CN107129964A - 一种st细胞培养液及其制备方法、使用方法 - Google Patents

一种st细胞培养液及其制备方法、使用方法 Download PDF

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Abstract

一种ST细胞培养液及其制备方法、使用方法，属于兽用生物制品技术领域。该ST细胞培养液中每1000ml去离子水中含有以下组分：DMEM粉末9‑12 g、氯化钾100‑300 mg、氯化钠1‑6 g、转铁蛋白储液1‑3 ml、bFGF储液0.8‑4 ml、丙酮酸钠10‑40 mg、维生素C10‑100 mg、茯苓多糖10‑20 mg、柠檬酸铁20‑80 mg。本发明具有以下有益效果：本发明所使用的ST细胞培养液，大大减少了血清的使用量，降低了细胞培养的成本；提高ST细胞生长速度；增强PRV对ST细胞的敏感性，提高了病毒含量；由本发明所使用的ST细胞培养液还可以大幅度提高PRV疫苗的免疫原性。

Description

一种ST细胞培养液及其制备方法、使用方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种ST细胞培养液及其制备方法、使用方法。
背景技术
猪睾丸细胞（Swine Testis，ST）是从猪胎睾丸分离得到的成纤维细胞系，体外呈贴壁型生长，可连续传代培养，是猪伪狂犬病毒最为易感的细胞系之一，能稳定猪伪狂犬疫苗生产工艺并有效提高病毒滴度，在猪伪狂犬细胞源疫苗研究中被广泛使用。
猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV） 引起的不同阶段猪出现不同症状的一种传染病，妊娠母猪发病后可发生流产、死胎、木乃伊胎；哺乳阶段和保育阶段猪发病后，可出现神经症状和呼吸道症状。目前控制PRV的主要使用疫苗进行免疫防控，疫苗的质量和安全性在很大程度上取决于疫苗的生产方式和过程，PRV疫苗通常是大规模培养细胞收获病毒液，但目前多采用含血清的培养液培养细胞，血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量。从病毒疫苗生产工艺角度考虑，血清组分的复杂性和批次间的质量差异增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度；从病毒疫苗的安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患。
由使用血清所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定因素增加的现实问题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。无血清培养液具有诸多优势：简化下游目的产物的分离纯化、节约成本；避免血清批次间的差异性，提高细胞培养的稳定性及结果的可靠性；避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染；无血清培养液由于添加成分相对确定，可用于研究细胞生长、增殖、分化、代谢及基因调控等研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明目的在于设计提供一种ST细胞培养液及其制备方法、使用方法的技术方案。
所述的一种ST细胞培养液，其特征在于每1000ml 去离子水中含有以下组分：
DMEM粉末9-12 g、氯化钾100-300 mg、氯化钠1-6 g、转铁蛋白储液1-3 ml、bFGF储液0.8-4 ml、丙酮酸钠10-40 mg、维生素C10-100 mg、茯苓多糖10-20 mg、柠檬酸铁20-80 mg。
所述的一种ST细胞培养液，其特征在于每1000ml 去离子水中含有以下组分：
DMEM粉末9-12 g、氯化钾120-280 mg、氯化钠2-4 g、转铁蛋白储液1-3 ml、bFGF储液1-3 ml、丙酮酸钠20-30 mg、维生素C15-80 mg、茯苓多糖12-18mg、柠檬酸铁30-60 mg。
所述的一种ST细胞培养液，其特征在于每1000ml 去离子水中含有以下组分：
DMEM粉末10-12 g、氯化钾150-250 mg、氯化钠2-4 g、转铁蛋白储液1.5-2.5 ml、bFGF储液1.5-2.5 ml、丙酮酸钠22-28 mg、维生素C30-60 mg、茯苓多糖14-16mg、柠檬酸铁40-50mg。
所述的一种ST细胞培养液，其特征在于所述的转铁蛋白储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1 的生理盐水 和90% 甘油溶解转铁蛋白，配制浓度为15mg/ml的储液，置于-20℃备用。
所述的一种ST细胞培养液，其特征在于所述的bFGF储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1 的生理盐水和90%甘油溶解bFGF，配成浓度为50 u g/ml的储液，置于-20℃备用。
所述的一种ST细胞培养液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）以体积比为1:1 的生理盐水 和90% 甘油溶解转铁蛋白，配制浓度为15mg/ml的储液，置于-20℃备用；
