CN107201334A - 能悬浮培养的牛肾细胞及其悬浮培养方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了能悬浮培养的牛肾细胞及其悬浮培养方法与应用。本发明牛肾细胞MDBK悬浮培养方法省去了细胞消化、换液、频繁分种等大量人工操作，培养方法简便、快速，而且采用反应器培养实现了工艺自动化，不仅提高了单位体积的细胞产量，还解决了传统贴壁培养细胞批间存在差异的技术难题。本发明的牛肾细胞MDBK及其悬浮培养细胞可用于各类敏感病毒的培养、抗体蛋白生产、疫苗生产、产品外源病毒检验等领域。

Description

能悬浮培养的牛肾细胞及其悬浮培养方法与应用
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，特别是涉及可悬浮培养的牛肾细胞(MDBK)悬浮培养后在病毒培养及疫苗生产方面的应用。
背景技术
牛肾细胞(MDBK)传代细胞系来自公牛肾细胞，可用于病毒培养、原材料检验、营养代谢研究。MDBK通常可采用克氏瓶、转瓶甚至反应器载体培养，但实质均未改变，细胞均为贴壁培养工艺，贴壁培养工艺培养批量较小、批间差异大、生产效率低下、劳动强度大、占用场地多，细胞单位产量低，大规模生产工艺复杂。
牛病毒性腹泻/粘膜、牛传染性鼻气管炎、伪狂犬等病毒培养或疫苗生产通常采用MDBK贴壁细胞静置培养或转瓶培养的方法进行扩增，但存在贴壁培养工艺放大繁琐、培养批量较小、批间差异大、生产效率低下、劳动强度大、占用场地多等诸多问题，细胞单位产量低，大规模生产工艺复杂。CN104162154A中提出利用悬浮培养技术生产牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其使用经过驯化的MDBK细胞并未形成能够稳定传代的悬浮细胞株，由于细胞悬浮驯化存在不确定因素，并不是每次都能成功复制，在生产应用中存在较大困难。
发明内容
本发明的一个目的是提供可以悬浮培养的牛肾细胞。
本发明确定的能悬浮培养的牛肾细胞MDBK，具有以下特征：1)细胞直径：14-25μm；2)核型：2n＝60；3)可在不依赖附着物条件下纯悬浮培养；4)使用无血清或低血清培养基培养；或/和5)可使用生物反应器大规模培养。
具体的，能悬浮培养的牛肾细胞MDBK为能悬浮培养的牛肾细胞株MDBK-S CGMCCNo.11795。
本发明另一目的在于提供所述能悬浮培养的牛肾细胞MDBK的筛选方法，是将普通贴壁MDBK细胞经过适应低血清贴壁培养、低血清悬浮培养、无血清悬浮培养等过程，筛选获得能够悬浮培养的MDBK细胞株。
该筛选方法中，所述低血清贴壁培养是指：取长满单层的贴壁MDBK细胞，经0.25％(V/V)胰酶消化分散后加入含10％(V/V)新生牛血清的DMEM培养基与低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)的混合培养基，且混合培养基中低血清培养基混合比例按30％、50％、80％逐部增加，待细胞完全适应混合培养基培 养后再增加低血清培养基的含量，最终全部替代为低血清培养基，至细胞生长稳定可连续传代；
所述低血清悬浮培养是指：经低血清贴壁培养驯化好的贴壁MDBK细胞，经0.25％(V/V)胰酶消化分散后加入低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)，稀释细胞至0.5×106细胞/mL，加入三角瓶在37℃恒温摇床100-110rpm培养，富集直至细胞稳定培养；用低血清培养基重悬沉淀细胞并将细胞浓度调节至0.5×106细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养72h至细胞密度达到1.0×106细胞/mL至可稳定传代，得到初步悬浮MDBK细胞；
所述无血清悬浮培养是指：取初步悬浮MDBK细胞，100rpm离心5分钟，弃去上清，加入混合培养基重悬细胞；混合培养基为低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)与无血清CD培养基的混合物，无血清CD培养基含量为30％，连续培养待细胞可稳定培养后增加混合培养基中无血清CD培养基的含量至50％，连续培养待细胞培养稳定后以无血清CD培养基全部替代低血清培养基，至细胞稳定连续传代；取适应无血清CD培养基培养的悬浮MDBK细胞，将细胞液通过70μm细胞过滤器截留细胞团块，将滤过液100rpm离心5分钟，弃上清，用新鲜CD培养基重悬细胞，调节细胞密度至0.5×106细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养，重复述步骤直至细胞结团有所减轻，更换为40μm细胞过滤器，重复上述步骤，经过连续处理细胞结团逐步减轻，得到分散良好细胞为筛选获得的能够悬浮培养的MDBK细胞株。
本发明还一目的在于提供一种牛肾细胞MDBK的悬浮培养方法，是用牛肾细胞专用悬浮培养基将所述牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后接种至反应器中，加入所述牛肾细胞专用悬浮培养基，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养48-72小时至反应器内的牛肾细胞MDBK密度达到1.0×106-4.0×106细胞/mL。
所述的悬浮培养方法中，所述牛肾细胞专用悬浮培养基为含1％-5％(体积百分比V/V)新生牛血清的CD培养基(低血清培养基)或CD培养基(无血清培养基)；优选牛肾细胞专用悬浮培养基配方为：含CD培养基粉末15-20g/L，碳酸氢钠2-3g/L，pH值7.0-7.2的水溶液；优选CD培养基粉末17.7g/L，使用注射用水溶解后加入碳酸氢钠2.32g/L，调节pH值至7.0-7.2。
具体的，所述悬浮培养方法涉及获得所述牛肾细胞MDBK种细胞悬液，包括以下步骤：
(1)牛肾细胞MDBK的复苏
从液氮中取出一支冻存的权利要求1所述牛肾细胞MDBK或权利要求2所述牛肾 细胞MDBK-S CGMCC No.11795，至37℃-40℃水浴中快速融化，1000rpm离心5min，弃上清液，加入所述牛肾细胞专用悬浮培养基重悬细胞，转至三角摇瓶中，补加培养基，调节细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，置于摇床中37℃、100rpm悬浮培养；
(2)牛肾细胞MDBK的传代
细胞培养48-72h后取样计数，若细胞密度≥1.0×106细胞/mL时进行细胞传代，否则继续培养，取能够传代的牛肾细胞MDBK，转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清液(原培养基)，加入新的牛肾细胞专用悬浮培养基重悬细胞，转至三角摇瓶中，补加牛肾细胞专用悬浮培养基，调节细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，置于摇床中37℃、100rpm悬浮培养1-3代，得到牛肾细胞MDBK种细胞悬液。
以上所述悬浮培养方法中，反应器的容积为5L、50L、300L、500L、1000L、或5000L。
