CN115786275A - 一种b型禽偏肺病毒毒株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种B型禽偏肺病毒毒株及其分离方法，其保藏编号为CCTCCNO:V202188，其全基因组序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种培养B型禽偏肺病毒毒株的细胞系及其制备方法，采用该细胞系培养的B型禽偏肺病毒克服了传统表达方法分离成功率低，毒株滴度低等技术缺陷。

Description

一种B型禽偏肺病毒毒株

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体是涉及一种B型禽偏肺病毒毒株。

背景技术

禽偏肺病毒(aMPV)是造成鸡的肿头综合症(Swollen head syndrome,SHS)和产蛋量下降的重要诱因，国内血清流行病学调查及分子生物学调查显示：我国许多省份的种鸡场普遍存在禽偏肺病毒的感染情况，有的种鸡场血清阳性率可高达100％，而且该病毒还能促使禽类继发性感染多种疾病并造成严重的经济损失。

禽偏肺病毒根据编码G蛋白基因的不同可分为A、B、C、D四个亚型。目前国内已报道有A、B、C三种亚型的禽偏肺病毒，其中以B亚型为主要流行的亚型。禽偏肺病毒需要在感染的早期阶段分离，当出现明显的临床症状时，就难以从鸡的体内分离到aMPV，当出现严重的临床症状时，有可能是其他病毒或者细菌继发感染而引起的，这时再从患病鸡的气管、肺脏和其他内脏中分离病毒就更加困难，因此禽偏肺病毒的分离给研究者带来了严峻的挑战，为了提高aMPV的分离成功率，很多研究者对其分离培养方法进行了相关研究，常用的分离培养方式包括气管环培养(TOC)、鸡胚培养和细胞培养。气管环培养(TOC)法是利用即将出壳的SPF鸡胚、火鸡胚和1-2日龄的SPF鸡制备气管环用于aMPV的分离，该方法是以纤毛的运动情况作为判断指标，所以接种以后需要每天观察纤毛运动的情况，一般利用该方法分离aMPV时，需要连续培养几代后才能观察到稳定的纤毛停滞现象，该方法不适用于所有亚型的aMPV。鸡胚培养法是选用6-8日龄的SPF鸡胚或火鸡胚进行aMPV的分离，接种后，每天观察鸡胚，到第8d时，将尿囊液和卵黄囊液收集，然后连续接种鸡胚传代。研究发现经2-3次接种传代培养后，胚胎将会出现发育受阻、胚体表面有出血现象、甚至死亡等现象。细胞培养中可用来分毒的原代细胞包括火鸡胚成纤维细胞(Turkey embryo fibroblast,TEF)、鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)和鸡胚肝细胞(Chicken embryo liver,CEL)等；用于传代细胞包括罗猴细胞(MA-104)、鸡成纤维细胞(DF-1)、黑长尾猴肾细胞(BGM-70)、鼠源的麦科伊细胞、鹌鹑成纤维细胞(QT-35细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero)等。上述分离培养方法都存在耗时长，步骤繁琐，成功率低的缺陷。而且在实际工作中，该病毒常因疾病发现及采样不及时，病毒运输、保存方式、接种方式不当等多种因素也会导致分离失败。因此，为加强禽偏肺病毒(aMPV)的防控，研究者们急需一种稳定分离出高滴度的，稳定传代的B型禽偏肺病毒毒株，为病毒疫苗的制备奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种B型禽偏肺病毒毒株。

本发明的目的还在提供了一种B型禽偏肺病毒毒株的全基因序列。

本发明的目的还在于提供了一种培养B型禽偏肺病毒毒株的细胞系。

本发明的目的还在于提供了一种培养B型禽偏肺病毒毒株的细胞系的制备方法。

本发明的目的还在于提供了一种分离B型禽偏肺病毒毒株的方法。

为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种B型禽偏肺病毒毒株，保藏编号为CCTCC NO:V202188。

所述B型禽偏肺病毒的全基因组序列如SEQ ID NO.1所示。

一种培养如权利要求1所述一种B型禽偏肺病毒毒株的细胞系。

所述细胞系为敏感Vero细胞系，其制备方法为：

1)合成含有αv和β1基因的重组质粒

2)制备重组慢病毒液；

3)用2)中产物感染Vero细胞；

4)筛选出阳性的Vero-αvβ1细胞株。

所述B型禽偏肺病毒毒株的分离方法包括：

1)将样品充分剪碎，经研磨，反复冻融处理，然后提取上清液，于80℃保存备用；

2)上清液先经卵黄囊接种传代，然后经RT-PCR鉴定为阳性后，用敏感Vero细胞进行细胞接种，传代培养；

3)获得B型禽偏肺病毒并检测病毒含量。

所述B型禽偏肺病毒的病毒含量不低于10^7.12TCID₅₀/0.1ml。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明提供的B型禽偏肺病毒毒株，滴度高，稳定传代。

