CN104278009A - 无血清培养基及其用途和一种猪瘟病毒的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及兽用生物制品工程技术领域，更为具体的说是涉及无血清培养及其用途和应用这些培养基的猪瘟病毒的培养方法。本发明以MEM为基础培养基，通过对猪睾丸细胞以及猪瘟病毒的生长、增殖特征研究，利用在基础培养基内添加不同成分，分别得到一系列的猪睾丸细胞无血清培养基、以及不同生长阶段的猪瘟病毒增殖无血清培养基，从而既避免了BVDV及其抗体可能产生的污染风险，同时可以实现ST细胞贴壁生长，且生长迅速、细胞面完整，个体饱满，可以长期传代培养。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及兽用生物制品工程技术领域，更为具体的说是涉及无血清培养及其用途和应用这些培养基的猪瘟病毒的培养方法。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性传染病，被世界动物卫生组织列为A类动物传染病。目前，我国控制猪瘟疫病的主要手段是接种猪瘟兔化弱毒(HCLV)活疫苗。传统的猪瘟疫苗生产方式是感染兔体，然后收集脾脏及腹腔淋巴制成组织苗，或者是采用原代牛睾丸细胞增殖的细胞苗。但上述两种方式已逐步被连续传代猪睾丸细胞(Swine testis，ST)生产猪瘟疫苗所替代。
对于ST细胞而言，一般采用基础培养基中添加10％的牛血清进行贴壁培养，其方法是在基础培养基中添加2％的牛血清进行猪瘟病毒的增殖。由于猪瘟病毒在ST细胞上不产生细胞病变，所以一般可以允许3～5次接种病毒、收集病毒的操作。
但是在细胞生长及病毒增殖过程中加入的牛血清有几率造成牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及其抗体的污染。BVDV与CSFV同属于黄病毒科，瘟病毒属。猪瘟弱毒活疫苗产品中如果残有BVDV的污染可能会造成免疫动物严重的副反应。生产过程中如果有BVDV抗体的存在，则可能导致加入的猪瘟病毒种毒被中和，无法实现病毒的高滴度增殖，从而导致无法获得高滴度疫苗产品。
目前无血清培养基已经有所报道，但是目前现有文献报道的无血清培养基主要针对的是商业应用专属细胞株，或者最为接近的也是针对动物的肾脏组织来源的细胞。
由于不同的细胞，或者病毒所需要的培养条件差异性很大，因此发明人无法直接借鉴现有的无血清培养基组成，必须针对这一问题，重新研究，获得适用于ST细胞培养，以及CSFV增殖的无血清培养基。
发明内容
本发明针对目前ST细胞培养，以及CSFV病毒增殖中适用的无血清培养基的研究空白，公开了一系列分别用于猪睾丸细胞的生长、猪瘟病毒增殖的无血清培养基，并针对全新的培养基提出了一种新的猪瘟病毒培养方法。
首先，本发明公开了第一种无血清培养基，所述无血清培养基为pH为7.0～7.5的水溶液，其组分如下：
MEM基础培养基 9.8g/L；
丙酮酸钠 50～200mg/L；
大豆蛋白水解物 0.1～2g/L；
胆固醇 0.1～6mg/L；
碱性成纤维细胞生长因子 0.5～50mg/L；
抑制素B 0.5～50mg/L；
胰岛素 5～50mg/L；
L-丙氨酸 2～30mg/L；
L-缬氨酸 52～150mg/L；
L-亮氨酸 10～80mg/L；
L-异亮氨酸 5～180mg/L；
L-甲硫氨酸 15～300mg/L；
L-脯氨酸 10～250mg/L；
L-苯丙氨酸 10～250mg/L；
L-色氨酸 5～300mg/L；
L-甘氨酸 0～50mg/L；
L-丝氨酸 5～150mg/L；
L-苏氨酸 5～250mg/L；
L-半胱氨酸 5～250mg/L；
L-天冬酰胺 5～200mg/L；
L-谷氨酰胺 250～400mg/L；
L-酪氨酸 5～250mg/L；
L-天冬氨酸 2～80mg/L；
L-谷氨酸 5～200mg/L；
L-赖氨酸 6～100mg/L；
L-精氨酸 5～300mg/L；
L-组氨酸 5～300mg/L；
羟脯氨酸 0～40mg/L；
