CN109691407B - 一种快速建立轮虫单个体无性繁殖种群的方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速建立轮虫单个体无性繁殖种群的方法，该方法包括一种培养容器、一种混合培养液的配置方法以及一种逐步过渡培养方法。具体的，本发明设计了一种碗状玻璃器皿，该玻璃器皿具有开口宽大、碗身矮小、底部与器皿壁连接处存在弧度和玻璃透光率高的特点，可以方便的在体视显微镜下对轮虫进行观察、培养、计数和更换培养液等操作；本发明还提供了一种使用过滤湖水和EPA培养液的混合溶液作为初始培养基，并建立了逐步过渡到使用EPA培养液来培养的方法，使轮虫逐步适应新培养液，以期达到轮虫单个体无性繁殖快速建立种群的目的。相较于纯培养液体系，采用本发明方法培养的轮虫存活率高、繁殖快，缩短了使用单个体轮虫建立种群的时间。
Description
技术领域
本发明属于轮虫种群的培养方法，尤其是一种快速建立轮虫单个体无性繁殖种群的方法，具体地，本发明设计了一种碗状透明玻璃杯作为培养容器，并提供了一种将过滤湖水/培养液的混合溶液作为过渡期间使用的培养基来进行轮虫快速繁殖的培养方法。
背景技术
轮虫(Rotifer)是一类浮游动物，广泛分布于各类自然水体中。轮虫个体体型较小、世代时间短、生殖速度快、能缩短毒性试验时间、对很多有毒物质都具有较强的敏感性。此外，轮虫具有孤雌生殖、培养技术易行、具有较高的种群密度和种群增长率等特点，已作为模式动物在环境监测和生态毒理学研究中发挥着重要作用。自20世纪70年代开始，轮虫先后被用于重金属、有机农药和医药废弃物等化合物的急性和慢性毒性实验，为综合评价毒物的潜在环境风险提供了依据。
除了用于毒性测试，轮虫还可用于经济水产品幼苗的开口饵料。在养殖业生产过程中，当鱼、虾、贝、蟹苗被孵出时，卵囊内的营养物质已经被消耗殆尽，此时，还不能摄取个体较大的外源性食物。轮虫个体大小适宜水产品幼苗口径，游泳速度慢，易于幼苗消化吸收。
1991年，美国环保局正式把褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)和萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)分别作为海水和淡水污染的测试生物列入国家测试标准。褶皱臂尾轮虫分为“S”型和“L”型两种，广泛分布于淡水、半咸水和海水水域中，多用于海水鱼苗的开口饵料。萼花臂尾轮虫是常见的普通大型轮虫种类之一，多分布于淡水和半咸水环境中，是我国淡水湖泊池塘的习见轮虫种类，可用于淡水产品幼苗的开口饵料。使用轮虫进行环境毒性检测需要大量的无性繁殖获得的轮虫个体，用于水产养殖的开口饵料也需要先对轮虫进行大规模培养。因此，对轮虫单个体进行无性繁殖快速建立轮虫种群具有重要实用价值。此外，美国环保局指定使用EPA培养液作为浮游动物毒性测试的培养基。
长期以来，毒性实验用或饵料用轮虫均为从自然水体采集获得。实践中，采集获得的轮虫经过显微镜下甄别筛选，使用吸管逐个吸出后，于玻璃试管或者24孔细胞培养板中进行单个体培养，常用培养液主要为EPA培养液、Gilbert培养液或曝气自来水，并投喂适量的藻细胞作为食物。但是，上述培养方法在实践中存在较高的失败率和操作难度，导致轮虫的存活率较低、繁殖慢。究其原因，(1)将野外采集获得的轮虫直接转移至EPA培养液、Gilbert培养液或曝气自来水进行人工培养时，温度、pH值、水体营养以及盐度等环境因素都发生了骤变，很多轮虫因不适应新环境而死亡或者降低了轮虫的繁殖率；(2)大多数轮虫培养实验都是采用24孔板、小烧杯或试管作为培养容器。24孔板孔壁垂直，孔口狭小，在显微镜下存在遮光的问题，观察有死角，若轮虫游至观察死角则不容易被观察到；同时较小的孔径不利于吸管在体势显微镜下的灵活操作，经常发生吸管因碰撞孔壁折断的问题；试管管口相对较小，且管身较长，难以在体势显微镜下进行观察和操作，无法使用吸管对轮虫进行挑选、更换培养基等操作；使用小烧杯作为培养容器，其较高的杯壁意味着较深的培养液深度，在显微镜下需不断调整才能观察到各液层深度的轮虫，过程繁琐，不利于轮虫的甄别与筛选。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种快速建立轮虫单个体无性繁殖种群的方法，具体为采用一种小型透明碗状培养容器，并使用过滤湖水与培养液混合液对轮虫进行渡培养逐步替换到EPA培养液中，从而达到轮虫单个体无性快速繁殖种群的目的。
本发明的技术方案如下：
一种快速建立轮虫单个体无性繁殖种群的方法，包括以下步骤：
