬａ Ｓ３細胞系を懸濁液中の成長に適用することにより、培地含有血清中で接着細胞を成長させたのと同様に、本発明者らは、これら細胞系をＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＨｅＬａ無血清懸濁培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス）内で成長させた。しかしながら上記の通り、高い細胞発育特性にもかかわらず、本発明者らは、この培地中での非常に乏しいウィルス成長を観察した（感染細胞１個当たりのウィルス粒子は１未満）。ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）ＨｅＬａ無血清懸濁培地の正確な配合は知的所有権下にあるが、この無血清培地の既知の成分としては、硫酸化多糖類、硫酸デキストランであり、細胞クランピング防止のために加えられると考えられる。しかしながら、硫酸デキストランは、レトロウィルス、ヘルペスウィルス、ラブドウィルス、およびアレナウィルスを含む多種多様な外膜ウィルスの複製を抑制することが知られている（Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ， １９９３）。ＥＸ−ＣＥＬＬ培地には、硫酸デキストランが約２０ｍｇ／ｌ含まれている。硫酸デキストランの濃度を様々に変えて、上記の高速アッセイ法で評価を行った。硫酸デキストランがウィルス生産性に対して供与量に依存するマイナスの影響を与えることが見出され、この所見はその後古典的な力価アッセイ法を用いることにより確認された。硫酸デキストランを除去することでウィルス生産性が改善されるが、培地含有血清中での接着ＨｅＬａ細胞でルーチン的に実現される生産性よりもまだ低い。ウィルス生産性に影響を及ぼす他の培地成分としては、一般に細胞に対して非毒性の二官能性ブロックコポリマー界面活性剤Ｐｌｕｏｒｎｉｃ Ｆ−６８、一般に用いられる洗浄剤のＴｗｅｅｎ−８０、および大豆加水分解物を挙げることができる。特定の態様では、培地は、硫酸デキストラン、Ｐｌｕｏｒｎｉｃ Ｆ−６８、Ｔｗｅｅｎ−８０、および大豆加水分解物の一つ以上を欠如している。実施例におけるこれらの培地の配合および血清補充物の一部を、表１に示す。

（表１）培地の配合および補充物

ワクシニアウィルスの効率的な拡散のためには、細胞接触が好ましいため、ウィルスの細胞伝搬が低いことにより、懸濁細胞培養が制限を受けることもあり得る。特定の態様では、細胞のクランピングを促進してもよいか、あるいは、マイクロキャリア上で細胞を成長してもよいか、あるいは、接着培養がウィルス産生に十分であることが可能である。

非限定的な一つの例として、常に１００ｐｆｕ／細胞を超える力価が得られるよう、ＪＸ−５９４の成長のために以下の条件を用いた。細胞を、４×１０^４個の細胞／ｃｍ^２でローラーボトル内に準備し、培養物中で２日間成長させる。その際、成長培地を除去し、ＪＸ−５９４を１０^４ｐｆｕ／ｍｌ含む新しい培地を加える。さらに６０〜７０時間、細胞を維持し、その後、細胞を収集し、ウィルスを採取する。この準備により、ＪＸ−５９４を約１７０用量（１０^９ｐｆｕ／用量）生成することが可能である。このプロセスの間、本発明者らは、予測されない因子が、ウィルスの生産量に対して劇的な影響を及ぼすことを見出した。例えば、培地のｐＨが、ＪＸ−５９４複製に影響を与える。ウィルス産生は、ｐＨ７．３において十分に緩衝化された培地中で最適化された。接着培養物による生産性は、全ての懸濁培養物での試みに比べて非常に高い。

汚染生成物を全く含まない高品質ウィルス調製物の生産を確保するために、アッセイ法を多数行い、ウィルス純度および／または品質の解析を行ってもよい。多くのアッセイ法を行うことにより、ウィルスの調製を、別の確認されたロットにおけるウィルス調製の比較することを確保し、プロセスが成功していることが確認できるようになる。

特定の実施形態では、ワクシニアウィルスの分離および精製を行ってもよい。ワクシニアウィルスを精製するための方法は、ａ．液相の中に含まれるワクシニアウィルスによる固相マトリックスを充填するステップと、ｂ．マトリックスを洗浄するステップと、ｃ．ワクシニアウィルスを溶出するステップとを含むことができる。