豆蔻酸 0.01～0.3mg/L；
棕榈酸 0.01～0.3mg/L；
棕榈油酸 0.01～0.3mg /L；
硬脂酸 0.01～0.3mg/L；
精胺 0.1～0.3ml/L；
亚精胺 0.1～0.3ml/L；
还原型谷胱甘肽 1～3mg/L；
乙醇胺 1.5～3ml/L；
β-巯基乙醇 0.5～2ml/L；
甘油 0.5～2g/L；
生物素 0.01～0.1mg/L；
吡哆醇 1～5mg/L；
抗坏血酸 0.5～5mg/L；
维生素B-12 0.5～2mg/L；
次黄嘌呤 3～20mg/L；
胸苷 0.01～1mg/L；
NaHCO3 1～1.5g/L；
FeSO4·7H2O 5～20mg/L；
ZnSO4 2～40mg/L；
Na2SeO3 0.1～2mg/L；
柠檬酸铁 2～20mg/L。
进一步地，我们还限定了所述无血清培养基为pH为7.2的水溶液。
同时，我们还进一步限定了所述的无血清培养基在猪睾丸细胞体外培养和扩增中的应用。
本发明所公开的第一种无血清培养基在猪睾丸细胞的体外培养和扩增中可以提供细胞生长所需的足够的营养物质，并且通过各种成分的配比，保证其生长速率快、增殖获得的细胞完整，以及氨基酸代谢良好。通过本发明所共公开的培养基培养在猪睾丸细胞的培养增殖过程中，无氧化作用干扰，细胞在驯化过程中无结团现象，细胞受外部环境干扰损伤少，得到的细胞完整度高，增殖快。
然后，我们公开了第二种无血清培养基，所述无血清培养基为pH为6.2～6.8.的水溶液，其组分如下：
MEM基础培养基 9.8g/L；
丙酮酸钠 50～300mg/L；
大豆蛋白水解物 0.1～2g/L；
胆固醇 2～6mg/L；
碱性成纤维细胞生长因子 0.5～20mg/L；
抑制素B 0.5～20mg/L；
胰岛素 10～50mg/L；
L-丙氨酸 10～100mg/L；
L-缬氨酸 2～35mg/L；
L-甲硫氨酸 10～30mg/L；
L-脯氨酸 10～250mg/L；
L-色氨酸 5～300mg/L；
L-甘氨酸 10～50mg/L；
L-丝氨酸 5～150mg/L；
L-半胱氨酸 5～250mg/L；
L-天冬酰胺 5～200mg/L；
L-谷氨酰胺 100～200mg/L；
L-天冬氨酸 2～80mg/L；
L-谷氨酸 5～200mg/L；
羟脯氨酸 10～60mg/L；
豆蔻酸 0.01～0.3mg/L；
棕榈酸 0.01～0.3mg/L；
棕榈油酸 0.01～0.3mg/L；
硬脂酸 0.01～0.3mg/L；
精胺 0.1～0.3ml/L；
亚精胺 0.1～0.3ml/L；
还原型谷胱甘肽 3～15mg/L；
乙醇胺 1.5～3ml/L；
β-巯基乙醇 1～2ml/L；
甘油 0.5～2g/L；
二甲基亚砜0.1～10ml/L；
羟乙基哌嗪乙磺酸 1000～5000mg/L；
生物素 0.01～0.1mg/L；
吡哆醇 1～5mg/L；
抗坏血酸 2～5mg/L；
维生素B-12 0.2～2mg/L；
次黄嘌呤 3～20mg/L；
胸苷 0.01～1mg/L；
FeSO4·7H2O 5～20mg/L；
ZnSO4 2～40mg/L；
Na2SeO3 0.1～2mg/L；
柠檬酸铁 2～20mg/L。
进一步地，我们限定了第二种无血清培养基中，所述无血清培养基为pH为6.6的水溶液。
同时，我们进一步公开了第二种无血清培养基在猪瘟病毒增殖前期中的应用。
紧接着，我们还公开了第三种无血清培养基，所述无血清培养基为pH为7.0～7.2.的水溶液，其组分如下：
MEM基础培养基 9.8g/L；
丙酮酸钠 10～100mg/L；
大豆蛋白水解物 0.1～0.5g/L；
胆固醇 0.01～0.5mg/L；
胰岛素 0.01～2.5mg/L；
豆蔻酸 0.01～0.3mg/L；
棕榈酸 0.01～0.3mg/L；
棕榈油酸 0.01～0.3mg /L；
硬脂酸 0.01～0.3mg/L；
精胺 0.1～0.3ml/L；
亚精胺 0.1～0.3ml/L；
还原型谷胱甘肽 0.1～10mg/L；
乙醇胺 0.1～1ml/L；
β-巯基乙醇 0.1～1ml/L；
