CN104087549A - 高产杆状病毒的昆虫细胞系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产杆状病毒的昆虫细胞系，SuperSpodopterafrugiperdaa（SuperSf-a），其保藏编号为CCTCCNo.C2014100；该细胞系具有高产杆状病毒的能力，可高效表达外源基因，对杆状病毒感染敏感性高等特性，其表达的外源病毒蛋白或病毒样颗粒产物具有较强的生物活性，符合疫苗的生产要求；经过外源病毒检测、支原体检测、无菌检测、外源因子检测后，该细胞系的各种指标均符合疫苗生产用细胞基质的要求；可应用于杆状病毒和疫苗的生产。
Description
技术领域
本发明涉一种新的昆虫细胞系，具体涉及一种高产杆状病毒的昆虫细胞系及其应用。
背景技术
近20年来BEVS被成功地用于表达了许多外源基因的实践证明，目前有3个相对比较好的细胞系具有良好的性质适用于AcMNPB和BmNPV重组蛋白表达的研究和生产，它们是来源于秋粘虫卵巢组织的IPLB-SF21AE(Sf21)细胞系及其衍生株Sf9和来自甘蓝尺镬的BTI TN5B1-4(High Five)细胞系以及来源于家蚕卵巢的BmN及其亚系。这些昆虫细胞系没有一个象许多普通应用的哺乳动物细胞系那样含有潜在有害的转化因子。最近Protein Science公司报道了一个新的取得了商业许可的细胞系(Express SF+)，该系比Sf9更优秀，另一商品化的昆虫细胞系Ea4(Novagen公司)-BTI EAA细胞系的亚系能在表达产物上附加复杂的糖链。近年来从不同的鳞翅目昆虫中建立了许多新的细胞系，但尚未发现在蛋白表达方面表现优秀的细胞系。鉴于这一原因，不少科研将研究重点转移到对现有细胞株进行改造与筛选上。以提高重组杆状病毒的产毒量、目标蛋白的表达产量。
昆虫细胞属于半贴壁细胞，贴壁培养时需要添加10％的胎牛血清(FBS)，悬浮培养时可以用无血清悬浮培养基进行培养，现有的利用BEVS系统表达蛋白，用来制备疫苗均采用悬浮培养的方式进行。因此采用的昆虫细胞系的倍增时间、能达到的最高密度、生产杆状病毒的能力、对病毒的敏感性、表达外源基因的能力成为选择的首要标准。
目前国内外已经利用昆虫-杆状病毒表达系统已经成功开发上市了多种疫苗产品：人用上市疫苗包括：GSK公司的二价宫颈癌疫苗(CERVARIX)，Protein Sciences公司的三价流感疫苗(FLUBLOK)、Dendreon公司的前列腺癌疫苗(PROVENGE)、uniQure公司的脂蛋白脂酶缺乏症的基因治疗疫苗(Glybera)，兽用上市疫苗包括牛环状病毒疫苗(Intervet/Schering-Ploug(Merck))、猪瘟病毒疫苗(Intervet/Schering-Plough(Merck))等，以及处于临床期的十多种疫苗。
将目标基因经过优化，然后通过分子生物学手段，构建获得重组杆状病毒，再通过杆状病毒感染昆虫细胞，经过表达获得目标蛋白，在经过各种纯化手段获得符合要求的目标产物，是目前利用昆虫-杆状病毒表达系统开发疫苗产品的基本思路。
目前已经上市和正处于临床期间的利用该表达系统生产的疫苗在大规模临床实验中显示出较好的预防效果，这是因为利用昆虫细胞生产的蛋白质更容易糖基化，使蛋白质更加接近天然状态的活性。
非专利文献1：Rose，R.C.，Bonnez，W.，Reichman，R.C.，Garcea，R.L.，1993.Expression ofhuman papillomavirus type 11 L1 protein in insect cells：in vivo and in vitro assembly of virus-likeparticles.J.Virol.67，1936-1944.
非专利文献2：Protein Sciences Corporation，Meriden.FluBlok，a next generation influenzavaccine manufactured in insect cells.Biologicals.2009Jun；37(3)：182-9.doi：10.1016/j.biologicals.