S1,在野外河流、湖泊使用浮游生物网在水面进行反复拖捞，采集浮游动物，保存在500mL塑料瓶中；同时收集3L干净湖水，带回实验室备用；
S2,使用0.22μm孔径的膜对湖水进行过滤，去除浮游动物、杂质和微生物，与EPA培养液按照8:2的比例混合；在每个培养容器中加入1.5-2ml混合液，备用；所述培养容器为碗状玻璃器皿，碗状玻璃器皿的开口直径d1＝25-35mm，底部直径d2＝14-20mm，总高度H1＝15-25mm，碗状玻璃器皿的上半部分为圆柱体，下半部分的内外表面均呈现圆弧状并与底部进行圆滑过渡，透光率大于98％；
S3,摇匀收集到的浮游动物，倒少量液体于培养皿中；在体势显微镜下进行甄别筛选，并用吸管吸取培养皿中的轮虫，转移至所述培养容器中，每个培养容器中放一只轮虫；
S4,向每个培养容器中投喂0.5×106cells/mL密度的斜生栅藻，放入光照培养箱进行培养，培养条件为：明暗比12h:12h，光照强度2000Lux，温度25±1℃；
S5,使用逐步过渡培养方式，步骤4即培养第1天使用8:2比例的湖水/EPA培养液的混合液作为初始培养液，第2天替换为6:4比例的湖水/EPA培养液的混合液作为混合培养液，第3天使用4:6比例的湖水/EPA培养液的混合液作为混合培养液，第4天使用2:8比例的湖水/EPA培养液的混合液作为混合培养液；从第5天开始，使用纯EPA培养液作为最终培养液；
S6,根据轮虫的繁殖数量，不断增大培养体积；并根据轮虫的种群密度，适量增加投喂藻类食物的密度；当轮虫总数达到100个时，视为种群建立成功，可转移至更大的容器中进行大规模培养。
作为本发明的进一步改进，S1的采集地点为野外河流、湖泊中水体清洁的地方，采集时间为晴天8h-18h之间。
作为本发明的进一步改进，S2中，所述培养容器为采用高硼硅玻璃制作而成的碗状玻璃器皿，碗状玻璃器皿的开口直径d1＝30mm，底部直径d2＝18mm，总高度H1＝20mm，碗状玻璃器皿的上半部分为高度H2＝10mm的圆柱体，下半部分的内外表面均呈现圆弧状并与底部进行圆滑过渡，厚度为1mm，透光率大于98％。
作为本发明的进一步改进，S3中，摇匀收集到的浮游动物，倒少量液体于直径9cm的培养皿中，液面厚度约2-3mm。
作为本发明的进一步改进，S6中，根据轮虫的繁殖数量，按照20个/ml的密度，不断增大培养体积。
相比现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明设计了一种碗状玻璃器皿，该玻璃器皿具有开口宽大、碗身矮小、底部与器皿壁连接处存在弧度和玻璃透光率高的特点，可以方便的在体势显微镜下对轮虫进行观察、培养、计数和更换培养液等操作；
(2)本发明还提供了一种使用过滤湖水和EPA培养液的混合溶液作为初始培养基，并建立了逐步过渡到使用EPA培养液来培养的方法，使轮虫逐步适应新培养液，以期达到轮虫单个体无性繁殖快速建立种群的目的。
(3)相较于纯培养液体系，采用本发明培养的轮虫存活率高、繁殖快，缩短了使用单个体轮虫建立种群的时间。
附图说明
图1是本发明提供的培养容器的结构示意图。
图2是本发明提供的培养容器的图片。
具体实施方式
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面结合附图及具体实施例对本发明进一步说明。
萼花臂尾轮虫是典型的浮游动物，在浮游动物学、水生态学，环境科学、毒理学以及水产养殖等领域均有重要应用。萼花臂尾轮虫单个体体长为0.2-0.35mm，宽约0.2mm，质量约为0.5-1.5μg。本实施例以萼花臂尾轮虫作为研究对象，根据本发明的方法于野外采集萼花臂尾轮虫并进行无性繁殖。
1、2019年1月初，于深圳大学文山湖采集浮游动物样品和干净的湖水。湖水经0.22μm微孔滤膜过滤以后备用。
2、过滤湖水/EPA混合液培养组：取如图1所示的30个培养容器，里面各放一只萼花臂尾轮虫。第1天，加入8:2比例的湖水/EPA混合液2mL，投喂0.5×106cells/mL密度的斜生栅藻，培养条件为：明暗比12h:12，光照强度2000Lux，温度25±1℃，进行轮虫单个体培养；第2天替换为6:4比例的湖水/EPA混合培养液；第3天替换为2mL的4:6比例的湖水/EPA混合培养液，第4天替换为2:8比例的湖水/EPA混合培养液。从第5天开始，使用纯EPA培养液进行培养，因轮虫种群密度增大，每天投喂藻密度增加至1.0×106cells/mL浓度。同时，随着轮虫数量增多，培养液体积逐步提升为5mL。
3、EPA培养组：取30个培养容器，里面各放一只萼花臂尾轮虫，使用2ml纯EPA培养液进行轮虫单个体培养。温度、光照、食物投喂及培养体积等培养条件同过滤湖水/EPA混合液培养组。