牛肾细胞MDBK种细胞在反应器中可采用流加培养、批培养或灌注培养等方式进行悬浮培养：
所述流加培养方法为：先用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后将经稀释的牛肾细胞种细胞悬液按反应器容积的20％-40％加入反应器中，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养，待细胞密度达到≥0.8×106细胞/mL时，开始流加牛肾细胞专用悬浮培养基，流加速度为反应器容积的15％-20％/天，待培养体积达到反应器容积时停止；
所述批培养方法为：先用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后将经稀释的牛肾细胞种细胞悬液按反应器容积的20％-40％加入反应器中，再加入牛肾细胞专用悬浮培养基至反应器容积，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养，待细胞密度≥1.0×106细胞/mL可停止；
所述灌注培养方法为：先用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后将经稀释的牛肾细胞种细胞悬液加满反应器中，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养，待细胞密度达到≥0.8×106细胞/mL时，灌注牛肾细胞专用悬浮培养基，灌注速度为30％-50％/天，废液经细胞截留装置排出，待细胞密度≥2.0×106细胞/mL时停止。
本发明提供的所述牛肾细胞MDBK或牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795及其悬浮培养细胞在各类敏感病毒培养、抗体蛋白生产、疫苗生产、产品外源病毒检验中的应 用也属于本发明。
本发明以上提供了能悬浮培养的牛肾细胞MDBK及利用筛选得到的细胞株进行悬浮培养的方法，其核心是用生物反应器和流加培养、批培养或灌注培养等方式对牛肾细胞(包括但不限于MDBK-S CGMCC No.11795)进行大规模纯悬浮培养，通过调节培养参数可使细胞大量繁殖，可使牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795密度最高可达4×106细胞/mL，培养体积可达1000L，牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795可不依赖附着物，在纯悬浮状态下快速增值、繁殖，实现了牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795的规模化生产。本发明牛肾细胞的悬浮培养方法省去了细胞消化、换液、频繁分种等大量人工操作，培养方法简便、快速，而且采用反应器培养实现了工艺自动化，不仅提高了单位体积的细胞产量，还解决了传统贴壁培养细胞批间存在差异的技术难题。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施方式
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明所公开的内容不限于下述实施例。
为克服牛肾细胞贴壁培养的不足，实现牛肾细胞的大规模悬浮培养，本发明的发明人长期致力于牛肾细胞的驯化研究，终于获得了一株可以悬浮培养的牛肾细胞。
发明人通过对贴壁MDBK细胞进行悬浮培养筛选、克隆等多种方法，成功获得了一株可以纯悬浮培养的MDBK细胞，并利用该细胞通过悬浮培养工艺生产MDBK细胞。本发明利用生物反应器大规模悬浮培养MDBK细胞并将其应用于大规模病毒培养和疫苗生产中，该大规模培养可用100L、300L、1000L反应器按比例将培养体积逐渐放大进行扩大培养。
实施例1、悬浮牛肾细胞株(悬浮MDBK细胞株)的获得及保藏
本发明中的悬浮MDBK细胞株是将普通贴壁MDBK细胞经过适应低血清贴壁培养、低血清悬浮培养、无血清悬浮培养等程序，筛选获得的一株能够悬浮培养的MDBK细胞株。
具体筛选过程如下：
1.贴壁MDBK细胞培养
通常贴壁MDBK细胞采用市售DMEM培养基(购自：GIBCO)，添加10％(体积百分比，V/V)新生牛血清(购自：金源康生物工程有限公司)37℃静置培养，待细胞长满单层后，用0.25％(V/V)胰酶消化分散，按1:3至1:5的比例稀释分种传代，扩大培养。
2.低血清贴壁培养
取长满单层的贴壁MDBK细胞，经0.25％(V/V)胰酶消化分散后加入(含10％(V/V)新生牛血清)DMEM与低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基，以下同)的混合培养基，低血清培养基混合比例按30％、50％、80％逐部增加，待细胞完全适应混合培养基培养后再增加低血清培养基的含量，最终全部替代为低血清培养基，细胞生长稳定可连续传代。
3.低血清悬浮培养
3.1.细胞悬液制备：取经低血清培养驯化好的贴壁MDBK细胞，经0.25％(V/V)胰酶消化分散后加入低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)，稀释细胞至0.5×106细胞/mL备用。
3.2.悬浮培养适应：将稀释好的细胞悬液加入125mL三角瓶中，培养体积50mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养。72h取样计数，细胞结团较多时可离心弃上清后加入等体积胰酶消化分散细胞后计数。
3.3.悬浮细胞富集：细胞培养初期无法生长，大量结团，生长缓慢。将细胞悬液沉降约1分钟，弃去沉淀团块，取细胞上清液100rpm离心5分钟，取沉淀。用低血清培养基将细胞沉淀稀释为0.5×106细胞/mL，细胞少时可将多瓶细胞悬液经上述步骤处理后混为一瓶，不足体积补加经上述3.1步制备的低血清贴壁MDBK细胞悬液，补足至50mL。至37℃恒温摇床100-110rpm培养。细胞培养72h后取样计数，若游离细胞密度≥1.0×106细胞/mL，则进行悬浮细胞传代，否则离心换液继续进行悬浮细胞富集工作。细胞需长期富集，直至细胞可稳定培养。
3.4.悬浮细胞传代：取悬浮细胞，100rpm离心5分钟，弃去上清，用低血清培养基重悬沉淀细胞并将细胞浓度调节至0.5×106细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养72h。若该悬浮细胞生长不稳定，72h细胞密度未能达到1.0×106细胞/mL，则重复步骤3.3和3.4，直到细胞可稳定传代。若该悬浮细胞可稳定连续传代，说明细胞已适应低血清悬浮培养方式，即初步得到了悬浮MDBK株，得到的细胞即为悬浮MDBK细胞。
4.悬浮MDBK细胞适应无血清培养
取初步适应低血清悬浮培养的悬浮MDBK细胞，100rpm离心5分钟，弃去上清， 加入混合培养基重悬细胞。混合培养基为低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)与无血清CD培养基(GIBCO市售产品，货号：1688240)的混合物，无血清CD培养基含量为30％，连续培养。待细胞可稳定培养后增加混合培养基中无血清CD培养基的含量至50％，连续培养。待细胞培养稳定后最终全部替代为无血清培养基，使细胞稳定连续传代。
