CN115044556A - 一种鲤鱼脑细胞系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鲤鱼脑细胞系及其应用，涉及水生生物细胞技术领域，本发明构建的鲤鱼脑细胞系，保藏号为：CCTCC NO：C202256，其可以连续传代，现已连续传至60代次以上，可提供大量的鲤鱼脑来源细胞，且细胞能维持良好、稳定的生长状态，可以对其进行冷冻保存，经连续多次传代后对锦鲤疱疹病毒和蛙虹彩病毒具有敏感性，可应用于KHV、LMBV的分离培养、病原特性研究以及相关疫苗的研制。
Description
技术领域
本发明涉及水生生物细胞技术领域，具体而言，涉及一种鲤鱼脑细胞 系及其应用。
背景技术
鲤鱼，中文别名鲤拐子、鲤子、毛子或红鱼。鲤科(Cyprinidae)中粗 强的褐色鱼，学名Cyprinus carpio。原产亚洲，后引进欧洲、北美以及其他 地区，杂食性。
锦鲤疱疹病毒病由锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus，KHV)引起，主要 感染锦鲤和鲤鱼，是锦鲤和鲤鱼养殖生产中发生的一种高致病性疾病，发 病率和致死率均可高达80％-100％。KHV非常特殊，只能在源自于原始宿 主的细胞中增殖，即在锦鲤组织细胞中增殖，很难在鱼类病毒分离常用的 细胞系(如EPC)中增殖。
建立来源于锦鲤的细胞系，是进行锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定，研究 其致病机理，疫苗制备和免疫预防技术的重要基础。获取不同种属来源的 细胞系将有助于丰富和完善对KHV的病毒学、毒理、生理、分子遗传学等 的研究。现有能够用于KHV分离培养的细胞系相对匮乏，获得的病毒滴度 也相对有限。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鲤鱼脑细胞系及其应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种鲤鱼脑细胞系，其保藏号为：CCTCC NO：C202256。
第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在 锦鲤疱疹病毒KHV培养中的应用。
第三方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在 分离锦鲤疱疹病毒KHV分离中的应用。
第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在 制备锦鲤疱疹病毒KHV疫苗中的应用。
第五方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在 制备用于检测锦鲤疱疹病毒KHV的产品中的应用。
第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在 蛙虹彩病毒LMBV培养中的应用。
第七方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在 分离蛙虹彩病毒LMBV分离中的应用。
第八方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在 制备蛙虹彩病毒LMBV疫苗中的应用。
第九方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在 制备用于检测蛙虹彩病毒LMBV的产品中的应用。
第十方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在 构建用于药物筛选或药物评价中的应用，所述药物为用于防治锦鲤疱疹病 毒KHV和/或蛙虹彩病毒LMBV感染引发的相关疾病。
本发明具有以下有益效果：
本发明构建了一种鲤鱼脑细胞系，保藏号为：CCTCC NO：C202256， 其可以连续传代，现已连续传至60代次以上，可提供大量的鲤鱼脑来源细 胞，且细胞能维持良好、稳定的生长状态，可以对其进行冷冻保存。
本发明构建的鲤鱼脑细胞系，经连续多次传代后对锦鲤疱疹病毒(KHV) 依旧具有敏感性，接毒后20℃培养3d可观察到细胞病变(CPE)，7天细胞 全部病变，10-14天细胞脱落死亡，经反复冻融两次后，取离心上清200μl 提取病毒DNA后经qPCR检测，Cq值为16左右，因此本发明的细胞系可 以直接应用于KHV病原特性研究及其疫苗的研制。
