CN103602629A

CN103602629A - 一种无血清培养猪睾丸细胞及利用其生产猪瘟细胞疫苗的方法

Info

Publication number: CN103602629A
Application number: CN201310598989.6A
Authority: CN
Inventors: 李阳春; 曹政; 岳秀阳; 李春燕
Original assignee: CHONGQING AULEON BIOLOGICALS Co Ltd
Current assignee: CHONGQING AULEON BIOLOGICALS Co Ltd
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2013-11-25
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2033-11-25
Also published as: CN103602629B

Abstract

本发明公开了一种无血清培养猪睾丸细胞及利用其生产猪瘟细胞疫苗的方法；无血清培养猪睾丸细胞的方法为：将猪睾丸细胞用含10%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含5%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含10%小牛血清的培养基传代培养3-5代；重复上述步骤，逐步将血清含量从10%减至5%、2%、1%直到无血清培养；最后利用绝迹稀释法筛选纯系的细胞系。本发明无血清驯化培养得到猪睾丸细胞，该细胞可较好的使猪瘟病毒增殖并应用于猪瘟细胞疫苗生产，不仅避免了动物血清的使用带来的风险，同时使培养基成分明确、提高了批次间同一性、简化了下游纯化加工过程。

Description

一种无血清培养猪睾丸细胞及利用其生产猪瘟细胞疫苗的方法

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，涉及一种无血清培养猪睾丸细胞及利用其生产猪瘟细胞疫苗的方法。

背景技术

猪瘟(classical swine fever, CSF)，是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病。1984年世界动物卫生组织(OIE) 将其列入A类传染病，我国目前也将其定为一类传染病。猪瘟除可引起败血症以外，还可引起一系列其它临床表现，如妊娠母猪流产、胎儿畸变、慢性营养性消耗、淋巴细胞和血小板减少等。目前，世界大部分国家都采取了严格的卫生防疫措施和剔除猪瘟感染猪净化猪群来控制和消灭猪瘟，一些发达国家通过防疫和防控手段已经彻底根除了猪瘟。所以，免疫接种是猪瘟防控的重要措施，而且对无猪瘟国家爆发猪瘟时根除本病和阻止野毒传向无猪瘟猪群也很有必要。因此，各国学者一直没有放弃对猪瘟疫苗的研制和开发。

至今为止，猪瘟疫苗在研发及临床应用上主要有猪瘟灭活苗、猪瘟弱毒苗、猪瘟基因工程疫苗、猪瘟标记疫苗、以及猪瘟DNA疫苗等几类。其中猪瘟灭活苗是在上世纪中页由Dorest等首先利用结晶紫制备的，但由于其低免疫原性、低保护力等因素已退出市场。猪瘟弱毒苗主要有兔弱化苗及低温细胞苗，两种疫苗都是由弱毒制备，是目前市场上主要应用的产品。猪瘟基因工程苗主要有由Hulst、Bouma、及 Tsibezov等分别制备的亚单位疫苗；以及由Dong等制备的多肽疫；还包括Rumenapf、Konig、Peeter等分别制备的活病毒载体疫苗，但都由于免疫源性或安全性等因素没有取得良好的实用效果，甚至没有上市应用。猪瘟标记疫苗的本质仍是亚单位疫苗，是在研发时去掉保护性抗原的某一表位，在临床应用后，可根据动物体所产生的特异性抗体种类而区分动物是自然感染还是经过免疫。标记疫苗从上世纪末期至今都有报道，虽然有着较好的安全性及临床应用的便捷，但由于免疫源性等原因，目前还没有较好的产品问世。而DNA疫苗作为疫苗研发领域内的一个重要部分，每年都有针对各种病原体的DNA疫苗的报道，但是由于DNA疫苗涉及转基因问题，在全世界对转基因问题的看法不会改变时，DNA疫苗仍无法实际应用。