本发明克服了传统表达方法分离成功率低，毒株滴度低等技术缺陷。

本发明通过对B型禽偏肺病毒全基因序列测定，确定了病毒的亚型，丰富了国内禽偏肺病毒的研究，也为后期疫苗制备的相关研究奠定了基础。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为各片段PCR扩增结果图；其中M为marker，1-3为第一段，4-6为第二段，7-9为第三段，10-12为第四段，13-15为第五段，16-18为第六段，19-21为第七段，1,4,7,10,13,16,19为阴性对照，2,5,8,11,14,17,20为阳性对照；3,6,9,12,15,18,21为目的片段

图2.为分离株RPVA0201株与Genbank中已公布的禽偏肺病毒的同源性比对结果图；

具体实施方式

以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

以下实施例中使用的试剂、质粒、培养基、宿主菌等生物原料均来自商业化产品。

实施例1敏感Vero细胞系的制备

1材料与方法

1.1材料

1.1.1pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro、pRSV-Rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G4种DNA质粒均购自SBI公司。

1.1.2 293T细胞、Vero细胞均由天津瑞普生物技术股份有限公司提供。

1.1.3胰蛋白酶，购自sigma公司。

1.1.4新生牛血清，购自GIBCO公司。

1.1.5MEM培养基、DMEM培养基均购自Hyclone公司。

1.2方法

1.2.1αv和β1基因获取与合成

根据NCBI数据库公布的鸡整合素αv和β1全长蛋白质序列(Genebank编号NP_990770.2和NP_001034343.2)，按照哺乳动物密码子偏好性，将鸡整合素αv和β1基因进行优化，优化后的鸡整合素αv和β1基因序列(如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示)插入到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro载体的多克隆位点XbaI/NotI之间，然后将两个基因通过IRES序列连接，IRES序列如SEQ ID NO.4所示。αv-IRES-β1直接由基因合成公司合成，并亚克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro载体中。

1.2.2重组慢病毒的包装和浓缩

1.2.2.1细胞准备

转染前1天将生长状态良好的293T细胞用胰酶消化重悬接种于10cm细胞培养皿中，37℃5％CO₂培养过夜。

1.2.2.2质粒准备

制备慢病毒包装系统中4种质粒DNA溶液：将4种DNA质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro、pRSV-Rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G4种DNA质粒混合，并加入无菌水定容至1800μl，再加入CaCl₂(2.5mol/L)溶液200μl混匀，加入2×HBS缓冲盐溶液2000μl，室温放置20～25min。

1.2.2.3质粒转染

当细胞密度达60％～70％时转染。将上述混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养6～8h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS 15ml，轻摇后弃去，重复该步骤3次。

1.2.2.4更换培养基

每瓶细胞中加入10％血清的细胞培养液6ml，继续培养48h。

1.2.2.5收集病毒上清

收集转染后84h的293T细胞上清液。

1.2.2.6病毒上清液离心、过滤、浓缩

将收集的上清液于4℃，3000g离心10min，收集离心后的上清液；将上清液以0.45μm滤器过滤后，于40ml超速离心管中，4℃，25000rpm/min离心2h；之后用500μl DMEM重悬，制备成的慢病毒原液于4℃溶解过夜。

1.2.3病毒滴度测定

293T细胞在10cm培养皿中培养至80％～90％融合时，弃去培养液，用3mlPBS洗涤细胞2次，加1ml胰酶，混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置1～2min，再加入2ml含10％血清的DMEM培养液，吹打细胞成单细胞悬液；按3×104/孔的浓度接种96孔板，混匀后于37℃

5％CO₂培养24h；取慢病毒原液10μl，用10％血清的DMEM培养基10倍稀释3～5个梯度；吸去96孔板中的培养液，每孔加入100μl稀释的病毒液，同时设立空白对照组，于37℃5％CO2培养24h；吸弃96孔板中的稀释病毒液，每孔加入100μl10％血清的DMEM培液，于37℃5％CO2继续培养72h；通过荧光显微镜计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。