此外，本发明构建的锦鲤脑细胞系同样其对蛙虹彩病毒LMBV敏感， 接毒后24℃培养，3d可见50％细胞死亡，7d时基本上所有细胞脱落死亡， 检测此时的病毒滴度为109TCID50/ml，可用于LMBV病原特性研究及疫苗 的研制与生产。
综上，本发明构建的鲤鱼脑细胞系具有广阔的应用前景，可应用于KHV、 LMBV的病原特性研究以及相关疫苗的研制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需 要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些 实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1中A为物镜4X时的视野图；B为物镜10X时的视野图；
图2为P4代次的鲤鱼脑细胞系；
图3为P13代次的鲤鱼脑细胞；
图4为P20代次的鲤鱼脑细胞，A为低倍镜下细胞形态(图中标尺为 100μm)；B为高倍镜下的细胞形态(图中标尺为100μm)；
图5中A为正常鲤鱼脑细胞；B为感染KHV病毒6天的鲤鱼脑细胞； C为感染KHV病毒14天的鲤鱼脑细胞；
图6为病毒DNA的qPCR反应曲线(曲线从左到右依次为病毒样本(重 复检测)，阳性对照)；
图7中A为正常鲤鱼脑细胞；B为感染LMBV病毒3天的鲤鱼脑细胞； C为感染LMBV病毒7天的鲤鱼脑细胞。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发 明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件 者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产 厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供了一种鲤鱼脑细胞系(CCB63)，其保藏号为：CCTCC NO：C202256，该细胞系的保藏信息如下：
保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址:中国.武汉，武汉大学，保 藏日期：2022年2月18日，分类命名为鲤鱼脑组织细胞CCB63，保藏编 号：CCTCC NO：C202256。
鲤鱼脑细胞系CCB63的构建包括以下步骤：(a)取鲤鱼苗的脑组织， 洗涤、剪碎、胰酶消化；所述胰酶消化为：向剪碎的鲤鱼苗脑细胞中加入 胰酶，消化后离心弃上清，重悬；(b)将步骤(a)消化得到的细胞采用含 胎牛血清的L15培养基培养，得到原代鲤鱼脑细胞；(c)将原代鲤鱼脑细 胞，传代超过50代，得到鲤鱼脑细胞系CCB63。
鲤鱼脑细胞系CCB63，首次传代细胞在8-16h可贴壁生长，大约3-5d 能生长成汇合细胞单层，细胞呈典型的成纤维样；连续传代15次后，传代 细胞约3d即可汇合成细胞单层，5d可形成致密细胞单层。CCB63细胞经 液氮冷冻后复苏，通过台盼蓝染色计数，约90％的细胞具有细胞活性，并 保持原有生长状态，目前该细胞已经稳定传代60多次。
具体地，制备得到原代鲤鱼脑细胞的条件为：用含EDTA的0.25％胰 酶在25-37℃下消化30-60min，每隔10-20min吹打一遍，并加入含血清的 培养液中和后，1000-1500rpm离心5-10min收集细胞，用含15％-20％胎牛 血清的L15培养基，在23-27℃下静置培养7-10天，之后每隔2-3天更换 40％-60％的培养液以去除死细胞，待细胞长满至至少80％时，进行传代培 养。
优选地，在该细胞系的1-3代传代时，需保证每次加入约40-60％的条 件培养基。
优选地，在细胞传代15代以后，胎牛血清浓度降至8％-12％，并以1： (2-4)的方式开始传代培养。
本发明要求保护的CCB63是基于上述构建方法获得的，然而细胞系的 获得与样本本身和构建方法中的刺激因素有关，重复该构建方法无法必然 地获得本申请要求保护的细胞系。
本发明构建的鲤鱼脑细胞系CCB63对锦鲤疱疹病毒KHV具有敏感性， 接毒后3d可观察到细胞病变(CPE)，7天细胞全部病变，10-14天细胞脱 落死亡，经qPCR检测，其Cq值约为16，可以直接应用于KHV病原特性 研究及其疫苗的研制。