5.悬浮MDBK细胞优化筛选
取适应无血清CD培养基培养的悬浮MDBK细胞，将细胞液通过70μm细胞过滤器截留细胞团块，将滤过液100rpm离心5分钟，弃上清，用新鲜CD培养基重悬细胞，调节细胞密度至0.5×106细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养。重复上述步骤直至细胞结团有所减轻。更换为40μm细胞过滤器，重复上述步骤，经过连续处理细胞结团逐步减轻，分散良好。
用上述方法获得的能够悬浮培养的MDBK细胞株，这些能悬浮培养的MDBK细胞株均属于本发明所公开的内容。
将其中一株命名为牛肾细胞MDBK-S，该细胞株已于2015年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.11795。
经鉴定，以上方法获得的能悬浮培养的MDBK细胞的特征如下：
1)细胞直径：14-25μm；
2)核型：2n＝60；
3)该细胞可在不依赖附着物条件下纯悬浮培养；
4)该细胞使用无血清或低血清培养基培养；
5)该细胞可使用生物反应器大规模培养。
实施例1获得的能悬浮培养的MDBK细胞株以及保藏的牛肾细胞株MDBK-S CGMCCNo.11795可用于牛肾细胞MDBK的悬浮培养生产。培养中可利用三角摇瓶、搅拌瓶或生物反应器，通过流加培养、批培养或灌注培养的方式，采用牛肾细胞专用悬浮培养基(低血清或无血清培养基)批量悬浮培养牛肾细胞MDBK，使最终悬浮细胞培养密度大于1.0×106细胞/mL，培养体积可达1000L以上。
所述牛肾细胞专用悬浮培养基为含1％-5％(体积百分比V/V)新生牛血清的CD培养基(低血清培养基)或CD培养基(无血清培养基)。
优选的牛肾细胞专用悬浮培养基配方：含CD培养基粉末15-20g/L，碳酸氢钠2-3g/L，pH值7.0-7.2的水溶液。
最优化配方：CD培养基(GIBCO市售产品，货号：1688240)粉末17.7g/L，使用注 射用水溶解后加入碳酸氢钠2.32g/L，调节pH值至7.0-7.2。实施例中使用该优化牛肾细胞专用悬浮培养基配方。
以下实施例详述牛肾细胞MDBK的悬浮培养/生产方法。
实施例2、牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795种细胞悬液的获得
牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795种细胞悬液的获得方法，包括以下步骤：
1)牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795的复苏
从液氮中取出一支冻存的悬浮牛肾细胞株MDBK-S CGMCC No.11795，至37℃-40℃水浴中快速融化，1000rpm离心5min，弃上清液，加入上述牛肾细胞专用悬浮培养基重悬细胞，转至三角摇瓶中，补加牛肾细胞专用悬浮培养基，调节细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，置于摇床中37℃、100rpm悬浮培养。
2)牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795的传代
步骤1)细胞培养48-72h后取样计数，若细胞密度≥1.0×106细胞/mL时进行细胞传代，否则继续培养，取能够传代的牛肾悬浮细胞，转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清液(原牛肾细胞专用悬浮培养基)，加入新的牛肾细胞专用悬浮培养基重悬细胞，转至三角摇瓶中，补加牛肾细胞专用悬浮培养基，调节细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，置于摇床中37℃、100rpm悬浮培养1-3代，得到牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795种细胞悬液。
实施例3、反应器流加培养牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795
牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795的流加培养，包括以下各级以及逐级放大培养：
1)5L反应器中的流加培养
先用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795的种细胞悬液(实施例2制备得到)稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后取经稀释的细胞悬液1000-2000mL(根据反应器情况定)转移至5L反应器中，设定细胞培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm，待细胞密度达到0.8×106细胞/mL时(判断细胞生长旺盛)，开始流加牛肾细胞专用悬浮培养基，流加速度为1000mL/天，待培养体积达到5L时停止流加，取出即得到5L生产规模的牛肾悬浮细胞(根据生产规模可将其转移至下一级反应器中继续进行扩大培养)。
2)50L反应器中的流加培养
取经三台5L反应器培养的牛肾悬浮细胞的细胞液15L，转入50L反应器中，设定细胞培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm，开始流加牛肾细胞专用悬浮培养基，流加速度为8L/天，待培养体积达到50L时停止流加，取出即得到50L生产规模的牛肾悬浮细胞(根据生产规模可将其转移至下一级反应器中继续进行扩大培养)。
3)300L反应器中的流加培养
取经两台50L反应器培养的牛肾悬浮细胞的细胞液100L，转入300L反应器中，设定细胞培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm，开始流加牛肾细胞专用悬浮培养基，流加速度为50L/天，待培养体积达到300L时停止流加，取出即得到300L生产规模的牛肾悬浮细胞(根据生产规模可将其转移至下一级反应器中继续进行扩大培养)。
4)1000L反应器中的流加培养
取经300L反应器培养的牛肾悬浮细胞的细胞液300L，转入1000L反应器中，设定细胞培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm，开始流加牛肾细胞专用悬浮培养基，流加速度为150L/天，待培养体积达到1000L时停止流加，取出即得到1000L生产规模的牛肾悬浮细胞(根据生产规模还可将其转移至下一级反应器中继续进行扩大培养)。
经鉴定，本实施例用各容积的反应器流加培养牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795，密度可达1-2×106细胞/mL。生产规模可逐级扩大，扩大至1000L反应器仍可获得稳定的MDBK悬浮细胞。
实施例4、反应器批培养牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795
牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795的批培养，包括以下各级以及逐级放大培养：
1)5L反应器中的批培养
先用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795的种细胞悬液(实施例2制备得到)稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后取经稀释的种细胞悬液5L转移至5L反应器中，设定细胞培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm，待细胞密度≥1.0×106细胞/mL时，取出即得到5L生产规模的牛肾悬浮细胞(根据生产规模可将其转移至下一级反应器中继续进行扩大培养)。
2)50L反应器中的批培养
取经5L反应器培养好的细胞悬液，用牛肾细胞专用悬浮培养基稀释细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，将稀释好的种细胞悬液50L转移至50L反应器中，设定细胞培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm， 待细胞密度≥1.0×106细胞/mL时，取出即得到50L生产规模的牛肾悬浮细胞(根据生产规模可将其转移至下一级反应器中继续进行扩大培养)。
3)300L反应器中的批培养
取经50L反应器培养好的细胞悬液，用牛肾细胞专用悬浮培养基稀释细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，将稀释好的种细胞悬液300L转移至300L反应器中，设定细胞培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm，待细胞密度≥1.0×106细胞/mL时，取出即得到300L生产规模的牛肾悬浮细胞(根据生产规模可将其转移至下一级反应器中继续进行扩大培养)。
3)1000L反应器中的批培养
取经300L反应器培养好的细胞悬液，用牛肾细胞专用悬浮培养基稀释细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，将稀释好的种细胞悬液1000L转移至1000L反应器中，设定细胞培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm，待细胞密度≥1.0×106细胞/mL时，取出即得到1000L生产规模的牛肾悬浮细胞(根据生产规模可将其转移至下一级反应器中继续进行扩大培养)。
经鉴定，本实施例用各级反应器批培养牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795，密度可达1-2×106细胞/mL，生产规模可逐级扩大，扩大至1000L反应器仍可获得稳定的MDBK悬浮细胞。
实施例5、反应器灌注培养牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795
牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795的灌注培养，包括以下各级以及逐级放大培养：
1)5L反应器中的灌注培养
先用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795的种细胞悬液(实施例2制备得到)稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后取经稀释的种细胞悬液5L转移至5L反应器中，设定细胞培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm，待细胞密度达到0.8×106细胞/mL时时，开始灌注牛肾细胞专用悬浮培养基，灌注速度为1.5L/天，废液经旋转滤器或ATF系统(ATF细胞截留系统，购自Refinetechnology公司)或其它细胞截留装置排出，待细胞密度≥2.0×106细胞/mL时可转移至下一级反应器中继续进行扩大培养。
2)50L反应器中的灌注培养
取经5L反应器培养好的细胞悬液，用牛肾细胞专用悬浮培养基稀释细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，将稀释好的种细胞悬液50L转移至50L反应器中，设定细胞培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm， 待细胞密度达到0.8×106细胞/mL时，开始灌注牛肾细胞专用悬浮培养基，灌注速度为15L/天，废液经旋转滤器、ATF系统或其它细胞截留装置排出，待细胞密度
≥2.0×106细胞/mL时，取出即得到50L生产规模的牛肾悬浮细胞(根据生产规模可将其转移至下一级反应器中继续进行扩大培养)。
3)300L反应器中的灌注培养
取经50L反应器培养好的细胞悬液，用牛肾细胞专用悬浮培养基稀释细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，将稀释好的种细胞悬液300L转移至300L反应器中，设定细胞培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm，待细胞密度达到0.8×106细胞/mL时，开始灌注牛肾细胞专用悬浮培养基，灌注速度为150L/天，废液经旋转滤器、ATF系统或其它细胞截留装置排出，待细胞密度≥2.0×106细胞/mL时，取出即得到500L生产规模的牛肾悬浮细胞(根据生产规模可将其转移至下一级反应器中继续进行扩大培养)。
4)1000L反应器中的灌注培养
取经300L反应器培养好的细胞悬液，用牛肾细胞专用悬浮培养基稀释细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，将稀释好的种细胞悬液1000L转移至1000L反应器中，设定细胞培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm，待细胞密度达到0.8×106细胞/mL时，开始灌注牛肾细胞专用悬浮培养基，灌注速度为300L/天，废液经旋转滤器、ATF系统或其它细胞截留装置排出，待细胞密度达2-4×106细胞/mL时，取出即得到1000L生产规模的牛肾悬浮细胞(根据生产规模还可将其转移至下一级反应器中继续进行扩大培养)。
经鉴定，本实施例用各级反应器灌注培养牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795，密度可达2-4×106细胞/mL，生产规模可逐级扩大，扩大至1000L反应器仍可获得稳定的MDBK悬浮细胞。
MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞的应用
本发明的MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞可用于各类敏感病毒(例如：猪瘟病毒、伪狂犬病毒、牛病毒性腹泻/粘膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、羊口疮病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感3型病毒、边界病病毒、口蹄疫病毒、马腺病毒、马流感病毒、牛慢病毒、群阿卡斑病毒、牛细小病毒等)培养、抗体蛋白生产、疫苗生产、产品外源病毒检验等。以下实施例将做具体说明。