特定の態様では、マトリックスは、ワクシニアを結合するリガンドを含んでもよい。リガンドは、マトリックスへの結合またはカップリングにより、固相マトリックスに結合させてもよい。リガンドとウィルスの間の作用は、可逆型の複合体を生成し、したがって、ウィルスは、マトリックスによって可逆的に保持される。特定の態様では、グルコサミングリカン（ＧＡＧ）、特にヘパラン硫酸またはヘパリン、またはＧＡＧ類似物質を、リガンドに用いることができる。本明細書で用いられる例では、「グリコサミノグリカン類」（ＧＡＧ）は、長鎖の分枝のない多糖類であり、二糖繰り返し単位から成る。

リガンドは、生体分子であってもよく、例えば、ペプチドおよび／またはレクチンおよび／または抗体および／または、好ましくは、炭水化物である。リガンドは、また、硫酸エステルを含有してもまたは硫酸エステルを含んでもよい。さらなる実施形態では、リガンドは、一つ以上の負に荷電した硫酸基を含む。

特定の態様では、リガンドは、疎水性分子であり、例えば、芳香剤フェニル基、ＰＰＧ基、ブチル基、またはヘキシル基である。

一つの態様では、本方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるワクシニアウィルスの精製を含む。さらなる実施形態では、本方法は、アフィニティークロマトグラフィーと共にＨＩＣを用いたワクシニアウィルスの精製を含む。ＨＩＣを用いることにより、ウィルス収率を増加させ、ＤＮＡおよびタンパク質のコンタミネーションを大きく低減させる。ＤＮＡコンタミネーションのレベルは、初期出発原料の０．０１％まで低減でき、また、タンパク質コンタミネーションのレベルは、０．１％以下まで低減できる。

特定の態様では、ＨＩＣフェニルカラムクロマトグラフィーに硫酸化セルロースを用いて、高収率および高純度レベルでウィルス粒子を生成してもよい。

特定の態様では、ワクシニアウィルスの精製の前または後に、ＤＮＡを分解または除去してもよい。ヌクレアーゼ処理、例えばベンゾナーゼ（登録商標）等の処理によって、ＤＮＡを除去してもよい。ヌクレアーゼ処理は、ワクチンの確率、完全なオンコジーンを含んでいるウィルスベクター、あるいはさらなる機能的なＤＮＡ塩基配列を低減する。

関連する態様において、ワクシニアウィルスの精製の前または後に、タンパク質を分解または除去する。タンパク質は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ処理等のプロテアーゼ処理によって除去してもよい。好ましくは、ヌクレアーゼとプロテアーゼ処理の組み合せを用いて、ＨｅＬａ ＤＮＡおよびタンパク質のコンタミネーションを低減または排除する。

マトリックスは、ゲル、ビーズ、ウェル、膜、コラム、その他の形態であってもよい。本発明の好適な実施形態としては、固相は膜であり、特にセルロース膜である。ウィルスを結合することが可能な広い範囲の変性ポリマーを用いてもよい。このポリマーの例としては、セルロース誘導体（セルロースエステル、セルロース水和物、酢酸セルロース、ニトロセルロース）；アガロースおよびその誘導体；キチンまたはキトサン等の多糖類；ポリオレフィン（ポリプロピレン）；ポリサルホン；ポリエーテルサルホン；ポリスチレン；芳香剤アミドおよび脂肪族ポリアミド；ポリサルホンアミド；ハロゲン化ポリマー（ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン）；ポリエステル；アクリロニトリルのホモポリマーおよびコポリマーを挙げることができる。

ワクシニアウィルスを無菌条件の下で精製することにより、活動的であり安定でありかつ純度の高いウィルスの調製を実現することができる。ワクシニアウィルスは、天然型でも組み換え型でもよい。

本明細書で用いられる例では、「汚染物」とは、ウィルス成長のために用いられる宿主細胞（例えば宿主細胞ＤＮＡまたはタンパク質）から生じうるか、あるいは上流（例えばゲンタミシン）および下流（例えばベンゾナーゼ）を含む製造プロセス中に用いられるあらゆる添加剤から生じうる、あらゆる不要な物質を包含するものである。