本发明构建的鲤鱼脑细胞系CCB63可用于锦鲤疱疹病毒培养，其滴度 测定可以达到105.84TCID50/ml。
本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在锦鲤疱疹病 毒KHV培养中的应用。
本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在分离锦鲤疱 疹病毒KHV分离中的应用。
本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在制备锦鲤疱 疹病毒KHV疫苗中的应用。
进一步地，CCB63细胞取自鲤鱼脑组织，与鲤鱼上皮瘤细胞EPC在一 定程度上具有相似性。经验证，CCB63对蛙虹彩病毒LMBV敏感，接毒后 24℃培养，3天可见50％细胞病变，培养7天时基本上所有细胞脱落死亡， 检测此时的病毒滴度为109TCID50/ml。
该细胞系有多方面的应用，对锦鲤疱疹病毒和蛙虹彩病毒的诊断检测、 疫苗制备与免疫研究有重要意义。
具体地，本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在制 备用于检测锦鲤疱疹病毒KHV的产品中的应用。
本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在蛙虹彩病毒 LMBV培养中的应用。
本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在分离蛙虹彩 病毒LMBV分离中的应用。
本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在制备蛙虹彩 病毒LMBV疫苗中的应用。
本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在制备用于检 测蛙虹彩病毒LMBV的产品中的应用。
此外，本发明实施例提供了如前述实施例所述的鲤鱼脑细胞系在构建 用于药物筛选或药物评价中的应用，所述药物为用于防治锦鲤疱疹病毒 KHV和/或蛙虹彩病毒LMBV感染引发的相关疾病，比如锦鲤疱疹病毒病 和蛙虹彩病毒病。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
鲤鱼脑细胞系的构建方法如下。
(1)组织预处理
取体长3-5cm左右的鲤鱼苗(淘宝购买)，处死后置于75％酒精中浸泡 30s-2min，对鱼体表面进行杀菌；转移到超净工作台中，用手术剪刀剪断颈 部，用无菌手术镊夹出脑组织，用含双抗的PBS溶液洗涤3-5次，第一次 洗涤时先将其浸泡30min，后面每次浸泡10min，以去除血块和可能残留的 微生物；
(2)组织处理
将处理好的脑组织，用无菌的眼科剪刀剪成1mm3左右大小的组织块， 加入5-7倍组织体积的胰蛋白酶溶液，37℃消化至少30min，每10min吹打 一次；加入等体积的含20％FBS(胎牛血清)的L15培养液终止消化，1500rpm离心5min收集细胞。
(3)原代培养
将上步获得的细胞用含20％FBS(胎牛血清)的L15培养液制成细胞 悬液(每条鱼的脑细胞用5ml培养液重悬)，接到T25密闭盖培养瓶中，在 27℃条件下培养，7-10d内切勿移动(除非观察到明显异常，比如染菌)。 之后待脑细胞稳定贴壁生长后，每隔2-3d半量更换一次培养液，以去除脱 落的组织和死细胞。
(4)1-3代传代培养
当原代培养的细胞长满瓶底时，见图1。吸出旧培养液用0.22um的无 菌滤器过滤保留(记为条件培养基)，培养瓶加入2ml PBS洗2次，用胰蛋 白酶(0.25％，含EDTA，生工生物)将细胞消化至细胞变圆时，吸弃胰酶， 加入3ml新鲜的含20％FBS(胎牛血清)的L15培养液和2ml条件培养基 终止消化，将细胞轻拍下后吹打混匀并以1:1的方式接到新T25中，27℃培 养；隔天观察，如发现较多未贴壁的死细胞，则将培养上清吸出离心去除 死细胞后加回培养瓶，继续培养；
(5)传代培养
传代到第四代的细胞，形态已发生变化，多为短纤维状(如图2)。当 细胞基本长满瓶底时，弃去培养液，用2ml PBS洗涤一次，加入1ml 0.25％ 胰蛋白酶液(含EDTA，不含酚红，生工生物)消化2min，消化后去除酶 液，加入2ml含20％FBS(胎牛血清)的L15培养液将细胞吹下并混匀， 以1:2的方式进行传代，25℃培养；