2009.02.014.Epub 2009 Mar 17
非专利文献3：Lin YL，Yu CI，Hu YC，Tsai TJ，Kuo YC，Chi WK，Lin AN，Chiang BLEnterovirus type 71 neutralizing antibodies in the serun of macaque monkeys immunized withEV71 virus-like particles.Vaccine.2012 Feb 8；30(7)：1305-12.doi：10.1016/j.vaccine.2011.12.081.Epub 2011 Dec 31.
专利文献1：WO2007/018049
上述非专利文献1～3和专利文献1的全部记载在此作为本申请的特别公开内容。
在非专利文献1中，采用Sf9细胞作为表达人乳头瘤病毒(HPV)11型L1蛋白的细胞系，利用昆虫-杆状病毒表达系统(BEVS)成功的表达了HPV11型L1蛋白，并制备成功了HPV11VLPs。证明昆虫-杆状病毒系统可以成功的应用于疫苗生产系统。
在非专利文献2中，采用Express Sf+细胞作为表达人流感病毒外壳蛋白的细胞系，利用昆虫-杆状病毒表达系统(BEVS)成功的表达了人流感病毒外壳蛋白，通过多步纯化制备成了流感疫苗，临床试验证明制备的流感疫苗具有较好的免疫原性。Express Sf+细胞为ProteinSciences Corporation自行从Sf9细胞中筛选获得，并获得美国FDA认可与美国专利授权，说明采用不同的筛选途径可以从Sf9中获得不同的新型昆虫细胞系。
在非专利文献3中，报道了EV71病毒样颗粒作为候选疫苗在猴子中诱导的抗血清中和抗体滴度情况，说明EV71病毒样颗粒具有较高的免疫原性。
发明内容
本发明通过筛选获得一种高产杆状病毒、对高杆状病毒感染敏感、高效表达外源基因的新昆虫细胞系Super Sf-a，该细胞系可用于作为疫苗生产用的细胞基质。
本发明的目的在于提供一种新的昆虫细胞系：Super Sf-a。
本发明的另一目的在于提供Super Sf-a细胞系在生产杆状病毒和疫苗中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
申请人将细胞系Super Spodopterafrugiperda a(简称Super Sf-a)保藏在位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心于2014年5月21日收到申请人提供的细胞株。保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCC No.C2014100，提议的分类命名为Super Spodopterafrugiperda a。
本发明的有益效果是：
本发明建立了一种新的昆虫细胞系，即Super Sf-a细胞系；在本发明中，经用同种的重组杆状病毒对不同来源的昆虫细胞系进行测试发现，Super Sf-a细胞系具有更高的生产杆状病毒能力，可高效表达外源基因，对杆状病毒感染敏感性高等特性，其表达的外源病毒蛋白或病毒样颗粒产物具有较强的生物活性，符合疫苗的生产要求；经过外源病毒检测、支原体检测、无菌检测、外源因子检测后，该细胞系的各种指标均符合生产用细胞基质的要求。
附图说明
图1为Super Sf-a细胞的光学显微镜图；
图2为Super Sf-a细胞核型图；
图3为Super Sf-a细胞的生长曲线图；
图4为Super Sf-a细胞在无血清培养基中的生长曲线；
图5为Super Sf-a与ATCC Sf-9、Invitrogen Sf-9对杆状病毒敏感性的比较；
图6为Super Sf-a细胞与ATCC Sf-9、Invitrogen Sf-9生产杆状病毒的能力比较；
图7为不同传代次数的Super Sf-a细胞扩增杆状病毒的情况；
图8为ATCC Sf-9细胞、Invitrigen Sf-9细胞、Super Sf-a细胞生产重组EV71-VLP的能力比较；
图9为ATCC Sf-9细胞、Invitrigen Sf-9细胞、Super Sf-a细胞生产外源病毒蛋白HPV-L1的能力比较；
图10为ATCC Sf-9细胞、Invitrigen Sf-9细胞、Super Sf-a细胞表达RV-G蛋白的能力比较；
图11为ATCC Sf-9细胞、Invitrigen Sf-9细胞、Super Sf-a细胞生产重组HA-VLP的能力比较；
