CN113980888A - 一种纯悬浮培养细胞及其应用和制备方法 - Google Patents
一种纯悬浮培养细胞及其应用和制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113980888A CN113980888A CN202111245848.7A CN202111245848A CN113980888A CN 113980888 A CN113980888 A CN 113980888A CN 202111245848 A CN202111245848 A CN 202111245848A CN 113980888 A CN113980888 A CN 113980888A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- suspension
- cell
- virus
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 48
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 230
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 82
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 62
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 51
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 23
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 23
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 22
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 21
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 17
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 14
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 claims description 13
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims description 12
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 12
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 10
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 9
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 10
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 14
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 9
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 description 7
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 7
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 7
- 241000712909 Reticuloendotheliosis virus Species 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 3
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000713842 Avian sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100191561 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP3 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000003570 air Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940103067 oxygen 60 % Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0656—Adult fibroblasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/99—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
- C12Y204/99007—Alpha-N-acetylneuraminyl-2,3-beta-galactosyl-1,3-N-acetylgalactosaminide 6-alpha-sialyltransferase (2.4.99.7)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Abstract
本发明实施例涉及一种纯悬浮培养细胞及其应用和制备方法，该细胞可以实现细胞的纯悬浮培养，使用该细胞进行纯悬浮培养，可以明显提升所获得的细胞密度和病毒滴度；降低病毒培养生产成本；提高疫苗生产效率和安全性。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品领域，尤其是涉及一种纯悬浮培养细胞、纯悬浮培养细胞在高密度培养和/或病毒培养中的应用及纯悬浮培养细胞的制备方法。
背景技术
DF-1细胞是一种可传代的鸡成纤维细胞系，来源于ELL鸡胚胎，该细胞无禽白血病病毒和肉瘤病毒的内源性基因，同时在形态上呈纤维状。DF-1细胞系是一种稳定的、无肿瘤基因、自发无限增殖的细胞系，其对多种禽源病毒比较易感，比如鸡传染性法氏囊病毒、鸡新城疫病毒、禽流感病毒等。
DF-1细胞呈贴壁型生长，进行DF-1细胞培养时和使用DF-1细胞进行病毒培养时均采用贴壁单层培养，目前多采用滚瓶和微载体等传统技术进行培养，然而贴壁单层培养很难能够得到足够多的细胞来表达相应病毒，进行规模生产时耗时耗力。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种纯悬浮培养的DF-1细胞及其应用和制备方法，该细胞可以实现细胞的纯悬浮培养，使用该细胞进行纯悬浮培养，可以明显提升所获得的细胞密度和病毒滴度，病毒滴度可达109.5TCID50/ml以上，降低病毒培养的生产成本，提高疫苗生产效率和安全性。
解决方案
一种纯悬浮培养细胞，命名为DF-1Sus细胞株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18892。
在一种可能的实现方式中，所述DF-1Sus细胞通过低血清培养基培养，所述低血清培养基中的血清浓度为2％。
再一方面，提供一种所述纯悬浮细胞在高密度培养和/或病毒培养中的应用。
进一步地，所述高密度悬浮培养为细胞密度达到8.0×106个/ml以上。
进一步地，所述高密度悬浮培养方法为：所述高密度悬浮培养的方法为：将DF-1Sus细胞株复苏，悬浮培养扩增，接种至生物反应器，通过低血清培养基培养，转速60～70r/min，温度37℃，溶氧设定为30～40％，pH值设定为7.2，培养过程中补加培养基并提高溶氧，使细胞密度达到8.0×106个/ml以上。
可选地，培养过程补加培养基并提高溶氧的策略为：培养45～50小时补加低血清培养基，转速设置为70～90r/min、温度37℃、溶氧设置为50～60％、pH7.10，继续培养至72～96小时收获。
可选地，培养过程补加培养基并提高溶氧的策略为：培养45～50小时补加低血清培养基，转速设置为70～90r/min、温度37℃、溶氧设置为50％、pH7.10，继续培养至72小时，转速设置为70～90r/min、温度37℃、溶氧设置为60％，继续培养至96小时收获。
进一步地，所述病毒培养方法为：将DF-1Sus悬浮细胞培养至2～8×106个/ml以上，将病毒按照0.01～1MOI的接种量接种，在生物反应器中继续培养48～96小时，收获病毒液。
进一步地，所述病毒培养过程采用高密度培养(可采用上述的高密度培养方法)，可选地，培养基采用低血清培养基。
进一步地，所述病毒培养中的病毒为鸡传染性法氏囊病毒、鸡新城疫病毒或鸡禽流感病毒；
可选地，鸡传染性法氏囊病毒为B87株鸡传染性法氏囊病毒；
可选地，鸡新城疫病毒为La Sota株鸡新城疫病毒；
可选地，鸡禽流感病毒为JD株鸡禽流感病毒。
还一方面，提供一种所述纯悬浮细胞或所述的制备方法制备的纯悬浮细胞在制备疫苗中的应用。
上述的培养基(混合的培养液、低血清培养基)中还可含有0.03％PF68，PF68为常规发酵、细胞培养常用消泡剂。
在一种可能的实现方式中，所述高密度悬浮培养的方法为：将液氮冻存的纯悬浮培养的DF-1Sus细胞株复苏，用玻璃摇瓶悬浮培养扩增，以细胞浓度4～6×105个/ml接种至生物反应器，反应器中加入含2％胎牛血清的低血清培养基2L，接通四种气体，四种气体设定为空气、氧气、氮气和CO2，转速60～70r/min，温度37℃，溶氧设定为30～40％，pH值设定为7.2，培养48小时补加低血清培养基至3L，转速设置为70～90r/min、温度37℃、溶氧设置为50～60％、pH7.10，继续培养至72～96小时收获，可选地，培养至72小时补加低血清培养基至4L。
另一方面，提供一种所述的纯悬浮培养细胞的制备方法，包括以下步骤：
将带有ST6GalNac V基因的重组质粒转染至贴壁型生长的DF-1细胞中，筛选DF-1阳性克隆细胞株，获得稳定表达ST6GalNac V基因的DF-1克隆细胞株；
对DF-1阳性克隆细胞株进行低血清悬浮驯化获得DF-1Sus悬浮细胞株。
进一步地，所述低血清悬浮驯化包括：传代培养过程中，通过逐步降低血清浓度的方法进行低血清悬浮驯化培养；
可选地，低血清悬浮驯化包括如下步骤：
S1、悬浮驯化：
(1)将DF-1阳性克隆细胞株用含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液，进行传代培养；
(2)再用DMEM/F12培养基和悬浮培养基按体积比混合的培养液进行传代培养多代，所述混合的培养液中含5％胎牛血清；可选地，体积比为1:1；
(3)然后用低血清培养基传代培养多代，获得DF-1悬浮细胞株，所述低血清培养基为含2％胎牛血清的悬浮培养基；
S2、低血清悬浮驯化：继续用低血清培养基传代培养，驯化10～20代，细胞呈圆形、透亮、分散生长，细胞密度达到要求后，获得DF-1Sus悬浮细胞株，所述低血清培养为含有2％胎牛血清的悬浮培养基；可选地，细胞密度在1×106/ml以上。
有益效果
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明中纯悬浮的DF-1细胞可以实现细胞的纯悬浮培养，该方法可以明显提升细胞密度和病毒滴度，病毒滴度可达109.5TCID50/ml，降低病毒培养生产成本，提高疫苗生产效率和安全性。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为驯化前DF-1细胞和DF-1Sus悬浮细胞的形态对比图；其中，A为DF-1贴壁细胞(40x)，B为DF-1Sus悬浮细胞(40x)；
