CN114591885A - 一种适应无血清悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞驯化方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种适应无血清悬浮培养的LLC‑PK1Sa细胞驯化方法和应用。本发明涉及的细胞悬浮驯化方法主要指逐步降血清和逐步增加悬浮培养基相结合的方法，最终获得无血清悬浮培养型LLC‑PK1Sa细胞，同时本发明提供了无血清悬浮培养LLC‑PK1Sa细胞在生产猪丁型冠状病毒中的应用。应用该细胞增殖的病毒滴度高，稳定性好，可显著降低生产成本，有利于规模化生产，具有良好的市场前景。

Description

一种适应无血清悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞驯化方法和应用

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种适应无血清悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞驯化方法和应用。

背景技术

猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)属于冠状病毒科丁型冠状病毒属成员之一，PDCoV可以感染不同年龄的猪，其中以哺乳仔猪最易感。其主要临床症状为水样腹泻、脱水和死亡。自报道从猪体内首次分离到PDCoV以来，全球各地不断有关于PDCoV疾病发生的报告。有研究证明近年来PDCoV常与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)混合感染，导致仔猪死亡率骤升。2014年 Hu等对PDCoV分离及细胞适应性进行了较为详细的研究，发现该病毒可以在猪睾丸细胞 (ST)和猪肾上皮细胞(LLC-PK1)上生长与传代，并产生明显的细胞病变，表现为细胞变圆、聚集，最后脱落，此后学者大多借鉴此方法进行PDCoV的分离(HU H,KWONIL J, ANASTASIA N V,et al.Isolation andCharacterization of Porcine Deltacoronavirus from Pigs with Diarrhea in theUnited States[J].Journal of Clinical Microbiology,2015,53(5):1537-1548.； GAOX,ZHAO D H,ZHOU P,et al.Characterization,pathogenicity and protectiveefficacy of a cell culture-derived porcine deltacoronavirus[J].Virusresearch,2020,282:197955.)。目前尚无成熟的PDCoV疫苗的相关生产工艺，且由于细胞的贴壁培养工艺费时费力，工业化生产成本较高，无法满足大规模生产要求及市场需求，而细胞的无血清全悬浮培养工艺有着无外源病毒污染、自动化程度高、生产成本低等优点，在病毒疫苗的生产上有着无可比拟的优势，并且已经成功应用到了部分病毒疫苗的生产中，正在成为当前国内外生物制品生产的主要趋势。

如申请公布号为CN 109852580 A的发明专利申请，通过无血清适应培养和悬浮培养驯化，得到了无血清悬浮培养型MDCK-XF02细胞株，犬肾细胞MDCKXF02细胞在无血清培养基悬浮培养活力高、结团少且均一性好，完全适应在无血清培养基中进行悬浮培养。不过该方法并不适用于猪肾上皮细胞(LLC-PK1)的无血清悬浮培养，另外，采用现有的无血清悬浮培养的猪肾上皮细胞(LLC-PK1)在PDCoV培养时，病毒滴度较低。

发明内容

鉴于PDCoV已经成为危害我国生猪健康养殖的安全隐患，且目前国内尚无相关预防或治疗药物上市，迫切需要适合规模化生产PDCoV抗原的细胞培养工艺解决方案，本发明提供一种适应无血清悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞驯化方法，该方法中LLC-PK1细胞在经过多代传代后细胞仍具有较高的存活率，且能显著提高其培养的PDCoV的病毒滴度。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案：

一种适应无血清悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞驯化方法，包括：

(1)驯化培养：将贴壁生长的LLC-PK1细胞使用MEM培养基重悬，稀释，添加灭活的胎牛血清和悬浮培养基，传代培养5～8代，直至细胞适应生长；重复该驯化步骤4～ 5次；驯化培养过程中，灭活的胎牛血清的添加量从体积比5％降至0％，每次降低1％～2％，悬浮培养基的添加量从体积比0％增至100％，每次增加20％～40％；传代培养时，按照自然沉降法、离心法和有限稀释法的顺序每2代更换一次传代培养方法，如第1～2代采用自然沉降法，第3～4代采用离心法，第5～6代采用有限稀释法，第7～8代采用自然沉降法；