图12为ATCC Sf-9细胞、Invitrigen Sf-9细胞、Super Sf-a细胞生产重组CHIKV-VLP能力比较；
图13为ATCC Sf-9细胞、Invitrigen Sf-9细胞、Super Sf-a细胞生产重组PV-VLP能力比较；
图14为ATCC Sf-9细胞、Invitriigen Sf-9细胞、Super Sf-a细胞生产重组RSV-VLP能力比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
一、Super Sf-a细胞系的建立
Super Sf-a(Super Spodopterafrugiperda a)细胞系是从S.frugiperda Sf-9中分离获得的。该细胞系是Sf-9细胞经过多轮有限稀释，然后利用商业化的无血清昆虫悬浮培养基进行条件化筛选获得，并建立了符合疫苗生产用细胞基质要求的细胞库。具体筛选步骤如下：
1)用于筛选的Sf-9(Spodoptera frugiperda Sf-9)是来源于ATCC(ATCC CRL-1711)，根据ATCC提供的证明材料(COA)显示，该细胞来源于德州农工大学(Texas A&M university)，在德州农工大学传了4代，在ATCC传了16代，本发明人购买后继续传代30建立了细胞库(sf-9主细胞库，批号为20130304)，冻存于液氮中，然后从主库细胞取一只复苏，传代10代建立工作细胞库(Sf-9工作细胞库，批号20130408)。
2)从Sf-9工作细胞库中选取一支，37℃水浴复苏，低速离心除去所有含有血清培养基，然后细胞用Grace培养基(Grace培养基，Life Technolofies，批号：1124801)+10％胎牛血清(Gibco，Life Technologies，批号：10099)进行多轮细胞单克隆化，挑选细胞一致性较好，形态均一，外观饱满的细胞单克隆候选株保存。
3)对第一轮保存的单克隆细胞进行杆状病毒敏感性、生产杆状病毒能力、表达外源基因能力测试，筛选敏感性强、生产杆状病毒和表达外源基因能力强的单克隆细胞进行保存。
4)经过筛选的单克隆细胞进行第二轮单克隆筛选获得形状更稳定的二次单克隆细胞，再次对二次克隆单细胞进行杆状病毒敏感性、生产杆状病毒能力、表达外源基因能力测试，筛选符合条件的单克隆细胞进行保存。
5)经过两轮单克隆筛选后的细胞经过测试检测完毕，建立筛选候选细胞株。
6)从细胞候选株中选择各种性状均较优越的细胞株，然后用无血清昆虫培养基(Sigma，EX-cell-420干粉培养基，批号：24420C)逐步替换Grace培养基，直至完全为无血清培养基。
具体的培养其替换过程如下：
7)将Grace培养基完全替换成EX-cell-420培养基的细胞，继续用EX-cell-420培养基继续培养10代，建立原始细胞库，用冻存液(45％新鲜EX-cell-420培养基+45％条件化EX-cell-420培养基+10％DMSO)冻存于液氮中，即获得Super Sf-a细胞原始库。其中，条件化EX-cell-420培养基为将培养悬浮细胞2天后的培养基离心，去掉细胞及细胞碎片，用0.22μ滤器过滤澄清、除菌后的培养基。
8)取一支原始库细胞，37℃复苏，低速离心去除冻存液，细胞悬浮于新鲜EX-cell-420培养基中，密度为1.5×106/ml，28℃，120rpm培养。由原始库细胞扩大培养四代至细胞密度为4.0×106/ml，细胞活力大于98％，开始按照原始库细胞冻存液冻存细胞，建立主细胞库，主细胞库也冻存于液氮中。
9)取一支主库细胞，37℃复苏，低速离心去除冻存液，细胞悬浮于新鲜EX-cell-420培养基中，密度为1.5×106/ml，28℃，120rpm培养。由主库细胞扩大培养四代至细胞密度为4.0×106/ml，细胞活力大于98％，开始按照主库细胞冻存液冻存细胞，建立工作库，工作库也冻存于液氮中。
二、Super Sf-a细胞系的鉴定
(1)光学显微镜观察
Super Sf-a细胞光学显微照片图如图1所示，Super Sf-a细胞平均直径为20.2±0.2μm比Invitrigen Sf-9、ATCC Sf-9细胞平均直径大4μm左右。
(2)核型分析