图2为细胞株的RT-PCR鉴定；其中，M：DL2000Marker，1：DF-1克隆细胞株-1；2：DF-1克隆细胞株-2；3：DF-1克隆细胞株-3；4：DF-1克隆细胞株-4；5：DF-1克隆细胞株-5；6：DF-1母本细胞；7：阴性对照；
图3为驯化前DF-1细胞和DF-1Sus细胞核型分析对比图；其中，C为驯化前DF-1细胞，D为DF-1Sus细胞；
图4为培养方式1下DF-1Sus悬浮细胞生物反应器培养生长曲线。
图5为培养方式2下DF-1Sus悬浮细胞生物反应器培养生长曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，通过对DF-1细胞克隆株进行驯化，获得DF-1Sus悬浮细胞系，该细胞在生物反应器中进行高密度悬浮培养。
实施例1 DF-1Sus悬浮细胞制备及驯化
1材料
细胞株：DF-1是一种可传代的鸡成纤维细胞系，DF-1贴壁细胞由ATCC购买，编号为
CRL-12203TM，由北京生泰尔科技股份有限公司提供。
DMEM/F12培养基为商品化产品，购自GibCo，货号：12500-096；可根据需要加入1％～5％胎牛血清；
悬浮培养基，购自健顺生物，货号：10501-211；可根据需要在使用时补加2％胎牛血清，制成低血清培养基。
胎牛血清，Lanzhou Roya Bio-Technology Co，货号：RY-F22-05；
胰蛋白酶，Gibco，货号：27250-018，配制成0.1％胰蛋白酶溶液；
10％PLURONIC F-68，Gibco，货号：24040-032；
GlutaMAX-1(100×)，Gibco，货号：35050-061；
ST6GalNac重组质粒，购自Genecopoeia公司(货号：EX-V1581-M03)，该重组质粒骨架采用puc19质粒，插入的外源基因为ST6GalNac V。
大肠杆菌DH5α感受态细胞：批号AJ11854A；pMD18-T载体，货号D101A，均购自大连宝生物。
G418(遗传霉素)购自Invitrogen公司；转染试剂Lipofectamine 2000Regeant购自Roche公司。
one-step RT-PCR kit，购自北京全式金生物技术有限公司。
毒种鸡传染性法氏囊病毒(B87株)、鸡新城疫病毒(La Sota株)，均购自中国兽医药品监察所。鸡禽流感病毒(JD株)由北京生泰尔科技股份有限公司分离与鉴定，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6659。
RNA提取试剂盒等反应或提取试剂均为市售产品。
2仪器设备
生物反应器，sartorius stedim，型号：
B CC 5L，最大培养体积5L；
CO2培养箱，ESCO，型号：CCL-170B-8；
低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司，型号：SC-3616；
倒置显微镜，舜宇光学科技集团，型号：XD系列；
细胞培养瓶(Corning，T75货号：430720)；
悬浮培养瓶，Corning，规格：500ml，1000ml；
移液器，eppendorf，规格：20～200μl，100～1000μl；
数显恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂，HHS-21-24
50ml离心管，Corning，货号：430829；
洁净工作台，苏净安泰，型号：SW-CJ-2FD。
3方法
3.1 DF-1克隆细胞株获得
DF-1细胞复苏：从北京生泰尔科技股份有限公司细胞库中选取DF-1细胞种子(编号为
CRL-12203TM)1支进行复苏，细胞活力为94.6％，该细胞种子经无菌、支原体、外源病毒检验均合格，培养液为含5％胎牛血清的DMEM/F12，37℃、5％CO2培养48h形成了致密单层，细胞边缘清晰，呈梭形，按1:4比例分瓶传代，见图1A。
转染：接种约5.0×105个DF-1细胞于T25细胞瓶中，待细胞长至80％～90％时可用于转染，ST6GalNac重组质粒按照转染说明书转染进入DF-1细胞。
阳性克隆的筛选：转染后48h，将细胞用胰酶消化，均匀铺于24孔板中，用DMEM/F12继续培养，间隔72～96小时换一次液，持续培养，通过G418抗性筛选，可见，有G418抗性的细胞生长，无G418抗性的细胞死亡。
收集有抗性的细胞，采用有限稀释法，挑选生长状态较好的单克隆细胞，继续用有限稀释法筛选单个能稳定表达ST6GalNac V基因的细胞。有限稀释法广泛用于细胞克隆的筛选，通过将细胞稀释不同梯度，接种具有相应抗性的平板上，克隆成功的具有抗性的可以生长，未克隆的不具有抗性，不能生长，挑取生长出的单克隆，按照上述方法继续进行操作，直至挑取的单克隆为100％纯粹为止。
阳性克隆细胞的冻存：本研究共挑取阳性克隆株5株，命名为DF-1克隆细胞株-1、DF-1克隆细胞株-2、DF-1克隆细胞株-3、DF-1克隆细胞株-4、DF-1克隆细胞株-5。阳性克隆细胞用胰酶消化后扩大培养并采用常规方法冻存细胞。上述培养液中含有0.8mg/ml G418和5％胎牛血清。
DF-1克隆细胞株RT-PCR鉴定：DF-1克隆细胞株-1、DF-1克隆细胞株-2、DF-1克隆细胞株-3、DF-1克隆细胞株-4、DF-1克隆细胞株-5和DF-1母本细胞使用RNA提取试剂盒提取总RNA，以总RNA为模板，采用One-step RT-PCR法进行检测，引物序列(引物P1、P2为ST6GalNacV基因的上下游引物)如下，由上海生工生物有限公司合成，目的片段560bp。