(2)单克隆细胞株筛选：将步骤(1)培养得到的细胞置于96孔细胞培养板培养，待细胞密度达到80～90％时，转移至6孔细胞培养板培养；然后转移至摇瓶中培养，连续传代20代，筛选生长最佳的细胞株即为LLC-PK1悬浮细胞，命名为LLC-PK1Sa细胞。

上述步骤(1)和步骤(2)中，重悬后将LLC-PK1细胞稀释至5.0×10⁵cells/mL。

上述悬浮培养基可采用PK201悬浮细胞培养基，PK201悬浮细胞培养基中添加了体积比1％的NEAA、体积比1％的HEPES及体积比1％青链霉素，NEAA的浓度为10mM， HEPES的浓度为1mol/L，青链霉素的浓度为10000U/mL，NEAA、HEPES、青链霉素在向 PK201悬浮细胞培养基中添加时，均需先稀释100倍。

上述步骤(1)中，共计驯化培养4次，第二次驯化培养时，灭活的胎牛血清的添加量为体积比3％，悬浮培养基的添加量为体积比40％，第三次驯化培养时，灭活的胎牛血清的添加量为体积比2％，悬浮培养基的添加量为体积比60％，第四次驯化培养时，灭活的胎牛血清的添加量为体积比1％，悬浮培养基的添加量为体积比80％，第五次驯化培养时，灭活的胎牛血清的添加量为0，悬浮培养基的添加量为100％。

上述步骤(3)中，先将步骤(2)得到的细胞稀释至100cells/mL，再用MEM培养基稀释20倍体积，取细胞混合液加至96孔细胞培养板中，200μL/孔，置37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，待细胞密度达到80～90％时，转移至6孔细胞培养板；待生长增殖到细胞密度大于1.5×10⁶cells/mL后，转移至摇瓶中培养，以5.0×10⁵cells/mL起始密度连续传代 20代。

在上述无血清悬浮培养型LLC-PK1Sa细胞驯化方法中，细胞适应生长的判定指标为：细胞密度大于1.5×10⁶cells/mL，活率≥95％。

具体包括如下步骤：

步骤1：将贴壁生长的LLC-PK1细胞在MEM培养基中重悬，并以MEM培养基将 LLC-PK1细胞稀释至5.0×10⁵cells/mL，添加终浓度为5％的灭活的胎牛血清(Fetal BovineSerum,FBS)，置于摇床中传代培养5～8代，直至细胞适应生长；

步骤2：将步骤1中适应生长的细胞，在MEM培养基中重悬，并以MEM培养基将 LLC-PK1细胞稀释至5.0×10⁵cells/mL，添加终浓度为3％的灭活FBS，同时添加体积比为 40％的PK201悬浮培养基，置于摇床中传代培养5～8代，直至细胞适应生长；

步骤3：将步骤2中适应生长的细胞，在MEM培养基中重悬，并以MEM培养基将 LLC-PK1细胞稀释至5.0×10⁵cells/mL，添加终浓度为2％的灭活FBS，同时添加体积比为 60％的PK201悬浮培养基，置于摇床中传代培养5～8代，直至细胞适应生长；

步骤4：将步骤3中适应生长的细胞，在MEM培养基中重悬，并以MEM培养基将 LLC-PK1细胞稀释至5.0×10⁵cells/mL，添加终浓度为1％的灭活FBS，同时添加体积比为 80％的PK201悬浮培养基，置于摇床中传代培养5～8代，直至细胞适应生长；

步骤5：将步骤4中适应生长的细胞，在PK201悬浮培养基中重悬，并以PK201悬浮培养基将LLC-PK1细胞稀释至5.0×10⁵cells/mL，置于摇床中传代培养5～8代，直至细胞适应生长。

步骤6：将步骤5中适应生长的细胞，并以PK201悬浮培养基将LLC-PK1细胞稀释至100cells/mL，取1mL用MEM培养基混合至20mL，取细胞混合液加至96孔细胞培养板中， 200μL/孔，置37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，待细胞密度达到80～90％时，转移至6 孔细胞培养板。待生长增殖到足够数量后，转移至125mL摇瓶中培养，以5.0×10⁵cells/mL 起始密度连续传代20代，筛选生长最佳的细胞株即为LLC-PK1Sa细胞。