Super Sf-a细胞核型分析图如图2所示。对Super Sf-a细胞进行核型分析，在统计的100个分裂中期细胞中，染色体数目主要分布在185～225条之间，每个分裂中期细胞染色体数目平均为206条，对Invitriigen Sf-9、ATCC Sf-9细胞进行核型分析，在所统计的100个细胞中，每个细胞的染色体数目平均为186条，细胞的染色体数目主要分布在160～190条之间。进一步说明本发明的Super Sf-a细胞系不同于母本ATCC Sf-9细胞系。
(3)同工酶分析
对Super Sf-a细胞进行同工酶分析，分别分析了乳酸脱氢酶(LDH)；天冬氨酸氨基转移酶(AST)；6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)；苹果酸酶(ME)，并与其他细胞系进行比较，如ATCC Sf9、Sf21、BHK、Vero、SL2、MRC-5和Aedes，具体数据见表1。
表1 Super Sf-a细胞系的同工酶分析
注：“--”表示此酶没有检测到；PCB表示原始库，MCB表示主库；WCB表示工作库。
从表1中分析结果可以获知本发明的Super Sf-a细胞系同工酶与已有的昆虫细胞ATCCSf9、Sf21种类相似，不同于其他哺乳动物细胞与昆虫细胞。
(4)Super Sf-a细胞生长特性鉴别
Super Sf-a细胞在27℃～28℃条件下生长，利用无血清昆虫培养基(Sigma，EX-cell-420干粉培养基，批号：24420C)进行培养，每周传代三次，每次传代细胞密度按照1.5×106个细胞/ml进行，细胞平均直径为20.2±0.2μm，Super Sf-a细胞呈现指数增长，细胞倍增时间为16小时～20小时，具体见图3所示的生长曲线图，一般3～4天细胞密度可达到6～9×106个细胞/ml，活力大于96％，连续传50代，均能保持相应的标准(如图4所示)。
另外，对建完库后的细胞经过测试分析，Super Sf-a细胞还具有以下特性：
1)Super Sf-a细胞基因型和表现型不同于父代的Sf9细胞。
2)Super Sf-a细胞能够用无血清昆虫悬浮培养基在贴壁培养与悬浮培养之间相互转换培养，不影响细胞生物学特性。
3)Super Sf-a细胞呈现指数增长，倍增时间为16～20小时，见图3所示的细胞生长曲线图，细胞平均直径为20.2±0.2μm。
4)Super Sf-a细胞经连续传代70代实验，细胞活力维持稳定均＞98％。
5)Super Sf-a细胞呈现单个悬浮生长细胞，没有明显聚集成团。
6)Super Sf-a细胞对核型多角体病毒(AcNPV)具有极高敏感性。
7)Super Sf-a细胞可以用来感染重组杆状病毒，表达外源基因，获得目标蛋白。
8)Super Sf-a细胞可以用来进行杆状病毒噬斑纯化。
9)Super Sf-a细胞可以用来生产高滴度的杆状病毒。
10)Super Sf-a细胞符合政府的疫苗生产用细胞基质的要求。
三、Super Sf-a细胞系的安全性检测
建完库后对细胞系进行安全性测试和分析：
按照中国国家食品药品监督管理总局(SFDA)有关生物制品生产用细胞基质的要求，结合《中华人民共和国药典》2010年版第三部关于生产用细胞基质的有关检测方法对Super Sf-a细胞进行全面检测，检测项包括：无菌、致瘤性、支原体、螺原体、外源病毒、逆转录病毒等。
(1)无菌检测(细菌、真菌、支原体)：按照《中华人民共和国药典》2010年版第三部附录XIIA进行检测，结果符合要求。
(2)细胞法检测外源病毒：用Super Sf-a细胞工作库细胞(WCB)的某一代次1×107个细胞和培养上清液转接人二倍体细胞和蚊子细胞、果蝇细胞、牛肾细胞、不同代次的SuperSf-a细胞等，没有发生细胞病变与血吸附现象，结果符合要求。
(3)动物法和鸡胚检测外源病毒：
按照中国药典要求进行，结果符合要求，具体结果如下：
(4)逆转录病毒检测：利用透射电镜观察细胞切片，进行确定，检测结果为阴性，符合要求。
(5)细胞致瘤性研究：采用BALB/c裸鼠进行检测，检测结果为Super Sf-a细胞不具备致瘤性，符合要求。
(6)螺原体检测：采用罗氏螺原体检测试剂盒进行检测，实验结果为Super Sf-a细胞阴性，符合要求。
四、Super Sf-a细胞系生物量能力的检测
在大规模生物反应器中，用杆状病毒分别感染Super Sf-a细胞、ATCC Sf-9细胞、InvitngenSf-9细胞，比较不同细胞的生物量。
利用重组的手足口病(EV71)杆状病毒以同样的MOI(MOI＝0.5)分别感染Super Sf-a细胞、ATCC来源的Sf9细胞与Invitrigen Sf-9细胞，感染细胞密度为2.0×106/mi，按照50L生物反应器体积进行培养，感染96小时后收获细胞，离心收集细胞沉淀，并称重，比较所收获的细胞的生物量(如表1所示)。
