CN114395538A - 一种促进重组病毒载体向细胞外分泌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒载体制备，提供了一种促进重组病毒载体向细胞外分泌的方法。技术方案如下：在细胞培养或/和病毒接种的过程中，向培养基中加入一种含磺酸基的多糖类化学物质促进病毒载体向细胞外分泌。具体包括如下步骤：(1)细胞复苏；(2)细胞传代；(3)病毒接种及培养；(4)病毒收获。本发明通过在病毒扩增过程中加入一种含磺酸基的多糖类化学物质，促进病毒从胞内向细胞外分泌，从而在病毒收获过程中，无需裂解细胞，直接收获培养上清得到病毒，简化主要位于细胞内的病毒载体的收获工艺。本发明提供的方法工艺简单，不引入去污剂等有害化学物质，无需进行复杂的细胞裂解步骤就可收获病毒，经济环保。

Description

一种促进重组病毒载体向细胞外分泌的方法
技术领域
本发明涉及病毒载体制备，尤其涉及一种促进病毒载体收获的工艺。
背景技术
基因治疗是指将外源正常基因导入到靶细胞内校正或置换致病基因的一种疗法。通过这种疗法目的基因或与宿主细胞染色体整合或不整合位于染色体外但能在细胞中得到表达起到治疗疾病的目的。虽然病毒或非病毒载体均可以用来作为基因治疗载体，但是病毒载体由于其优异的感染细胞能力和递送基因的能力，是基因治疗的主流。
病毒载体的制备是一项非常复杂的工作，对病毒生产工艺的优化可以提高病毒生产效率。病毒载体的生产包括：细胞培养和扩增、病毒接种、病毒扩增、病毒收获和病毒纯化。病毒扩增后可能分泌至细胞上清，如慢病毒。还有一些病毒，如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒等病毒载体，收获时主要存在于细胞内，因此需要对细胞进行裂解，如去污剂处理、冻融或者超声裂解细胞释放病毒，但是这些裂解细胞的方法有如下缺点，1)增加工艺复杂程度的步骤，需要昂贵的专业设备；2)引入去污剂等有害化学物质；3)细胞裂解后会释放大量宿主DNA和蛋白质等杂质，给病毒纯化带来很大的挑战。对于病毒生产工艺而言，如果这些位于胞内的病毒，在扩增后能主动分泌至细胞上清，将会避免在收获病毒时裂解细胞，极大简化了病毒收获工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进病毒载体分泌至细胞外的方法，从而简化主要位于细胞内的病毒载体的收获工艺。本发明提供的方法工艺简单，不引入去污剂等有害化学物质，无需进行复杂的细胞裂解步骤就可收获病毒，经济环保。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明在细胞培养或/和病毒接种的过程中，向培养基中加入一种含磺酸基的多糖类化学物质，如硫酸葡聚糖及其钠盐、肝素钠等，其特点在于，加入该多糖可以促进病毒载体向细胞外分泌。
本发明公开了一种促进重组病毒载体向细胞外分泌的方法，其特征在于，将培养后的细胞进行病毒接种，在病毒接种过程中，向培养基中加入硫酸葡聚糖。
进一步地，所述病毒接种过程中，向培养基中加入0.01％～1％质量浓度的硫酸葡聚糖。
进一步地，所述硫酸葡聚糖分子量为5kD～500kD。
进一步地，所述病毒接种步骤的病毒加入量＝细胞密度×培养体积×MOI/毒种滴度。
进一步地，所述的病毒为人5型腺病毒或I型单纯疱疹病毒。
进一步地，所述的细胞为HEK293或Vero细胞。
进一步地，所述病毒接种步骤的细胞培养条件为30.0℃～38.0℃，5.0％～8％CO2。
进一步地，所述病毒接种后还包括病毒收获步骤：病毒接种培养后，收集细胞培养物，离心取上清。
本发明具体包括如下步骤：
1)细胞复苏：从液氮中取1支细胞，液氮或者冰浴转移至水浴锅旁，37.0℃±1.0℃水浴快速融化(120s±30s)，无菌转移至含有培养基的15ml离心管中，526×g，25℃离心5min，弃除上清液。细胞沉淀使用10ml培养基重悬后无菌转移至摇瓶或方瓶中，使用培养基补足体积，在摇床或培养箱中培养，30.0℃～38.0℃，5.0％～8％CO2条件下培养。
2)贴壁细胞传代方式：待细胞培养48～72h后，显微镜下观察细胞汇合率，汇合率>85％后弃上清；加入10ml DPBS润洗，润洗后弃除DPBS；加入5ml TrypLE室温消化细胞2min；加入5ml完全培养基终止消化，使用移液枪轻轻吹打混匀，取样计数。根据铺板密度计算细胞液用量，加入方瓶中(细胞液用量＝细胞密度×培养面积/细胞密度)；完全培养基补足培养体积至15ml；30.0℃～38.0℃，5.0％～8％CO2条件下培养。