传代培养至10-15代以后，将培养液中的胎牛血清含量降至10v/v％， 并进行后续的传代培养，此时细胞形态如图3所示。
在本实施例中，当细胞传代至P20时，可观察到典型上皮样细胞出现， 如图4所示(箭头所指区域)，该类细胞在后续的传代中逐渐成为优势，并 经过多次传代培养，获得了一种鲤鱼脑细胞系CCB63。
本发明制备的鲤鱼脑细胞系CCB现已传代至60多代，细胞多为上皮 样细胞，生长稳定，当以1:3的方式传代后，3天即可长满瓶底并开始再次 传代。
实施例2
病毒感染实验。
为了研究本发明构建的鲤鱼脑细胞系CCB63对锦鲤疱疹病毒(KHV) 的病毒敏感性，以第50代的鲤鱼脑细胞为对象，检测KHV对该细胞的敏 感程度。细胞用含2％FBS的L15的培养液接种培养24h后，将0.1ml KHV 病毒液加入到T25细胞培养液中，20℃培养，观察细胞病变(CPE)。
检测结果如图5所示，与感染KHV前的鲤鱼脑细胞(图5中A)相比， 感染KHV后的鲤鱼脑细胞出现了明显的细胞病变效应CPE(如图5中B； 图5中C)，从中可以明显看出鲤鱼脑细胞出现空泡样，细胞碎片增多，细 胞脱落，单层呈破渔网状。
20℃培养14天后，收获病毒并取离心上清200ul，提取病毒DNA后， 经qPCR检测，测得Cq值为16.17和15.38，其反应曲线如图6。上述结果 说明本发明制备的鲤鱼脑细胞可用于KHV的培养。
实施例3
病毒滴度检测。
取实施例2中收获的病毒进行滴度检测。
取生长良好的本发明鲤鱼脑细胞CCB63经消化后取样计数，用L-15 将细胞按照5×104个/mL的浓度进行稀释，以100μl/孔的初始量接种到96 孔板培养24h使细胞充分贴壁。
次日，取出细胞板弃尽生长液，每孔添加100μl含2％FBS的L-15基础 培养基，然后将待检病毒样品按稀释倍数由低到高的顺序以100μl/孔分别添 加到96孔板的B-G行各孔中，A和H行各添加100μl含2％FBS的L15维 持液作为阴性对照，该实验设3个重复。将细胞板于20℃低温培养箱中培 养10天后观察细胞病变(cytopathic effect，CPE)并记录终点，按Reed-Muench法计算病毒的效价，公式为：
病毒滴度＝10lgCPE>50％的病毒最高稀释度+(CPE>50％的百分数-50％)/(CPE>50％的百分数-CPE<50％的百分数)TCID50/100μl。结果如下表1：
表1鲤鱼脑细胞CCB培养KHV病毒滴度检测
| 病毒稀释度 | 10<sup>-3</sup> | 10<sup>-4</sup> | 10<sup>-5</sup> | 10<sup>-6</sup> | 10<sup>-7</sup> | 10<sup>-8</sup> |
| 接种孔数 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| CPE孔数(平均值) | 10 | 10 | 8 | 4 | 2 | 0 |
| 正常孔数 | 0 | 0 | 2 | 6 | 8 | 10 |
| CPE总孔数 | 34 | 24 | 14 | 6 | 2 | 0 |
| 正常总孔数 | 0 | 0 | 2 | 8 | 16 | 26 |
| CPE孔数占比 | 34/34 | 24/24 | 14/16 | 6/14 | 2/18 | 0/26 |
| 细胞病变率 | 100％ | 100％ | 87.5％ | 42.9％ | 11.1％ | 0％ |
经统计、计算，本发明构建的鲤鱼脑细胞CCB63可以用于锦鲤疱疹病 毒培养，且病毒滴度为105.84TCID50/ml。在此基础上可实现锦鲤疱疹病毒的 检测、疫苗制备和疾病治疗。
实施例4
为了研究本发明构建的鲤鱼脑细胞系CCB63对蛙虹彩病毒(LMBV) 的病毒敏感性。用第50代鲤鱼脑细胞系CCB63，检测其对LMBV的敏感 程度。
将细胞传代到T25中，用含10％胎牛血清的L15培养液，27℃培养， 待细胞长满瓶底的80％时，移去旧培养液，加入2ml PBS洗涤一次后，加 100ul LMBV病毒液和900ml含2％胎牛血清的L15培养液，24℃培养2h 后弃去，再用PBS缓冲液洗2-3遍，每次5ml，最后补加5ml含2％胎牛血 清的L15培养液，24℃培养观察细胞病变效应(CPE)。
