CN113234660A - 一种草鱼输尿管组织细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草鱼输尿管组织细胞系，命名为草鱼输尿管组织细胞系CiU，该细胞系于2019年5月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为CCTCC NO：C201978，请求保藏人为肇庆大华农生物药品有限公司。该细胞系能在低至3％血清培养液中生长良好，目前已经稳定传至100代以上，冻存后细胞复苏率90％以上，复苏细胞能够贴壁并生长分裂，并可以正常传代，细胞形态与增殖能力同冻存前无明显差异。该细胞系对于草鱼出血病毒Ⅱ型、草鱼出血病毒GCHV‑892毒株非常敏感，可用于草鱼出血病疫苗的生产。

Description

一种草鱼输尿管组织细胞系及其应用

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种草鱼输尿管组织细胞系CiU及其 应用。

背景技术

草鱼是鲤科、草鱼属鱼类，栖息于平原地区的江河湖泊，一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域。草鱼是中国重要的淡水养殖鱼类，它和鲢、鳙、青鱼一起，构成了中 国的“四大家鱼”。在养殖过程中，草鱼容易发生各种疾病，而近年来由于各地忽视了 免疫工作，草鱼出血病的发病率呈上升趋势。草鱼出血病毒(grass carp hemorrhage virus,GCHV，国际病毒分类委员会称之为reovirus of grass carp,GCRV)是中国分 离的第一种鱼类病毒，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，直径70～80nm，20 面体球形颗粒，含有11个片段的双链RNA。该病毒主要引起中国淡水养殖主要品种草鱼 在鱼种阶段发生出血病，死亡率高达90％以上，给水产养殖业造成巨大损失。

目前草鱼出血病病原公认的至少有3个基因型，最早于1980年分离和研究的属于基因I型(如GCHV-873株等)；而张超、王庆等于2010年首次报道了II型草鱼出血 病病毒，GCHV-HZ08株；Fan YD,Rao SJ等于2009年在国内首次分离并报道了III型 草鱼出血病病毒：HGDRV(GCHV-104株)；不同基因型毒株间的各节段序列同源性相似性 为15.1-46.1％不等，且不同基因型的交叉保护率低，这也就意味着即使免疫过单种疫 苗，也仍然会有被其他基因型病原感染的风险。目前，草鱼出血病活疫苗(GCHV-892株) 已经能够对基因I型达到较好的免疫保护作用。而II型GCRV作为目前主要流行株型， 对草鱼的致病性较强、致死率高，尚没有针对性的高效疫苗。

鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感 的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性，所以建立一株需求鱼类细胞系有效的途径是以 数量对质量，即制备大批量的原代细胞株，从而筛选出敏感的细胞系。草鱼吻端成纤维细胞系PSF是目前草鱼出血病活疫苗(GCHV-892株)生产用细胞系，已经在草鱼出血 病毒培养和疫苗生产领域得到了广泛应用，但是汇合度为80-90％的PSF细胞贴壁培养 2-3天后，细胞生长为长梭形，对病毒的敏感性下降。草鱼出血病II型在细胞上不产生 病变，在目前常用于分离GCRV的CIK、PSF、FHM、EPC等细胞系上扩繁拷贝数低，难 以满足草鱼呼肠孤病毒II型的分离、繁殖及草鱼出血病疫苗研究的要求。为了研究及 预防该病毒，技术人员需要一种对草鱼出血病毒有更强敏感性的细胞系。

一般的鱼类有一对输尿管，肾脏过滤的新陈代谢废物由肾小管汇集到输尿管，借助 输尿管肌肉壁的蠕动将尿液排出体外。输尿管壁具有三层：粘膜层、肌肉层、纤维层。 粘膜层有较多纵行皱褶；肌肉层里层为纵肌，外层为环肌，均属于滑肌；纤维层有较多 弹性结缔组织、血管、神经分布期间。但是，目前还没有关于草鱼输尿管组织细胞系的 报道，更没有关于草鱼输尿管组织细胞系用于培养草鱼出血病病毒的报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明以草鱼输尿管组织为对象，成功构建了草鱼输尿管 组织细胞系，该细胞系不仅能用于草鱼出血病病毒Ⅱ型的增殖，还能用于草鱼出血病疫苗的生产。