1.2.4嘌呤霉素对Vero细胞的最低致死浓度确定

将嘌呤霉素按终浓度为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml。分别接种细胞融合率为80％的Vero单层细胞。每个浓度3个重复，继续培养7天，选择能使Vero细胞全部死亡的最低浓度为最小致死量。

1.2.5慢病毒感染Vero细胞MOI值的确定

用24孔细胞培养板，进行Vero细胞感染预实验，实验前按照MOI分别为1、5、10、20、40、80、100设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量。

1.2.5.1细胞准备

在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3～5×10⁴个目的细胞，待细胞的融合度约为70％左右时进行病毒感染。

1.2.5.2病毒准备

将病毒滴度为4×10⁸TU/ml的慢病毒对照组按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，在培养基中加入聚凝胺(Polybrene)(8μg/ml左右)来提高以期获得最佳的感染效率。

1.2.5.3感染目的细胞

用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基；吸去培养基的培养器皿中的培养基；在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液；混匀后放于培养箱(37℃、5％CO₂)孵育过夜；于第四天补充一定量的培养液，保持细胞生长状态良好；于第六天，在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染效率。

1.2.6阳性细胞株(Vero-αvβ1)的筛选

1.2.6.1按照感染预实验所确定的MOI值，用含2％血清的MEM培养液稀释慢病毒原液后分别接种于生长50％单层的Vero细胞。同时，每孔加入终浓度为6μg/ml的Polybrene，于37℃5％CO2培养箱培养。

1.2.6.2培养48h后，弃掉旧培养液，更换10％血清的MEM培养液，同时加终浓度为6μg/ml的嘌呤霉素进行筛选。

1.2.6.3待细胞长满后，按1:3进行传代，继续用终浓度为5μg/ml的嘌呤霉素筛选并继续传代，至视野下80％为抗性细胞为止。

1.2.6.4采用有限稀释法，筛选阳性细胞株。

2结果

2.1αv和β1基因获取与合成结果通过αv和β1基因获取与合成最终构建的质粒命名为pCDH-CMV-αv-IRES-β1-EF1-GFP-T2A-Puro。

2.2重组慢病毒的包装和浓缩结果通过包装和浓缩获得重组慢病毒。

2.3病毒滴度测定结果重组慢病毒病毒滴度为4×10⁸TU/ml。

2.4嘌呤霉素对Vero细胞的最低致死浓度确定结果5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml嘌呤霉素均能使Vero细胞全部死亡，5μg/ml为最小致死量。

2.5慢病毒感染Vero细胞MOI值的确定结果当按20MOI病毒量感染细胞时病毒滴度最高为9×10⁸TU/ml。

2.6阳性细胞株(Vero-αvβ1)的筛选结果继续用终浓度为5μg/ml的嘌呤霉素筛选，直至视野下100％为抗性细胞为止，扩大培养保存。

实施例2禽偏肺病毒的分离

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料组织16份，RT-PCR检测为阳性，来源于不同鸡场疑似禽偏肺感染鸡群，以上鸡群出现甩头、流鼻涕、肿头综合征等临床症状。

1.1.2PBS，0.01mol/L，pH7.2～7.4，由天津瑞普生物技术股份有限公司家禽中心提供。

1.1.3SPF鸡胚，购自济南赛斯家禽科技有限公司。

1.1.4新生牛血清，购自美国GIBCO公司。

1.1.5MEM培养基，购自Hyclone公司。

1.1.6敏感Vero细胞、普通Vero细胞，由天津瑞普生物技术股份有限公司提供。

1.1.7试剂Viral RNA Mini Kit购自QIAGEN公司；一步法RT-PCR试剂盒购自全式金生物技术有限公司；PCR纯化试剂盒购自Axygen公司；pMD18-T载体购自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1样品处理

将收集的禽偏肺阳性病料(气管、肺脏组织混合物)放入灭菌烧杯中，用灭菌剪刀充分剪碎，加入适量PBS溶液(含2000单位双抗)混匀，转移至研磨管中震荡研磨。将研磨好的组织液，冻融2次后，离心，无菌取上清，置-80℃保存备用。

1.2.2卵黄囊接种

取6～8日龄SPF鸡胚5枚，卵黄囊接种上述组织病毒液，0.2ml/胚，用石蜡封孔，置37℃孵化器继续培养。弃去24小时内死亡鸡胚，培养120小时收获。冻融2次后继续传代，连续传代5代。取样进行RT-PCR检测。

