CN107267443B - 一种适应全悬浮培养的vero E6细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适应全悬浮培养的vero E6细胞株，命名为Vero E6‑S，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC 2017101，分类命名为非洲绿猴肾细胞悬浮适应株Vero E6‑S，保藏日期为2017年6月29日。相对于现有技术，本发明公开的适应全悬浮培养的vero E6细胞株培养疫苗病毒自动化程度高，不需要载体介入，可以在无血清或低血清培养基中悬浮培养，解决病毒培养大规模产业化的要求，开发能满足GMP生产技术要求的大规模化生产方法，拥有很好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适应全悬浮培养的vero E6细胞株及其应用。
背景技术
Vero-E6细胞即非洲绿猴肾细胞系，属于上皮细胞，来源于非洲绿猴肾细胞，是母细胞Vero 76的克隆株，贴壁依赖性生长，可连续传代培养，无致瘤性，该细胞株经过数次悬浮驯化得到悬浮适应株，可不依赖于载体悬浮生长。该细胞对猪流行性腹泻病毒、狂犬病病毒、猪伪狂犬病毒，犬瘟热病毒、犬腺病毒，犬副流感病毒病毒特别敏感，目前广泛用于这几种病毒病疫苗的生产。
因原始Vero-E6细胞贴壁依赖性生长，所以目前这几种病毒病疫苗的生产主要采用传统转瓶工艺，疫苗抗原制备的生产过程劳动强度大污染机率高，而且疫苗质量不稳定，批间差异大，这种传统工艺在今天规模化工业化生产需求中逐渐被自动化生产替代。生物反应器细胞悬浮培养已然成为目前疫苗工业自动化生产工艺的研究主力，因为细胞驯化难度大，研发周期长，很多数企业选择载体依赖性细胞悬浮培养，如专利公布号为CN103468648 A“一种利用激流式生物反应器制备猪流行性腹泻病毒的方法”与专利公布号为CN 101804203 A “一种大规模生产伪狂犬病毒疫苗的方法”，专利公布号为CN 102038946A “应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法”及专利公布号为CN 104587460 A“水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用”；这种微载体、纸片载体悬浮培养虽然较传统转瓶工艺自动化程度高，但细胞培养受载体因素限制不能实现最优化生长，与细胞全悬浮培养比较，载体依赖性培养增加了生产环节，增加生产成本，规模化放大程度有限，只是细胞悬浮培养的初级阶段。随着细胞驯化技术的突破，载体依赖性细胞悬浮培养很快会被自动化规模化程度更高的细胞全悬浮培养工艺取代。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种生产成本低、可以规模化放大培养的适应全悬浮培养的vero E6细胞株及其在生产疫苗病毒中的应用。
本发明的目的是以下述方式实现的：
一种适应全悬浮培养的vero E6细胞株，命名为Vero E6-S，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC 2017101，分类命名为非洲绿猴肾细胞悬浮适应株Vero E6-S，保藏日期为2017年6月29日。
如上述的适应全悬浮培养的vero E6细胞株在培养病毒中的应用。
所述病毒为猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒，犬瘟热病毒、犬腺病毒，犬副流感病毒。
一种适应全悬浮培养的vero E6细胞株培养病毒的方法，包括如下步骤：
（1）用悬浮培养瓶培养权利要求1所述Vero E6细胞株，以细胞浓度（6-10）×105个/ml接种至生物反应器中悬浮培养，得到Vero E6细胞悬浮培养液；
（2）当Vero E6细胞悬浮培养液中细胞密度达到（3-6）×106个/ml时，用病毒培养维持培养基替换细胞生长培养基，并按照病毒培养维持培养基终体积的1-10%接种病毒；
（3）在生物反应器中继续培养Vero E6悬浮细胞（36-96）h，收获病毒液。
所述的生物反应器为工业化搅拌式生物反应器。
相对于现有技术，本发明公开的适应全悬浮培养的vero E6细胞株培养疫苗病毒自动化程度高，不需要载体介入，可以在无血清或低血清培养基中悬浮培养，解决病毒培养大规模产业化的要求，开发能满足GMP生产技术要求的大规模化生产方法，拥有很好的工业化应用前景。
附图说明
图1是Vero-E6 S细胞悬浮生长曲线图。
图2是Vero-E6 S细胞悬浮生长图。
具体实施方式
以下是本发明具体的实施方案，以进一步阐述本发明，但不能解释为限制本发明的范围。本领域技术人应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实验涉及的主要生物材料和设备：
适应全悬浮培养Vero-E6细胞株，命名为Vero E6-S，分类为细胞，保藏在中国典型培养物保藏中心，分类命名为非洲绿猴肾细胞悬浮适应株Vero E6-S，保藏编号为CCTCCC2017101，保藏日期为2017年6月29日，保藏单位地址为：中国.武汉.武汉大学。
细胞生长培养基：默克公司无血清培养基，添加4%新生牛血清，细胞生长培养基即是细胞悬浮株摇瓶培养与生物反应器全悬浮培养所用的营养液；
病毒培养维持培养基：默克公司无血清培养基，添加1-2%新生牛血清，病毒培养维持培养基即是全悬浮培养的Vero-E6细胞培养病毒所用的营养液；
疫苗病毒：
猪流行性腹泻病毒：为市售商品猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒（G5型）三联活疫苗（弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株）分离；是猪流行性腹泻弱毒CV777株；