本发明所述的草鱼输尿管组织细胞系的生物学名称为草鱼输尿管组织细胞系CiU， 该细胞系于2019年5月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏登记入册编号为CCTCC NO：C201978，请求保藏人为 肇庆大华农生物药品有限公司。

本发明所述的一种草鱼输尿管组织细胞系可以用于草鱼出血病毒II型的增殖。

本发明所述的一种草鱼输尿管组织细胞系可以用于草鱼出血病毒GCHV-892毒株增 殖。

本发明的一种草鱼输尿管组织细胞系CiU是采用以下步骤制备得到的：

(1)草鱼输尿管组织处理：取健康草鱼进行消毒，取出输尿管组织用漂洗液反复冲洗后 切碎，加入胰酶消化；

(2)原代培养：往上述经过胰酶消化处理后的细胞原液加入原代培养液进行原代培养；

(3)传代培养：原代培养细胞培养至50-70％汇合度时，加入胰酶消化，使用培养液吹下 贴壁细胞，将细胞悬液接种于2个培养瓶，培养箱培养，以后每5-7天传代一次。

其中，草鱼输尿管组织处理的具体方法如下：取100g左右的鲜活草鱼，经PCR检 测无草鱼呼肠孤病毒感染，处死后用75％酒精短时浸泡鱼体，再用酒精棉球擦拭鱼体表 进行消毒。在无菌条件下的超净工作台内解剖取输尿管组织，用漂洗液反复冲洗8-10 次，用锋利刀片将组织块切碎，加入胰酶消化30min。浸泡于漂洗液所述漂洗液包含基 础培养基、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素和800μg/mL制霉菌素，pH值7.2-7.4、 且该基础培养基为M199培养液。

其中，原代培养的具体方法如下：胰酶消化后的细胞悬液用100目的灭菌滤网过滤。 滤液1.5ml EP管中1000rpm离心10min，去上清，用原代培养液重悬沉淀，移入25cm2 培养瓶中，每个培养瓶内添加生长培养液至5ml。将培养瓶置于28℃培养箱内培养。细 胞贴壁后，每天观察拍照，及时记录细胞生长情况。为补充新的营养，每2-3天按半量 换液方式更换培养液。所述原代培养液包括M199培养基、20％胎牛血清、400IU/mL青 霉素、400μg/mL链霉素，pH值7.2-7.4。

其中，传代培养的具体方法如下：原代培养细胞长至50-70％汇合度时，进行原代细 胞的传代。加入0.25％胰酶室温下消化2～3min，使用完全培养液吹下贴壁细胞，将细胞悬液接种于2个培养瓶中28℃培养箱培养。以后每5-7天传代一次，传至第5-10代 时，将细胞培养液中血清浓度降为15％，抗生素浓度降至正常使用浓度，即青霉素浓度 为100IU/ml、链霉素浓度为100μg/ml；传至第15-20代时，将培养液中血清含量降 至8-10％。

所述草鱼输尿管组织细胞系的冻存保种方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)取处于对数生长期的细胞，经胰酶消化后获得单细胞悬液，离心，弃掉上清液；

(2)向细胞沉淀中加入细胞冻存液，重悬，转移入无菌冻存管中；

(3)将无菌冻存管放入程序降温盒中，冰箱过夜，隔天放入液氮中长期保存。

所述草鱼输尿管组织细胞系的复苏方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将含有冷冻细胞的冻存管从液氮罐中取出，放入水浴锅中快速摇晃至融化；