综上所述，目前市场上所应用的猪瘟疫苗仍旧以兔弱化苗及由细胞培养而来的细胞苗为主。其中我国主要应用的兔弱化苗是1954年成功培育出并制成疫苗的CLS株病毒，也叫“C株”或“K株”。疫苗病毒的复制主要在淋巴样组织，该毒株虽然可以通过怀孕猪的胎盘屏障，但不感染胎儿引起任何畸变，同时毒力不返强，对乳猪和种猪无残余毒性。而细胞苗主要应用毒株有GPE株及Thiverval株，此弱毒株都是由强毒株在猪睾丸或猪肾细胞上通过传代，随后用终点稀释法选出纯系毒株，再通过牛睾丸细胞及豚鼠肾细胞传代，最终筛选出纯系毒株，该毒株能很好的在30℃温度中增殖。在生产及应用上与兔弱化苗相比，细胞苗是用细胞培养，都是以种子批系统为基础，每批种子在同一性、无菌性、纯度、安全性、非传染性、稳定性和免疫原性等方面都是一致的，以确保同批疫苗的均一性。但在疫苗生产过程中动物血清的使用会产生成本增加、引入外源蛋白、引入其他病毒及病原体的风险，是细胞苗在生产过程种面临的一个棘手问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种无血清培养猪睾丸细胞及利用其生产猪瘟细胞疫苗的方法，无血清驯化培养得到的猪睾丸细胞，可较好的使猪瘟病毒增殖并应用于猪瘟细胞疫苗生产，并且避免动物血清的使用带来的风险。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明公开了一种无血清培养猪睾丸细胞的方法，包括以下步骤：

1）将猪睾丸细胞用含10%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含5%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含10%小牛血清的培养基传代培养3-5代；

2）当细胞贴壁后，更换含5%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含2%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含5%小牛血清的培养基传代培养3-5代；

3）当细胞贴壁后，更换含2%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含1%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含2%小牛血清的培养基传代培养3-5代；

4）当细胞贴壁后，更换含1%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换无血清培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含1%小牛血清的培养基传代培养3-5代；

5）当细胞贴壁后，更换无血清培养基传代培养3-5代；

6）利用绝迹稀释法筛选纯系的细胞系。

进一步，所述步骤6）中，利用绝迹稀释法筛选纯系的细胞系的具体步骤为：

① 将细胞传入96孔细胞培养板中培养；

② 当细胞贴壁后，留下只含有一个细胞的孔，抛弃其他孔；

③ 持续培养直至单细胞生长成集落并布满60%孔底，消化细胞并按对应位置将一半细胞传入另一96孔板中；

④ 继续培养，将其中一个96孔板进行扩大培养并保存细胞，另一个96孔板待细胞长满后接入猪瘟病毒，37?C吸附1h后更换新鲜培养基继续培养；

⑤ 在接毒后24h、36h、72h分别通过ELISA方法检测病毒滴度，筛选出具有较好产毒能力的细胞系。

进一步，所述培养基为MEM培养基、DMEM低糖培养基、DMEM高糖培养基或1640培养基。

进一步，所述培养基中加入2-100μg/mL的糖胺聚糖，所述糖胺聚糖为硫酸肝素、硫酸软骨素B、硫酸透明质酸或肝素。

进一步，所述培养基中加入10μg/mL的糖胺聚糖，所述糖胺聚糖为肝素。

进一步，所述培养基中加入1%-10%的外源蛋白质，所述蛋白质为牛血清白蛋白和胰蛋白胨。

进一步，所述培养基中加入1%的牛血清白蛋白和5%胰蛋白胨。

本发明还公开了一种利用无血清培养的猪睾丸细胞生产猪瘟细胞疫苗的方法，将猪瘟病毒接种于无血清培养的猪睾丸细胞并按常规培养条件培养。

进一步，所述猪瘟病毒为CLS株、GPE株或Thiverval株。

本发明的有益效果在于：本发明无血清驯化培养得到猪睾丸细胞，该细胞可较好的使猪瘟病毒增殖并应用于猪瘟细胞疫苗生产，不仅避免了动物血清的使用带来的风险，同时使培养基成分明确、提高了批次间同一性、简化了下游纯化加工过程。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1：无血清培养猪睾丸细胞

5）当细胞贴壁后，更换无血清培养基传代培养3-5代；

6）利用绝迹稀释法筛选纯系的细胞系：

① 将细胞传入96孔细胞培养板中培养；

② 当细胞贴壁后，留下只含有一个细胞的孔，抛弃其他孔；

所述培养基为MEM培养基，培养基中加入了10μg/mL的肝素、1%的牛血清白蛋白和5%胰蛋白胨。

实施例2：细胞培养及细胞批库建立

所驯化并筛选的无血清培养猪睾丸细胞采DMEM培养基，添加庆大霉素，在细胞工厂或细胞发酵罐进行培养，建立细胞工作种子批库，并及对传代后的外援源因子、致瘤性及稳定性等全面检定，细胞使用代数控制在40代以内，均符合疫苗生产介质的要求。