本明細書で用いられる例では、ワクシニアウィルスまたは組み換え型ワクシニアウィルスの「工業規模」または「大規模」の生産は、１バッチ（生産稼働）当たり少なくとも１．０×１０^８個のウィルス粒子（最低限で５．０×１０^１２個のウィルス粒子）の５０，０００用量を提供できる方法を含む。

本明細書で用いられる例では、ワクシニアウィルス調製またはワクチンの「純度」は、不純ＤＮＡ、タンパク質、ベンゾナーゼおよびゲンタミシンの含量に関して調べられる。純度は、特定の不純物に対して、１用量当たりの各不純物の量（例えばｎｇ ＤＮＡ／用量）で表される。

本明細書で用いられるように、「安定度」は、ウィルス調製の品質（バルク薬物物質（ＢＤ）または最終薬物製品（ＦＤＰ））が、例えば温度、湿度および光等の様々な環境因子の影響でどのように経時変化するかの尺度を意味し、ＢＤＳに対して再試験の期間を確定するか、またはＦＤＰに対して推奨の貯蔵条件での有効期間を確定する。

リガンドは、結合したワクシニアウィルスの溶出を、ワクシニアウィルスが生物学的活性度を完全に保持できるような穏やかな条件下で可能にするものである。これは、ウィルスは感染性を有していることを意味するものである。精製中にワクシニアウィルスの感染性を保持することが可能であるので、初期ＴＣＩＤ_５０（５０％組織培養感染量）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が、精製中にも保持される。好ましくは、初期ＴＣＩＤ_５０の少なくとも３０％が精製中に保持される。

一実施形態では、固相マトリックスは、ゲルまたは膜であり、その細孔径は、０．２５μｍ、好ましくは０．２５μｍ超、さらに好ましくは１．０〜３．０μｍであり、１０ｃｍ／分〜２０ｃｍ／分の実際の精製条件下での直線流速を示すものである。マトリックスの細孔径は、０．２５〜０．５μｍ、０．５〜０．７５μｍ、０．７５〜１．０μｍ、１．０〜２．０μｍ、２．０〜３．０μｍ、または３．０μｍよりも大きくしてもよい。

バッチ、コラムまたは膜のアプローチにより、固相をリガンドで充填することを実施してもよい。

膜のアプローチでは、ワクシニアウィルスのような大きいウィルスの精製に対していくつかの利点を与えることができる。膜の表面における大きい細孔径およびリガンドの有効性により、大きなウィルス粒子の結合能を高めることができる。

一実施形態では、ウィルスは、例えば、０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．６Ｍ、０．８Ｍ、１．０Ｍ、１．２Ｍ、１．４Ｍ、１．６Ｍ、１．８Ｍ、または２．０Ｍの硫酸アンモニウム中で、リガンドに結合される。

リガンドまたはマトリックスに対してワクシニアウィルスまたは組み換え型ウィルスの結合が十分に進行したとき、ワクシニアウィルスが結合されるマトリックスを、適切な洗浄培地で洗浄することにより、液相中に残留する宿主細胞汚染物（特に、宿主細胞ＤＮＡおよびタンパク質）を除去することができる。一つの態様では、マトリックスは、０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．６Ｍ、０．８Ｍ、１．０Ｍ、１．２Ｍ、１．４Ｍ、１．６Ｍ、１．８Ｍ、または２．０Ｍの硫酸アンモニウムで洗浄される。

結合したワクシニアウィルスまたは組み換え型ウィルスを、マトリックスから溶出させてもよい。リガンドまたはマトリックスとワクシニアウィルスとの間の特異的な相互作用を特異的に阻害する作用物質により、あるいはリガンドまたはマトリックスと表面タンパク質との間の静電的相互作用を非特異的に阻害する作用物質により、捕捉されたワクシニアウィルスの溶出が行われてもよい。一つの態様では、この作用物質は、硫酸アンモニウムである。さらなる態様では、ワクシニアウィルスを、ＧＡＧまたはＧＡＧ類似リガンドにより溶出してもよい。また別の態様では、この作用物質は、塩化ナトリウムであり、より好ましくは、ＮａＣｌ濃度勾配は０．１５Ｍ〜２．０Ｍの範囲で上昇する。