其中，悬浮细胞采用摇床培养时，培养温度为37℃，起始速度为50rpm，细胞每传代一次摇床速度增加5rpm，摇床目标速度为160rpm。

另外，本发明还公开了上述的适应无血清全悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞株在培养疫苗病毒中的应用。进一步的，上述的适应无血清全悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞株可以用在猪丁型冠状病毒的生产中。

本发明相对于现有技术，具有如下有益效果：

(1)本发明提供的LLC-PK1Sa细胞的无血清悬浮驯化方法通过降低血清浓度和提高悬浮培养基比例同步进行，方法简单，能够快速获得无血清全悬浮细胞系。

(2)本发明获得的无血清悬浮LLC-PK1Sa细胞生长速度快，倍增时间短，细胞活率高，适合大规模的工厂化生产。

(3)本发明获得的无血清悬浮LLC-PK1Sa细胞可用于工业化生产PDCoV抗原，具有抗原纯净、易于控制、质量稳定、成本较低等优势。

(4)本发明中的LLC-PK1细胞在经过多代传代后细胞仍具有较高的存活率，且能显著提高其培养的PDCoV的病毒滴度。

附图说明

图1为实施例1中的贴壁型LLC-PK1细胞在悬浮驯化不同阶段显微镜下的形态观察结果(a.贴壁培养的LLC-PK1细胞；b.3％FBS悬浮培养的LLC-PK1细胞；c.2％FBS悬浮培养的LLC-PK1细胞；d.1％FBS悬浮培养的LLC-PK1细胞；e.适应无血清悬浮培养的 LLC-PK1细胞)。

图2为实施例2中的无血清悬浮培养型LLC-PK1Sa细胞生长动力学曲线，其生长曲线呈“S”型，细胞从12h开始进入对数生长期，60h之后进入平台期，细胞密度增长缓慢，细胞活力持续下降。

图3为实施例3中利用间接免疫荧光方法检测两种不同培养方式(贴壁培养和悬浮培养)生产的PDCoV对LLC-PK1细胞的侵染力，结果表明两种来源的PDCoV均可以特异性的侵染LLC-PK1细胞并增殖，并无明显差异。图中A表示悬浮型细胞增殖的PDCoV感染的LLC-PK1细胞；B表示贴壁型细胞增殖的PDCoV感染的LLC-PK1细胞；C表示未接毒的贴壁细胞LLC-PK1(对照细胞)。DAPI列表示荧光染料DAPI染色细胞，PDCoV列指的是猪丁型冠状病毒感染细胞，MERGE是指两张图合并后的结果。其中PDCoV感染细胞为绿色荧光，DAPI染色为蓝色荧光。

图4为实验例4中的利用双抗体夹心ELISA方法检测两种不同培养方式(贴壁培养和悬浮培养)生产的PDCoV的抗原性的差异，结果表明两种来源的PDCoV均可特异性的结合抗PDCoV的猪多克隆抗体，二者均有良好的抗原反应性。图中NC代表阴性对照，Control 为阳性对照。

图5为实施例5中不同的病毒和细胞的接种比例对生产的PDCoV滴度的影响。

图6为实施例6中的不同的TPCK胰酶浓度对生产的PDCoV滴度的影响。

图7为实施例6中不同胰酶对PDCoV滴度的影响。

图8为实施例7中不同细胞传代方法对LLC-PK1细胞密度和活率的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

实施例1

本实施例提供的一种无血清悬浮培养LLC-PK1Sa细胞的驯化方法，包括如下步骤：

步骤1：细胞复苏

从液氮罐中取出冻存的LLC-PK1贴壁细胞，在37℃水浴中快速摇动使其迅速融化，以800r/min离心3min，弃上清液，用适量含5％FBS的MEM细胞培养液重悬，移入细胞瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养至长满单层。

步骤2：细胞传代

待LLC-PK1细胞长满单层时，加入适量0.05％胰蛋白酶37℃消化10～15min，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，按照1:3的比例(体积比)分到培养瓶中进行传代培养。

步骤3：无血清悬浮驯化

将贴壁生长良好的LLC-PK1细胞在MEM培养基中重悬，并将LLC-PK1细胞稀释至5.0×10⁵cells/mL，添加终浓度为5％的灭活的胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)，置于摇床中培养5～8代，直至细胞适应生长；