实施例3：细胞形态学及稳定性鉴定

猪睾丸细胞无血清条件下37℃培养并连续传代，每间隔24h对细胞进行一次观察，其贴壁情况及细胞形态都未发生改变。

实施例4：细胞无杂菌鉴定

将实施例2制备的猪睾丸细胞种子库接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养14d，并以无菌生理盐水做阴性对照，培养温度为25?C、35?C。结果显示细胞种子库未见细菌生长。将猪睾丸细胞种子库分别用半流体和肉汤培养基，37℃初代培养21天，次代培养21天，无菌生理盐水做阴性对照，结果显示细胞种子库无支原体生长。

实施例5：猪睾丸细胞猪瘟病毒增殖鉴定

将实施例2所制备的猪睾丸细胞连续传代16次以上，按常规方法接入猪瘟病毒并按常规培养条件培养，通过ELISA方法检测其产毒能力没有发生改变。所述猪瘟病毒为CLS株、GPE株或Thiverval株。

实施例6：猪瘟病毒原液鉴定

将实施例5无血清条件下培养的猪瘟病毒通过Lorry法测定蛋白含量均在理论范围；通过电镜观察猪瘟病毒颗粒直径约40-45nm；通过SDS-PAGE和WB检测抗原蛋白成分存在，且无外源杂蛋白；通过免疫Balb/C小鼠1次血清中和抗体效价在3200以上；通过目测病毒原液的外观为澄清液体；pH值为7.0-7.2；通过血平板进行杂菌鉴定结果为阴性；通过半流体和肉汤培养基培养进行支原体鉴定结果为阴性。

实施例7：猪瘟病毒安全性鉴定

溶血性试验：选取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血1ml，用PBS洗涤3次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍。用注射用水将病毒原液分别做2倍、4倍、8倍稀释，将豚鼠血细胞加入到稀释的病毒液中，8小时后，评价血球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。结果显示，没有发生血球破裂，无溶血现象。说明无血清条件下生产的猪瘟病毒原液及所制备的疫苗无溶血反应。

急性毒性试验：取无血清培养的猪瘟病毒原液0.5ml腹腔注射体重为12～18g Balb/C小鼠，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，而体重呈现增加，由此证明无血清培养的猪瘟病毒及制备的疫苗在试验的浓度下对动物是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。

过敏试验研究：取无血清培养的猪瘟病毒皮下接种体重为250～350g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0.5ml，隔日一次，共3次，同时做阴性对照。连续3周观察实验动物，结果表明豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，无血清培养的猪瘟病毒及所制备的疫苗在动物体内无过敏反应。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种无血清培养猪睾丸细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

5）当细胞贴壁后，更换无血清培养基传代培养3-5代；

6）利用绝迹稀释法筛选纯系的细胞系。

2.根据权利要求1所述的无血清培养猪睾丸细胞的方法，其特征在于：所述步骤6）中，利用绝迹稀释法筛选纯系的细胞系的具体步骤为：

① 将细胞传入96孔细胞培养板中培养；

② 当细胞贴壁后，留下只含有一个细胞的孔，抛弃其他孔；

3.根据权利要求1所述的无血清培养猪睾丸细胞的方法，其特征在于：所述培养基为MEM培养基、DMEM低糖培养基、DMEM高糖培养基或1640培养基。

4.根据权利要求3所述的无血清培养猪睾丸细胞的方法，其特征在于：所述培养基中加入2-100μg/mL的糖胺聚糖，所述糖胺聚糖为硫酸肝素、硫酸软骨素B、硫酸透明质酸或肝素。

5.根据权利要求4所述的无血清培养猪睾丸细胞的方法，其特征在于：所述培养基中加入10μg/mL的糖胺聚糖，所述糖胺聚糖为肝素。

6. 根据权利要求3所述的无血清培养猪睾丸细胞的方法，其特征在于：所述培养基中加入1%-10%的外源蛋白质，所述蛋白质为牛血清白蛋白和胰蛋白胨。

7.根据权利要求6所述的无血清培养猪睾丸细胞的方法，其特征在于：所述培养基中加入1%的牛血清白蛋白和5%胰蛋白胨。

8.一种利用权利要求1至7任意一项所述的方法得到的无血清培养的猪睾丸细胞生产猪瘟细胞疫苗的方法，其特征在于：将猪瘟病毒接种于无血清培养的猪睾丸细胞并按常规培养条件培养。

9.根据权利要求8所述的利用无血清培养的猪睾丸细胞生产猪瘟细胞疫苗的方法，其特征在于：所述猪瘟病毒为CLS株、GPE株或Thiverval株。