猪伪狂犬病毒：为市售商品哈药集团 伪美瑞--猪伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61）分离；
犬瘟热病毒、犬副流感病毒：为荷兰英特威国际有限公司生产的宠必威○R优免康犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、副流感四联活疫苗分离得到；
犬腺病毒：为市售商品吉林五星 犬狂犬、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒与犬细小病毒病五联活疫苗分离得到；
生物反应器：上海国强生化7升搅拌式生物反应器。
实施例1：适应全悬浮培养的Vero E6-S细胞株的培养
Vero E6-S保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2017101。
①取生长良好的Vero E6-S细胞株，加入盛有营养液的摇瓶中，于36-37℃培养72-96h，按照1:3-1:4的比例传代放大培养；
②将步骤①中放大培养的Vero E6-S细胞株稀释至（6-10）×105个/ml的密度，接种入生物反应器，培养温度为36-37℃，pH值为6.8-7.2，溶氧为40%-60%，Vero E6-S细胞悬浮生长曲线如图1所示，悬浮生长图片见图2；
③三批次生物反应器中细胞密度的测定：用生物反应器连续培养三个批次VeroE6-S细胞，培养条件同步骤②，在培养的第72小时采样，细胞离心后用胰酶消化，用台盼兰染色法检测细胞密度，实验结果如表1所示。
实施例2：利用Vero E6-S悬浮培养细胞培养猪流行性腹泻病毒的方法
取生长良好的悬浮Vero E6-S细胞，按6.5×105个/ml的密度，接种入生物反应器，细胞培养条件为：反应器工作体积5.0升，细胞培养温度为37℃，pH值为7.0，溶氧为50%，培养72小时，细胞密度为44.7×105个/ml时，更换为含1.0%新生牛血清的病毒培养维持培养液，按照10ug/ml的量添加胰蛋白酶，同时按照病毒培养维持培养基体积的10%接种猪流行性腹泻病毒，病毒培养条件为：温度36.5℃，pH值为6.9，溶氧为45%，培养48小时收获病毒液，病毒滴度按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》 标准进行判定，收获病毒含量为6.0 TCID50/ml。
实施例3 利用Vero E6-S悬浮培养细胞培养猪伪狂犬病毒的方法
取生长良好的悬浮Vero E6-S细胞，按7.4×105个/ml的密度，接种入生物反应器，细胞培养条件为：反应器工作体积5.0升，细胞培养温度为36.5℃，pH值为6.8，溶氧为50%，培养88小时，细胞密度为47.1×105个/ml时，更换为含2.0%新生牛血清的病毒培养维持培养液，同时按照病毒培养维持培养基体积的5%接种猪伪狂犬病毒，病毒培养条件为：温度36.5℃，pH值为7.0，溶氧为55%，培养36小时收获病毒液，病毒滴度按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》 标准进行判定，收获病毒含量为8.5 TCID50/ml。
实施例4 利用Vero E6-S悬浮培养细胞培养犬瘟热病毒的方法
Vero E6-S细胞悬浮培养方法同实施例2，培养72h时将细胞生长培养基更换为病毒培养维持培养基，病毒培养条件在具体实施例中按照接种病毒的不同适当调整，参照表2，所有病毒滴度的测定按照常规试验方法进行，实验结果见表2。
实施例5 利用Vero E6-S悬浮培养细胞培养犬副流感病毒的方法
Vero E6-S细胞悬浮培养方法同实施例2，培养72h时将细胞生长培养基更换为病毒培养维持培养基，病毒培养条件在具体实施例中按照接种病毒的不同适当调整，参照表2，所有病毒滴度的测定按照常规试验方法进行，实验结果见表2。
实施例6 利用Vero E6-S悬浮培养细胞培养犬腺病毒的方法
Vero E6-S细胞悬浮培养方法同实施例2，培养72h时将细胞生长培养基更换为病毒培养维持培养基，病毒培养条件在具体实施例中按照接种病毒的不同适当调整，参照表2，所有病毒滴度的测定按照常规试验方法进行，实验结果见表2。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种适应全悬浮培养的vero E6细胞株，其特征在于：命名为Vero E6-S，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC 2017101，分类命名为非洲绿猴肾细胞悬浮适应株Vero E6-S，保藏日期为2017年6月29日。
2.如权利要求1所述的适应全悬浮培养的vero E6细胞株在培养病毒中的应用。
3.根据权利要求2所述的适应全悬浮培养的vero E6细胞株在培养疫苗病毒中的应用，其特征在于：所述病毒为猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒，犬瘟热病毒、犬腺病毒，犬副流感病毒。
4.一种适应全悬浮培养的vero E6细胞株培养病毒的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）用悬浮培养瓶培养权利要求1所述Vero E6细胞株，以细胞浓度（6-10）×105个/ml接种至生物反应器中悬浮培养，得到Vero E6细胞悬浮培养液；
（2）当Vero E6细胞悬浮培养液中细胞密度达到（3-6）×106个/ml时，用病毒培养维持培养基替换细胞生长培养基，并按照病毒培养维持培养基终体积的1-10%接种病毒；
（3）在生物反应器中继续培养Vero E6悬浮细胞（36-96）h，收获病毒液。
5.根据权利要求4所述的适应全悬浮培养的vero E6细胞株培养病毒的方法，其特征在于：所述的生物反应器为工业化搅拌式生物反应器。
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