甲基-β-环糊精 1～1000mg/L；
γ-环糊精 1～1000mg/L；
羟乙基哌嗪乙磺酸 1000～5000mg/L；
生物素 0.01～0.1mg/L；
吡哆醇 0.1～3mg/L；
抗坏血酸 2～5mg/L；
维生素B-12 0.1～2mg/L；
次黄嘌呤 1～10mg/L；
胸苷 0.01～1mg/L；
FeSO4·7H2O 5～20mg/L；
ZnSO4 2～40mg/L；
Na2SeO3 0.1～1mg/L；
柠檬酸铁 2～20mg/L。
进一步地，我们公开了第三种无血清培养基中，优选pH为7.0的水溶液。
同时，我们还进一步公开了第三种无血清培养基在猪瘟病毒增殖后期中的应用。最后，我们公开了一种猪瘟病毒的培养方法，包括以下步骤：
将猪瘟病毒接种于第二种无血清培养基中，控制DO值为30％，pH值为6.6，搅拌转速为75rpm，温度为37℃，接种病毒后每三天进行收毒换液操作，完成3～5批次收毒后，转用第三种无血清培养基进行培养增殖，控制DO值为30％，pH 值为7.0，搅拌转速为55rpm，温度为32℃，接种病毒后每四天进行收毒换液操作，完成2批次收毒后，即完成猪瘟病毒的培养、收集。
在本发明中，大豆蛋白水解物即大豆蛋白酶解蛋白胨。可以采用市售的产品，譬如sigma公司出品的大豆蛋白酶解蛋白胨。
本发明以MEM为基础培养基，通过对猪睾丸细胞以及猪瘟病毒的生长、增殖特征研究，利用在基础培养基内添加不同成分，分别得到一系列的猪睾丸细胞无血清培养基、以及不同生长阶段的猪瘟病毒增殖无血清培养基，从而既避免了BVDV及其抗体可能产生的污染风险，同时可以实现ST细胞贴壁生长，且生长迅速、细胞面完整，个体饱满，可以长期传代培养。
附图说明
图1为采用本发明所公开的无血清培养基培养ST细胞时，ST细胞在培养方瓶中生长形态照片。
图2为采用本发明所公开的无血清培养基培养ST细胞时，ST细胞在微载体上悬浮培养形态照片。
图3为采用本发明所公开的无血清培养基，ST细胞连续增殖4批次HCLV后的细胞形态。
具体实施方式
下面结合具体实施方式中的实施例进一步对本发明进行说明，但是本发明不限于以下实施例。
如果没有特别说明，在本发明中所指的原料均来自sigma公司所售产品，其基础操作，譬如溶解方式，预处理方式等参考产品说明书处理。
本发明中操作均在室温条件下进行，即25℃左右的温度下进行操作。
实施例1
分别将以下物质溶解，将各个溶解液混合，避光搅拌30分钟，直至充分混合后，加入无热源的超净纯水800ml，再次搅拌混合后，定容至1000ml，并调节溶液pH至7.2。所加入物质包括：MEM基础培养基9.8g；丙酮酸钠50～200mg；大豆蛋白水解物0.1～2g；胆固醇0.1～6mg；碱性成纤维细胞生长因子0.5～50mg； 抑制素B0.5～50mg；胰岛素5～50mg；L-丙氨酸2～30mg；L-缬氨酸52～150mg；L-亮氨酸10～80mg；L-异亮氨酸5～180mg；L-甲硫氨酸15～300mg；L-脯氨酸
10～250mg；L-苯丙氨酸10～250mg；L-色氨酸5～300mg；L-甘氨酸
0～50mg；L-丝氨酸5～150mg；L-苏氨酸5～250mg；L-半胱氨酸5～250mg；L-天冬酰胺5～200mg；L-谷氨酰胺250～400mg；L-酪氨酸5～250mg；L-天冬氨酸2～80mg；L-谷氨酸5～200mg；L-赖氨酸6～100mg；L-精氨酸
5～300mg；L-组氨酸5～300mg；羟脯氨酸0～40mg；豆蔻酸0.01～0.3mg；棕榈酸0.01～0.3mg；棕榈油酸0.01～0.3mg；硬脂酸0.01～0.3mg；精胺0.1～0.3ml；亚精胺0.1～0.3ml；还原型谷胱甘肽1～3mg；乙醇胺1.5～3ml；β-巯基乙醇0.5～2ml/L；甘油0.5～2g；
生物素0.01～0.1mg；吡哆醇1～5mg；抗坏血酸0.5～5mg；维生素B120.5～2mg；次黄嘌呤3～20mg；胸苷0.01～1mg；NaHCO31～1.5g；FeSO4·7H2O5～20mg；ZnSO42～40mg；Na2SeO30.1～2mg；柠檬酸铁2～20mg/L。