实施例6、伪狂犬病毒悬浮培养的方法及疫苗制备
1.病毒培养
本实施例中伪狂犬病病毒为Bartha-K61(弱毒株)或闽A株等(来源：中国兽医 微生物菌种保藏管理中心)。也可使用其它伪狂犬病毒毒株，本发明不做限制。
1.1.种毒培养与制备
取生长良好的MDBK贴壁细胞，待细胞长满单层后弃去原培养液，更换含有1％(体积比)伪狂犬病毒(贴壁种毒或悬浮种毒，种毒分为弱毒株和强毒株)的维持液(维持液配方：市售DMEM培养基，调节pH至7.0)，37℃培养，待细胞CPE达到75％以上时，收获病毒液作为种毒，-20℃保存备用。
1.2.悬浮毒液制备
取经反应器培养的MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞(细胞密度≥2.0×106细胞/mL)，弃去原培养液，加入维持液(无血清或含0.5-2％血清的低血清SFM培养基)恢复至原体积，按体积比加入1％种毒(贴壁种毒或悬浮种毒，种毒分为弱毒株和强毒株)，设定病毒培养条件：温度36-37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值6.8-7.2转速40-60rpm。
反应器培养72h-96h，培养过程定期取样计数观察，待细胞活力低于30％时，停止培养，收获病毒液至-20℃保存。收获的弱毒液可用作下一级培养悬浮种毒或生产弱毒疫苗、灭活疫苗抗原，收获的强毒毒液可用作下一级培养悬浮种毒或生产灭活疫苗抗原或疫苗效力检验攻毒使用。
2.疫苗制备
2.1.弱毒活疫苗制备
取反应器悬浮培养的伪狂犬病毒弱毒液(接种Bartha株的毒液)，按体积比1：1-2加入蔗糖牛奶保护剂(或耐热保护剂)，经真空冷冻干燥，制成伪狂犬弱毒活疫苗。
2.2.灭活疫苗制备
2.2.1.毒液灭活
取悬浮培养的伪狂犬病病毒液，经离心或过滤去除细胞碎片，按体积加入0.025％的β-丙内酯灭活剂(或二乙烯亚胺、甲醛)4℃灭活24小时，升温至37℃保持2小时，灭活结束。将灭活后毒液至4℃保存备用。
2.2.2.配苗
取经灭活后的伪狂犬病毒液，按体积比46:54加入佐剂(如206佐剂)，充分混合后，制成伪狂犬灭活疫苗。
本例中反应器为三角摇瓶、搅拌瓶或5L、100L、300L、500L、1000L甚至5000L等不同容积生物反应器，可视生产规模选择。
3.悬浮毒液和疫苗检测
按《中华人民共和国兽药典》进行细胞半数感染量(TCID50)检测，利用MDBK-SCGMCC No.11795悬浮细胞培养的伪狂犬病毒半数细胞感染量可达到108.5TCID50/mL，达到并优于规程标准104.5TCID50/0.1mL水平。利用悬浮培养伪狂犬病毒毒液制备的疫苗均达到《中华人民共和国兽药典》要求。
4.方法比较
将本发明培养伪狂犬病毒工艺与常规贴壁培养和载体悬浮培养进行比较，如表1所示：
表1：培养伪狂犬病毒工艺比较
表1的比较内容表明：利用MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞培养伪狂犬病毒，可以使用大容积生物反应器，能达到5000L，培养时间72-96h，一次收获抗原量可制备成品疫苗5000万头份以上。相比传统贴壁培养能够节省大量劳动力，减少人为操作误差因而能降低批间差异。较载体培养不需要微载体投入，也不需要消化放大，节约了成本，简化了工艺。另外，病毒半数细胞感染量(TCID50)高于其他方法10倍以上，生产效能大大提高。可见，本发明的优势在于可利用反应器大规模悬浮培养，生产放大工艺简单，批间差较小，劳动强度小，占地空间少，可大大提高生产效率。
实施例7、羊接触传染性脓疱性皮炎病毒培养方法及疫苗制备
1.病毒培养
本实施例中羊接触传染性脓疱性皮炎病毒(Orf virus)，又名羊接触传染性臁疮病毒，羊口疮病毒，羊接触传染性脓疱性口炎病毒(来源：美国菌种保藏中心)。也可使用其它羊接触传染性脓疱性皮炎病毒毒株，本发明不做限制。
1.1.种毒培养与制备
取生长良好的MDBK贴壁细胞，待细胞长满单层后弃去原培养液，更换含有1-2％(体积比)羊接触传染性脓疱性皮炎病毒(贴壁种毒或悬浮种毒，种毒分为弱毒株和 强毒株)的维持液(维持液配方：市售DMEM培养基)，37℃培养，待细胞CPE达到85％以上时，收获病毒液，-70℃保存备用。
1.2.悬浮毒液制备
取经反应器培养的MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞(细胞密度≥2.0×106细胞/mL)，采用自然沉降或离心方式弃去原培养液，加入维持液(无血清或含0.5-2％新生牛血清的低血清SFM培养基)恢复至原体积，按体积比加入1-2％种毒(贴壁种毒或悬浮种毒，种毒分为弱毒株和强毒株)，设定病毒培养条件：温度36-37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.4±0.1、转速40-60rpm。
反应器培养48h-72h，培养过程定期取样计数观察，待细胞活力低于15％时，停止培养，收获病毒液至-20℃保存。收获的弱毒液可用作下一级培养悬浮种毒或生产弱毒疫苗、灭活疫苗抗原，收获的强毒毒液可用作下一级培养悬浮种毒或生产灭活疫苗抗原或疫苗效力检验攻毒使用。
2.疫苗制备
2.1.灭活疫苗制备
2.1.1.毒液灭活
取悬浮培养的羊接触传染性脓疱性皮炎病毒液，经离心或过滤去除细胞碎片，加入0.025％的β-丙内酯(或二乙烯亚胺、甲醛)2-8℃灭活24小时，升温至37℃保持2小时，灭活结束后将毒液至-20℃保存备用。
2.1.2.配苗
取经灭活后的羊接触传染性脓疱性皮炎病毒液，按体积比46:54加入206佐剂(SEPPIC)，充分混合后，制成羊接触传染性脓疱性皮炎灭活疫苗。
2.2.弱毒活疫苗制备
取反应器培养的羊接触传染性脓疱性皮炎病毒(自然或人工至弱毒株)弱毒液，按比例1：1-2(体积比)加入蔗糖牛奶保护剂(或耐热冻干保护剂)，经真空冷冻干燥，制成羊接触传染性脓疱性皮炎病活疫苗。
本例中反应器为三角摇瓶、搅拌瓶或5L、100L、300L、500L、1000L甚至5000L等不同体积生物反应器，可视生产规模选择。
3.悬浮毒液和疫苗检测
按《中华人民共和国兽药典》经细胞半数感染量(TCID50)检测，利用MDBK-S CGMCCNo.11795悬浮细胞培养的羊接触传染性脓疱性皮炎病毒半数细胞感染量可达到108.5TCID50/mL，毒价与贴壁培养持平。利用悬浮培养羊接触传染性脓疱性皮炎病毒毒液制备的疫苗均达到《中华人民共和国兽药典》要求。
4.方法比较
将本发明培养羊接触传染性脓疱性皮炎病毒工艺与常规贴壁培养和载体悬浮培养进行比较，如表2所示：
表2：培养羊接触传染性脓疱性皮炎病毒工艺比较