1.2.3样品检测：具体步骤如下：

1.2.3.1引物序列

aMPV-F:5’-GAACATTTTCATGCAAGCTTATGG-3’,

aMPV-R:5’-TCCTAGCACCACACTTGCAAA-3’,

引物合成后，用DEPC水溶解稀释成10pmol/μl的工作浓度，-20℃保存备用。

1.2.3.2病毒总RNA提取

从-80℃冰箱取出病毒液，使用QIAGEN Viral RNA Mini Kit按照说明书进行RNA提取：取560μl AVL溶液于1.5ml EP管中，加入5.6μl carrier RNA，加入140μl病毒液，混匀后室温静置10min；加入560μl无水乙醇混匀；取600μl上述混合液加入离心柱中，8000g离心1min，弃去溶液；加入500μl AW1溶液，8000g离心1min，弃去溶液；加入700μl AW2溶液，14000g离心3min，弃去溶液；20000g空离2min；加入40μl DEPC水，室温静置1min，8000g离心1min，所得溶液即为提取的总RNA。

1.2.3.3RT-PCR

反应体系如下：

反应条件：45℃30min，94℃5min，32*(94℃30s，51℃30s，72℃20s)，72℃10min，最后4℃冷却，扩增结束。

1.2.3.4PCR产物鉴定

取扩增结束的5μl PCR产物，用1％琼脂糖凝胶、100V 45min电泳检查扩增结果，预期扩增产物大小为247bp。在阴阳性对照成立的条件下，若样品泳道在247bp处出现条带，则判为阳性，反之判为阴性。

1.2.4细胞接种

分别取液氮中冻存的敏感Vero细胞及普通Vero细胞于37℃水浴溶解，在细胞瓶中补加适量含10％新生牛血清的MEM培养基(完全培养基)，置37℃5％CO₂培养。6小时后待细胞贴壁后弃去原培养基，加入适量完全培养基置培养箱中继续培养。待细胞长满后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞成单个细胞，按1:3比例进行传代。待Vero细胞长成单层后，接种上述经RT-PCR检测为阳性的鸡胚尿囊液(经0.22μm滤器过滤)，置培养箱中孵育1.5小时，弃去培养液，补加适量含2％新生牛血清的MEM病毒维持液，置培养箱培养120小时，收获病毒液，即为第一代病毒(F1)。将F1代病毒液按前述方法连续接种Vero细胞5代，观察细胞出现CPE时间及测定病毒滴度。

1.2.5病毒毒价测定

取敏感细胞毒第3代和普通细胞毒第5代病毒液分别用含2％新生牛血清的MEM培养液作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8 6个稀释度，每个稀释度接种96孔细胞培养板上已长成良好单层的细胞6孔，0.1ml/孔；同时设不接毒的正常细胞对照组。置37℃、5％CO₂条件下培养5日，观察并记录出现细胞CPE的孔数，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。

1.2.6免疫原性试验

用传代后的病毒液制备成灭活疫苗，颈部皮下接种28日龄SPF鸡，0.5ml/只，另设攻毒对照。接种后21日后进行攻毒，病毒液0.2ml(含10^4.0EID₅₀)，连续观察14日。记录各组鸡发病及保护情况。

2结果

2.1卵黄囊接种结果

将16份阳性组织病料接种鸡胚5代后，RT-PCR检测共有2份呈阳性，且均有胚体出血点病变。将卵黄囊分离阳性的禽偏肺病毒分别命名为RPVA0201株和RPVA0202株。

2.2细胞接种及毒价测定结果将RPVA0201株和RPVA0202株分别接种敏感Vero细胞和普通Vero细胞，经5代连续传代后，敏感Vero细胞在接种第3代时均出现明显形态变圆、形成合胞体为主要特征的CPE；普通Vero细胞在接种第5代时只有1份病毒出现以上CPE。敏感细胞毒第3代病毒含量分别为10^7.12TCID₅₀/0.1ml和10^5.50TCID₅₀/0.1ml。RPVA0201株普通细胞毒第5代病毒含量为10^4.75TCID₅₀/0.1ml，RPVA0202株普通细胞毒第5代未测到。具体结果见下表1。

表1病毒分离及毒价测定结果

注：“-”表示无细胞病变，“+”表示有细胞病变低于50％，“++”表示高于50％病变。

由表2结果可知，与接种普通Vero细胞相比，将阳性尿囊液接种敏感细胞可提高病毒的分离率，并显著提高病毒滴度。

2.3免疫原性试验结果

RPVA0201株灭活疫苗，对本毒株10/10保护，对RPVA0202株8/10保护，对照组10/10发病；用RPVA0202株灭活疫苗，对本毒株8/10保护，对RPVA0201株7/10保护，对照组8/10发病。说明RPVA0201株病毒免疫原性良好。结果见表2。