3)悬浮细胞传代方式：待细胞培养48～72h后，取样计数。根据传代细胞密度计算细胞液用量，加入摇瓶中(细胞液用量＝传代细胞密度×培养体积/细胞密度)；培养基补足培养体积；30.0℃～38.0℃，5.0％～8％CO2条件下培养。
4)病毒接种：取样计数细胞密度，根据感染复数(MOI)计算病毒加入体积(病毒加入体积＝细胞密度×培养体积×MOI/毒种滴度)；取毒种加入细胞中，并同时加入0.01％～1％(w/v)的硫酸葡聚糖(分子量范围：5kD～500kD)，混匀。30.0℃～38.0℃，5.0％～8％CO2条件下培养。
5)病毒收获：病毒扩增24～96h后，收集细胞培养物，2000×g，4℃离心5min，弃细胞沉淀，留取上清，完成病毒收获。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明在病毒扩增过程中加入一种含磺酸基的多糖类化学物质，例如，硫酸葡聚糖及其钠盐、肝素钠，促进病毒从胞内向细胞外分泌，从而在病毒收获过程中，无需裂解细胞，直接收获培养上清得到病毒。收获液中宿主细胞DNA和蛋白质残留远远低于直接裂解细胞的方法收获的病毒液。本发明对于主要位于细胞内的病毒收获工艺具有较高的参考价值。
本发明提供的方法工艺简单，不引入去污剂等有害化学物质，无需进行复杂的细胞裂解步骤就可收获病毒，经济环保。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：人5型腺病毒载体的扩增和收获
1)细胞复苏：从液氮中取1支HEK293悬浮细胞，液氮或者冰浴转移至水浴锅旁，37.0℃±1.0℃水浴快速融化(120s±30s)，无菌转移至含有Dyanmis培养基的15ml离心管中，526×g，25℃离心5min，弃除上清液。细胞沉淀使用10ml培养基重悬后无菌转移至125ml摇瓶中，使用Dyanmis培养基补足体积至30ml，取样计数为0.5×106cells/ml，在摇床中培养，37.0℃，5.0％CO2条件下培养。
2)细胞传代：待细胞培养72h后，取样计数，为4.5×106cells/ml。根据传代细胞密度(0.5×106cells/ml)，将30ml细胞培养液用Dyanmis培养基稀释至270ml；37.0℃，5.0％CO2条件下培养。
3)接毒前细胞培养：当细胞生长48h后，取样计数，为2.3×106cells/ml，然后使用等体积Dyanmis培养基，将细胞密度稀释至1.0×106cells/ml左右，体积约550ml，继续培养24h，当细胞密度生长至2.0×106cells/ml左右时，开始接毒。
4)接毒：取样计数，细胞密度为2.1×106cells/ml，按照培养体积550ml，将细胞平分两份，每份275ml。一份正常接毒，作为对照组；一份接毒同时加入0.1％的硫酸葡聚糖，作为实验组。按照MOI＝10计算，共需要1.15×1010PFU总量的毒种，取约10ml毒种(毒种滴度约1.2×109PFU/ml)，每份细胞加入5ml毒种；按照0.1％(w/v)浓度计算所需硫酸葡聚糖用量，取约2.7ml 10％(w/v)硫酸葡聚糖溶液，加入实验组细胞，混匀，37.0℃，5.0％CO2条件下培养。
5)病毒收获：病毒扩增培养72h后，将细胞培养液2000×g，4℃离心5min，分别收取上清和细胞沉淀。细胞沉淀使用等体积新鲜的Dyanmis培养基重悬后，于-80.0℃/37.0℃反复冻融3次，然后2000×g，4℃离心5min，取上清中的细胞裂解液。检测培养上清和细胞裂解液中的腺病毒感染滴度和宿主蛋白(HCP)等杂质，结果如下表所示：
表1.使用硫酸葡聚糖促进腺病毒载体细胞外分泌结果
Figure BDA0003477441270000041
本实施例中，1)实验组中的上清样品中病毒感染滴度显著高于细胞裂解液，而对照组中的结果正好相反，说明在接毒时加入0.1％硫酸葡聚糖可以显著提高病毒分泌至细胞外上清中；2)对照组中的病毒主要位于细胞内，裂解后，病毒样品的HCP残留显著高于实验组直接收取上清病毒样品中的HCP，不利于病毒纯化。
实施例2：I型单纯疱疹病毒载体的扩增和收获
1)细胞复苏：取1支Vero细胞工作库的细胞放置于液氮中转移到水浴锅，在37℃±1℃水浴中快速解冻，时间控制120s±30s。细胞转移到1支含有9ml 37℃±1℃预热的四种DMEM培养基(含10％FBS)的15ml离心管中。稀释后的细胞悬液于常温(125×g)离心7～9min。弃上清，将细胞沉淀分别重悬于10ml 37℃±1℃预热的MEM培养基(含10％FBS)中。混匀后取样计数，转移至T25瓶中，共4个T25培养瓶放入37℃±1℃，5±0.5％CO2培养箱中培养。