(2)在无菌条件下将解冻细胞转移至离心管，并加入适量完全培养液，离心，去除上 清液，收集细胞；

(3)用完全培养液重悬细胞，转移至细胞培养瓶中，28℃培养箱中培养。

优选地，在草鱼输尿管组织细胞系的制备方法中所述漂洗液包含基础培养基、400IU /mL青霉素、400μg/mL链霉素和800μg/mL制霉菌素，pH值7.2-7.4，且该基础培养基为M199培养液。

优选地，在草鱼输尿管组织细胞系的制备方法中所述原代培养液包括M199培养基、 20％胎牛血清、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素，pH值7.2-7.4。

对比现有技术，本发明的有益效果如下：

1.本发明所述的细胞系培养方法简单，生长迅速，可连续传代，连续传代100次 以上仍然可以正常生长，冻存后细胞复苏率90％以上，复苏细胞能够贴壁并生长分裂， 并可以正常传代，细胞形态与增殖能力同冻存前无明显差异。

2.常规的细胞系一般需要在8％以上的血清浓度下才能够生长良好，而本细胞系的 细胞能在3％的血清浓度下生长良好，细胞的血清低依赖性大大降低了血清使用成本。

3.草鱼输尿管组织细胞对草鱼出血病病毒II型比较敏感，病毒拷贝数是现有草鱼生产用细胞的1200多倍；同时，草鱼输尿管组织细胞对草鱼出血病生产用毒株GCHV-892 比较敏感，平均病毒滴度比现有草鱼疫苗生产用细胞高出0.7滴度，因此可有效降低草 鱼出血病病毒的培养成本。在日后投入疫苗生产后，也可以有效降低生产成本，节约生 产时间，提高经济效益。

附图说明

图1为草鱼输尿管组织原代培养细胞(标尺＝100μm)；

图2为草鱼输尿管组织细胞系第20代细胞(标尺＝100μm)；

图3为草鱼输尿管组织细胞系第80代细胞(标尺＝100μm)；

图4为草鱼输尿管组织细胞系接种GCHV-892后细胞病变情况。

具体实施方式

以下将通过具体实施例和验证效果试验例对本发明作进一步详细表述，但本发明并 不仅限于以下的实施例。

实施例1

细胞的冻存保种与复苏

(1)草鱼输尿管组织处理：取健康草鱼进行消毒，取出输尿管组织用漂洗液反复冲洗 后切碎，加入胰酶消化；

(2)原代培养：往上述经过胰酶消化处理后的细胞原液加入原代培养液进行原代培养；

(3)传代培养：原代培养细胞培养至50-70％汇合度时，加入胰酶消化，使用培养液吹 下贴壁细胞，将细胞悬液接种于2个培养瓶，培养箱培养，以后每5-7天传代一次。

其中，草鱼输尿管组织处理的具体方法如下：取100g左右的鲜活草鱼，经PCR检 测无草鱼呼肠孤病毒感染，处死后用75％酒精短时浸泡鱼体，再用酒精棉球擦拭鱼体表 进行消毒。在无菌条件下的超净工作台内解剖取输尿管组织，用漂洗液反复冲洗8-10 次，用锋利刀片将组织块切碎，加入胰酶消化30min。浸泡于漂洗液所述漂洗液包含基 础培养基、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素和800μg/mL制霉菌素，pH值7.2-7.4、 且该基础培养基为M199培养液。

其中，原代培养的具体方法如下：胰酶消化后的细胞悬液用100目的灭菌滤网过滤。 滤液1.5ml EP管中1000rpm离心10min，去上清，用原代培养液重悬沉淀，移入25cm2 培养瓶中，每个培养瓶内添加生长培养液至5ml。将培养瓶置于28℃培养箱内培养。细 胞贴壁后，每天观察拍照，及时记录细胞生长情况。为补充新的营养，每2-3天按半量 换液方式更换培养液。所述原代培养液包括M199培养基、20％胎牛血清、400IU/mL青 霉素、400μg/mL链霉素，pH值7.2-7.4。