从表1中可以看出在同样的细胞密度下接种杆状病毒后，Super Sf-a细胞生物量比ATCCSf-9细胞、Invitfigen Sf-9细胞平均高2.5倍以上。Super Sf-a的高细胞生物量可能主要有两方面的原因，一方面Super Sf-a细胞的倍增时间短为16-20小时，ATCC Sf-9细胞、Invitrigen Sf-9的倍增时间为18-24小时；另一方面Super Sf-a细胞尺寸较大，细胞平均直径为20.2±0.2μm。Super Sf-a的这种高生物量可间接体现出Super Sf-a将更有利于杆状病毒的大量生产和外源蛋白的高量表达。
表2ATCC Sf-9细胞、Invitrigen Sf-9细胞及Super Sf-a生物量的比较
五、Super Sf-a细胞对杆状病毒敏感性研究
利用构建的携带绿色荧光蛋白(GFP)的重组杆状病毒(核型多角体病毒)按照MOI＝0.5分别感染ATCC来源的Sf-9细胞(即ATCC Sf-9)与Life Technologies公司来源的Sf-9细胞(即Invitrogen Sf-9)以及Super Sf-a细胞，三种细胞密度分别为2.0×106/ml，2.4×106/ml，2.0×106/ml。接毒后，28℃培养48小时后观察，计算荧光数。
计数结果如图5所示，从图中可以看出单位体积的Super Sf-a细胞中绿色荧光数(379.5个/0.32cm2)明显高于ATCC Sf-9(113个/0.32cm2)和Invitrogen Sf-9(97个/0.32cm2)中的荧光数，说明Super Sf-a细胞中的杆状病毒数明显高于其他两种Sf-9细胞。
上述实验结果表明Super Sf-a细胞对杆状病毒的敏感性均大大高于ATCC来源的Sf-9细胞与Life Technologies公司来源的Sf-9细胞。
六、Super Sf-a细胞生产杆状病毒能力研究
(1)Super Sf-a细胞与Sf-9细胞生产杆状病毒能力的比较
利用构建的携带绿色荧光蛋白(GFP)的重组杆状病毒(核型多角体病毒)按照MOI＝0.2分别感染ATCC来源的Sf-9(即ATCC Sf-9)细胞与Life Technologies公司来源的Sf-9细胞(即Invitrogen Sf-9)以及Super Sf-a细胞，三种细胞密度分别为2.0×106/ml，2.4×106/ml，2.0×106/ml。接毒后，28℃培养，分别于48小时、72小时、96小时、120小时、144小时取样测定病毒滴度。
测定结果如图6所示，从图中可以看出单位体积的Super Sf-a细胞中杆状病毒的滴度明显高于ATCC Sf-9和Invitrogen Sf-9中的滴度，尤其是在生产100～120小时后，Super Sf-a细胞中的杆状病毒滴度最高可达1.20E+08，而ATCC Sf-9和Invitrogen Sf-9的杆状病毒滴度仅约为2.00E+07。
上述实验结果表明Super Sf-a细胞产杆状病毒的能力均大大高于ATCC来源的Sf-9细胞与Life Technologies公司来源的Sf-9细胞。
(2)不同传代次数的Super Sf-a细胞扩增杆状病毒的能力
Super Sf-a细胞的一个显著特性就是可以扩增高滴度的杆状病毒。利用工作细胞库进行传代、扩增目标杆状病毒，每代细胞密度按照1.5×106个细胞/ml进行扩增，连续扩增50代；对不同传代次数的Super Sf-a细胞进行接毒，接毒细胞密度按照2×106个细胞/ml，接毒MOI按照0.5进行，接毒72小时后进行收获，4000转/分钟，离心去细胞，收获上清，病毒滴度按照噬斑法进行测定。
测定结果如图7所示，从中可以不同传代次数的Super Sf-a细胞均能生产高滴度的杆状病毒，并通过对50代细胞扩增杆状病毒的结果比较分析，以接毒细胞密度按照2×106个细胞/ml，MOI＝0.5进行接毒，72小时收获毒液，获得的目标杆状病毒滴度最高2.4×108pfu/ml，最低7.0×107pfu/ml，平均滴度为1.4×108pfu/ml。
七、Super Sf-a细胞表达外源基因能力研究
(1)Super Sf-a细胞与Sf-9细胞表达外源基因能力的比较