从而制备得到第一目标培养基，用0.22μm滤膜过滤除菌后，于4℃冰箱中避光保存，待用。
实施例2
按照实施例1中的方式，制备第一种目标无血清培养基，其中各物质如表1中所示，
表1 适用于ST细胞生长的无血清培养基组分
| MEM基础培养基 | 9.8g/L |
| 丙酮酸钠 | 200mg/L |
| 大豆蛋白水解物 | 2g/L |
| 胆固醇 | 2.5mg/L |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | 25mg/L |
| 抑制素B | 25mg/L |
| 胰岛素 | 25mg/L |
| L-丙氨酸 | 20mg/L |
| L-缬氨酸 | 150mg/L |
| L-亮氨酸 | 45mg/L |
| L-异亮氨酸 | 58mg/L |
| L-甲硫氨酸 | 150mg/L |
| L-脯氨酸 | 150mg/L |
| L-苯丙氨酸 | 150mg/L |
| L-色氨酸 | 50mg/L |
| L-甘氨酸 | 10mg/L |
| L-丝氨酸 | 55mg/L |
| L-苏氨酸 | 55mg/L |
| L-半胱氨酸 | 55mg/L |
| L-天冬酰胺 | 50mg/L |
| L-谷氨酰胺 | 250mg/L |
| L-酪氨酸 | 55mg/L |
| L-天冬氨酸 | 20mg/L |
| L-谷氨酸 | 50mg/L |
| L-赖氨酸 | 60mg/L |
| L-精氨酸 | 50mg/L |
| L-组氨酸 | 50mg/L |
| 羟脯氨酸 | 40mg/L |
| 豆蔻酸 | 0.1mg/L |
| 棕榈酸 | 0.1mg/L |
| 棕榈油酸 | 0.1mg/L |
| 硬脂酸 | 0.1mg/L |
| 精胺 | 0.1ml/L |
| 亚精胺 | 0.1ml/L |
| 还原型谷胱甘肽 | 1.5mg/L |
| 乙醇胺 | 1.5ml/L |
| β-巯基乙醇 | 0.5ml/L |
| 甘油 | 1.5g/L |
| 生物素 | 0.05mg/L |
| 吡哆醇 | 1mg/L |
| 抗坏血酸 | 1.5mg/L |
| 维生素B-12 | 0.5mg/L |
| 次黄嘌呤 | 12mg/L |
| 胸苷 | 0.08mg/L |
| NaHCO3 | 1.5g/L |
| FeSO4·7H2O | 15mg/L |
| ZnSO4 | 28mg/L |
| Na2SeO3 | 0.18mg/L |
| 柠檬酸铁 | 18mg/L |
实施例3
分别将以下物质溶解，将各个溶解液混合，避光搅拌30分钟，直至充分混合后，加入无热源的超净纯水800ml，再次搅拌混合后，定容至1000ml，并调节溶液pH至6.6。所加入物质包括：MEM基础培养基9.8g；丙酮酸钠50～300mg；大豆蛋白水解物0.1～2g；胆固醇2～6mg；碱性成纤维细胞生长因子0.5～20mg； 抑制素B0.5～20mg；胰岛素10～50mg；L-丙氨酸10～100mg；L-缬氨酸
2～35mg；L-甲硫氨酸10～30mg；L-脯氨酸10～250mg；L-色氨酸5～300mg；L-甘氨酸10～50mg；L-丝氨酸5～150mg；L-半胱氨酸5～250mg；L-天冬酰胺5～200mg；L-谷氨酰胺100～200mg；L-天冬氨酸2～80mg；L-谷氨酸5～200mg；
羟脯氨酸10～60mg；豆蔻酸0.01～0.3mg；棕榈酸0.01～0.3mg；棕榈油酸0.01～0.3mg；硬脂酸0.01～0.3mg；精胺0.1～0.3ml；亚精胺0.1～0.3ml；还原型谷胱甘肽3～15mg；乙醇胺1.5～3ml；β-巯基乙醇1～2ml；甘油0.5～2g；二甲基亚砜0.1～10ml；羟乙基哌嗪乙磺酸1000～5000mg；生物素0.01～0.1mg；吡哆醇1～5mg；抗坏血酸2～5mg；维生素B-120.2～2mg；次黄嘌呤3～20mg；胸苷0.01～1mg；FeSO4·7H2O5～20mg；ZnSO42～40mg；Na2SeO30.1～2mg；柠檬酸铁2～20mg。