将上述适应生长的细胞，在MEM培养基中重悬，并将LLC-PK1细胞稀释至 5.0×10⁵cells/mL，添加终浓度为3％的灭活FBS，同时添加体积比40％的PK201悬浮培养基，置于摇床中培养5～8代，直至细胞适应生长；

以此类推，逐渐将FBS的添加量由体积比3％降为2％、1％直至无FBS，逐渐将PK201悬浮培养基的添加量由体积比40％增加至60％、80％直至100％，每次更换培养基均需培养5～8代，直至细胞适应生长；传代培养时，按照自然沉降法、离心法和有限稀释法的顺序每2代更换一次传代培养方法，具体的，第1～2代采用自然沉降法，第3～4代采用离心法，第5～6代采用有限稀释法，第7～8代采用自然沉降法。

步骤4：单克隆细胞株筛选

将适应无血清悬浮生长的细胞，稀释至100cells/mL，取1mL用MEM培养基混合至20mL，取细胞混合液加至96孔细胞培养板中，200μL/孔，置37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，每日观察细胞生长情况并及时换液。待各培养孔中单克隆细胞增殖到足够数量，用胰蛋白酶消化后，转移至12孔细胞培养板培养。待细胞密度达到80～90％时，转移至6孔细胞培养板。待生长增殖到足够数量(细胞密度大于1.5×10⁶cells/mL)后，转移至125mL 摇瓶中培养，以5.0×10⁵cells/mL起始密度连续传代20代。通过比较各单克隆细胞株的生长数据和传代稳定性，筛选出生长最佳的单克隆细胞株即为LLC-PK1Sa细胞。

贴壁型LLC-PK1细胞在悬浮驯化过程中，在不同浓度的FBS中的细胞状态见图1。

由图1可知：图1a所示的LLC-PK1细胞贴壁生长时形态较一致，呈有规则的纤维样细胞，细胞之间紧密排列，相互衔接；图1b所示为细胞在添加了3％FBS中进行的悬浮生长，虽然细胞形态由纤维样变为圆形，但是细胞大小不一，细胞密度较小；图1c、图1d 说明LLC-PK1细胞进一步适应低血清悬浮生长环境，经过传代，细胞大小均一，细胞密度逐渐增大，但是仍有少量结团现象；图1e说明LLC-PK1细胞完全适应由无血清培养基构成的悬浮生长环境，细胞形态和大小都逐渐趋于一致和稳定，均匀分散，无明显结团现象。

实施例2

本实施例为绘制LLC-PK1Sa细胞悬浮培养生长动力学曲线。

取生长良好的第5代LLC-PK1Sa细胞，稀释成5.0×10⁵cells/mL，接种到125mL摇瓶中，培养体积为40mL。每隔一定时间取样，进行细胞计数。绘制悬浮培养型LLC-PK1Sa 细胞生长动力学曲线，并求细胞最大増殖密度以及倍增时间，结果见图2。

如图2所示，LLC-PK1Sa细胞生长曲线呈“S”型，细胞从12h开始进入对数生长期，60h 之后进入平台期，细胞密度增长缓慢，细胞活力持续下降。细胞倍增时间为20h，且细胞最大增殖密度为4.2×10⁶cells/mL。

实施例3

本实施例为间接免疫荧光法(IFA)检测两种细胞培养方式(贴壁培养和悬浮培养)生产的PDCoV对LLC-PK1细胞的侵染力。

待LLC-PK1细胞生长至90％～100％时，分别接种PDCoV HNZK-04(该毒株来自河南农业大学动物分子病原学实验室)株P10代及LLC-PK1Sa增殖的PDCoV F10代 (10^9.38TCID₅₀/0.1mL)，300μL/孔。同时设不接毒阴性对照组，在37℃培养箱中培养至病变30％左右时，利用IFA方法进行检测，其中一抗为抗PDCoV HNZK-04的猪多克隆抗体 (1:1000，采用PDCoVHNZK-04灭活后免疫猪获得的)，二抗为FITC标记的兔抗猪IgG 抗体(1:100，购自北京索莱宝生物科技有限公司)，37℃作用1h，0.05％PBST洗涤5次后，荧光显微镜下观察病毒在细胞上的增殖情况，结果见图3。