P1(SEQ ID NO:1)：TTACTCGCCACAAGATGCTG；
P2(SEQ ID NO:2)：GCACCATGCCATAAACATTG。
反应体系2×one-step reaction mix 10ul；ES one-step mix 0.4ul；P1 0.5ul；P2 0.5ul；RNA3ul；Rnase free water 5.6ul，反应体系20ul；
反应条件42℃反转录60分钟；94℃预变性5分钟；94℃变性30秒；60℃退火45秒；72℃延伸45秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。扩增产物进行琼脂糖(10g/L)凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TAE，电泳条件为100V、20min，8μl点样电泳，利用凝胶成像系统检测分析，见图2，说明DF-1克隆细胞株-1、DF-1克隆细胞株-2、DF-1克隆细胞株-3、DF-1克隆细胞株-4、DF-1克隆细胞株-5均成功插入了ST6GalNac V基因。
结果判定阳性对照出现一条560bp的条带，阴性对照无任何条带，试验成立。如果样品中出现和阳性对照大小一致条带，判为阳性；如果样品中没有出现560bp的特异性条带，判为阴性。
3.2 DF-1克隆细胞株悬浮驯化
3.2.1将DF-1克隆细胞株用DMEM/F12培养液，37℃、5％CO2传代培养48～72小时，轻摇细胞瓶收集细胞转入摇瓶，37℃、70r/min、5％CO2培养48～72小时。上述培养液含5％胎牛血清和0.03％PF68。
3.2.2将3.2.1中收获的细胞用DMEM/F12和低血清培养基按体积比1：1比例混合的培养液调整至4～6×105/ml，37℃、70r/min、5％CO2培养48～72小时。上述混合的培养液含5％胎牛血清和0.03％PF68。
3.2.3将步骤3.2.2获得的细胞按照步骤3.2.2的相同培养方法培养三代。
3.2.4将3.2.3中收获的细胞用低血清培养基调整至4～6×105/ml，37℃、70r/min、5％CO2培养48～72小时。上述低血清培养基含2％胎牛血清和0.03％PF68。
然后将3.2.4获得的细胞再按照上述步骤3.2.4中相同的培养方法培养三代，细胞呈圆形、透亮、分散生长，细胞密度在1×106/ml以上，即得DF-1悬浮细胞株，见附图1B。
细胞培养液离心收集细胞，冻存悬浮细胞种子，冻存液配方60％DMEM/F12+30％胎牛血清+10％DMSO，细胞活力为90％以上，1.5ml/管，每管至少含1.0×107个细胞。
3.3 DF-1悬浮细胞低血清悬浮驯化
3.3.1用低血清培养基将3.2获得的细胞密度调整至4～6×105/ml，用摇瓶在70r/min、37℃、5％CO2培养48～72小时，低血清培养基中含有2％胎牛血清和0.03％PF68。
3.3.2上述步骤3.3.1中得到的细胞培养液吸入至摇瓶，加等体积低血清培养基，37℃、60～75r/min、5％CO2培养72～96小时；细胞密度达到1×106/ml以上时，按照细胞密度为4～6×105/ml传代。所述低血清培养基中含有2％胎牛血清和0.03％PF68。细胞种子密度为1.6×107/ml，细胞活力为95.1％，每支1.5ml。
按照步骤3.2、3.3方法分别驯化DF-1克隆细胞株-1株～5株10～20代，驯化结果见表1：
DF-1克隆细胞株-1、DF-1克隆细胞株-2、DF-1克隆细胞株-3、DF-1克隆细胞株-5细胞经传代成功驯化，细胞呈圆形、透亮、分散生长，细胞密度在1×106/ml以上，说明DF-1悬浮细胞已适应低血清培养，冻存该阶段细胞种子，DF-1克隆细胞株-2命名为DF-1Sus悬浮细胞株。如表1和图1所示，驯化成功的DF-1Sus悬浮细胞株的细胞形态呈圆形、透亮、分散生长。
DF-1克隆细胞株-4株驯化结果不理想，细胞驯化20代细胞呈聚集或成团生长，细胞生长缓慢，细胞数量较低。
表1 DF-1悬浮细胞低血清培养驯化
3.4细胞株保存DF-1Sus悬浮细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO:18892，保藏日期：2019.11.15，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。
3.5 DF-1Sus悬浮细胞株鉴定
3.5.1纯净性检验根据《中国兽药典》“生产用细胞标准”进行检定。
3.5.2无菌检验DF-1Sus悬浮细胞培养的上清液接种到TG和TBS培养基培养均为阴性；
3.5.3支原体检验DF-1Sus悬浮细胞冻融一次上清液接种到支原体液体培养基和支原体固体培养基中培养均为阴性；
表2 DF-1Sus悬浮细胞的无菌和支原体检验
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
改良Frey液体培养基是指根据《中国兽药典》附录进行配制的培养基。
3.5.4外源病毒检验DF-1Sus细胞经鸡胚检查法、细胞检查法、禽白血病病毒ELISA检验、禽网状内皮组织增生症病毒检验均为阴性。
鸡胚检查法、细胞检查法、禽白血病病毒ELISA检验、禽网状内皮组织增生症病毒检验的方法均为《中国兽药典》附录中规定的禽源外源病毒检测的常规方法。
3.5.4.1鸡胚检查法DF-1Sus悬浮细胞种子接种9～11日龄SPF鸡胚，尿囊腔(AS)接种组：10/10鸡胚存活，鸡胚胎儿发育正常，鸡胚尿囊液红细胞凝集HA试验为阴性。
绒毛尿囊膜(CAM)接种组：10/10鸡胚存活，鸡胚胎儿发育正常，绒毛尿囊膜无病变，鸡胚尿囊液红细胞凝集HA试验为阴性，见表3。
表3鸡胚检查法记录结果
3.5.4.2细胞检查法DF-1Sus悬浮细胞接种鸡胚成纤维细胞单层，观察7日，鸡胚成纤维细胞上均未出现细胞病变，未接种的正常鸡胚成纤维细胞，也未出现细胞病变；同时加入0.1％鸡红细胞悬液，显微镜下检查，接种的鸡胚成纤维细胞上未出现红细胞吸附现象，未接种的正常鸡胚成纤维细胞也未出现红细胞吸附现象，见表4。