表2的比较内容表明：利用MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞培养羊接触传染性脓疱性皮炎病毒，可以使用大容积生物反应器(能达到5000L)，培养时间48h-72h，一次收获抗原量可制备成品疫苗百万头份以上。相比传统贴壁培养能够节省大量劳动力，减少人为操作误差，降低批间差异。较载体培养不需要微载体投入，也不需要消化放大，节约了成本简化了工艺。可见，本发明的优势在于可利用反应器大规模悬浮培养，生产放大工艺简单，批间差较小，劳动强度小，占地空间少，可大大提高生产效率。
实施例8、牛病毒性腹泻/粘膜病毒悬浮培养的方法及疫苗制备
1.病毒培养
本实施例中牛病毒性腹泻/粘膜病毒为NADL株或Oregon C24V株等，(来源：中国兽医微生物菌种保藏管理中心)。也可使用其它牛病毒性腹泻/粘膜病毒毒株，本发明不做限制。
1.1.种毒培养与制备
取生长良好的MDBK贴壁细胞，待细胞长满单层后弃去原培养液，更换含有10％(体积比)牛病毒性腹泻/粘膜病毒(贴壁种毒或悬浮种毒，种毒分为弱毒株和强毒株)的维持液(维持液配方：市售DMEM培养基)，37℃培养，待细胞CPE达到75％以上时，收获病毒液，-20℃保存备用。
1.2.悬浮毒液制备
取经反应器培养的MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞,细胞密度≥1.0×106细胞/时，弃去原培养液，加入维持液(无血清或含0.5-2％血清低血清SFM培养基)恢复至 原体积，制备毒液时按体积比加入0.1％种毒(贴壁种毒或悬浮种毒，种毒分为弱毒株和强毒株，根据毒株的不同加入量可增加至1-10％)，设定病毒培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.2-7.4、转速40-60rpm。
生物反应器培养72h-96h，培养过程定期取样计数观察，待细胞活力低于30％时，停止培养，收获弱毒液或病毒液至-20℃保存。收获的弱毒液可用作下一级培养悬浮种毒或生产弱毒疫苗、灭活疫苗抗原，收获的强毒毒液可用作下一级培养悬浮种毒或生产灭活疫苗抗原或疫苗效力检验攻毒使用。
2.疫苗制备
2.1.弱毒活疫苗制备
取反应器培养的牛病毒性腹泻/粘膜病弱毒液，按1：1-2(体积比)加入蔗糖牛奶保护剂(或耐热保护剂)，经真空冷冻干燥，制成牛病毒性腹泻/粘膜病弱毒活疫苗。
2.2.灭活疫苗制备
2.2.1.毒液灭活
取悬浮培养的牛病毒性腹泻/粘膜病毒液，经离心或过滤去除细胞碎片，加入0.025％的灭活剂β-丙内酯(或二乙烯亚胺、甲醛)4℃灭活24小时，升温至37℃保持2小时，将灭活后毒液至4℃保存备用。
2.2.2.配苗
取经灭活后的牛病毒性腹泻/粘膜病毒液与206佐剂(SEPPIC)按46:54(体积比)的比例充分混合，制成牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗。
本例中反应器为三角摇瓶、搅拌瓶或5L、100L、300L、500L、1000L甚至5000L等不同体积生物反应器，可视生产规模选择。
3.悬浮毒液和疫苗检测
按《中华人民共和国兽药典》经细胞半数感染量(TCID50)检测，利用MDBK-S CGMCCNo.11795悬浮细胞培养的牛病毒性腹泻/粘膜病毒半数细胞感染量可达到107.5TCID50/mL，毒价略高于贴壁培养。利用悬浮培养牛病毒性腹泻/粘膜病毒毒液制备的疫苗均达到《中华人民共和国兽药典》要求。
4.方法比较
将本发明培养牛病毒性腹泻/粘膜病毒工艺与常规贴壁培养和载体悬浮培养进行比较，如表3所示：
表3：牛病毒性腹泻/粘膜病毒工艺比较
表3的比较内容表明：利用MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞培养牛病毒性腹泻/粘膜病毒，可以使用大容积生物反应器(能达到5000L)，培养时间72h-96h，一次收获抗原量可制备成品疫苗百万头份以上。相比传统贴壁培养能够节省大量劳动力，减少人为操作误差，降低批间差异。较载体培养不需要微载体投入，也不需要消化放大，节约了成本简化了工艺。较CN104162154A悬浮培养生产牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其使用贴壁驯化的MDBK细胞并未形成能够稳定传代的悬浮细胞株，由于细胞悬浮驯化耗时较长，细胞病毒敏感性存在差异，不确定因素多，并不是每次都能成功复制，在生产应用中存在较大困难。本发明是利用可稳定悬浮培养的牛肾细胞(MDBK-S CGMCC No.11795)，细胞从液氮中复苏后直接悬浮培养，省去了细胞重复驯化工作，冻存形成的细胞批对病毒敏感性稳定，工艺可靠性强，应用更为方便可靠。可见，本发明的优势在于可利用反应器大规模悬浮培养，生产放大工艺简单，批间差较小，劳动强度小，占地空间少，可大大提高生产效率。
实施例9、牛传染性鼻气管炎病毒悬浮培养的方法及疫苗制备
1.病毒培养
本实施例中牛传染性鼻气管炎病毒(来源：中国兽医微生物菌种保藏管理中心)。也可使用其它牛传染性鼻气管炎病毒毒株，本发明不做限制。
1.1.种毒培养与制备
取生长良好的MDBK贴壁细胞，待细胞长满单层后弃去原培养液，更换含有10％(体积比)牛传染性鼻气管炎病毒的维持液(维持液配方：市售DMEM培养基)，37℃培 养，待细胞CPE达到75％以上时，收获病毒液，-20℃保存备用。
1.2.悬浮毒液制备
取经反应器培养的MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞(细胞密度≥1.0×106细胞/mL)，弃去原培养液，加入维持液(无血清或含0.5-2％血清的低血清SFM培养基)恢复至原体积，按体积比加入0.1-1％种毒(贴壁种毒或悬浮种毒)，设定病毒培养条件：温度36-37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.2-7.4、转速40-60rpm。
生物反应器培养48h-72h，培养过程定期取样计数观察，待细胞活力低于20％时，停止培养，收获病毒液至-20℃保存。收获的毒液可用作下一级培养悬浮种毒或生产疫苗抗原或疫苗效力检验攻毒使用。
2.疫苗制备
2.1.灭活疫苗制备
2.1.1.毒液灭活
取悬浮培养的牛传染性鼻气管炎病毒液，经离心或过滤去除细胞碎片，加入0.025％(体积比)的β-丙内酯灭活剂(或二乙烯亚胺、甲醛)4℃灭活24小时，升温至37℃保持2小时，灭活结束后将灭活后毒液至4℃保存备用。
2.1.2.配苗
取经灭活后的牛传染性鼻气管炎病毒液，按体积比46:54加入206佐剂(SEPPIC)，充分混合后，制成牛传染性鼻气管炎病毒灭活疫苗。
本例中反应器为三角摇瓶、搅拌瓶或5L、100L、300L、500L、1000L甚至5000L等不同体积生物反应器，可视生产规模选择。
3.悬浮毒液和疫苗检测
按《中华人民共和国兽药典》经细胞半数感染量(TCID50)检测，利用MDBK-S CGMCCNo.11795悬浮细胞培养的牛传染性鼻气管炎病毒半数细胞感染量可达到108.5TCID50/mL，毒价高于贴壁培养。利用悬浮培养牛传染性鼻气管炎病毒毒液制备的疫苗均达到《中华人民共和国兽药典》要求。
4.方法比较
将本发明培养牛传染性鼻气管炎病毒工艺与常规贴壁培养和载体悬浮培养进行比较，如表4所示：
表4：牛传染性鼻气管炎病毒工艺比较