由图3可知，未接毒贴壁细胞LLC-PK1组的细胞质无绿色荧光，经贴壁细胞LLC-PK1和悬浮细胞LLC-PK1Sa增殖的PDCoV接种LLC-PK1细胞后，绝大部分细胞的细胞质呈现明亮的绿色荧光，进而表明，经悬浮细胞LLC-PK1Sa增殖的PDCoV可以特异性的侵染 LLC-PK1细胞并增殖。

实施例4

本实施例是利用双抗体夹心ELISA检测两种细胞培养方式(贴壁培养和悬浮培养)生产的PDCoV的抗原性差异。

将LLC-PK1细胞培养的P10代PDCoV(10^8.38TCID₅₀/0.1mL)、P20代PDCoV(10^8.71TCID₅₀/0.1mL)和LLC-PK1Sa细胞培养的F10代PDCoV(10^9.38TCID₅₀/0.1mL)、F20 代PDCoV(10^8.87TCID₅₀/0.1mL)分别加至预先包被抗PDCoV的猪多克隆抗体的96孔板， 100μL/孔，每个稀释度重复3孔，同时设阴性和阳性对照，37℃孵育45min，PBST洗涤5 次，加入1:8000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG抗体，37℃孵育反应45min；PBST洗涤5 次，加入TMB单组份显色液，100μL/孔，37℃避光孵育10分钟，加入终止液，50μL/孔， 2分钟内在酶标仪上测定OD₄₅₀值。阴性血清OD₄₅₀值≤0.15，各阴性血清重复孔差值不能大于0.04；阳性血清OD₄₅₀nm值≥1.0，阳性血清重复孔的变化幅度不超过其平均OD₄₅₀值的30％，试验成立。样品OD₄₅₀值<0.196判为PDCoV阴性；样品OD₄₅₀值≥0.196判为PDCoV 阳性。结果见图4。

由图4所示结果可知，阴性对照OD₄₅₀值为0.114，无论是经LLC-PK1增殖的P10代PDCoV、P20代PDCoV，还是经LLC-PK1Sa增殖的F10代PDCoV、F20代PDCoV，其 OD₄₅₀值均在1.636～2.149之间，结果均判为PDCoV阳性，可见经悬浮驯化后LLC-PK1Sa 细胞增殖的PDCoV具有良好的抗原反应性，且细胞代次的增加对PDCoV的抗原性无明显影响。

实施例5

本实施例为研究LLC-PK1Sa细胞生产PDCoV的工艺。

按照LLC-PK1Sa细胞悬浮培养条件，对PDCoV不同接种条件进行研究。

⑴最佳细胞密度：将初始细胞密度分别调整为5×10⁵cells/mL、1×10⁶cells/mL、2×10⁶ cells/mL、3×10⁶cells/mL，按MOI为0.01接种PDCoV HNZK-04株P10代，同时设不接毒对照组，观察细胞病变率，检测TCID₅₀。结果见表1。

⑵接毒量及收获时间：在最佳细胞密度条件下，分别按MOI为0.0001、0.001、0.01接种PDCoV HNZK-04株P10代，分别于接毒后24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h收获病毒液，进行TCID₅₀检测。结果见图5。

表1不同初始密度的LLC-PK1Sa细胞对PDCoV滴度的影响

细胞初始密度	细胞活率(％)	收毒时间(h)	病毒滴度(TCID<sub>50</sub>/0.1mL)
				5×10<sup>5</sup>cells/mL	75	72	10<sup>8.5</sup>
1×10<sup>6</sup>cells/mL	78	60	10<sup>8.83</sup>
				2×10<sup>6</sup>cells/mL	72	48	10<sup>9.76</sup>
3×10<sup>6</sup>cells/mL	75	48	10<sup>9.38</sup>

从表1结果可知，细胞密度较低时，细胞病变时间相应延长，而细胞密度较高时，收毒时间缩短，但是病毒的滴度并不与细胞密度呈正相关。当细胞初始密度在2×10⁶cells/mL 时，在48h左右收获的病毒液滴度较理想，可达到10^9.76TCID₅₀/0.1mL。

如图5所示，当MOI为0.0001时，在84h时收获的病毒液滴度最高为10^7.77TCID₅₀/0.1mL，而当MOI为0.01、0.001时，均在48h时收获的病毒液滴度最高，分别为10^8.71TCID₅₀/0.1mL、 10^9.88TCID₅₀/0.1mL。因此确定，最佳MOI为0.001，最佳收毒时间为感染后48h。