マトリックスの充填に先立ち、特に液相培養物中のワクシニアウィルスから汚染物を除去するため、ウィルス懸濁液の前処理を実施してもよい。この場合の前処理は、以下のステップの一つ以上を単独でまたは組み合せで行うことができる：宿主細胞のホモジナイゼーション、超音波処理、凍結／融解、低浸透圧細胞溶解、高圧処理、遠心分離、ろ過、ヌクレアーゼ処理、プロテアーゼ処理、カチオン交換処理、選択的沈降処理。

ワクシニアウィルスまたは組み換え型ウィルスの溶出に用いる作用物質によっては、ウィルス調製の純度を高めるため、後処理を行ってもよい。この後処理は、不純物をさらに除去するための限外ろ過／ダイアフィルトレーションとしてもよく、かつ／または溶出に用いる特異的または非特異的作用物質としてもよい。

通常、ｐＨ値は、ウィルスの溶出の後に、特に最高でｐＨ９以上に上昇し、特に、ｐＨ７．５、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．５、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．５、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４または１０．５に上昇する。

本発明の実施は、従来技術の当業者の範囲における分子生物学、タンパク質分析および微生物学の技術を用いる。これらの技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． １９９５， ｅｄｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ に十分に説明されている。

ＩＩ．実施例
以下の各実施例は、本発明の各種実施形態を例示する目的で示すものであり、何らか様式で本発明を限定する意図するものではない。本発明は、本願に説明される目的を遂行して結果および利益を得るように十分に適合しており、またこれは、本願に内在する目的、結果および利益についても同様であることが、当業者には容易に理解されよう。本願の各実施例は、ここに記載される方法とともに好適な各実施形態をここに示すものであり、また、例示的でもあり、本発明の範囲を限定する意図ではない。特許請求の範囲で画定される本発明の趣旨に含まれる変更および別の応用も、当業者には自明のものである。

ＪＸ−５９４の生産について、様々なヒト細胞系を試験した。簡潔には、接着ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ｍ１４細胞、Ｕ−２ ＯＳ細胞、懸濁ＨｅＬａ Ｓ３細胞および接着ＨｅＬａ Ｓ３細胞を、０．１の感染多重度でＪＸ−５９４に感染させ、感染後７２時間において溶菌液を収集し、ウィルスの力価を、Ｕ−２ ＯＳ細胞で測定した。その結果を図１に示す。驚くべきことに、接着ＨｅＬａ細胞で良好な結果が得られた。

接着ＨｅＬａ細胞内でのウィルス生産を最適化する取り組みの中で、各種パラメータを試験した。感染培地のｐＨがウィルス産生に予期せぬ劇的な影響を及ぼす（図２参照）ことが、見出された。ＪＸ−５９４の生産は、下記以外は同一の条件下で、感染培地ｐＨ７．１における約１２ｐｆｕ／細胞から、ｐＨ７．３の感染培地における約６０ｐｆｕ／細胞まで増加した。感染培地のｐＨが７．１未満の場合は、ウィルス産生物はほとんど存在しなかった。さらに、感染多重度が０．００５〜０．０５の範囲内、特に０．０１と０．０３の間にあった時に、ならびに、温度が感染中および感染後３６℃〜３７．５℃の間に維持され処理を行った時に、ウィルス産生の改善が観察された。プラスチックのローラーボトルを接着表面として使用したことも、ウィルス収率を高めることに貢献した。

感染前の接着ＨｅＬａ細胞の培養に用いる培地中の血清の存在およびその量を、ウィルス収率に影響を及ぼすように決定した。培地がＦＢＳを１０％含んでいた時に最適な収量が得られたが、この際、培地中に血清量は減っており、その分に対応して、ウィルス収率が低下した。にもかかわらず、いくらか減少した血清中濃度に起因した収率の損失は、別のパラメータ（例えばｐＨ、感染多重度、接着表面）の最適化により打ち消される。

しかしながら、感染培地中の血清の存在および量は、ウィルス収率に実質的に影響を及ぼさなかった。したがって、本発明に従い、接着ＨｅＬａ細胞中でワクシニアウィルスの驚くほど良好な収率を得るためには、感染培地は、血清を含んでいてもまた実質的に血清無しでもよい。