其中，传代培养的具体方法如下：原代培养细胞长至50-70％汇合度时，进行原代细 胞的传代。加入0.25％胰酶室温下消化2～3min，使用完全培养液吹下贴壁细胞，将细胞悬液接种于2个培养瓶中28℃培养箱培养。以后每5-7天传代一次，传至第5-10代 时，将细胞培养液中血清浓度降为15％，抗生素浓度降至正常使用浓度，即青霉素浓度 为100IU/ml、链霉素浓度为100μg/ml；传至第15-20代时，将培养液中血清含量降 至8-10％。

结果表明：图1、图2、图3可反映出连续传代的细胞仍然具有良好的生长状况， 意味着本发明所述的细胞系培养方法简单，生长迅速，可连续传代。

实施例2

细胞的冻存保种与复苏

细胞的冻存保种：取处于对数生长期的细胞，经胰酶消化后获得单细胞悬液，160g离心10min，弃掉上清液；向细胞沉淀中加入适量配置好的细胞冻存液，重悬，转移入 1.8ml无菌冻存管中；将无菌冻存管放入程序降温盒中，-80℃冰箱过夜，隔天放入液 氮中长期保存，所述细胞冻存液为含有15-20％FBS、10％DMSO的M199培养液。

冻存细胞的复苏：将冻存管从液氮罐中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化；然后在无菌条件下将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入适量完全培养液，160g离 心5-10min，去除上清液，收集细胞；用完全培养液重悬细胞，转移至细胞培养瓶中， 28℃培养箱中培养。

实验结果：

结果表明：不同代次细胞冻存后复苏率在90％以上，复苏细胞能够贴壁并生长分裂， 并可以正常传代，细胞形态与增殖能力同冻存前无明显差异。

实施例3

检测不同血清浓度下细胞的生长情况

检测不同血清浓度下细胞的生长情况的具体方法如下：取第64代细胞，分别取2.0×10⁵个细胞分别接种于含3％、5％、8％FBS的M199培养基中，28℃下培养6天后用血 球计数板进行细胞计数，

表3

FBS浓度(％)	3	5	8
				细胞数目(个)	2.46×10<sup>6</sup>	2.47×10<sup>6</sup>	2.5×10<sup>6</sup>

结果表明：细胞在3％血清浓度M199培养基生长良好，细胞生长密度与8％血清浓度 相仿。细胞能在较低血清浓度下生长良好。细胞的血清低依赖性大大降低了血清使用成本。

实施例4

对草鱼出血病病毒II型的敏感性

草鱼出血病II型是目前市场主要流行株型，对草鱼的致病性较强、致死率高，尚没有针对性的高效疫苗。检测了草鱼出血病II型毒株GDZS-1505对PSF细胞和CiU细胞的敏 感程度：待细胞接种铺满25cm²细胞瓶底壁后，接种同样体积的病毒，1小时后，移去病 毒溶液，更换含3％胎牛血清的新鲜细胞培养液，继续培养，每天观察细胞病变。7天后 收获细胞冻融，荧光定量PCR方法测定病毒拷贝数。

表4

细胞种类	草鱼出血病病毒II型增殖拷贝数(拷贝/μL)
		PSF	6.3×10<sup>5</sup>±3.3×10<sup>3</sup>
CiU	8.1×10<sup>8</sup>±1.1×10<sup>6</sup>

结果表明：草鱼输尿管组织细胞对草鱼出血病病毒II型高敏感，病毒拷贝数是现有 草鱼生产用细胞PSF的1200多倍,因此可有效降低草鱼出血病病毒研究过程中的培养成本，可很好地应用于草鱼呼肠孤病毒II型的分离、繁殖及疫苗研制。