表4细胞观察及红细胞吸附试验记录结果
3.5.4.3禽白血病病毒ELISA检验DF-1Sus悬浮细胞接种鸡胚成纤维细胞(CEF)单层，培养5～7日后，按常规方法消化、收获细胞，连续传3代，收集3代的细胞培养液，用禽白血病病毒ELISA试剂盒进行检测，阴性对照OD650nm值小于0.2，阳性对照OD650nm值大于0.4，试验结果成立；DF-1Sus悬浮细胞连续传代的OD650nm值均小于0.2，表明禽白血病病毒检测阴性，见表5。
表5禽白血病病毒ELISA检验记录结果
表1中的，RAV-1、RAV-2对照分别是指禽白血病1型和禽白血病2型的病毒对照。
3.5.4.4禽网状内皮组织增生症病毒检验取DF-1Sus悬浮细胞接种鸡胚成纤维细胞(CEF)单层，培养7日后，按常规方法消化、收获细胞，接种48孔细胞板，置5％CO2，37℃继续培养5天，然后进行荧光染色，显微镜下观察，阳性病毒对照接种的4个孔全部出现特异性绿色荧光，细胞对照孔均未出现特异性绿色荧光，接种DF-1Sus悬浮细胞的4个孔均未出现特异性绿色荧光，表明禽网状内皮组织增生症病毒(REV)检测为阴性，见表6。
表6禽网状内皮组织增生症病毒检验
实施例2 DF-1Sus悬浮细胞高密度培养
本实施例所用低血清培养基均为含有2％胎牛血清和0.03％PF68的悬浮培养基。
复苏一支DF-1Sus悬浮细胞，用50ml细胞生长培养液，置75r/min、37℃、5％CO2培养；培养72～96h细胞密度达1×106/ml，用低血清培养基稀释成100ml用悬浮培养瓶扩大培养，稀释后细胞密度为3～5×105/ml，培养条件：60r/min，37℃、5％CO2培养；培养48～72h加低血清培养基至1000ml分两个悬浮培养扩大培养，每瓶500ml，细胞密度为3～5×105/ml。培养条件：60r/min、37℃、5％CO2培养；培养48h细胞密度达2.0×106/ml以上，一部分转入生物反应器培养，剩余部分以3～5×105/ml密度连续传代培养。
培养方式1用低血清培养基将上述悬浮培养DF-1Sus细胞按以密度3～5×105/ml接种至生物反应器，体积为4L。反应器参数：转速60r/min、温度37℃、溶氧30～40％、pH7.1。每24小时取样计数，见表7，生长曲线见图4。
表7 DF-1Sus悬浮细胞生物反应器培养细胞计数及观察
培养方式2 DF-1Sus悬浮细胞按密度3～5×105/ml接种至生物反应器培养，起始培养体积2L。参数设定：转速60r/min、温度37℃、溶氧30％、pH7.2。每24h计数细胞密度和活力，48h细胞密度达1.5×106/ml，补加低血清培养基至3L，反应器参数：转速70r/min、温度37℃、pH7.10，提高空气和氧气通气量保持溶氧50％左右。培养至72h细胞密度达58×105/ml，补加低血清培养基至4L；反应器参数：转速70r/min、温度37℃、溶氧60％、pH7.10，培养至96h密度达83×105/ml，见表8，生长曲线见图4。
表8 DF-1Sus悬浮细胞生物反应器高密度培养细胞计数及观察
综上，常规培养时接种密度4×105/ml，培养96h细胞密度2.8×106/ml，约生长7倍，细胞活力为90％。而流加培养接种密度4×105/ml，起始培养体积2L，培养96h细胞密度8.3×106/ml，约生长21倍，细胞活力为95％。由此可见，流加培养可以提高细胞生长效率，更适合DF-1Sus悬浮细胞生物反应器的高密度培养，按照此培养工艺连续培养3批，见表9。
表9 DF-1Sus悬浮细胞生物反应器高密度培养结果
为了体现尽量减少培养条件造成的误差，以下实施例的病毒培养方法中在细胞接种病毒后的培养方法尽量参照实施例2的培养方式2培养，由于微载体培养方式与悬浮细胞的培养方式较容易达到相近的条件，对于贴壁-1细胞的培养是尽量一致的基础上(例如培养体积、接种密度、pH、接毒比例等)，但像溶氧控制因悬浮培养和贴壁培养的差异是难以控制一致的，但也尽量满足贴壁培养的溶氧需求，以比较悬浮培养、贴壁培养对病毒培养的影响。
实施例3鸡传染性法氏囊病毒培养
鸡传染性法氏囊病毒分别接种驯化细胞株(DF-1Sus悬浮细胞)、驯化失败的克隆细胞株(DF-1克隆细胞株-4)和母细胞(DF-1细胞株)，按照0.01～1MOI的接种量接种(接种时的细胞密度见表10)DF-1Sus悬浮细胞、DF-1克隆细胞株-4、DF-1细胞株，DF-1Sus悬浮培养病毒含量可达到109.8TCID50/ml，见表10。
表10不同细胞对鸡传染性法氏囊病毒增殖能力的对比
实施例4鸡新城疫病毒培养
鸡新城疫病毒分别接种驯化细胞株(DF-1Sus悬浮细胞)、驯化失败的克隆细胞株(DF-1克隆细胞株-4)和母细胞(DF-1细胞株)，按照0.01～1MOI的接种量接种(接种时的细胞密度见表11)DF-1Sus悬浮细胞、DF-1克隆细胞株-4、DF-1细胞株，培养72小时细胞80％以上病变收获，DF-1Sus悬浮细胞病毒含量可达到109.5TCID50/ml，见表11。
表11不同细胞对鸡新城疫病毒增殖能力的对比
实施例5禽流感病毒培养
禽流感病毒分别接种驯化细胞株(DF-1Sus悬浮细胞)、驯化失败的克隆细胞株(DF-1克隆细胞株-4)和母细胞(DF-1细胞株)，按照0.01～1MOI的接种量接种(接种时的细胞密度见表12)DF-1Sus悬浮细胞、DF-1克隆细胞株-4、DF-1细胞株，培养72小时细胞80％以上病变收获，DF-1Sus悬浮细胞的病毒含量可达到109.5TCID50/ml，结果见表12。
表12不同细胞对禽流感病毒增殖能力的对比
从表12可知，在同样经过ST6GalNac V基因改造的DF-1Sus悬浮细胞和DF-1克隆细胞株-4所获得病毒滴度差异较大，说明并不是经过ST6GalNac V基因改造后就能获得悬浮效果好的悬浮细胞，培养的病毒滴度差异也比较大，说明本发明的DF-1Sus悬浮细胞不仅悬浮效果好，而且病毒培养的滴度也高，培养病毒的产量高。