最適化された上流プロセスの非限定的な例を概説する工程図は、以下の通りである。

ＪＸ−５９４上流プロセス

バイアル解凍および接種物増大
セルバンクから十分な数のバイアルを解凍することにより、上流プロセスは開始する。得られた細胞懸濁液は、ポリスチレン細胞培養容器（６３６ｃｍ^２）中で培養される（Ｎｕｎｃ Ｎａｌｇｅｎｅ）。細胞の成長は、汎用の細胞培養プロトコールを用いて目視による評価で決定された特定の集密度（約８０〜９５％）となるように行われる。

経路１では、培地を除去し、細胞をＰＢＳでリンスし、培養容器から剥離させる。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ ＸＲ（ベックマンコールター社）または血球計数器を用いて生存細胞を計数した後、各２００ｍｌの１００培地を含む４本ポリスチレン培養容器（全面積２５４４ｃｍ^２）に、１×１０^４〜６×１０^４個の細胞／ｃｍ^２の密度で播種される。培養物を、３７℃でインキュベーションする。

培養物を２×１０^４で播種した場合は、次の経路の目標日時は、播種４日後である。培養物を４×１０^４で播種した場合は、次の経路の目標日時は、播種３日後である。各々の経路の時点で、およそ１×１０^５個の細胞／ｃｍ^２となるように、プロセスを調整する。

ローラーボトル細胞培養物増大
経路２の目標日時では、培地を除去し、ＰＢＳで細胞をリンスし、ポリスチレン培養容器から剥離させる。

ＲＣ−４０ローラーボトル装置（シンセコン社、全表面積８４００ｃｍ^２）内の２本の拡大表面（ＥＳ）ポリスチレンローラーボトル（ＲＢ、セロン社）に１×１０^４〜６×１０^４個の細胞／ｃｍ^２の密度で、細胞を播種する。９００ｍｌの１００培地を含む各ボトルは培養され、細胞培養物を、ＲＣ−４０インキュベーター（三洋電機株式会社）内で、３７℃でインキュベーションする。

経路３の目標日時では、細胞培養培地を除去し、ＰＢＳで細胞をリンスし、剥離させる。細胞懸濁液をＥＳボトルから回収し、１００培地を１：１で混合し、生存細胞を計数する。次いで、適当量の細胞懸濁液を４本のＥＳ ＲＢ（全表面積１６８００ｃｍ^２）に１×１０^４〜６×１０^４個の細胞／ｃｍ^２で播種する。各ボトルにつき培地９００ｍｌとして、細胞培養物を３７℃でインキュベーションする。

経路４の間、細胞培養物を１０本のＲＢ（全表面積４２０００ｃｍ^２）へ移し替え、経路５の間、細胞培養物を２０本のＲＢ（全表面積８４０００ｃｍ^２）までに増大させる。経路６は、ＪＸ−５９４産生プロセスの第１の重要なステップであり、この理由は、細胞培養物は４０本のＲＢ（全表面積１６８０００ｃｍ^２）までに増大するからである。４０本のＲＢの播種密度は、ＪＸ−５９４の産生において重要であり、その目標値は４×１０^４個の細胞／ｃｍ^２である。ＤＮＡフィンガープリント法および付随的な作用物質試験のために、細胞懸濁液および条件培地のサンプルを経路６で収集する。産生用播種の間、細胞培養物の温度は３７℃に制御される。

感染およびＪＸ−５９４産生
４０本のＲＢの播種から、マスターウィルスバンクまたはワーキングウィルスバンクのいずれか由来のＪＸ−５９４のバイアルによる感染までの間隔の目標は、７２時間である。感染の日時には、培地を細胞培養物から除去し、ＪＸ−５９４ウィルスを１×１０^４ｐｆｕ／ｍＬ含む新たな１００培地で置換する。感染培地の力価は、重要なプロセスパラメータであり、１×１０^４ｐｆｕ／ｍＬの画定した目標値を有する。菌体密度は、感染の時点で計数しないが、しかし、経路履歴に基づき１×１０^５個の細胞／ｃｍ^２と予想される。感染の継続時間は、４０〜８０時間の範囲内に制御され、かつ好ましくは約４４時間である。感染中の細胞培養物の温度は、重要なプロセスパラメータであり、３７℃に制御される。