实施例5

对草鱼出血病活疫苗(GCHV-892株)的敏感性

草鱼出血病活疫苗(GCHV-892株)2010年获得了国家一类新兽药证书(2010新 兽药证字51号)，也是世界首个水生生物类病毒弱毒活疫苗。GCHV-892株生产用细胞系 为草鱼吻端组织细胞系PSF，PSF为成纤维样细胞，汇合度为80-90％的PSF细胞贴壁培养 2-3天后，细胞生长为长梭形，对病毒的敏感性下降。

分别将PSF细胞和CiU细胞培养至24孔板中，培养18h后接种GCHV-892。感染后显微镜下每天观察细胞病变情况。

检测草鱼出血病生产用毒株GCHV-892对PSF细胞和CiU细胞的敏感程度：待细胞接种 铺满25cm²细胞瓶底壁后，接种同样体积的病毒，1小时后，移去病毒溶液，更换含3％胎牛血清的新鲜细胞培养液，继续培养，每天观察细胞病变。5-7天后病变完全后，收取 病毒感染细胞的裂解液，冻融后TCID50法测定病毒含量。

表5

细胞种类	病毒滴度(lg TCID50/ml)	平均滴度
			PSF细胞	8.26、8.36、7.6	8.07
CiU细胞	8.72、8.75、8.85	8.77

实验结果以及图4表明：草鱼输尿管组织细胞对草鱼出血病生产用毒株GCHV-892比较敏感，平均病毒滴度比现有草鱼疫苗生产用细胞高0.7滴度，在日后投入疫苗生产 后，也可以有效降低生产成本，节约生产时间，提高经济效益。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种草鱼输尿管组织细胞系，其生物学名称为草鱼输尿管组织细胞系CiU，保藏号为：CCTCC NO:C201978。

2.权利要求1所述的一种草鱼输尿管组织细胞系在用于草鱼出血病病毒II型的增殖的用途。

3.权利要求1所述的一种草鱼输尿管组织细胞系在用于草鱼出血病病毒GCHV-892毒株增殖的用途。

4.一种制备如权利要求1所述草鱼输尿管组织细胞系的方法，其特征在于，所述制备方法包括一下步骤：

(1)草鱼输尿管组织处理：取健康草鱼进行消毒，取出输尿管组织用漂洗液反复冲洗后切碎，加入胰酶消化；

(2)原代培养：往上述经过胰酶消化处理后的细胞原液加入原代培养液进行原代培养；

(3)传代培养：原代培养细胞培养至50-70％汇合度时，加入胰酶消化，使用培养液吹下贴壁细胞，将细胞悬液接种于2个培养瓶，培养箱培养，以后每5-7天传代一次。

5.一种权利要求1所述草鱼输尿管组织细胞系的冻存保种方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)取处于对数生长期的细胞，经胰酶消化后获得单细胞悬液，离心，弃掉上清液；

(2)向细胞沉淀中加入细胞冻存液，重悬，转移入无菌冻存管中；

(3)将无菌冻存管放入程序降温盒中，冰箱过夜，隔天放入液氮中长期保存。

6.一种权利要求1所述草鱼输尿管组织细胞系的复苏方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将含有冷冻细胞的冻存管从液氮罐中取出，放入水浴锅中快速摇晃至融化；

(2)在无菌条件下将解冻细胞转移至离心管，并加入适量完全培养液，离心，去除上清液，收集细胞；

(3)用完全培养液重悬细胞，转移至细胞培养瓶中，28℃培养箱中培养。

7.一种如权利要求4所述的制备草鱼输尿管组织细胞系的方法，其特征在于，所述漂洗液包含基础培养基、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素和800μg/mL制霉菌素，pH值7.2-7.4，且该基础培养基为M199培养液。

8.一种如权利要求4所述的制备草鱼输尿管组织细胞系的方法，其特征在于，所述原代培养液包括M199培养基、20％胎牛血清、400IU/mL青霉素、400μg/mL链霉素，pH值7.2-7.4。

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