实施例6

将悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞密度调整为2×10⁶cells/mL，3瓶/组，分别向每组细胞培养液中添加终浓度为5.0μg/mL的胰酶、5.0μg/mL TPCK胰酶，设不添加胰酶的细胞为对照组，按MOI为0.001接种PDCoV，接种后24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h收获病毒液，进行TCID₅₀检测，对检测结果进行统计学分析。结果见图6。

图6可知，相较于不添加胰酶的对照组，添加终浓度为5.0μg/mL的胰酶、5.0μg/mLTPCK 胰酶的试验组，所收获的病毒液的滴度均有显著增高，其中TPCK胰酶组所收获的病毒滴度可达到10^8.71TCID₅₀/0.1mL，比胰酶组病毒滴度高100倍；对照组和胰酶组均在接种后60h出现病毒滴度的峰值，而TPCK胰酶组在接种后48h即出现病毒滴度的峰值，所需时间更短，峰值更高。

最佳TPCK胰酶浓度筛选：

在最佳细胞密度、最佳接毒量条件下，加入TPCK胰酶分别为1μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL。每个剂量的TPCK胰酶接种3组，每组接种3瓶，同时设置不接毒对照组作空白对照，对收获的病毒液进行TCID₅₀检测，结果见图7。

由图7可知，随着病毒液中TPCK胰酶终浓度的逐渐增加，所收获的病毒液的滴度也呈上升趋势，当TPCK胰酶终浓度达到7.5μg/mL时，病毒液的滴度最高，可达到 10^8.88TCID₅₀～10^9.59TCID₅₀，但是当病毒液中TPCK胰酶终浓度＞7.5μg/mL，PDCoV病毒液的滴度反而下降。因此确定，最佳TPCK胰酶的终浓度为7.5μg/mL。

实施例7

取适应终浓度为5％的灭活FBS生长的LLC-PK1细胞，按照表2方法进行细胞传代，通过细胞计数和细胞活力检测，筛选出在添加量为体积比3％的灭活FBS，同时添加量为体积比40％的PK201悬浮培养基适应生长的最佳细胞传代方法。

细胞传代方法如下：

1、常规法培养传代流程

①吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加1mL0.25％胰酶进行消化细胞。

②镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁松动时(不消化到细胞漂浮)去掉胰酶，加6～8ml培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落，吹散。

③取部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的MEM培养基，同时添加体积比 40％的PK201悬浮培养基，将灭活FBS添加量降为体积比3％，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养。

④注意培养基pH值变化情况，定期换液(每周2～3次)，待细胞密度达到80％以后重复步骤1操作。

2、自然沉降法培养传代流程

①吸出细胞培养瓶，在无菌操作台中静置15min～20min，待细胞自然沉降后，轻轻弃去原有培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加1ml 0.25％胰酶进行消化细胞。

②镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁松动时去掉胰酶，加6～8ml培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落，吹散。

③取部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的MEM培养基，同时添加体积比为40％的PK201悬浮培养基，将灭活FBS终浓度降为3％，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养。

④注意培养基pH值变化情况，定期换液(每周2～3次)，待细胞密度达到80％以后重复步骤1项操作。

3、离心法培养传代流程

①吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加1mL 0.25％胰酶进行消化细胞。

②镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁松动时去掉胰酶，加6～8ml培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落，吹散。

③将细胞悬液转移至灭菌离心管中，800rpm离心3min，弃去上清液，加入6～8ml培养基重悬细胞。

④添加适当的MEM培养基，同时添加体积比为40％的PK201悬浮培养基，将灭活FBS终浓度降为3％，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养。

⑤注意培养基pH值变化情况，定期换液(每周2～3次)，待细胞密度达到80％以后重复步骤1操作。

4、有限稀释法培养传代流程

①取出细胞培养瓶，置于无菌操作台，用无菌吸管吹打细胞，直至无结团或贴壁细胞。

②取出适量细胞，进行细胞计数。

③添加适当的MEM培养基，同时添加体积比为40％的PK201悬浮培养基，将灭活FBS终浓度降为3％，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养。