从而制备得到第二目标培养基，即第一猪瘟病毒增殖液，适用于猪瘟病毒前期增殖的病毒增值液，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，于4℃冰箱中避光保存，待用。
实施例4
按照实施例3中的方式，制备第二种目标无血清培养基，其中各物质如表2中所示，
表2 适用于猪瘟病毒前期增殖的病毒增殖液组分
| MEM基础培养基 | 9.8g/L |
| 丙酮酸钠 | 150mg/L |
| 大豆蛋白水解物 | 1.5g/L |
| 胆固醇 | 5mg/L |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | 0.5mg/L |
| 抑制素B | 0.5mg/L |
| 胰岛素 | 10mg/L |
| L-丙氨酸 | 50mg/L |
| L-缬氨酸 | 35mg/L |
| L-甲硫氨酸 | 20mg/L |
| L-脯氨酸 | 150mg/L |
| L-色氨酸 | 200mg/L |
| L-甘氨酸 | 50mg/L |
| L-丝氨酸 | 50mg/L |
| L-半胱氨酸 | 150mg/L |
| L-天冬酰胺 | 100mg/L |
| L-谷氨酰胺 | 100mg/L |
| L-天冬氨酸 | 70mg/L |
| L-谷氨酸 | 100mg/L |
| 羟脯氨酸 | 30mg/L |
| 豆蔻酸 | 0.15mg/L |
| 棕榈酸 | 0.15mg/L |
| 棕榈油酸 | 0.15mg/L |
| 硬脂酸 | 0.15mg/L |
| 精胺 | 0.1ml/L |
| 亚精胺 | 0.1ml/L |
| 还原型谷胱甘肽 | 5mg/L |
| 乙醇胺 | 2.5ml/L |
| β-巯基乙醇 | 2ml/L |
| 甘油 | 2g/L |
| 二甲基亚砜 | 2ml/L |
| 羟乙基哌嗪乙磺酸 | 4500mg/L |
| 生物素 | 0.01mg/L |
| 吡哆醇 | 1mg/L |
| 抗坏血酸 | 5mg/L |
| 维生素B-12 | 1mg/L |
| 次黄嘌呤 | 3mg/L |
| 胸苷 | 0.05mg/L |
| FeSO4·7H2O | 10mg/L |
| ZnSO4 | 20mg/L |
| Na2SeO3 | 0.1mg/L |
| 柠檬酸铁 | 10mg/L |
实施例5
分别将以下物质溶解，将各个溶解液混合，避光搅拌30分钟，直至充分混合后，加入无热源的超净纯水800ml，再次搅拌混合后，定容至1000ml，并调节溶液pH至7.0。所加入物质包括：MEM基础培养基9.8g；丙酮酸钠10～100mg；大豆蛋白水解物0.1～0.5g；胆固醇0.01～0.5mg；胰岛素0.01～2.5mg；豆蔻酸0.01～0.3mg；棕榈酸0.01～0.3mg；棕榈油酸0.01～0.3mg；硬脂酸0.01～0.3mg；精胺0.1～0.3ml；亚精胺0.1～0.3ml；还原型谷胱甘肽0.1～10mg；乙醇胺0.1～1ml；β-巯基乙醇0.1～1ml；甲基-β-环糊精1～1000mg；γ-环糊精1～1000mg；羟乙基哌嗪乙磺酸1000～5000mg；生物素0.01～0.1mg；吡哆醇0.1～3mg；抗坏血酸2～5mg；维生素B-120.1～2mg；次黄嘌呤1～10mg；胸苷0.01～1mg；FeSO4·7H2O5～20mg/L；ZnSO42～40mg/L；Na2SeO30.1～ 1mg/L；柠檬酸铁2～20mg/L。
从而制备得到第三目标培养基，即第二猪瘟病毒增殖液，适用于猪瘟病毒后期增殖的病毒增值液，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，于4℃冰箱中避光保存，待用。实施例6
按照实施例5中的方式，制备第三种目标无血清培养基，其中各物质如表3中所示，
表3适用于猪瘟病毒后期增殖的病毒增殖液组分
| MEM基础培养基 | 9.8g/L |
| 丙酮酸钠 | 30mg/L |
| 大豆蛋白水解物 | 0.1g/L |