观察结果如图7所示，与LMBV感染前的鲤鱼脑细胞系(图7中A) 相比，感染后的鲤鱼脑细胞系出现了明显的细胞病变效应CPE(如图7中B、 C所示)，从中可以明显看出鲤鱼脑细胞碎片增多，细胞脱落，单层呈破渔 网状。
当细胞病变达到70％时，将鲤鱼脑细胞反复冻融2-3次后，离心过滤 去除细胞杂质，采用微量培养板(Corning)培养法测定病毒滴度。
取生长良好的本发明鲤鱼脑细胞经消化后取样计数，用L-15将细胞按 照5×104个/mL的浓度进行稀释，以100μl/孔的初始量接种到96孔板培养 24h使细胞充分贴壁。次日，取出细胞板弃尽生长液，每孔添加100μl含2％ FBS的L-15基础培养基，然后将待检病毒样品按稀释倍数由低到高的顺序 以100μl/孔分别添加到96孔板的B-G行各孔中，A和H行各添加100ul含 2％FBS的L-15维持液作为阴性对照。将细胞板置于24℃低温培养箱中培 养7天后观察细胞病变(cytopathic effect，CPE)并记录终点，按Reed-Muench 法计算病毒的效价(公式同上)，以鲤鱼瘤上皮细胞(EPC)培养LMBV作 实验对照。
经统计计算，结果表明本发明构建的鲤鱼脑细胞系对LMBV病毒敏感， 病毒经培养，滴度可以达到109TCID50/ml(具体数据见表2)，而商品化的 EPC细胞系培养的病毒，滴度只有108TCID50/ml(表3)。
表2鲤鱼脑细胞系(CCB63)培养病毒(LMBV)滴度检测
表3鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)培养病毒(LMBV)滴度检测
| 病毒稀释度 | 10<sup>-5</sup> | 10<sup>-6</sup> | 10<sup>-7</sup> | 10<sup>-8</sup> | 10<sup>-9</sup> | 10<sup>-10</sup> |
| 接种孔数 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| CPE孔数(平均值) | 10 | 10 | 8 | 6 | 1 | 0 |
| 正常孔数 | 0 | 0 | 2 | 4 | 9 | 10 |
| CPE总孔数 | 35 | 25 | 15 | 7 | 1 | 0 |
| 正常总孔数 | 0 | 0 | 2 | 6 | 15 | 25 |
| CPE孔数占比 | 35/35 | 25/25 | 15/17 | 7/13 | 1/16 | 0/25 |
| 细胞病变率 | 100％ | 100％ | 88.2％ | 53.8％ | 6.25％ | 0％ |
综上，本发明构建的鲤鱼脑细胞系现已能稳定传代、增殖，并可用于 锦鲤疱疹病毒KHV和蛙虹彩病毒LMBV的分离培养，不仅丰富了上述两 种病毒的诊断方式，同时其培养获得的高滴度LMBV病毒使相关疫苗研制、 鱼类疫病的防治成为可能。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于 本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种鲤鱼脑细胞系，其特征在于，其保藏号为：CCTCC NO：C202256。
2.如权利要求1所述的鲤鱼脑细胞系在锦鲤疱疹病毒KHV培养中的应用。
3.如权利要求1所述的鲤鱼脑细胞系在分离锦鲤疱疹病毒KHV分离中的应用。
4.如权利要求1所述的鲤鱼脑细胞系在制备锦鲤疱疹病毒KHV疫苗中的应用。
5.如权利要求1所述的鲤鱼脑细胞系在制备用于检测锦鲤疱疹病毒KHV的产品中的应用。
6.如权利要求1所述的鲤鱼脑细胞系在蛙虹彩病毒LMBV培养中的应用。
7.如权利要求1所述的鲤鱼脑细胞系在分离蛙虹彩病毒LMBV分离中的应用。
8.如权利要求1所述的鲤鱼脑细胞系在制备蛙虹彩病毒LMBV疫苗中的应用。
9.如权利要求1所述的鲤鱼脑细胞系在制备用于检测蛙虹彩病毒LMBV的产品中的应用。
10.如权利要求1所述的鲤鱼脑细胞系在构建用于药物筛选或药物评价中的应用，其特征在于，所述药物为用于防治锦鲤疱疹病毒KHV和/或蛙虹彩病毒LMBV感染引发的相关疾病。
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