2）以体积比为1:1 的生理盐水和90%甘油溶解bFGF，配成浓度为50 u g/ml的储液，置于-20℃备用；
3）按所述的配方量取各组分，并将各组分充分混合，加入到去离子水中，边加边搅拌，直至完全溶解，然后补去离子水定量1000ml，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。
所述的一种ST细胞培养液的使用方法，其特征在于包括以下步骤：ST细胞采用微载体悬浮培养方式进行培养，按初始接种密度为1-3×105 个/ml 的ST细胞接种于1-5L的含有ST细胞培养液的生物反应器中，微载体用量为2-8g/ml ，控制溶氧饱和度在50%左右，搅拌速度为20-50 r/min，PH控制在7.0-7.4 之间，在温度37℃环境下培养48-72h；将感染复数MOI为0.005-0.5的PRV病毒液接入到ST细胞微载体培养物中，接毒后培养80-96h，待细胞病变达到75%以上进行收获病毒液。
本发明中各组分均为现有产品，其中DMEM粉末、转铁蛋白和bFGF购买于Sigma；茯苓多糖购买于上海源叶生物科技有限公司。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所制备的ST细胞培养液，为无添加血清培养液，既可以大幅度降低生产成本，又保证疫苗的质量和安全性。
2、本发明所制备的ST细胞培养液，可以大大提高细胞的生长速度。
3、本发明所制备的ST细胞培养液，可以提高PRV对ST细胞的感染敏感性，提高其病毒含量，从而还提高PRV灭活疫苗的免疫原性。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1：培养液的制备
DMEM粉末：9 g (购买于：Sigma )
氯化钾： 100 mg (购买于：科密欧化学试剂有限公司)
氯化钠：1 g (购买于：科密欧化学试剂有限公司)
转铁蛋白储液: 1ml (转铁蛋白购买于：Sigma )
bFGF储液: 0.8 ml (bFGF购买于：Sigma )
丙酮酸钠：10 mg (购买于：广东翁江化学试剂有限公司)
维生素C: 10 mg (购买于：江苏古贝生物科技有限公司)
茯苓多糖：10 mg (购买于：上海源叶生物科技有限公司)
柠檬酸铁： 20 mg (购买于：武汉福鑫化工有限公司)
转铁蛋白储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1 的生理盐水 和90% 甘油溶解转铁蛋白，配制浓度为15mg/ml的储液，置于-20℃备用。
bFGF储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1 的生理盐水和90%甘油溶解bFGF，配成浓度为50 u g/ml的储液，置于-20℃备用。
将以上各种成分充分混合，加入到盛有一定量的去离子水中，边加边搅拌，直至完全溶解，然后补去离子水定量1000ml，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。
实施例2：培养液的制备
DMEM粉末：10 g (购买于：Sigma )
氯化钾： 200 mg (购买于：科密欧化学试剂有限公司)
氯化钠：4 g (购买于：科密欧化学试剂有限公司)
转铁蛋白储液:2 ml (转铁蛋白购买于：Sigma )
bFGF储液: 2 ml (bFGF购买于：Sigma )
丙酮酸钠：22 mg (购买于：广东翁江化学试剂有限公司)
维生素C: 50 mg (购买于：江苏古贝生物科技有限公司)
茯苓多糖：15 mg (购买于：上海源叶生物科技有限公司)
柠檬酸铁：45 mg (购买于：武汉福鑫化工有限公司)
转铁蛋白储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1 的生理盐水 和90% 甘油溶解转铁蛋白，配制浓度为15mg/ml的储液，置于-20℃备用。
bFGF储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1 的生理盐水和90%甘油溶解bFGF，配成浓度为50 u g/ml的储液，置于-20℃备用。
将以上各种成分充分混合，加入到盛有一定量的去离子水中，边加边搅拌，直至完全溶解，然后补去离子水定量1000ml，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。
实施例3：培养液的制备
DMEM粉末： 12 g (购买于：Sigma )
氯化钾： 300mg (购买于：科密欧化学试剂有限公司)
氯化钠： 6 g (购买于：科密欧化学试剂有限公司)
转铁蛋白储液: 3 ml (转铁蛋白购买于：Sigma )
bFGF储液: 4 ml (bFGF购买于：Sigma )
丙酮酸钠： 40 mg (购买于：广东翁江化学试剂有限公司)
维生素C: 100 mg (购买于：江苏古贝生物科技有限公司)
茯苓多糖： 20 mg (购买于：上海源叶生物科技有限公司)
柠檬酸铁： 80 mg (购买于：武汉福鑫化工有限公司)
转铁蛋白储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1 的生理盐水 和90% 甘油溶解转铁蛋白，配制浓度为15mg/ml的储液，置于-20℃备用。