表4的比较内容表明：利用MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞培养牛传染性鼻气管炎病毒，可以使用大容积生物反应器(能达到5000L)，培养时间48h-72h，一次收获抗原量可制备成品疫苗百万头份以上。相比传统贴壁培养能够节省大量劳动力，减少人为操作误差，降低批间差异。较载体培养不需要微载体投入，也不需要消化放大，节约了成本简化了工艺。较CN104162154A悬浮培养生产牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其使用贴壁驯化的MDBK细胞并未形成能够稳定传代的悬浮细胞株，由于细胞悬浮驯化耗时较长，细胞病毒敏感性存在差异，不确定因素多，并不是每次都能成功复制，在生产应用中存在较大困难。本发明是利用可稳定悬浮培养的牛肾细胞(MDBK-S CGMCC No.11795)，细胞从液氮中复苏后直接悬浮培养，省去了细胞重复驯化工作，冻存形成的细胞批对病毒敏感性稳定，工艺可靠性强，应用更为方便可靠。可见，本发明的优势在于可利用反应器大规模悬浮培养，生产放大工艺简单，批间差较小，劳动强度小，占地空间少，可大大提高生产效率。
实施例10、牛呼吸道合胞体病毒悬浮培养的方法及疫苗制备
1.病毒培养
本实施例中牛呼吸道合胞体病毒(来源：美国菌种保藏中心)。也可使用其它牛呼吸道合胞体病毒毒株，本发明不做限制。
1.1.种毒培养与制备
取生长良好的MDBK贴壁细胞，待细胞长满单层后弃去原培养液，更换含有10％(体积比)牛呼吸道合胞体病毒(贴壁种毒或悬浮种毒，种毒分为弱毒株和强毒株)的维 持液(维持液配方：市售DMEM培养基)，37℃培养，待细胞CPE达到75％以上时，收获病毒液，-20℃保存备用。
1.2.悬浮毒液制备
取经反应器培养的MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞(细胞密度≥2.0×106细胞/mL)，弃去原培养液，加入维持液(无血清或含0.5-2％血清的低血清SFM培养基)恢复至原体积，按体积比加入1-5％种毒(贴壁种毒或悬浮种毒，种毒分为弱毒株和强毒株)，设定病毒培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.2-7.4、转速40-60rpm。
生物反应器培养56h-72h，培养过程定期取样计数观察，待细胞活力低于15％时，停止培养，收获病毒液至-20℃保存。收获的弱毒液可用作下一级培养悬浮种毒或生产弱毒疫苗、灭活疫苗抗原，收获的强毒毒液可用作下一级培养悬浮种毒或生产灭活疫苗抗原或疫苗效力检验攻毒使用。
2.疫苗制备
2.1.弱毒活疫苗制备
取反应器培养的牛呼吸道合胞体病弱毒液，按1:1-2(体积比)加入蔗糖牛奶保护剂(或耐热保护剂)，经真空冷冻干燥，制成伪狂犬弱毒活疫苗。
2.2.灭活疫苗制备
2.2.1.毒液灭活
取悬浮培养的牛呼吸道合胞体病毒液，经离心或过滤去除细胞碎片，按体积加入0.025％的β-丙内酯灭活剂(或二乙烯亚胺、甲醛)4℃灭活24小时，升温至37℃保持2小时，将灭活后毒液至4℃保存备用。
2.2.2.配苗
取经灭活后的牛呼吸道合胞体病毒液，按体积比46:54加入206佐剂(SEPPIC)，充分混合后，制成牛呼吸道合胞体病毒灭活疫苗。
3.悬浮毒液和疫苗检测
按《中华人民共和国兽药典》经细胞半数感染量(TCID50)检测，利用MDBK-S CGMCCNo.11795悬浮细胞培养的牛呼吸道合胞体病毒半数细胞感染量可达到107.0TCID50/mL，毒价与贴壁培养持平。利用悬浮培养牛呼吸道合胞体病毒毒液制备的疫苗均达到《中华人民共和国兽药典》要求。
4.方法比较
将本发明培养牛呼吸道合胞体病毒工艺与常规贴壁培养和载体悬浮培养进行比
较，如表5所示：
表5：牛呼吸道合胞体病毒工艺比较
表5的比较内容表明：利用MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞培养牛呼吸道合胞体病毒，可以使用大容积生物反应器(能达到5000L)，培养时间56h-72h，一次收获抗原量大。相比传统贴壁培养能够节省大量劳动力，减少人为操作误差，降低批间差异。较载体培养不需要微载体投入，也不需要消化放大，节约了成本简化了工艺。可见，本发明的优势在于可利用反应器大规模悬浮培养，生产放大工艺简单，批间差较小，劳动强度小，占地空间少，可大大提高生产效率。
实施例11、牛副流感3型病毒悬浮培养的方法及疫苗制备
1.病毒培养
本实施例中牛副流感3型病毒(来源：美国菌种保藏中心)。也可使用其它牛副流感3型病毒毒株，本发明不做限制。
1.1种毒培养与制备
取生长良好的MDBK贴壁细胞，待细胞长满单层后弃去原培养液，更换含有10％(体积比)牛副流感3型病毒的维持液(维持液配方：市售DMEM培养基)，37℃培养，待细胞CPE达到75％以上时，收获病毒液，-20℃保存备用。
1.2悬浮毒液制备
取经反应器培养的MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞(细胞密度≥1.0×106细胞/mL)，弃去原培养液，加入维持液(无血清或含0.5-2％血清的低血清SFM培养基)恢复至原体积，按体积比加入0.1-1％种毒(贴壁种毒或悬浮种毒)，设定病毒培养条件：温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.2-7.4、转速40-60rpm。
生物反应器培养48h-72h，培养过程定期取样计数观察，待细胞活力低于20％时，停止培养，收获病毒液至-20℃保存。收获的毒液可用作下一级培养悬浮种毒或生产疫苗抗原或疫苗效力检验攻毒使用。
2.疫苗制备
2.1灭活疫苗制备
2.2.1毒液灭活
取悬浮培养的牛副流感3型病毒液，经离心或过滤去除细胞碎片，按体积加入0.025％的β-丙内酯灭活剂(或二乙烯亚胺、甲醛)4℃灭活24小时，升温至37℃保持2小时，将灭活后毒液至-20℃保存备用。
2.2.2配苗
取经灭活后的牛副流感3型病毒液，按体积比46:54加入206佐剂(SEPPIC)，充分混合后，制成牛副流感3型病毒灭活疫苗。
3.悬浮毒液和疫苗检测
按《中华人民共和国兽药典》经细胞半数感染量(TCID50)检测，利用MDBK-S CGMCCNo.11795悬浮细胞培养的牛副流感3型病毒半数细胞感染量可达到108.5TCID50/mL，毒价与贴壁培养持平。利用悬浮培养牛副流感3型病毒毒液制备的疫苗均达到《中华人民共和国兽药典》要求。
4.方法比较
将本发明培养牛副流感3型病毒工艺与常规贴壁培养和载体悬浮培养进行比较，如表5所示：
表6：牛副流感3型病毒工艺比较
表6的比较内容表明：利用MDBK-S CGMCC No.11795悬浮细胞培养牛副流感3型病毒，可以使用大容积生物反应器(能达到5000L)，培养时间48h-72h，一次收获抗原量可制备成品疫苗百万头份以上。相比传统贴壁培养能够节省大量劳动力，减少人为操作误差，降低批间差异。较载体培养不需要微载体投入，也不需要消化放大，节约了成本简化了工艺。可见，本发明的优势在于可利用反应器大规模悬浮培养，生产放大工艺简单，批间差较小，劳动强度小，占地空间少，可大大提高生产效率。

Claims (10)

1.能悬浮培养的牛肾细胞MDBK，具有以下特征：
1)细胞直径：14-25μm；
2)核型：2n＝60；
3)可在不依赖附着物条件下纯悬浮培养；