利用核型多角体病毒分别构建携带手足口病病毒(EV71)基因、人乳头瘤病毒(HPV)基因、犴犬病G蛋白(RV-G)基因、流感病毒(HA)基因、基孔肯雅热病毒(CHIKV)基因、脊髓灰质炎病毒(PV)基因、呼吸道合胞病毒(RSV)基因的重组杆状病毒，按照MOI＝0.5分别感染ATCC来源的Sf-9细胞(即ATCC Sf-9)细胞与Life Technologies公司来源的Sf-9细胞(即Invitrogen Sf-9)以及Super Sf-a细胞，三种细胞密度分别为2.0×106/ml，2.4×106/ml，2.0×106/ml。接毒后，28℃培养，分别于48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时取样测定各重组杆状病毒表达外源病毒基因、生产各种病毒样颗粒的能力，检测方法主要采用ELISA法检测各病毒样颗粒的生产能力，以及外源病毒蛋白的表达能力。
测定结果如图8～14所示，分别为上述三种细胞系在不同时间生产手足口病病毒样颗粒(EV71-VLP)的生产量(图8)、人乳头瘤病毒L1蛋白(HPV-L1)的表达量(图9)、狂犬病G蛋白(RV-G)的表达量(图10)、流感病毒病毒样颗粒(HA-VLP)的生产量(图11)、基孔肯雅热病毒病毒样颗粒(CHIKV-VLP)的生产量(图12)、脊髓灰质炎病毒病毒样颗粒(PV-VLP)的生产量(图13)、呼吸道合胞病毒病毒样颗粒(RSV-VLP)的生产量的能力比较；从中可以看出Super Sf-a细胞对上述外源病毒蛋白的表达能力、以及生产上述病毒样颗粒的能力均高于ATCC Sf-9和Invitrogen Sf-9细胞，尤其是在培养120小时以后。
上述实验结果表明Super Sf-a细胞表达外源基因(包括表达病毒样颗粒与重组蛋白)的能力大大高于ATCC来源的Sf-9细胞与Life Technologies公司来源的Sf-9细胞。
(2)Super Sf-a细胞表达外源基因
Super Sf-a细胞具有高表达外源目标基因的特性，最佳接毒的细胞密度为2×106个细胞/ml，最佳接毒MOI为1.0，培养温度为28.5℃，培养基采用流加补充的方式进行，从24小时后，开始补料，溶氧整个过程控制在35％以上。
利用不同病毒目标基因进行昆虫源密码子优化，然后构建不同重组杆状病毒，并利用各自的杆状病毒分别接种Super Sf-a细胞，接种细胞密度为2×106个细胞/ml，培养条件按照上述方法进行，每种重组病毒分别生产50L，采用Sepharose4FF、阳离子层析、阴离子层析、羟基磷灰石等纯化方式相组合，对表达产物进行纯化。
具体利用Super Sf-a细胞表达的外源基因及结果如表3所示。
表3 Super Sf-a细胞表达的外源基因及结果
八、工业实用性
按照中国国家食品药品监督管理总局(SFDA)有关生物制品生产用细胞基质的要求，结合《中华人民共和国药典》2010年版第三部关于生产用细胞基质的有关检测方法对Super Sf-a细胞进行全面检测，检测项包括：无菌、致瘤性、支原体、螺原体、外源病毒、逆转录病毒等。所有检验结果均符合要求，能够作为疫苗生产用的细胞基质。
利用Super Sf-a细胞按照疫苗生产的要求制备符合要求的疫苗：
首先，构建重组杆状病毒：利用核型多角体病毒分别构建携带手足口病病毒(EV71)基因、人乳头瘤病毒(HPV)基因、狂犬病G蛋白(RV-G)基因、流感病毒(HA)基因、基孔肯雅热病毒(CHIKV)基因、脊髓灰质炎病毒(PV)基因、呼吸道合胞病毒(RSV)基因的重组杆状病毒；
其次，利用获得的重组杆状病毒以一定的感染复数(MOI)感染Super Sf-a细胞，感染后72～96小时收获细胞，裂解细胞，经过多步柱层析纯化获得目标重组蛋白或者目标VLPs颗粒，将纯化的重组蛋白或者目标VLPs颗粒与氢氧化铝佐剂按照一定的比例混合，即成重组蛋白疫苗或病毒样颗粒疫苗；
最后，按照标准规定的免疫程序将上述疫苗免疫新生小鼠获得抗血清，经检测发现各种抗血清均有较高的抗体滴度。
Claims (8)
1.一种高产杆状病毒的昆虫细胞系，其名称为Super Spodoptera frugiperda a，简称Super Sf-a，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC No. C2014100。
2.权利要求1所述的Super Sf-a细胞系在生产杆状病毒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的杆状病毒为核型多角体病毒。