bFGF储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1 的生理盐水和90%甘油溶解bFGF，配成浓度为50 u g/ml的储液，置于-20℃备用。
将以上各种成分充分混合，加入到盛有一定量的去离子水中，边加边搅拌，直至完全溶解，然后补去离子水定量1000ml，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。
试验例 本发明培养液的应用
1材料
1.1 ST细胞培养液
按本发明实施例1-3制得
1.2 DMEM基础培养液、胎牛血清 购于GIBCO公司，硫乙醇酸盐培养液(TG)、胰酪蛋白胨培养液（TSB）购于北京中海生物科技有限公司
1.3 ST细胞 购于ATCC，由浙江美保龙生物技术有限公司保存
1.4 猪伪狂犬病毒C株/ Bartha株（PRV）， 购于中国兽医药品监察所
1.5 试验动物 28日龄健康断奶仔猪60头，检测伪狂犬抗体、抗原双阴性。
2 方法
2.1 培养液检验
2.1.1 无菌检验
将实施例1-3制备的ST细胞培养液，各取3个不同批次进行无菌检验，每个批次分别取1ml接种于2支50ml TG大管中，1支置于35-37℃培养，1支置于23-25℃培养，3d后各吸取培养物分别接种于10个TG小管，再分别置于35-37℃和23-25℃培养，另外每个批次分别取0.2ml接种于TSB小管内，置于23-25℃培养，同时做阴性对照，均培养7日，观察结果。
2.1.2 内毒素测定
将实施例1-3制备的ST细胞培养液，各取3个不同批次进行内毒素检验，每个批次分别取1.7 ml用鲎试剂盒分别进行检测，用酶标仪选择波长405nm测其OD值，同时做阴性对照。
2.2 细胞培养及生长速度的测定
在5个1L生物反应器中分别加入80-120ml由实施例1-3制备的ST细胞培养液，含8%、10%FBS的完全培养液，按相同的初始接种密度：1-3×105 个/ml 的ST细胞接种于1L的生物反应器中，微载体用量为6 g/ml ，控制溶氧饱和度在50%左右，搅拌速度为30 r/min，PH控制在7.0，在温度37℃环境下培养48-72 h后，均匀吸取各悬浮培养的细胞培养样品，用 CedexAS-20 细胞密度和活力自动分析仪计数细胞密度和活力。
2.3 病毒培养
将PRV病毒液按0.1 MOI，以相同剂量分别接入到等量的5种ST细胞微载体培养物中，接毒后培养80-96 h，待细胞病变达到75%以上进行收获病毒液。
2.4 TCID50测定
分别将由实施例1-3制备的ST细胞培养液培养的细胞、含8%、10%FBS的DMEM培养液培养的细胞，均稀释成1×105～106 个/m L，按 0. 2 m L /孔转入96孔培养板中，置于37℃，5%的培养箱中培养2d，弃掉培养液上清，将2.3收获的PRV 分别用DMEM基础培养液作连续10倍稀释 ，按0.2 mL /孔接种，置于37℃，5%的培养箱中培养4d，每天观察细胞病变并记录，按Reed-Muench 法计算TCID50。
2.5 免疫原性测定
将2.3收获的五种病毒液经检验合格，经加工处理制成疫苗测定疫苗的免疫原性。将60头28日龄断奶仔猪共分为6组，每组10头，第Ⅰ组采用经本发明实施例1制备的培养液，用于培养ST细胞繁殖 PRV，经加工处理后制成的疫苗，按照1ml/头，进行肌肉免疫接种；第Ⅱ组采用经本发明实施例2制备的培养液，用于培养ST细胞繁殖 PRV，经加工处理后制成的疫苗，按照1ml/头，进行肌肉免疫接种；第Ⅲ组采用经本发明实施例3制备的培养液，用于培养ST细胞繁殖 PRV，经加工处理后制成的疫苗，按照1ml/头，进行肌肉免疫接种；第Ⅳ组采用含10%FBS培养液，用于培养ST细胞繁殖PRV，经加工处理后制成的疫苗，按照1ml/头，进行肌肉免疫接种；第Ⅴ组采用含8%FBS培养液，用于培养ST细胞繁殖PRV，经加工处理后制成的疫苗，按照1ml/头，进行肌肉免疫接种。第Ⅳ组，疫苗对照组，不进行免疫。每组在免疫后7d、14d、28d、42d、63d、84d分别采血，分离血清，采用IDEXX猪伪狂犬抗体检测试剂盒检测各组gB IgG抗体。
3 结果
3.1 检验结果
表1 无菌检验结果
表2 内毒素检验结果（405nm）
由表1、表2可以看出，由实施例1、2、3制备的不同批次的培养液均既无菌生长又不含内毒素，该方法制备的培养液安全可靠。
3.2 细胞密度及活力测定结果
表3 细胞密度测定结果
由表3可以看出，由实施例1、2、3制备的培养液培养的ST细胞密度明显大于含FBS培养液培养的ST细胞。
表4 细胞活率测定结果
由表4可以看出，在相同的培养时间内，由实施例1、2、3制备的培养液培养的ST细胞存活率明显大于由含FBS培养液培养的ST细胞。
3.3 TCID50测定结果
表5 TCID50测定结果
由表5可以看出，由实施例1、2、3制备的培养液添加剂培养的ST细胞比由含FBS培养液培养的ST细胞更有利于PRV的繁殖，敏感性更强。
3.4 免疫原性测定结果
表6 PRV的抗体水平测定结果
由表6可以看出，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的抗体水平明显高于Ⅳ、Ⅴ组，由实施例1、2、3制备的培养液培养的PRV的免疫原性高于含FBS培养液培养的PRV。
4 结论
综上所述，本发明所使用的ST细胞培养液，在可以大大提高细胞的生长速度的前提下，一方面能增强PRV对ST细胞的敏感性，提高病毒含量，另一方面，还可以增强PRV疫苗的免疫原性。