１００ｐｆｕ／細胞を超えるウィルス力価が通常、本プロセスに従って得られる。

ＪＸ−５９４下流プロセス
細胞由来ポックスウィルスの小規模調製のための古典的な方法は、低張細胞溶解に続いて、凍結融解および音波処理のラウンドが含まれていた。本発明者らは、凍結／融解および音波処理がともに不必要なステップであり、しばしばウィルス力価を低下させることを見出した。従って、ＪＸ−５９４の下流処理では、ヌクレアーゼ（ベンゾナーゼ）処理を用いてＨｅＬａ ＤＮＡを消化し、プロテアーゼ（ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ）処理を行いＨｅＬａタンパク質を消化し、次いで、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を行う。ベンゾナーゼによる天然培養物（低張細胞溶解緩衝液中にウィルスおよび細胞のデブリを含む）の処理により、製剤中の宿主（ＨｅＬａ）ＤＮＡ汚染が非常に少なくなった（図３参照）。したがって、ヌクレアーゼ処理をＴＦＦと組み合わせて行うことにより、製剤中の宿主ＤＮＡおよびタンパク質の汚染を大きく低減し、かつ、ウィルスの感染に要する力価を保持しながら、純度の非常に高いウィルス製剤を得ることができる。特に、ＤＮＡ汚染を４０μｇ ＤＮＡ／用量から３μｇ ＤＮＡ／用量へと低減し、タンパク質汚染を１２ｍｇタンパク質／用量から４ｍｇタンパク質／用量へ低減することが、ヌクレアーゼ／プロテアーゼ処理とＴＦＦの組み合せを用いて実現される（用量＝１×１０^９ｐｆｕ ＪＸ−５９４）。一つ以上のクロマトグラフィーステップを用いることで、これらをさらに低減することも可能である。一つの態様では、一つ以上のクロマトグラフィーステップは、イオン交換クロマトグラフィーを含む。別の態様では、一つ以上のクロマトグラフィーステップは、ワクシニアウィルスＡ２７Ｌタンパク質のヘパリン結合能を利用するヘパリン（もしくはヘパリン類似分子）または硫酸化セルロースに基づくことが好ましい、疑似アフィニティークロマトグラフィーを含む。さらに別の態様では、一つ以上のクロマトグラフィーステップは、膜吸着クロマトグラフィー、例えば膜アフィニティークロマトグラフィーを含む。好適な膜は、少なくとも３μＭの細孔径を有する微孔構造を有すると考えられる。

参考文献
以下の参考文献は、本願に述べた事項への補足として、例示的な手順の詳細または別の詳細を提供する限度において、参照事項として本願に包含される。

Claims (40)