4.权利要求1所述的Super Sf-a细胞系在疫苗生产过程中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的疫苗为病毒样颗粒疫苗或重组蛋白疫苗。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的病毒样颗粒疫苗或重组蛋白疫苗是以杆状病毒为表达系统生产的疫苗。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述的病毒样颗粒疫苗选自手足口病病毒样颗粒（EV71-VLP）疫苗、人乳头瘤病毒样颗粒（HPV-VLP）疫苗、流感病毒样颗粒（HA-VLP）疫苗、基孔肯雅热病毒样颗粒（CHIKV-VLP）疫苗、脊髓灰质炎病毒样颗粒（PV-VLP）疫苗或呼吸道合胞病毒样颗粒（RSV-VLP）疫苗。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述的重组蛋白疫苗选自狂犬病G蛋白疫苗。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: Moon Road, Science City high tech Industrial Development Zone of Guangzhou City, Guangdong province 510663 No. 3 Guangzhou international business incubator F F715. Patentee after: Guangdong Southern China vaccine Limited by Share Ltd Address before: 510663 Guangdong city of Guangzhou province high tech Industrial Development Zone of Guangzhou Science City skim Springs Road No. 3, Guangzhou international business incubator area F room 701 Patentee before: Southern China United Vaccine Institute Co., Ltd. |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: High yield baculovirus insect cell line and application thereof Effective date of registration: 20190926 Granted publication date: 20160629 Pledgee: Bank of China Limited Dongshan Branch of Guangzhou Pledgor: Guangdong Southern China vaccine Limited by Share Ltd Registration number: Y2019440000091 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20210207 Granted publication date: 20160629 Pledgee: Bank of China Limited Dongshan Branch of Guangzhou Pledgor: SOUTH CHINA VACCINE Co.,Ltd. Registration number: Y2019440000091 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Insect cell lines with high yield of baculovirus and their application Effective date of registration: 20210325 Granted publication date: 20160629 Pledgee: Bank of China Limited Dongshan Branch of Guangzhou Pledgor: SOUTH CHINA VACCINE Co.,Ltd. Registration number: Y2021440000104 |