实施例6
采用不同代次的纯悬浮DF-1Sus细胞株对鸡传染性法氏囊病病毒进行培养，结果表明DF-1Sus细胞株生物特性稳定，不同代次的细胞均可适应病毒生长。具体结果见表13。
表13不同代次DF-1Sus悬浮细胞对鸡传染性法氏囊病病毒增殖能力的对比
实施例7
在培养条件尽量一致的情况下，分别进行贴壁培养、微载体培养和纯悬浮培养，对比培养数据如表14。
表14纯悬浮培养、微载体培养和贴壁培养的对比
如表14所示，本实施例的悬浮细胞DF-1Sus细胞株不仅能进行悬浮培养，对鸡传染性法氏囊病毒培养的病毒滴度达109.5TCID50/ml，与微载体培养体系的相近；而对新城疫病毒、禽流感病毒培养的病毒滴度分别为109.33TCID50/ml、109.34TCID50/ml，远远高于微载体培养体系的病毒滴度，均远远大于贴壁培养的病毒滴度。由于本实施例7中的微载体培养采用目前较成熟的微载体培养体系，通过借助颗粒载体，使细胞生长在颗粒载体上进而悬浮在培养基中，但此法规模放大难度较大，操作相对复杂，培养成本较高。说明本发明的DF-1Sus细胞株不仅方便放大培养，而且操作方便，能方便培养病毒，降低成本。
本发明通过对贴壁型DF-1细胞改造后，不仅可以进行低血清高密度悬浮培养，降低血清使用的同时，提高疫苗产品的安全性，这是由于血清属于外源蛋白，而疫苗中含有的外源蛋白越高，产品的安全性就越差，甚至引起注射动物的过敏率比较高。然而细胞正常生长需要由血清中吸取大量的必要物质，一般来说满足细胞正常生长的血清添加比例为10％，要实现细胞培养中血清由10％，降至5％，最终降至2％，难度非常大，需要对细胞改造并反复驯化培养，才能获得适应低血清培养的细胞株。本发明通过基因改造和低血清悬浮驯化的方式筛选得到了一株能适应低血清悬浮培养的细胞株，不仅能实现高密度培养，而且能大大提高病毒滴度，可达109.5TCID50/ml，降低病毒培养成本，提高疫苗的生产效率和疫苗生产的安全性。
本发明的有益效果为：本发明获得的DF-1悬浮细胞可在反应器中进行低血清高密度悬浮培养，降低血清使用，降低生产成本，细胞密度可达8.0×106个/ml以上，活力90％以上，在5L的反应器(实际最高培养体积4L)至少可得到3.0×1010个细胞，相当于600个3L滚瓶收获的细胞数量；病毒培养至少比贴壁培养提高1～2个滴度。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京华夏兴洋生物科技有限公司
北京生泰尔科技股份有限公司
华夏兴洋（江苏）生物科技有限公司
<120> 一种纯悬浮培养细胞及其应用和制备方法
<130> 1103-200415F
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物P1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 1
ttactcgcca caagatgctg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物P2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 2
gcaccatgcc ataaacattg 20
Claims (10)
1.一种纯悬浮培养细胞，命名为DF-1Sus细胞株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18892。
2.根据权利要求1所述的纯悬浮培养的细胞，其特征在于：所述DF-1Sus细胞通过低血清培养基培养，所述低血清培养基中的血清浓度为2％。
3.一种权利要求1或2所述纯悬浮细胞在高密度培养和/或病毒培养中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述高密度悬浮培养方法为：所述高密度悬浮培养为细胞密度达到8.0×106个/ml以上；
可选地，所述高密度悬浮培养的方法为：将DF-1Sus细胞株复苏，悬浮培养扩增，接种至生物反应器，通过低血清培养基培养，转速60～70r/min，温度37℃，溶氧设定为30～40％，pH值设定为7.2，培养过程中补加培养基并提高溶氧，使细胞密度达到8.0×106个/ml以上；
可选地，培养过程补加培养基并提高溶氧的策略为：培养45～50小时补加低血清培养基，转速设置为70～90r/min、温度37℃、溶氧设置为50～60％、pH7.10，继续培养至72～96小时收获；
可选地，培养过程补加培养基并提高溶氧的策略为：培养45～50小时补加低血清培养基，转速设置为70～90r/min、温度37℃、溶氧设置为50％、pH7.10，继续培养至72小时，转速设置为70～90r/min、温度37℃、溶氧设置为60％，继续培养至96小时收获。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述病毒培养方法为：将DF-1Sus悬浮细胞培养至2～8×106个/ml以上，将病毒按照0.01～1MOI的接种量接种，在生物反应器中继续培养48～96小时，收获病毒液。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述病毒培养过程采用高密度培养，可选地，培养基采用低血清培养基。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述病毒培养中的病毒为鸡传染性法氏囊病毒、鸡新城疫病毒或鸡禽流感病毒；
可选地，鸡传染性法氏囊病毒为B87株鸡传染性法氏囊病毒；
可选地，鸡新城疫病毒为La Sota株鸡新城疫病毒；
可选地，鸡禽流感病毒为JD株鸡禽流感病毒。
8.一种权利要求1或2所述纯悬浮细胞在制备疫苗中的应用。