1. ワクシニアウィルスを生成するための方法であって、
   （ａ）表面に接着したＨｅＬａ細胞を０．００５〜１．０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でワクシニアウィルスと接触させることにより、該ＨｅＬａ細胞をワクシニアウィルスに感染させるステップと、
   （ｂ）ｐＨ７．１超を有する感染培地中で、感染させた該細胞を培養するステップと、
   （ｃ）培養物からワクシニアウィルスを採取するステップと
   を含む、方法。
2. ステップ（ａ）の間、接着したＨｅＬａ細胞の密度が、１０^４〜１０^６個のＨｅＬａ細胞／ｃｍ^２である、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ａ）の間、接着したＨｅＬａ細胞の密度が、約１０^５個のＨｅＬａ細胞／ｃｍ^２である、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＨｅＬａ細胞が、セルキューブ、セルファクトリー、Ｔ型フラスコ、ローラーボトル、またはマイクロキャリアに接着している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記ＨｅＬａ細胞が、一つ以上のプラスチックのローラーボトル容器に接着している、請求項４に記載の方法。
6. 前記一つ以上のローラーボトルが少なくとも１６８，０００ｃｍ^２の培養面積を備えている、請求項５に記載の方法。
7. ステップ（ａ）の間、ワクシニアウィルスの濃度が１０^３〜１０^５ｐｆｕ／ｍｌである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. ステップ（ａ）の間、ワクシニアウィルスの濃度が約１０^４ｐｆｕ／ｍｌである、請求項７に記載の方法。
9. 前記感染培地のｐＨが、７．２超であり、かつ好ましくは約７．３である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が、３６℃〜３７．５℃の温度で、好ましくは３７℃で実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. ステップ（ｂ）が、４０〜８０時間、好ましくは約４４時間の期間実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. ＨｅＬａ細胞１個当たり少なくとも５０ｐｆｕのワクシニアウィルスが生成され、好ましくは、ＨｅＬａ細胞１個当たり少なくとも７５ｐｆｕのワクシニアウィルスが生成される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記培地が、硫酸デキストラン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８、ポリソルベート８０、および大豆加水分解物のうちの一つ以上を含まない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記培地が硫酸デキストランを含まない、請求項１３に記載の方法。
15. 前記培地が、硫酸デキストラン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８、ポリソルベート８０、および大豆加水分解物を欠如している、請求項１４に記載の方法。
16. 前記培地がウシ胎児血清を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記培地が１０％未満のウシ胎児血清を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記培地が血清を含まない、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
19. ステップ（ａ）のｍ．ｏ．ｉ．が、約０．０１〜０．５ｐｆｕ／細胞であり、かつ好ましくは約０．０２ｐｆｕ／細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 採取された前記ウィルスが一つ以上の精製ステップに供される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記精製が、ＨｅＬａ細胞核酸を除去するためのヌクレアーゼによる前記採取されたウィルスの処理、および／またはＨｅＬａ細胞タンパク質を除去するためのプロテアーゼによる該採取されたウィルスの処理を含む、請求項１９に記載の方法。
22. 前記精製がタンジェンシャルフロー濾過ステップを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
23. 前記精製が、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーステップを含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記精製が、膜吸収クロマトグラフィーステップを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記ワクシニアウィルスが、ワクシニアウィルスのＩＨＤ−Ｊ株、ワイス株、ウェスタンリザーブ株、またはコペンハーゲン株である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記ワクシニアウィルスが組み換え型ワクシニアウィルスである、請求項２４に記載の方法。
27. 前記組み換え型ワクシニアウィルスが、免疫促進性ポリペプチドをコードする異種のコード領域を含む、請求項２５に記載の方法。
28. 前記免疫促進性ポリペプチドがサイトカインである、請求項２６に記載の方法。
29. 前記サイトカインが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項２７に記載の方法。
30. 前記組み換え型ワクシニアウィルスが腫瘍細胞において選択的に複製する、請求項２８に記載の方法。
31. 前記組み換え型ワクシニアウィルスが内因性遺伝子中に突然変異を含んでいる、請求項２９に記載の方法。
32. 前記組み換え型ワクシニアウィルスが機能性チミジンキナーゼ遺伝子を欠如している、請求項３０に記載の方法。
33. 前記組み換え型ワクシニアウィルスが、ワクシニアウィルスのＩＨＤ−Ｊ株、ワイス(Ｗｙｅｔｈ)株、ウェスタンリザーブ株、またはコペンハーゲン株である、請求項３１に記載の方法。
34. 前記組み換え型ワクシニアウィルスが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ポリペプチドをコードする、請求項３２に記載の方法。
35. 感染の前にＨｅＬａ培養物を増大させることをさらに含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記ＨｅＬａ細胞が、少なくとも一つのローラーボトル培養容器を通過し、該ローラーボトル培養容器が、直前の培養容器と比べて増加した培養面積を有する、請求項３４に記載の方法。
37. 前記ローラーボトル培養容器が少なくとも８５０ｃｍ^２の培養面積を有する、請求項３５に記載の方法。
38. 最終通路が、少なくとも１６８，０００ｃｍ^２の培養面積を有するローラーボトル培養容器である、請求項３５に記載の方法。
39. 前記ローラーボトル培養容器の播種と、感染との間の間隔が、４８〜９６時間である、請求項３７に記載の方法。
40. 前記接着ＨｅＬａ細胞を２×１０^３〜１×１０^５個の組み換え型複製コンピテントワクシニアウィルス／ｍｌと接触させる、請求項３８に記載の方法。

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