4、暴气自来水培养组：取30个培养容器，里面各放一只萼花臂尾轮虫，使用经曝气24小时处理的自来水进行轮虫单个体培养。温度、光照、食物投喂及培养体积等培养条件同过滤湖水/EPA混合液培养组。
5、培养第3天，将过滤湖水/EPA混合液培养组、EPA培养组、暴气自来水培养组的培养容器置于体势显微镜下，统计轮虫仍然存活的培养容器数，计算轮虫存活率，见表1；培养第5天，于体势显微镜下对每个培养容器中轮虫个体数量进行计数，统计繁殖总量，见表2。
表1萼花臂尾轮虫3天的存活率
| 过滤湖水/EPA混合液培养组 | EPA培养组 | 暴气自来水培养组 |
| 100％ | 71％ | 78％ |
表2萼花臂尾轮虫5天的繁殖总量
| 过滤湖水/EPA混合液培养组 | EPA培养组 | 暴气自来水培养组 |
| 151.5±44.62个 | 92.2±21.71个 | 119.8±29.7个 |
表1、2表明，本发明配置的一种湖水/培养液混合液，部分保留了原水样的水质环境，并且采用逐步过渡培养的技术手段，使轮虫逐步适应新的培养液环境。相较于EPA培养液和暴气自来水等纯培养液体系，采用本发明培养的轮虫存活率高、繁殖快，缩短了使用单个体轮虫建立种群的时间。
此外，与24孔板、小烧杯和试管等培养容器相比，本发明使用的特制碗状玻璃器皿的下半部呈U型，避免了类似24孔板因板壁与板底垂直而导致的遮光现象，不存在观察死角，且更便于清洗；所使用的高硼硅玻璃材料透光率高，便于观察；合适的开口、底部直径以及总高度，使得该玻璃器皿在显微镜下具有良好的视野范围，也更利于体势显微镜下对轮虫进行吸取、计数等操作。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种快速建立轮虫单个体无性繁殖种群的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1, 在野外河流、湖泊使用浮游生物网在水面进行反复拖捞，采集浮游动物，保存在500 mL塑料瓶中；同时收集3 L干净湖水，带回实验室备用；
S2, 使用0.22 μm孔径的膜对湖水进行过滤，去除浮游动物、杂质和微生物，与EPA培养液按照8:2的比例混合；在每个培养容器中加入1.5-2 ml混合液，备用；所述培养容器为碗状玻璃器皿，碗状玻璃器皿的开口直径d1=25-35 mm，底部直径d2=14-20 mm，总高度H1=15-25 mm，碗状玻璃器皿的上半部分为圆柱体，下半部分的内外表面均呈现圆弧状并与底部进行圆滑过渡，透光率大于98%；
S3, 摇匀收集到的浮游动物，倒少量液体于培养皿中；在体视显微镜下进行甄别筛选，并用吸管吸取培养皿中的轮虫，转移至所述培养容器中，每个培养容器中放一只轮虫；
S4, 向每个培养容器中投喂0.5106 cells/mL密度的斜生栅藻，放入光照培养箱进行培养，培养条件为：明暗比12 h: 12 h，光照强度2000 Lux，温度25±1 ℃；
S5, 使用逐步过渡培养方式，步骤4即培养第1天使用8:2比例的湖水/EPA培养液混合液作为初始培养液，第2天替换为6:4比例的湖水/EPA培养液混合液作为混合培养液，第3天使用4:6比例的湖水/EPA培养液混合液作为混合培养液，第4天使用2:8比例的湖水/EPA培养液混合液作为混合培养液；从第5天开始，使用纯EPA培养液作为最终培养液；
S6,根据轮虫的繁殖数量，不断增大培养体积；并根据轮虫的种群密度，适量增加投喂藻类食物的密度；当轮虫总数达到100个时，视为种群建立成功，可转移至更大的容器中进行大规模培养。
2.根据权利要求1所述的一种快速建立轮虫单个体无性繁殖种群的方法，其特征在于，S1的采集地点为野外河流、湖泊中水体清洁的地方，采集时间为晴天8 h - 18 h之间。
3.根据权利要求1所述的一种快速建立轮虫单个体无性繁殖种群的方法，其特征在于，S2中，所述培养容器为采用高硼硅玻璃制作而成的碗状玻璃器皿，碗状玻璃器皿的开口直径d1=30 mm，底部直径d2=18 mm，总高度H1=20 mm，碗状玻璃器皿的上半部分为高度H2=10mm的圆柱体，下半部分的内外表面均呈现圆弧状并与底部进行圆滑过渡，透光率大于98%。
4.根据权利要求1所述的一种快速建立轮虫单个体无性繁殖种群的方法，其特征在于，S3中，摇匀收集到的浮游动物，倒少量液体于直径9 cm的培养皿中，液面厚度为2-3 mm。
5.根据权利要求1所述的一种快速建立轮虫单个体无性繁殖种群的方法，其特征在于，S6中，根据轮虫的繁殖数量，按照20个/ml的密度，不断增大培养体积。
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