9.一种权利要求1或2所述的纯悬浮培养细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
将带有ST6GalNac V基因的重组质粒转染至贴壁型生长的DF-1细胞中，筛选DF-1阳性克隆细胞株，获得稳定表达ST6GalNac V基因的DF-1克隆细胞株；
对DF-1阳性克隆细胞株进行低血清悬浮驯化获得DF-1Sus悬浮细胞株。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述低血清悬浮驯化包括：传代培养过程中，通过逐步降低血清浓度的方法进行低血清悬浮驯化培养；
可选地，低血清悬浮驯化包括如下步骤：
S1、悬浮驯化：
(1)将DF-1阳性克隆细胞株用含5％胎牛血清的DMEM/F12培养液，进行传代培养；
(2)再用DMEM/F12培养基和悬浮培养基按体积比混合的培养液进行传代培养多代，所述混合的培养液中含5％胎牛血清；可选地，体积比为1:1；
(3)然后用低血清培养基传代培养多代，获得DF-1悬浮细胞株，所述低血清培养基为含2％胎牛血清的悬浮培养基；
S2、低血清悬浮驯化：继续用低血清培养基传代培养，驯化10～20代，细胞呈圆形、透亮、分散生长，细胞密度达到要求后，获得DF-1Sus悬浮细胞株，所述低血清培养为含有2％胎牛血清的悬浮培养基；可选地，细胞密度在1×106/ml以上。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111245848.7A CN113980888B (zh) | 2021-10-26 | 2021-10-26 | 一种纯悬浮培养细胞及其应用和制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111245848.7A CN113980888B (zh) | 2021-10-26 | 2021-10-26 | 一种纯悬浮培养细胞及其应用和制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113980888A true CN113980888A (zh) | 2022-01-28 |
| CN113980888B CN113980888B (zh) | 2024-05-07 |
Family
ID=79741385
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111245848.7A Active CN113980888B (zh) | 2021-10-26 | 2021-10-26 | 一种纯悬浮培养细胞及其应用和制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113980888B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116355857A (zh) * | 2023-05-10 | 2023-06-30 | 北京华夏兴洋生物科技有限公司 | 悬浮培养的牛肾细胞及其制备方法与应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102453700A (zh) * | 2010-10-18 | 2012-05-16 | 北京清大天一科技有限公司 | 悬浮培养mdck细胞及利用其生产病毒疫苗的方法 |
| CN104258385A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-01-07 | 中国兽医药品监察所 | Bhk-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用 |
| CN107201334A (zh) * | 2016-03-16 | 2017-09-26 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 能悬浮培养的牛肾细胞及其悬浮培养方法与应用 |
| CN108486061A (zh) * | 2018-03-16 | 2018-09-04 | 李军涛 | 一种贴壁细胞的悬浮培养化方法及其应用 |
| CN109913404A (zh) * | 2018-12-04 | 2019-06-21 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | 鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法 |
| CN110093307A (zh) * | 2019-04-11 | 2019-08-06 | 北京鼎持生物技术有限公司 | 适应无血清悬浮培养的bhk-21-sc细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法 |
| CN111671893A (zh) * | 2020-07-31 | 2020-09-18 | 中国农业大学 | 牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗及其制备方法与所用悬浮mdbk细胞 |
-
2021
- 2021-10-26 CN CN202111245848.7A patent/CN113980888B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102453700A (zh) * | 2010-10-18 | 2012-05-16 | 北京清大天一科技有限公司 | 悬浮培养mdck细胞及利用其生产病毒疫苗的方法 |