表2免疫原性结果

注：判定标准：攻毒后观察14日，根据每只鸡的症状给予打分，累计每日分值，以积分8分以上者判为发病。计分方法：正常0分；鼻腔湿润，按压有少量鼻液流出1分；鼻腔有清亮分泌物2分；鼻腔有浑浊分泌物或分泌物结痂3分；鼻窦肿胀或眼有分泌物或肿头4分。

将分离到的B型禽偏肺病毒RPVA0201株全面鉴定合格后，与2021年12月9日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心。保藏编号为CCTCC NO:V202188。

实施例3禽偏肺病毒鉴定测序

参照Genbank上已公布毒株VCO3/60616(基因登录号AB548428.1)序列，将全基因组分为7段相互重叠的片段，对本发明实施例一中分离到的病毒进行全基因组测序。具体内容涉及引物设计及合成、核酸提取、RT-PCR、PCR产物鉴定、PCR产物纯化、目的片段连接pMD18-T载体、转化及摇菌、重组质粒提取及鉴定。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1B型禽偏肺病毒(RPVA0201株)，由天津瑞普生物技术股份有限公司提供。

1.1.2RNA提取试剂盒，购自QIAGEN公司。

1.1.3一步法PCR试剂盒，购自全式金生物技术有限公司。

1.1.4试剂：DNA Marker、pMD18-T载体、DNA连接酶，均购自TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成

依据Genbank上已公布毒株VCO3/60616(基因登录号AB548428.1)序列，将全基因组分为7段相互重叠的片段，具体引物信息见表3。

表3 7对引物信息

名称	序列(5’-3’)
		aMPV-F1	ACGAGAAAAAAACGCATTCAAGTCACAATAG
aMPV-R1	CATTACATGTTATGTTCTCCACATTCCC
		aMPV-F2	GAAACTTACAGTGAAGAATCATGCAG
aMPV-R2	GCAGGGATTCCTTCTGGACATCTTT
		aMPV-F3	CTTAGCATGTCAATCGTAGTGGGCATAG
aMPV-R3	ATATCTTTGCTTCGGCCTAGCCATTTC
		aMPV-F4	GGACCAATATGGACCCATCCAATGAG
aMPV-R4	GTCTCTTTGCTTCTACAAAACAT
		aMPV-F5	TTGGCCCATGGATAAACACT
aMPV-R5	TGGAAATTAGTTGTGCGGTATGCT
		aMPV-F6	AAGAGAGGGCCTAAGGCTCCATG
aMPV-R6	TCCTTGACATCAAGTTCCCTGCAC
		aMPV-F7	TGGTGGCAAAACTAGACCTCAG
aMPV-R7	ACGGCAAAAAAACCGTATTCAATAC

表3中引物的退火温度优选52～57℃。

1.2.2PCR反应体系

使用表3中引物进行PCR扩增，反应体系优选为：每40μl体系包括：Primescript1step enzyme mix 0.8μl，2*1step buffer 20μl，aMPV-F/R(10pmol)0.8μl，RNA模板4μl，ddH2O 13.6μl。

1.2.3PCR反应程序

使用表2中引物进行PCR扩增，反应程序优选为：45℃30min，94℃5min，32*(94℃30s，52～57℃30s，72℃3min30s)，72℃10min，最后4℃冷却，扩增结束。

1.2.4核酸电泳及目的片段纯化回收

1.2.4.1对上述PCR产物用1％琼脂糖凝胶、100V 45min电泳。

1.2.4.2将各目的片段切下，放置于1.5ml EP管中。

1.2.4.3加入300μl loading buffer，在55℃水浴锅中加热使胶融化。

1.2.4.4将溶液加入硅胶柱中，室温静置3min。

1.2.4.5 12000rpm离心1min，弃掉收集管液体。

1.2.4.6再加入300μl loading buffer离心1min，弃掉收集管液体。

1.2.4.7加700μl Wash buffer，12000rpm离心1min，弃掉收集管液体。

1.2.4.8重复上步1次，12000rpm空离1min，将回收柱移至新的离心管中。

1.2.4.9加入30μl Elution buffer，室温静置5min，12000rpm离心1min。

1.2.5目的片段与pMD18-T载体连接

按如下体系进行：pMD18-T载体1μl，目的片段3μl，SolutionⅠ溶液5μl，ddH2O 1μl，16℃连接过夜。

1.2.6连接产物转化DH5α感受态细胞

1.2.6.1从-80℃冰箱取出DH5α感受态细胞，置于冰上融化，将连接产物加入感受态细胞中，用枪头轻吹混匀，冰上静置30min。

1.2.6.2将离心管放入42℃水浴中热激90s，之后迅速置于冰上，冷却2min。

1.2.6.3向离心管中加入1ml SOC培养基，置于摇床上，220rpm/min，37℃培养1小时。

1.2.6.4在超净工作台中，将摇好的菌取出200μl加到含有100μg/ml Amp的LB培养基平板上，用事先准备好的无菌涂布棒将菌液涂布均匀。将平板倒置放入37℃温箱中培养过夜。

1.2.7挑取重组单菌落

在超净工作台中，用10μl枪头挑取单个菌落放入3ml Amp抗性的LB液体培养基中，于摇床上220rpm/min，37℃培养12小时至菌液饱和。

1.2.8提取重组质粒参照AxyPrep质粒小提试剂盒说明书：

1.2.8.1取1ml菌液于1.5ml EP管中，12000rpm离心1min，弃去上清。

1.2.8.2加入250μl buffer S1悬浮细菌沉淀。

1.2.8.3加入250μl buffer S2，温和并充分上下翻转4～6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透明液体。

1.2.8.4加入350μl buffer S3温和并充分上下翻转6～8次，12000rpm离心10min。

1.2.8.5将上步中离心上清转入制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液。

1.2.8.6将制备管放回离心管，加500μl buffer W1，12000rpm离心1min，弃滤液。

1.2.8.7将制备管放回离心管，加700μl buffer W2，12000rpm离心1min，弃滤液；重复此步骤1次。

1.2.8.8将制备管放回离心管，12000rpm空离1min。

1.2.8.9将制备管放入新的1.5ml EP管中，在制备管膜中央加60～80μl Elution，室温静置1min，12000rpm离心1min，将洗脱的质粒-20℃保存。

1.2.9重组质粒PCR鉴定

PCR反应体系：

反应条件：94℃5min，30*(94℃30s，51℃30s，72℃3min)，72℃10min。反应结束后取5μl产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.10重组质粒测序

将各段基因鉴定正确的重组质粒送3～5个至测序公司进行测序。利用DNAMAN软件对测序序列进行拼接，得到禽偏肺病毒完整的基因组序列。

2结果

2.1全基因组各片段PCR扩增结果

结果见图1，各片段均扩增出与阳性对照同等大小条带，阴性对照成立。

2.2测序及同源性比对结果

将7段测序序列用DNAMAN软件进行拼接，得到全基因组序列SEQ ID NO.1，共13508bp，与Genbank中已公布的A、B、C型禽偏肺病毒序列比对，结果与B型同源性达99.8％。说明该分离毒为B型禽偏肺病毒。同源性比对结果见图2。

Claims (6)

1.一种B型禽偏肺病毒毒株，其特征在于，所述毒株为B型禽偏肺病毒RPVA0201株，保藏编号为CCTCC NO:V202188。

2.根据权利要求1所述的一种B型禽偏肺病毒毒株，其特征在于，所述B型禽偏肺病毒的全基因组序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种培养如权利要求1所述一种B型禽偏肺病毒毒株的细胞系。

4.根据权利要求3所述的一种培养B型禽偏肺病毒毒株的细胞系，其特征在于，所述细胞系为敏感Vero细胞系，其制备方法为：

1)合成含有αv和β1基因的重组质粒；

2)制备重组慢病毒液；

3)用2)中产物感染Vero细胞；

4)筛选出阳性的Vero-αvβ1细胞株。

5.根据权利要求1所述的一种B型禽偏肺病毒毒株，其特征在于，所述B型禽偏肺病毒毒株的分离方法包括：

1)将样品充分剪碎，经研磨，反复冻融处理，然后提取上清液，于80℃保存备用；

2)上清液先经卵黄囊接种传代，然后经RT-PCR鉴定为阳性后，用敏感Vero细胞进行细胞接种，传代培养；

3)获得B型禽偏肺病毒并检测病毒含量。

6.根据权利要求1所述一种B型禽偏肺病毒毒株，其特征在于，所述B型禽偏肺病毒的病毒含量不低于10^7.12TCID₅₀/0.1ml。

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