| 胆固醇 | 0.01mg/L |
| 胰岛素 | 0.01mg/L |
| 豆蔻酸 | 0.01mg/L |
| 棕榈酸 | 0.01mg/L |
| 棕榈油酸 | 0.01mg/L |
| 硬脂酸 | 0.01mg/L |
| 精胺 | 0.1ml/L |
| 亚精胺 | 0.1ml/L |
| 还原型谷胱甘肽 | 0.1mg/L |
| 乙醇胺 | 0.1ml/L |
| β-巯基乙醇 | 1ml/L |
| 甲基-β-环糊精 | 1000mg/L |
| γ-环糊精 | 1000mg/L |
| 羟乙基哌嗪乙磺酸 | 4500mg/L |
| 生物素 | 0.01mg/L |
| 吡哆醇 | 0.1mg/L |
| 抗坏血酸 | 2mg/L |
| 维生素B-12 | 0.1mg/L |
| 次黄嘌呤 | 1mg/L |
| 胸苷 | 0.01mg/L |
| FeSO4·7H2O | 5mg/L |
| ZnSO4 | 2mg/L |
| Na2SeO3 | 0.1mg/L |
| 柠檬酸铁 | 10mg/L |
实施例7
首先将猪睾丸细胞进行低血清用量驯化，获得适应于含有1％～2％新生牛血清的 MEM培养基的低血清用量细胞株，作为本实施例的出发细胞株。
然后通过逐步阶梯性提高培养基中无血清培养基含量(体积占比)的方式，进一步驯化ST细胞，使其适应无血清培养基培养条件。
这里培养基由1号培养基至5号培养基(配比见表4，各组分之间为体积比)，阶梯性的提高了无血清培养基在培养基中的含量，从而最终实现100％完全使用本无血清培养基培养ST细胞。
表4 培养基配比
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| MEM培养基中添加有1％牛血清的培养基 | 100 | 75 | 50 | 25 | 0 |
| 实施例2中制备得到的无血清培养基 | 0 | 25 | 50 | 75 | 100 |
于37℃、5％CO2的培养环境，T75培养方瓶中以本实施例2中得到的无血清培养基静置培养ST细胞，细胞生长形态如图1所示。在本无血清培养基中ST细胞附着于培养表面生长，细胞个体饱满，生长速率正常。培养3～4天传代一次，传代时以0.05％EDTA溶液消化细胞，轻轻吹散细胞，经1000rpm离心2min去除消化溶液，重悬细胞于新鲜无血清培养基中分瓶即可完成正常传代培养，按照1传3至1传5比例分瓶。整个培养过程中，细胞的存活率均达到95％以上。在生物反应器中，以MEM培养基处理cytodex1球形微载体(6g/L)作为ST细胞的生长介质，以实施例2中获得的无血清培养基作为培养条件，以4.5×105cells/ml的初始细胞密度进行ST细胞微载体悬浮培养，设置温度为37℃，溶氧为50％，pH为7.0，搅拌转速为75rpm。培养3天后细胞密度可达到1.45×106cells/ml，进行补料培养操作，补料培养基成分如前所述。采用恒速流补料，控制葡萄糖消耗速率为5.5～7.0mmol/L·d，补料培养3天，细胞密度达到4.0～4.9×106cells/ml，细胞生长形态如图2所示。此时细胞可以进行接毒操作。
实施例8
将实施例7中微载体悬浮培养的ST细胞液中的上清液去除，然后用PBS清洗ST细胞3次，并将其接种在实施例4所得的适用于猪瘟病毒前期增殖的病毒增 殖液中。
更换上述适用于猪瘟病毒前期增殖的病毒增殖液至原体积，其中含有5～10％(体积比)的猪瘟病毒种毒(20万RID/ml)进行猪瘟病毒增殖。猪瘟病毒的增殖前期工艺如下：1)接毒后控制DO值(溶氧量)为30％，pH值为6.6，搅拌转速为75rpm，温度为37℃；2)接毒后每三天进行收毒、换液操作，继续用实施例4中获得的病毒增殖液进行换液操作，但留存上批次病毒增殖液的体积为增殖体积的5～10％；3)按照此接毒收毒步骤至少完成3～4批次收毒；4)第3～4批次所收猪瘟病毒可作为种毒保存；5)根据ST细胞在微载体上的生长状态，可以将此接毒收毒方式延长至5批次。使用病毒增殖液1进行ST细胞维持及病毒连续增殖时，细胞占满整个微载体，细胞状态良好，个体完整，如图3所示。