| CN104258385A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-01-07 | 中国兽医药品监察所 | Bhk-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用 |
| CN107201334A (zh) * | 2016-03-16 | 2017-09-26 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 能悬浮培养的牛肾细胞及其悬浮培养方法与应用 |
| CN108486061A (zh) * | 2018-03-16 | 2018-09-04 | 李军涛 | 一种贴壁细胞的悬浮培养化方法及其应用 |
| CN109913404A (zh) * | 2018-12-04 | 2019-06-21 | 哈药集团生物疫苗有限公司 | 鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法 |
| CN110093307A (zh) * | 2019-04-11 | 2019-08-06 | 北京鼎持生物技术有限公司 | 适应无血清悬浮培养的bhk-21-sc细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法 |
| CN111671893A (zh) * | 2020-07-31 | 2020-09-18 | 中国农业大学 | 牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗及其制备方法与所用悬浮mdbk细胞 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116355857A (zh) * | 2023-05-10 | 2023-06-30 | 北京华夏兴洋生物科技有限公司 | 悬浮培养的牛肾细胞及其制备方法与应用 |
| CN116355857B (zh) * | 2023-05-10 | 2023-09-12 | 北京华夏兴洋生物科技有限公司 | 悬浮培养的牛肾细胞及其制备方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113980888B (zh) | 2024-05-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105950544B (zh) | 全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法 | |
| CN110272864B (zh) | 一种适应无血清悬浮培养的Vero33细胞株及其驯化方法和应用 | |
| CN107460156B (zh) | 无血清全悬浮mdck细胞株及其在生产流感病毒中的应用 | |
| CN114317405B (zh) | 无血清全悬浮培养型f81细胞系及其构建方法与应用 | |
| CN109971710B (zh) | 建鲤脑细胞系及其建立方法与应用 | |
| CN114107170B (zh) | 猫肾悬浮细胞系及其构建方法与应用 | |
| CN116355857B (zh) | 悬浮培养的牛肾细胞及其制备方法与应用 | |
| CN113980888B (zh) | 一种纯悬浮培养细胞及其应用和制备方法 | |
| CN104894054B (zh) | 一种猴胚胎肾上皮细胞Marc‑145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫苗中的应用 | |
| CN113980912A (zh) | 可复制ibv病毒qx亚型毒株的基因敲除细胞系及其构建方法和应用 | |
| CN102453699A (zh) | 悬浮培养敏感细胞及利用其生产蓝耳病疫苗的方法 | |
| CN116769697A (zh) | 一种适合无血清全悬浮培养的siec-s细胞、驯化方法及应用 | |
| WO2007040242A1 (ja) | 単離されたヒト細胞、その取得方法及び用途 | |
| CN107488633B (zh) | 高效增殖杆状病毒的昆虫细胞株及其构建方法和应用 | |
| CN109280648B (zh) | 一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用 | |
| CN117070476B (zh) | 一株牛疱疹病毒4型毒株及其在灭活疫苗制备中的应用 | |
| CN106676071B (zh) | HeLa-F细胞及其用途 | |
| CN115948334B (zh) | 一株鳜鱼脑细胞克隆细胞株及其应用 | |
| CN106282098B (zh) | 一种利用较低血清含量营养物培养df1细胞以制备鸡传染性法氏囊病毒的方法 | |
| CN115786275A (zh) | 一种b型禽偏肺病毒毒株 | |
| CN117384856B (zh) | 一种永生化copd人支气管上皮细胞株及其构建方法和应用 | |
| CN112048478B (zh) | 一株幼地仓鼠肾细胞低免疫力细胞株及其构建方法和应用 | |
| CN111849875A (zh) | 鸭瘟病毒易感型mhc单倍体无特定病原体鸭源胚肝间充质干细胞系及其应用 | |
| CN117844743A (zh) | 一种无血清全悬浮培养的df1细胞及其构建方法、应用 | |
| CA3216360A1 (en) | Rhabdovirus negative spodoptera frugiperda insect cell line, and screening, identification and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |