CN111849875A - 鸭瘟病毒易感型mhc单倍体无特定病原体鸭源胚肝间充质干细胞系及其应用 - Google Patents

鸭瘟病毒易感型mhc单倍体无特定病原体鸭源胚肝间充质干细胞系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鸭瘟病毒易感型MHC单倍体无特定病原体鸭源胚肝间充质干细胞系及其应用。本发明利用四个单倍型鸭生产的11日龄鸭胚在添加碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子和干细胞因子同时培养的基础上成功构建得到具有干细胞分化能力、性能稳定的胚肝源的间充质干细胞系。针对细胞系的特征性病变观察表明，所构建的干细胞系能支持DEV复制。本发明进一步将DEV分别接种于所获得的细胞系最终筛选得到更适合DEV增殖的细胞系，其微生物保藏编号是CGMCC No.18304。本发明所构建的鸭胚肝间充质干细胞系本身无病原学潜在污染、遗传背景清晰、性能稳定，适合DEV的增殖和培养，能应用于商业化的鸭瘟病毒的增殖和培养。

Description

鸭瘟病毒易感型MHC单倍体无特定病原体鸭源胚肝间充质干 细胞系及其应用
技术领域
本发明涉及鸭源胚肝间充质干细胞系，尤其涉及适于鸭瘟病毒或鸭甲型肝炎病毒增殖的易感型MHC单倍体无特定病原体鸭源胚肝间充质干细胞系及其构建方法和应用，属于鸭源胚肝间充质干细胞系的构建和应用领域。
背景技术
鸭瘟(Duck Plague，DP)也被称为鸭病毒性肠炎，是由疱疹病毒1型鸭肠炎病毒(Duck Enterovirus，DEV)引起的急性、慢性和高度传染性疾病。DP可使不同年龄的家鸭、野鸭、天鹅、鹅和其它水禽发病，主要病理变化为血管损伤，淋巴器官损伤，消化道粘膜出血，严重腹泻和实质器官退行性病变。临床症状包括眼睑局部闭合，畏光，极度口渴，食欲不振，共济失调，鼻腔有分泌物，羽毛下垂以及水样腹泻等，产蛋量和孵化率下降，死亡率高，给世界养鸭业带来重大的经济损失。
鸭甲型肝炎病毒(DHAV)属于小RNA病毒科、小RNA病毒属，有三种基因型DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。在中国大陆，鸭病毒性肝炎(DVH)主要由DHAV-1和DHAV-3引起。DHAV-1主要影响4周龄以下的雏鸭，对1周龄以下的雏鸭死亡率高达95％。
HBK鸭是中国国内最早培育成功的实验动物标准化绍兴麻鸭鸭群——该鸭群已在正压环境下连续繁殖了8个世代，排除了9种特定病原微生物及其抗体，其质量符合中国实验动物学会发布的“T/CALAS 18-2017实验动物SPF鸭微生物学监测总则”、“T/CALAS 37-2017实验动物SPF鸭遗传学质量监测”和“T/CALAS 17-2017实验动物SPF鸭配合饲料”以及黑龙江省标准“DB23/T 2057.6-2017实验动物鸭饲养隔离器通用技术要求”。根据组织相容性复合体(MHC)的核心基因MHC I类分子重链编码基因(uaa)以及与其连锁的2个抗原转运相关体基因(tap1和tap2)的基因型，该鸭群分为4个单倍型，分别命名为Hvri：HB1(本文简称B1，下同)、Hvri：HB2(B2)、Hvri：HB3(B3)和Hvri：HB4(B4)。经过连续5个世代的半同胞兄妹交配方式，其生物学特性和遗传背景均已非常稳定。
无论是商业化生产鸭瘟疫苗，还是实验室内禽病病毒田间流行株的分离，目前存在几个不可回避的技术瓶颈：
1、DEV只能利用鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF)，或利用鸡胚制备鸡胚成纤维细胞(CEF)进行体外培养和增殖。如果鸭胚或鸡胚本身携带某种或某几种病原微生物，则由此增殖获得的DEV疫苗，不仅因可能污染了其他病原微生物而给被免疫鸭群带来生物安全风险；或因不同微生物间的相互影响而影响DEV的增殖能力，从而减低疫苗的效价。
2、DHAV-1强毒在鸭胚中连续传代会降低致病性，不宜用胚培养强毒。DHAV-1疫苗株能在鸭胚肝细胞、鸭胚内皮细胞和DEF增殖，但传代次数有限。DHAV-3强毒株与弱毒株均能感染DEF，但不产生明显的细胞病变，不易观察。
3、DEF和CEF都是有限传代细胞系，通常只能传代1-2代，其质量和活性受生产工艺和培养条件的密切影响，从而进一步影响DEV的含量和活力。
4、已有多个国内外研究报告表明，鸭的MHC遗传背景对DP的致病性或DEV的复制能力有很大相关性。
因此，构建建立一株本身无病原微生物污染、遗传背景来源清晰、能稳定传代的DEV培养细胞系，对于鸭瘟病毒、鸭甲型肝炎病毒、禽流感病毒以及其它禽类种属动物的病原微生物的商业性生产和实验室培养均具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的是提供一株本身无病原污染、遗传背景清晰、性能稳定，适合DEV或鸭甲型肝炎病毒或寄生虫等禽病原微生物株增殖的MHC单倍体鸭源胚肝间充质干细胞系；
本发明的另一目的是将所构建的MHC单倍体鸭源胚肝间充质干细胞系应用于禽病原微生物株的体外增殖和培养。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明利用B1、B2、B3和B4这四个单倍型鸭生产的11日龄鸭胚，无菌条件下取出胚胎制备细胞悬液，将分离获得的细胞添加纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)和干细胞因子(SCF)同时培养。分别连续传代，经过26世代的消化、贴壁、生长、增殖，最终成功得到胚肝源的间充质干细胞系(DuLMSC)。bFGF是一种细胞分裂原，具有促进间充质干细胞(MSC)增殖、促进中胚层和神经外胚层源细胞有丝分裂、提高细胞增殖力的作用；LIF是典型的多功能生长因子，有广泛的促细胞生长、增殖与分化的作用，能维持成体MSC的干性；SCF能加速MSC的增殖，促进MSC由静止状态进入增殖状态。
本发明对第25代DuLMSC经过30天成骨诱导后经过染色检测结果发现，在细胞内明显观察到钙小结特异性染色；经成脂诱导染色检测到脂肪滴；这些检测结果说明已成功获得具有干细胞分化能力的稳定细胞系。
本发明进一步将DEV弱毒KCE株分别接种来自4个鸭品系(B1、B2、B3和B4)的DuLMSC，特征性观察病变，发现均能支持DEV复制。
为了进一步筛选得到DEV适应性的DuLMSC细胞系，本发明将DEV弱毒疫苗C-KCE株同时接种4个品系(B1、B2、B3和B4)的DuLMSC细胞。病变100％时收获细胞，冻融三次后，离心去掉细胞碎片，作为种毒(F1代种毒)。以1/5体积接种至第5代DuLMSC，再次培养、收获、接种；以此，将病毒在4个品系细胞上各连续传10代。将所有代次的病毒液，同时接种至已第10代B3系DuLMSC细胞，均在接毒5d～7d后观察细胞病变情况。按照Reed-Muench两氏法计算各代次DEV的TCID50，以病毒的增殖代次为横轴，以TCID50值为纵轴，绘制曲线。结果发现，DEV的TCID50值较稳定，从F4代开始出现轻微分化，B1和B2的数值接近，B3和B4的接近，且B3和B4的数值明显高于B1和B2的数值，表明DEV在B3或B4上的增殖能力逐渐增强，而在B1或B2上变化不大。由此确定B3和B4系DuLMSC细胞系适合DEV增殖。
为了进一步筛选敏感的细胞系，本发明再次将C-KCE株接种4个品系的DuLMSC细胞，在接毒后6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h收获病毒，检测不同培养时间病毒增殖的含量，用TCID50表示。本实验接种于各系细胞的病毒分别来自F9代(B4)、F10(B2)、F9(B3)和F8(B1)，测定TCID50的细胞来自第5-12代的B4系DuLMSC。结果表明，除在24h和36h时B4略低于B3外，其余时间点B4系的病毒均明显高于其它3个品系。
本发明将所构建的适于鸭瘟病毒增殖的MHC单倍型无特定病原体鸭胚肝间充质细胞系(B4系)提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.18304；其分类命名是：MHC单倍型无特定病原体鸭胚肝间充质细胞系；保藏时间是2019年7月18日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所构建的鸭胚肝间充质细胞系，遗传背景清晰、本身无病原学潜在污染、性能稳定，适合DEV的增殖，能够应用于鸭瘟病毒、鸭甲型肝炎病毒或禽流感病毒等病毒的增殖和培养，在鸭瘟病毒、鸭甲型肝炎病毒或禽流感病毒的商业性生产和实验室培养中具有重要的应用前景。
另外，根据《中华人民共和国兽药典》(2015版)第三部“鸭瘟活疫苗CVP3/2015/HYM/032”的规定，鸭瘟疫苗是通过将鸭瘟病毒鸡胚化弱毒株接种SPF鸡胚或鸡胚成纤维细胞得来，说明鸭瘟病毒可以在鸡胚或鸡胚成纤维细胞上培养，本发明成功代替了鸡胚或鸡胚成纤维细胞的生物学材料，因此，本发明所建立的MHC单倍型无特定病原体鸭胚肝间充质细胞系也能用于其它禽(包括水禽)病原微生物或寄生虫的增殖或培养。
根据人用禽流感疫苗也是由鸡胚成纤维细胞制备生产，本发明所建立的MHC单倍型无特定病原体鸭胚肝间充质细胞系也能适用于特定人类病原微生物(譬如禽流感病毒等)的复制与增殖。
因此，本发明所构建的MHC单倍型无特定病原体鸭胚肝间充质细胞系不仅适于鸭瘟病毒增殖，也能用于其它禽类病原微生物的增殖和培养，尤其适用于水禽病原微生物的增殖和培养；另外，本发明中所述的MHC单倍型无特定病原体鸭胚肝间充质细胞系也能适用于特定人类病原微生物的复制与增殖。
本发明涉及到的术语及定义
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是由胚胎干细胞诱导分化而来的间充质干细胞，是最具代表性的成体干细胞之一，存在于多种组织器官当中，对组织损伤修复和疾病治疗具有良好的作用，无致瘤性。
鸭主要组织相容性复合体(MHC)是一组紧密连锁高度多态的基因簇,其单倍型与宿主的抗病性和免疫应答水平密切相关,其中抗原提呈相关转运蛋白(TAP)基因毗邻MHCI基因。
本发明中所述的“水禽”包括鸭、鹅、鸿雁或灰雁。
附图说明
图1DEV感染DuLMSC产生的典型病变；(A).正常细胞48h(100x)；(B).正常细胞48h(200x)；(C).接毒细胞48h(100x)；(D).接毒细胞48h(200x)。
图2在鸭不同单倍型DuLMSC细胞上增殖10代的DEV的TCID50含量比较。
图3MOI＝2的C-KCE毒株接种4种单倍型DuLMSC细胞后病毒含量的动态变化(TCID50)。
图4DHAV-1感染DuLMSC/4后的细胞病变情况；A：36h对照细胞；B：36h接毒细胞；C：72h对照细胞；D：72h接毒细胞。
图5病毒基因的PCR扩增；A：DHAV-1 3D基因(M.DNA分子质量标准；1.种毒；2～16.分别为F1～F15代的PCR扩增产物；17.空白对照)；B：DHAV-3VP1基因(M.DNA分子质量标准；1.种毒；2～16.分别为F1～F15代的PCR扩增产物；17.空白对照)。
图6DHAV-1和DHAV-2在DuLMSC细胞中连续传代时的病毒基因拷贝数。
图7弓形虫在DuLMSC细胞中培养的显微观察；A正常DuLMSC，1h，40x；B弓形虫感染DuLMSC，1h，40x；C正常DuLMSC，4h，40x；D弓形虫感染DuLMSC，4h，40x。
图8H5和H7禽病毒在DuLMSC细胞上的复制。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 MHC单倍型无特定病原体实验鸭胚肝间充质干细胞系的分离、建立以及性能检测
1.MHC单倍型无特定病原体鸭胚肝间充质干细胞系的分离和建立
取MHCI纯合的SPF鸭生产的鸭胚，共4个品系，在正压屏障环境下，孵化至11日龄，无菌取出胚胎，在平皿中摘取肝脏，剔除包膜及胆囊。将肝转入到无菌平皿，尽量剪碎。加入少量胶原酶溶液(0.1％IV型胶原酶)，完全浸没组织。37℃消化15min，每隔5min轻柔晃动1次。用3倍体积的DMEM/F12培养基终止消化，经300目细胞筛过滤。滤液转移至50ml离心管，700g/min离心8min，弃上清。再用DMEM/F12培养基洗涤一次，500g/min离心5min。计数，用完全培养液(10ng/mLSCF+10ng/mL LIF+10ng/mL bFGF+12％FBS)调整细胞为1×105个/mL，分散到细胞培养瓶，置于37℃、5％CO 2培养箱培养。48h后更换新鲜培养液，去除未贴壁的细胞，细胞形态稳定后呈长梭形。当细胞单层密度约90％时，尽弃培养液，加入适量0.25％胰酶溶液消化，扩大培养。每48h传代一次。
采用同样方法，分别制备HB1、HB2、HB3和HB4的DuLMSC，连续培养26代形态学观察无差异，获得的细胞命名为鸭胚肝间充质细胞(DuLMSC)。
2.DuLMSC的成骨诱导检测
待细胞长到60％左右，弃掉培养基，用PBS洗两次，加入成骨诱导液，每隔48h换液，连续培养21天。倒掉诱导液，用PBS洗两次，用4％多聚甲醛固定10min，PBS洗两次，用茜红素染液染色0.5h，75％酒精脱掉非特异性染色，再用PBS洗两次，镜下观察，结果可见红色的成骨结节，证明所构建的鸭胚肝间充质细胞具有成骨诱导能力。
3.鸭瘟病毒(DEV)感染DuLMSC细胞的特征性病变观察
将长到90％的单层LMSC细胞，用PBS洗两次，加入C-KCE株病毒细胞培养液(1/5体积)，补充培养基使覆盖细胞，于37℃、5％CO2培养箱中孵育2h。弃掉吸附液，用PBS清洗细胞2次，加入15mL含SCF、LIF和bFGF的含2％FBS的维持液，继续培养。接毒后12h出现明显特异性病变(CPE)，细胞开始变圆，36h-48h胞质浓缩出现空泡，60h-72h部分细胞开始脱落。DEV接种后第一代(F1)即出现CPE。胰酶消化细胞，收获病毒，再次接种已连续传代的DuLMSC，仍然可出现典型CPE：细胞皱缩，呈圆形，且在48h病变达100％，表明DuLMSC能支持DEV复制。
试验例1 DEV适应性DuLMSC细胞系的筛选
将DEV分别接种于4个鸭品系(B1、B2、B3和B4)的DuLMSC细胞系，48h后收获。将细胞培养物经过-20℃和37℃彻底冻融，离心去掉细胞碎片，上清液继续作为种毒，接种下一代的DuLMSC细胞系。依此方式，将病毒在DuLMSC上从第1代连续培养10代。收获每个世代的种毒液，同时接种4个品系的DuLMSC，按Reed-Muench法计算所有世代病毒的TCID50值。具体步骤是，用DMEM/F12培养基将病毒液按10-1～10-8连续稀释，每个稀释度设8个重复，接种到细胞密度约90％时的DuLMSC，设16个孔的细胞为正常细胞对照。于37℃、5％CO2培养箱吸附2h，再补充2％血清的维持培养液继续培养。根据细胞病变的程度，5～7d后观察并记录蚀斑数。结果表明，在DuLMSC上连续传代的DEV的TCID50值较稳定，从F4代开始出现轻微分化，B1和B2的数值接近，B3和B4的接近，且B3和B4的明显高于B1和B2的。表明DEV在B3或B4上的增殖能力逐渐增强，而在B1或B2上变化不大(表1，图3)；由此确定B3和B4系DuLMSC细胞系适合DEV增殖，其中，B4系DuLMSC细胞系尤其适合DEV增殖。
表1 MOI＝2的C-KCE毒株接种4种单倍型DuLMSC细胞后病毒含量的动态变化(TCID50)
Figure BDA0002613067500000081
Figure BDA0002613067500000091
试验例2应用DuLMSC细胞系复制甲型鸭肝炎病毒I型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)
1.DHAV-1与DHAV-3在DuLMSC/4上的接种与传代
将DHAV-1和DHAV-3商品化疫苗冻干粉，用2mL DMEM溶解，再用DMEM稀释100倍。将25cm2细胞瓶中单层汇合度达90％左右的DuLMSC/4的培养基弃掉，用PBS清洗细胞2次，加入1mL DHAV-1稀释液和1mL DMEM，置于37℃、5％CO2培养箱中感作2h，弃吸附液，用PBS清洗细胞2次。加入5mL DMEM/F12维持液(DMEM/F12+10ng/mLSCF+10ng/mL LIF+10ng/mL bFGF+2％FBS+1％SP)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养，逐日镜检，观察细胞变化，同时设置未接毒的对照细胞。待细胞老化或病变达到90％以上时收获细胞培养物，冻融2次。500×g，4℃，离心10min，收集上清F1代病毒。以上述比例将获得的F1代病毒继续接种至单层汇合度达90％的DuLMSC/4上。如此连续的将DHAV-1和DHAV-3分别在DuLMSC/4上传15代。-80℃保存各世代收获的病毒液。
细胞接毒后，密切观察细胞的变化。早期传代并没有引起细胞病变，直到病毒传到第8代，在接毒后36h能够观察到明显的细胞病变，早期可见局部细胞皱缩变圆和细胞间隙变大，单层细胞开始拉网，有少量细胞脱落漂浮于培养基中(图4B)；待到接毒后72h时能够观察到细胞拉网成丝状、细胞变得圆又亮、细胞间隙明显增大、大量细胞脱落漂浮于培养基中等明显的细胞病变现象(图4D)，未接毒的对照细胞形态始终无明显变化(图4A、4C)。随着病毒的传代，细胞病变稳定出现，病毒引起细胞产生病变所需的时间无明显变化。
DHAV-3在细胞上的前两次传代没有引起细胞明显的病变，当病毒传到第3代时就能观察到明显的细胞病变，DHAV-3引起的细胞病变现象类似DHAV-1：随着病毒的连续传代，细胞病变稳定出现，但DHAV-3引起细胞产生病变所需的时间在逐渐缩短，最初能够观察到细胞病变是在接毒后36h，当病毒传到第8代时，在接毒后24h即能观察到明显细胞病变，当病毒传到第12代时，在接毒后12h就能观察到细胞病变，且细胞病变在36h左右就能达到90％以上。
2.DuLMSC细胞系中病毒基因的PCR检测
合成DHAV-1 3D基因序列特异性引物P1-F与P2-R，设计并合成DHAV-3VP1基因部分序列的特异性引物DHAV-3-F与DHAV-3-R。提取F1-F15代DHAV-1和DHAV-3病毒以及DHAV-1和DHAV-3的原种毒总RNA，反转录获得cDNA。PCR反应体系为：2×Premix Taq 10μL，10μmol/LP1-F(DHAV-3-F)1.0μL，10μmol/L P2-R(DHAV-3-R)1.0μL，cDNA模板1.0μL，ddH2O 7μL。反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。DHAV-1和DHAV-3的原种毒作阳性对照。取5μL PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。将DHAV-1和DHAV-3的原种毒、F1、F7和F15代的扩增产物进行测序，利用MEGA6.0对获得的序列Blast比对。
表2 PCR引物信息
Figure BDA0002613067500000101
Figure BDA0002613067500000111
F1至F15代DHAV-1病毒液均能扩增出大小为440bp的3D基因片段(图5A)。F1、F7和F15代的3D核苷酸序列与原种毒的同源性均达100％。F1至F15代DHAV-3病毒液均能扩增出大小为603bp的VP1基因片段(图5B)。F1、F7和F15代的VP1核苷酸序列与原种毒的同源性均达100％。
3.DHAV-1和DHAV-3在DuLMSC/4上病毒拷贝数的定量检测
分别设计、合成2对DHAV-1和DHAV-3特异性引物，用于构建荧光定量PCR检测方法。引物序列见表2。将P1-F/P2-R扩增产物、DHAV-3-F/DHAV-3-R扩增产物以及DGAPDHF/DGAPDHR扩增产物分别克隆入pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18-T-3D、pMD18-T-VP1、pMD18-T-GAPDH，作为荧光定量PCR检测的标准品。将标准品模板用去离子水连续10倍梯度稀释，每个稀释度两个重复，进行荧光定量PCR反应，绘制标准曲线。PCR反应体系20μL，TBGreen Premix Ex TaqⅡ10μL，DHAV-1、DHAV-3和GAPDH定量上、下游引物各0.8μL(10μmol/L)，ROXⅡ0.4μL，标准品2μL，ddH2O 6μL。反应程序为：95℃30s；95℃5s，58℃20s，72℃30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃1s。使用QuantStudio 5荧光定量PCR仪对结果进行分析。
将F1-F15代DHAV-1的cDNA、F1-F14代DHAV-3的cDNA，进行荧光定量PCR检测。以代次为横坐标，以各代病毒拷贝数与内参拷贝数的比值为纵坐标，绘制DHAV-1和DHAV-3在DuLMSC/4上的增殖曲线。DHAV-1核酸拷贝数相对于内参基因的增殖曲线(图6A)与DHAV-3(图6B)表现出类似的上下起伏的周期性变化。DHAV-1分别在F4、F6、F8、F9、F12和F15代出现上升，明显的峰值出现在F4(相对比例为24)和F9代(相对比例为23)，但从F6、F12和F15代数值接近，推测病毒复制能力趋于平缓；DHAV-3的峰值出现在F6、F9和F14代，三代的病毒核酸相对拷贝数范围达91-107，且F14仍处于最高峰，说明后期复制能力仍保持一段时间。
本试验中DHAV-1弱毒株在DuLMSC/4上传到第8代时出现细胞病变，随着病毒继续传代，稳定出现细胞收缩、拉丝成网以及脱落等现象。DHAV-3弱毒株在DuLMSC/4上传到第3代时即可观察到CPE，随着病毒继续传代，CPE稳定出现并且CPE出现的时间越来越快，第12代时感染后12h即出现明显的病变。
F1-F15代DHAV-1病毒液均能特异性地扩增出3D基因，F1-F15代DHAV-3病毒液均能特异性地扩增出VP1基因，且核苷酸序列与原种毒完全同源，说明在DuLMSC/4上连续增殖15代，没有影响DHAV-1和DHAV-3的稳定性。
DHAV-1和DHAV-3的核酸相对拷贝数含量在DuLMSC/4细胞上呈现出类似的上升、下降、再上升、再下降的周期性变化，反映出病毒基因组大量复制、迅速降解的过程，因为每代次收获病毒的时间是依据细胞的状态，而DHAV作为小RNA病毒，不是严格的细胞结合型病毒，其复制、降解的过程并不依赖于宿主细胞。DHAV-3基因组含量比DHAV-1上升地晚，但上升的程度高，间隔的代次数也更稳定，可能更适合于在DuLMSC/4上增殖。
试验例3弓形虫在DuLMSC细胞系中的培养试验
刚第弓形虫(Toxoplasma gondii)简称弓形虫，属细胞内寄生虫,侵害宿主一切有核细胞，在家畜及野生动物中广泛存在，引起世界分布的人兽共患的弓形虫病。
将利用非洲绿猴肾细胞系Vero细胞培养的弓形虫标准株RH株，以100uL接种于7mL细胞长满至90％的DuLMSC细胞，37℃CO2通气培养。1h后，可观察到有虫株进入细胞内。3h后，可观察到弓形虫的速殖子大量增殖，在细胞内和细胞外都大量存在。速殖子的折光性较强，呈小短线型(图7)。
试验例4应用DuLMSC细胞系复制H5和H7型禽流感病毒分别在12孔细胞培养板中培养DuLMSC细胞，待长满至90％，分别接种5×TCID50 H5:DK/JS/S4439/2017(H5N1)和H7:CK/GD/SD008/2016(H7N9)。1h后，弃掉培养液上清，更换为新鲜的培养基。分别在接种后24h、48h、72h和96h收获病毒感染细胞，每个时间点收获3个孔作为重复，全部收获完毕后，进行半数组织感染量(TCID50)的测定。结果如表3所示，说明H5和H7病毒均能在DuLMSC细胞上增殖，且H5比H7病毒更适合生长，增殖曲线见图(8)。
表3 H5和H7型禽流感病毒在DuLMSC细胞系复制结果
毒株 LogEID<sub>50</sub>/ml LogTCID<sub>50</sub>/ml