④注意培养基pH值变化情况，定期换液(每周2～3次)，待细胞密度达到80％以后重复步骤1操作。

表2 LLC-PK1细胞无血清悬浮驯化细胞不同传代方法结果比较

由图8可知，应用常规法进行细胞传代，随着细胞代次的增加，细胞密度和活率均呈明显下降趋势，当细胞传代5代之后大部分细胞已死亡；按照自然沉降法、离心法、有限稀释法的顺序进行细胞传代，细胞密度和活率逐渐上升，经过6次传代，细胞密度从1.0 ×10⁶cells/mL增长至2.0×10⁶cells/mL以上，细胞活率在95％以上，即细胞可在添加量为体积比3％的灭活FBS，体积比40％的PK201悬浮培养基中适应生长；而按照离心法、自然沉降法、有限稀释法的顺序进行细胞传代，从第1代开始至第4代细胞，细胞密度和活率逐渐下降，特别是第1代和第2代细胞下降明显，从第5代细胞开始细胞状态趋于稳定。综上所述，按照自然沉降法、离心法、有限稀释法的顺序进行细胞传代为LLC-PK1细胞无血清悬浮驯化过程中的最佳细胞传代方法。

本发明以LLC-PK1细胞为母本，筛选出PDCoV高适应性悬浮细胞株LLC-PK1Sa，且PDCoV按MOI为0.001接种密度为2×10⁶cells/mL的LLC-PK1Sa细胞，当TPCK胰酶终浓度达到7.5μg/mL时，接毒后48h收获的病毒液滴度最高，且经LLC-PK1Sa细胞增殖的 PDCoV具有良好的抗原性。

本发明结果可为生物反应器增殖PDCoV提供候选悬浮细胞株，为优化PDCoV规模化悬浮培养工艺提供有益参考。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (8)

1.一种适应无血清悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞驯化方法，其特征在于，包括：

（1）驯化培养：将贴壁生长的LLC-PK1细胞使用MEM培养基重悬，稀释，添加灭活的胎牛血清和悬浮培养基，传代培养5～8代，直至细胞适应生长；重复该驯化步骤4～5次；驯化培养过程中，灭活的胎牛血清的添加量从体积比5%降至0%，每次降低1%～2%，悬浮培养基的添加量从体积比0%增至100%，每次增加20%～40%；传代培养时，按照自然沉降法、离心法和有限稀释法的顺序每2代更换一次传代培养方法；

（2）单克隆细胞株筛选：将步骤（1）培养得到的细胞置于96孔细胞培养板培养，待细胞密度达到80～90%时，转移至6孔细胞培养板培养；然后转移至摇瓶中培养，连续传代20代，筛选生长最佳的细胞株即为LLC-PK1悬浮细胞，命名为LLC-PK1Sa细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步骤（1）和步骤（2）中，重悬后将LLC-PK1细胞稀释至5.0×10⁵cells/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述悬浮培养基采用PK201悬浮细胞培养基，所述悬浮培养基中添加了体积比1%的NEAA、体积比1%的HEPES及体积比1%青链霉素。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步骤（1）中，共计驯化培养4次，第二次驯化培养时，灭活的胎牛血清的添加量为体积比3%，悬浮培养基的添加量为体积比40%，第三次驯化培养时，灭活的胎牛血清的添加量为体积比2%，悬浮培养基的添加量为体积比60%，第四次驯化培养时，灭活的胎牛血清的添加量为体积比1%，悬浮培养基的添加量为体积比80%，第五次驯化培养时，灭活的胎牛血清的添加量为0，悬浮培养基的添加量为100%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步骤（3）中，先将步骤（2）得到的细胞稀释至100cells/mL，再用MEM培养基稀释20倍体积，取细胞混合液加至96孔细胞培养板中，200μL/孔，置37℃，5% CO₂细胞培养箱中培养，待细胞密度达到80～90%时，转移至6孔细胞培养板；待细胞密度大于1.5×10⁶ cells/mL后，转移至摇瓶中培养，以5.0×10⁵ cells/mL起始密度连续传代20代。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述无血清悬浮培养型LLC-PK1Sa细胞驯化方法中，细胞适应生长的判定指标为：细胞密度大于1.5×10⁶ cells/mL，活率≥95%。

7.采用权利要求1～6任一项所述方法制备的适应无血清全悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞株在培养疫苗病毒中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的适应无血清全悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞株用在猪丁型冠状病毒的生产中。

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