4)使用无血清或低血清培养基培养；或/和
5)可使用生物反应器大规模培养。
2.能悬浮培养的牛肾细胞株MDBK-S CGMCC No.11795。
3.获得权利要求1或2所述能悬浮培养的牛肾细胞MDBK的筛选方法，是将普通贴壁MDBK细胞经过适应低血清贴壁培养、低血清悬浮培养、无血清悬浮培养等过程，筛选获得能够悬浮培养的MDBK细胞株。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，
所述低血清贴壁培养是指：取长满单层的贴壁MDBK细胞，经0.25％(V/V)胰酶消化分散后加入含10％(V/V)新生牛血清的DMEM培养基与低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)的混合培养基，且混合培养基中低血清培养基混合比例按30％、50％、80％逐部增加，待细胞完全适应混合培养基培养后再增加低血清培养基的含量，最终全部替代为低血清培养基，至细胞生长稳定可连续传代；
所述低血清悬浮培养是指：经低血清贴壁培养驯化好的贴壁MDBK细胞，经0.25％(V/V)胰酶消化分散后加入低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)，稀释细胞至0.5×106细胞/mL，加入三角瓶在37℃恒温摇床100-110rpm培养，富集直至细胞稳定培养；用低血清培养基重悬沉淀细胞并将细胞浓度调节至0.5×106细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养72h至细胞密度达到1.0×106细胞/mL至可稳定传代，得到初步悬浮MDBK细胞；
所述无血清悬浮培养是指：取初步悬浮MDBK细胞，100rpm离心5分钟，弃去上清，加入混合培养基重悬细胞；混合培养基为低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)与无血清CD培养基的混合物，无血清CD培养基含量为30％，连续培养待细胞可稳定培养后增加混合培养基中无血清CD培养基的含量至50％，连续培养待细胞培养稳定后以无血清CD培养基全部替代低血清培养基，至细胞稳定连续传代；取适应无血清CD培养基培养的悬浮MDBK细胞，将细胞液通过70μm细胞过滤器截留细胞团块，将滤过液100rpm离心5分钟，弃上清，用新鲜CD培养基重悬细胞，调节细胞密度至0.5×106细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养，重复述步骤直至细胞结团有所减轻，更换为40μm细胞过滤器，重复上述步骤，经过连续处理细胞结团逐步减轻，得到分散良好细胞为筛选获得的能够悬浮培养的MDBK细胞株。
5.一种牛肾细胞MDBK的悬浮培养方法，是用牛肾细胞专用悬浮培养基将权利要求1或2所述牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后接种至反应器中，加入所述牛肾细胞专用悬浮培养基，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养48-72小时至反应器内的牛肾细胞MDBK密度达到1.0×106-4.0×106细胞/mL。
6.根据权利要求5所述的悬浮培养方法，其特征在于：所述牛肾细胞专用悬浮培养基为含1％-5％(体积百分比V/V)新生牛血清的CD培养基(低血清培养基)或CD培养基(无血清培养基)；优选牛肾细胞专用悬浮培养基配方为：含CD培养基粉末15-20g/L，碳酸氢钠2-3g/L，pH值7.0-7.2的水溶液；优选CD培养基粉末17.7g/L，使用注射用水溶解后加入碳酸氢钠2.32g/L，调节pH值至7.0-7.2。
7.根据权利要求5或6所述的悬浮培养方法，其特征在于：所述牛肾细胞MDBK种细胞悬液的获得方法，包括以下步骤：
(1)牛肾细胞MDBK的复苏
从液氮中取出一支冻存的权利要求1所述牛肾细胞MDBK或权利要求2所述牛肾细胞MDBK-S CGMCC No.11795，至37℃-40℃水浴中快速融化，1000rpm离心5min，弃上清液，加入所述牛肾细胞专用悬浮培养基重悬细胞，转至三角摇瓶中，补加培养基，调节细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，置于摇床中37℃、100rpm悬浮培养；
(2)牛肾细胞MDBK的传代
细胞培养48-72h后取样计数，若细胞密度≥1.0×106细胞/mL时进行细胞传代，否则继续培养，取能够传代的牛肾细胞MDBK，转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清液(原培养基)，加入新的牛肾细胞专用悬浮培养基重悬细胞，转至三角摇瓶中，补加牛肾细胞专用悬浮培养基，调节细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，置于摇床中37℃、100rpm悬浮培养1-3代，得到牛肾细胞MDBK种细胞悬液。
8.根据权利要求5或6或7所述的悬浮培养方法，其特征在于：所述反应器的容积为5L、50L、300L、500L、1000L、或5000L。
9.根据权利要求5至8任一所述的悬浮培养方法，其特征在于：牛肾细胞MDBK种细胞在反应器中可采用流加培养、批培养或灌注培养等方式进行悬浮培养；
所述流加培养方法为：先用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后将经稀释的牛肾细胞种细胞悬液按反应器容积的20％-40％加入反应器中，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养，待细胞密度达到≥0.8×106细胞/mL时，开始流加牛肾细胞专用悬浮培养基，流加速度为反应器容积的15％-20％/天，待培养体积达到反应器容积时停止；
所述批培养方法为：先用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后将经稀释的牛肾细胞种细胞悬液按反应器容积的20％-40％加入反应器中，再加入牛肾细胞专用悬浮培养基至反应器容积，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养，待细胞密度≥1.0×106细胞/mL可停止；
所述灌注培养方法为：先用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后将经稀释的牛肾细胞种细胞悬液加满反应器中，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养，待细胞密度达到≥0.8×106细胞/mL时，灌注牛肾细胞专用悬浮培养基，灌注速度为30％-50％/天，废液经细胞截留装置排出，待细胞密度≥2.0×106细胞/mL时停止。
10.权利要求1所述牛肾细胞MDBK或权利要求2所述的牛肾细胞MDBK-S CGMCCNo.11795及其悬浮培养细胞在各类敏感病毒培养、抗体蛋白生产、疫苗生产、产品外源病毒检验中的应用。
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