当猪瘟病毒增殖到达后期时，可采用实施例6中获得的适用于猪瘟病毒后期增殖的病毒增殖液进行增殖培养。
更换用于猪瘟病毒后期增殖的病毒增殖液至原体积，其中含有5～10％(体积比)的留存上批次增殖液(适用于猪瘟病毒前期增殖的病毒增殖液)继续进行猪瘟病毒增殖。猪瘟病毒的增殖后期工艺如下：1)接毒后控制DO值(溶氧值)为30％，pH值为7.0，搅拌转速为55rpm，温度为32℃；2)更换病毒增殖液后，每四天进行收毒、换液操作，继续用实施例6中获得的病毒增殖液进行换液操作，但留存上批次病毒增殖液的体积为增殖体积的5～10％；3)按照此接毒收毒步骤至少完成2个批次的收毒流程。
收集各个批次获得的猪瘟病毒，并留存每个批次病毒增殖的上清液。
收集得到的猪瘟病毒即为用于疫苗制备的目标病毒。
实施例9
将实施例8中获得的猪瘟病毒和各个批次的上清液，以兔体感染定型热法(中国农业部兽用生物制品质量标准：猪瘟活疫苗效力检验标准方法)测定猪瘟病毒效价，结果见表5：
表5
对比：采用传统含有2％小牛血清的培养基增殖猪瘟病毒后，以兔体感染定型热法(中国农业部兽用生物制品质量标准：猪瘟活疫苗效力检验标准方法)测定猪瘟病毒效价，结果见表6：
表6
由上表对比可知，采用本发明所公开的无血清培养基获得的猪瘟病毒效价高，质量好。
Claims (10)
1.无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基为pH为7.0~7.5的水溶液，其组分如下：
MEM基础培养基 9.8 g/L；
丙酮酸钠 50～200mg/L；
大豆蛋白水解物 0.1～2g/L；
胆固醇 0.1～6mg/L；
碱性成纤维细胞生长因子 0.5～50mg/L；
抑制素B 0.5～50mg/L；
胰岛素 5～50mg/L；
L-丙氨酸 2～30mg/L；
L-缬氨酸 52～150mg/L；
L-亮氨酸 10～80mg/L；
L-异亮氨酸 5～180mg/L；
L-甲硫氨酸 15～300mg/L；
L-脯氨酸 10～250mg/L；
L-苯丙氨酸 10～250mg/L；
L-色氨酸 5～300mg/L；
L-甘氨酸 0～50mg/L；
L-丝氨酸 5～150mg/L；
L-苏氨酸 5～250mg/L；
L-半胱氨酸 5～250mg/L；
L-天冬酰胺 5～200mg/L；
L-谷氨酰胺 250～400mg/L；
L-酪氨酸 5～250mg/L；
L-天冬氨酸 2～80mg/L；
L-谷氨酸 5～200mg/L；
L-赖氨酸 6～100mg/L；
L-精氨酸 5～300mg/L；
L-组氨酸 5～300 mg/L；
羟脯氨酸 0～40mg/L；
豆蔻酸 0.01～0.3mg/L；
棕榈酸 0.01～0.3 mg /L；
棕榈油酸 0.01～0.3 mg /L；
硬脂酸 0.01～0.3 mg /L；
精胺 0.1～0.3ml/L；
亚精胺 0.1～0.3ml/L；
还原型谷胱甘肽 1～3mg/L；
乙醇胺 1.5～3ml/L；
β-巯基乙醇 0.5～2ml/L；
甘油 0.5～2g/L；
生物素 0.01～0.1mg/L；
吡哆醇 1～5mg/L；
抗坏血酸 0.5～5mg/L；
维生素B-12 0.5～2mg/L；
次黄嘌呤 3～20mg/L；
胸苷 0.01～1mg/L；
NaHCO3 1～1.5g/L；
FeSO47H2O 5～20mg/L；
ZnSO4 2～40mg/L；
Na2SeO3 0.1～2mg/L；
柠檬酸铁 2～20mg/L。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基为pH为7.2的水溶液。
3.权利要求1所述的无血清培养基在猪睾丸细胞体外培养和扩增中的应用。
4.无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基为pH为6.2~6.8.的水溶液，其组分如下：
MEM基础培养基 9.8 g/L；
丙酮酸钠 50～300mg/L；
大豆蛋白水解物 0.1～2g/L；
胆固醇 2～6mg/L；