2)细胞传代：复苏培养72～96h，汇合率大于95％。弃上清，加入10ml/T25 DPBS润洗2次，然后加入1ml/T25 TrypLE浸润细胞，37℃下消化5～10min左右，期间显微镜观察细胞脱落情况。待细胞开始脱落后，取10ml/T25 37℃±1℃预热的细胞培养液终止消化，吹打混匀，取0.2ml计数，记录细胞密度和活率(大于90％)，用完全培养液定容至30ml/T75，按1：6传代，控制接种密度在3.2×104～3.5×104cells/cm2进行传代，各传至2个T75培养瓶中，共2个T75培养瓶放于37℃±1℃，5％±0.5％CO2培养箱中培养。多余细胞弃去。
3)接毒前细胞培养：培养72～96h，弃上清，加入20ml/T75 DPBS润洗2次，然后加入2ml/T75 TrypLE浸润细胞，移入二氧化碳培养箱中37.0℃±1.0℃消化细胞5～15min期间观察细胞脱落情况，待细胞开始脱落后，取30ml/T75 37℃±1℃预热的完全培养液终止消化，吹打混匀，取0.2ml计数，记录细胞密度和活率(大于90％)，用培养液定容至90ml/T225，按1：6传代，控制接种密度3.2×104～3.5×104cells/cm2进行传代，各传至4个T225培养瓶中，共4个T225培养瓶放于37.0℃±1.0℃，5％±0.5％CO2培养箱中培养。多余细胞弃去。
4)病毒培养：接毒前镜检观察。取用于计数的T225培养瓶，进行消化计数，计算所需毒种量(MOI＝0.01)。接毒前进行换液，弃上清，对照组加入同等培养体积病毒感染液(DMEM+病毒)，实验组加入同等体积的含0.1％硫酸葡聚糖的病毒感染液。培养瓶在36℃±1℃，5％±0.5％CO2培养箱中培养。
5)病毒收获：病毒培养72h后，对照组和实验组收取上清，然后分别使用等体积的新鲜90％DMEM+10％FBS培养基重悬贴壁的Vero细胞，于-80.0℃/37.0℃反复冻融3次，然后2000×g，4℃离心5min，取上清中的细胞裂解液。检测培养上清和细胞裂解液中的I型单纯疱疹病毒感染滴度和宿主蛋白(HCP)等杂质，结果如下表所示：
表2.使用硫酸葡聚糖促进I型单纯疱疹病毒载体细胞外分泌结果
Figure BDA0003477441270000051
本实施例中，1)实验组中的上清样品中I型单纯疱疹病毒病毒感染滴度显著高于细胞裂解液，而对照组中的结果正好相反，说明在接毒时加入0.1％硫酸葡聚糖可以显著提高I型单纯疱疹病毒分泌至细胞外上清中；2)对照组中的病毒主要位于细胞内，反复冻融裂解后，病毒样品的HCP残留显著高于实验组直接收取上清病毒样品中的HCP，不利于病毒纯化。

Claims (8)

1.一种促进重组病毒载体向细胞外分泌的方法，其特征在于，将培养后的细胞进行病毒接种，在病毒接种过程中，向培养基中加入硫酸葡聚糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述病毒接种过程中，向培养基中加入0.01％～1％质量浓度的硫酸葡聚糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述硫酸葡聚糖分子量为5kD～500kD。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述病毒接种步骤的病毒加入量＝细胞密度×培养体积×MOI/毒种滴度。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的病毒为人5型腺病毒或I型单纯疱疹病毒。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的细胞为HEK293或Vero细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述病毒接种步骤的细胞培养条件为30.0℃～38.0℃，5.0％～8％CO2。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述病毒接种后还包括病毒收获步骤：病毒接种培养后，收集细胞培养物，离心取上清。
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