H5:DK/JS/S4439/2017(H5N1) 10.17 8.17
H7:CK/GD/SD008/2016(H7N9) 8.63 2.63
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> 鸭瘟病毒易感型MHC单倍体无特定病原体鸭源胚肝间充质干细胞系及其应用
<130> HLJ-2001-190525A-H
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artifical sequence
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
tgatgagata tggcaggtag aagga 25
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<212> DNA
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<400> 4
cacgcaagct gattcacaat aga 23
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
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<212> DNA
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ctgtcttcgt gtgtggctgt 20

Claims (10)

1.一株适于鸭瘟病毒增殖的MHC单倍型无特定病原体的鸭胚肝间充质干细胞系，其特征在于，其微生物保藏编号是CGMCC No.18304。
2.权利要求1所述的鸭胚肝间充质干细胞系在制备禽病疫苗中的应用。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：将禽病病原微生物接种所述的鸭胚肝间充质干细胞系，在体外增殖或培养相应的病原。
4.按照权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的禽包括水禽；优选的，所述的水禽包括鸭、鹅、鸿雁或灰雁。
5.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的禽病病原微生物包括病毒或细菌。
6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的病毒是鸭瘟病毒、鸭甲型肝炎病毒或禽流感病毒。
7.按照权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的禽病疫苗是鸭瘟疫苗。
8.权利要求1所述的鸭胚肝间充质干细胞系在禽寄生虫的增殖或培养中的应用。
9.权利要求1所述的鸭胚肝间充质干细胞系在人类病原微生物或寄生虫的复制与增殖中的应用。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的人类病原微生物包括禽流感病毒；所述的寄生虫包括弓形虫或球虫。
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Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAHESH KHATRI等: "鸡肺脏间充质干细胞的分离鉴定及其对禽流感病毒的易感性研究", 《中国畜牧兽医》 *
佟相慧等: "适合鸭瘟病毒弱毒增殖的MHC单倍型鸭胚肝间充质干细胞的建立", 《中国兽医科学》 *
佟相慧等: "鸭瘟病毒弱毒体外引起鸭胚肝间充质干细胞MHC I 类分子表达上调", 《第十四届中国实验动物科学年会》 *
徐丽晶等: "鸭瘟病毒在鸭胚脐带间充质干细胞上生物学特性的研究", 《中国兽医科学》 *

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