碱性成纤维细胞生长因子 0.5～20mg/L；
抑制素B 0.5～20mg/L；
胰岛素 10～50mg/L；
L-丙氨酸 10～100mg/L；
L-缬氨酸 2～35mg/L；
L-甲硫氨酸 10～30mg/L；
L-脯氨酸 10～250mg/L；
L-色氨酸 5～300mg/L；
L-甘氨酸 10～50mg/L；
L-丝氨酸 5～150mg/L；
L-半胱氨酸 5～250mg/L；
L-天冬酰胺 5～200mg/L；
L-谷氨酰胺 100～200mg/L；
L-天冬氨酸 2～80mg/L；
L-谷氨酸 5～200mg/L；
羟脯氨酸 10～60mg/L；
豆蔻酸 0.01～0.3mg/L；
棕榈酸 0.01～0.3 mg /L；
棕榈油酸 0.01～0.3 mg /L；
硬脂酸 0.01～0.3 mg /L；
精胺 0.1～0.3ml/L；
亚精胺 0.1～0.3ml/L；
还原型谷胱甘肽 3～15mg/L；
乙醇胺 1.5～3ml/L；
β-巯基乙醇 1～2ml/L；
甘油 0.5～2g/L；
二甲基亚砜 0.1～10ml/L；
羟乙基哌嗪乙磺酸 1000～5000mg/L；
生物素 0.01～0.1mg/L；
吡哆醇 1～5mg/L；
抗坏血酸 2～5mg/L；
维生素B-12 0.2～2mg/L；
次黄嘌呤 3～20mg/L；
胸苷 0.01～1mg/L；
FeSO47H2O 5～20mg/L；
ZnSO4 2～40mg/L；
Na2SeO3 0.1～2mg/L；
柠檬酸铁 2～20mg/L。
5.根据权利要求4所述的无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基为pH为6.6的水溶液。
6.权利要求4所述的无血清培养基在猪瘟病毒增殖前期中的应用。
7.无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基为pH为7.0~7.2.的水溶液，其组分如下：
MEM基础培养基 9.8 g/L；
丙酮酸钠 10～100mg/L；
大豆蛋白水解物 0.1～0.5g/L；
胆固醇 0.01～0.5mg/L；
胰岛素 0.01～2.5mg/L；
豆蔻酸 0.01～0.3mg/L；
棕榈酸 0.01～0.3 mg /L；
棕榈油酸 0.01～0.3 mg /L；
硬脂酸 0.01～0.3 mg /L；
精胺 0.1～0.3ml/L；
亚精胺 0.1～0.3ml/L；
还原型谷胱甘肽 0.1～10mg/L；
乙醇胺 0.1～1ml/L；
β-巯基乙醇 0.1～1ml/L；
甲基-β-环糊精 1～1000mg/L；
γ-环糊精 1～1000mg/L；
羟乙基哌嗪乙磺酸 1000～5000mg/L；
生物素 0.01～0.1mg/L；
吡哆醇 0.1～3mg/L；
抗坏血酸 2～5mg/L；
维生素B-12 0.1～2mg/L；
次黄嘌呤 1～10mg/L；
胸苷 0.01～1mg/L；
FeSO47H2O 5～20mg/L；
ZnSO4 2～40mg/L；
Na2SeO3 0.1～1mg/L；
柠檬酸铁 2～20mg/L。
8.根据权利要求7所述的无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基为pH为7.0的水溶液。
9.权利要求7所述的无血清培养基在猪瘟病毒增殖后期中的应用。
10.一种猪瘟病毒的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将猪瘟病毒接种于权利要求5所述的无血清培养基中，控制DO值为30%，pH值为6.6，搅拌转速为75rpm，温度为37℃，接种病毒后每三天进行收毒换液操作，完成3~5批次收毒后，转用权利要求7所述的无血清培养基进行培养增殖，控制DO值为30%，pH值为7.0，搅拌转速为55rpm，温度为32℃，接种病毒后每四天进行收毒换液操作，完成2批次收毒后，即完成猪瘟病毒的培养、收集。
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