Claims (7)

1.一种ST细胞培养液，其特征在于每1000ml 去离子水中含有以下组分：
DMEM粉末9-12 g、氯化钾100-300 mg、氯化钠1-6 g、转铁蛋白储液1-3 ml、bFGF储液0.8-4 ml、丙酮酸钠10-40 mg、维生素C10-100 mg、茯苓多糖10-20 mg、柠檬酸铁20-80 mg。
2.如权利要求1所述的一种ST细胞培养液，其特征在于每1000ml 去离子水中含有以下组分：
DMEM粉末9-12 g、氯化钾120-280 mg、氯化钠2-4 g、转铁蛋白储液1-3 ml、bFGF储液1-3 ml、丙酮酸钠20-30 mg、维生素C15-80 mg、茯苓多糖12-18mg、柠檬酸铁30-60 mg。
3.如权利要求1所述的一种ST细胞培养液，其特征在于每1000ml 去离子水中含有以下组分：
DMEM粉末10-12 g、氯化钾150-250 mg、氯化钠2-4 g、转铁蛋白储液1.5-2.5 ml、bFGF储液1.5-2.5 ml、丙酮酸钠22-28 mg、维生素C30-60 mg、茯苓多糖14-16mg、柠檬酸铁40-50mg。
4.如权利要求1或2或3所述的一种ST细胞培养液，其特征在于所述的转铁蛋白储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1 的生理盐水 和90% 甘油溶解转铁蛋白，配制浓度为15mg/ml的储液，置于-20℃备用。
5.如权利要求1或2或3所述的一种ST细胞培养液，其特征在于所述的bFGF储液通过以下步骤制得：以体积比为1:1 的生理盐水和90%甘油溶解bFGF，配成浓度为50 u g/ml的储液，置于-20℃备用。
6.如权利要求1或2或3所述的一种ST细胞培养液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）以体积比为1:1 的生理盐水 和90% 甘油溶解转铁蛋白，配制浓度为15mg/ml的储液，置于-20℃备用；
2）以体积比为1:1 的生理盐水和90%甘油溶解bFGF，配成浓度为50 u g/ml的储液，置于-20℃备用；
3）按所述的配方量取各组分，并将各组分充分混合，加入到去离子水中，边加边搅拌，直至完全溶解，然后补去离子水定量1000ml，并经过0.22um细菌滤器进行过滤除菌，之后进行分装备用。
7.如权利要求1或2或3所述的一种ST细胞培养液的使用方法，其特征在于包括以下步骤：ST细胞采用微载体悬浮培养方式进行培养，按初始接种密度为1-3×105 个/ml 的ST细胞接种于1-5L的含有ST细胞培养液的生物反应器中，微载体用量为2-8g/ml ，控制溶氧饱和度在50%左右，搅拌速度为20-50 r/min，PH控制在7.0-7.4 之间，在温度37℃环境下培养48-72h；将感染复数MOI为0.005-0.5的PRV病毒液接入到ST细胞微载体培养物中，接毒后培养80-96h，待细胞病变达到75%以上进行收获病毒液。
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