CN101322477B - 一种用于潮间带膜海绵幼虫人工收集培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种潮间带膜海绵在实验室条件下人工收集培育其有性生殖幼虫的方法，将含有成熟胚胎海绵在潮间带采集后，带回实验室，用海水清洗后固定在载体上，放入培养器培育，投喂饵料藻类作为主体食物。母体海绵在人工营造的环境下能够释放幼虫，幼虫经历浮游期后附着在选择性附着基上，在适宜食物和温度条件下能够发育成小海绵。本发明为海绵人工养殖的种源问题提供了一条新的技术，为解决海绵药物开发的“药源供给不足问题”提出一种新途径，具有广泛应用前景。

Description

一种用于潮间带膜海绵幼虫人工收集培育方法
技术领域
本发明涉及海洋生物，是在实验室内采用人工方法诱导含有胚胎海绵释放海绵幼虫，收集并培育幼虫的技术，具体地说是建立一种在实验室内人工收集培育海绵幼虫的方法，是一种用于潮间带膜海绵幼虫人工收集培育方法。
背景技术
海绵被认为是海洋中最具有开发潜力的药源生物，从海绵提取出来的次级代谢产物具有抗肿瘤、抗真菌、甚至抗HIV的活性，因此海绵药物开发成为近年来海洋药物开发的热点。但是海绵药物在开发过程中遇到了药源供给不足的瓶颈，即无足够的海绵量来提取一定数量的活性物质供药物深入研究之用，使得一些药物仅停留在临床实验阶段无法继续下去。人们尝试用多种方法去解决这一问题但都有难解决的关键技术，例如海绵细胞培养技术，目前还没有建立可以连续传代的细胞系；化学合成价格昂贵、步骤复杂、实际可行性太低；目前普遍认为海绵工厂化人工养殖被认为是可解决“药源供给不足问题”的较有希望的方式之一。但是工厂化养殖目前还处于实验室阶段，生物量增殖较小，而且不能达到人工可控条件下海绵外植体的连续传代培养，培养的种源始终需要向海洋要海绵，即采集野外自然海域海绵外植体人工培养，不断地采集会造成海绵资源的枯竭和生态环境的破坏。海洋无脊椎动物的有性生殖是个体数量迅猛增加的最理想的方式，野外条件下由于被捕食和环境条件的影响而使幼体存活率很低。
目前国内对于海绵幼虫的研究还没有，国外对于海绵幼虫的研究很多，但大多都是关于幼虫形态、行为、组织学、生态学方面的研究，幼虫在实验室内的收集和培育也有少量报道，幼虫附着成活率低，生长没有具体的数据，对于海绵幼虫人工收集、培育的系统性方法还未有报道。
发明内容
本发明是针对潮间带海绵有性生殖幼虫的收集和培育方法，在实验室内人工可控条件下培养少量带胚胎海绵组织块，人工诱导海绵释放幼虫，然后培育幼虫发育成小海绵。减少幼虫死亡率，收获大量幼体。然后以小海绵为种源，进行人工养殖，为实现海绵人工养殖的育种问题打下基础。
本发明的目的是提供一套有效且操作简单，可对潮间带膜海绵幼虫进行人工可控条件下收集培育的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于潮间带膜海绵幼虫人工收集培育方法，在实验室人工营造的环境下培育潮间带含有胚胎海绵，收集并培育海绵幼虫；将在潮间带秋季采集的、含有成熟胚胎的海绵(称为母体海绵)带回实验室，用天然清洁海水清洗，然后固定在载体上，放入培养器中培养，投喂藻类饵料，幼虫开始释放后，放入附着基，让幼虫附着，改变营养条件下进行幼虫培养，幼虫发育为幼海绵。
所述载体可为玻璃片、塑料板、石块、珊瑚焦石或陶瓷，海绵选择细线固定；母体海绵在培育过程中光照强度为0-5000lx；母体海绵在培育过程中温度条件为12-25℃，通气量为0.2-1.5升空气/每升海水·分钟；附着基材质可为玻璃、塑料、石头或珊瑚砂；海绵培养密度2-15‰m/v，培养水体溶氧浓度5-9mg/L，保持培养水体内的NH4 +浓度低于1mg/L；投喂饵料藻类食物时浓度2×104-2×105cells/ml；藻类为叉鞭金藻、新月菱形藻、亚心形扁藻、小球藻、角毛藻或盐藻；在幼虫释放完成后，幼虫附着后的培育营养条件为，培养海水中：金藻0.2-1×104个/ml，光合细菌0.1-100ppm，硅0.1-60μmol/L，Fe3+0.1-5μmol/L。
方法原理：海绵具有有性生殖和无性生殖的特点，利用海绵有性生殖产生幼虫的特点在野外海绵生殖季节采集海绵组织块，在人工营造的适宜条件下培育母体海绵，诱导幼虫释放，收集幼虫，并培育幼虫发育成小海绵。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1.技术相对完整。本发明首次对潮间带膜海绵幼虫在可控条件下收集和培育给出一套相对完整方法；是一种在实验室中对含有胚胎的潮间带膜海绵进行人工诱导释放、收集和培育幼虫的新技术。
2.简单易操作。本发明母体海绵选择、温度控制、光照控制、附着基选择等均非常简单，容易达到要求。
3、应用广泛。本发明可用于人工可控条件下收集培育海绵有性生殖幼虫；为解决海绵人工养殖的种源问题提供基础，为海绵研究的国际难点--海绵细胞培养，研究细胞分化增殖提供借鉴。
总之，本发明可提供人工条件下培育潮间带膜海绵含有胚胎外植体，收集培育幼虫的方法。技术相对较完整、操作简便，在室内可控培育海绵幼虫，为解决海绵工厂化养殖的种源问题提供了初步方法，从而为解决海绵药物开发的“药源供给不足问题”提出一种新途径，具有广泛应用前景。
附图说明
图1为繁茂膜海绵幼虫形态图，A浮游阶段肉眼形态图，B附着后发育成小海绵显微镜下形态图；
图2为繁茂膜海绵幼虫显微镜下形态图；
图3为繁茂膜海绵幼虫附着1天内显微镜下形态图；
图4为母体海绵在22℃通气培养，光照和暗培养幼虫释放情况图；
图5为母体海绵在不同温度通气培养条件下释放幼虫情况图；
图6为幼虫附着在珊瑚砂(A)和石块上(B)图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法与结果进行说明，本发明使用购买深海水作为养殖海水，用于母体海绵、海绵幼虫和幼虫附着后幼海绵的培养及饵料藻类的培养；肉眼每天观察计数释放幼虫数量，计算平均每克湿重海绵释放幼虫数量；幼虫尺寸小时用显微镜下标尺计算，大时采用标尺对比照相方式获得。
一种用于潮间带膜海绵幼虫收集培育方法，实验室人工营造海绵生长的环境，在适宜条件下诱导幼虫释放，收集并培育幼虫。具体步骤，将生长在潮间带的膜海绵采集后，立即放入盛海水的小桶里，带回实验室用干净海水清洗，然后将海绵固定于载体上，放入培养器中通气培养，控温、控光培养，投喂饵料藻类作为食物，肉眼见幼虫释放后，在培养器底部放置附着基让幼虫附着，密度合适时将附着基取出，适宜温度营养条件下培育。
具体操作过程为：
1)海边潮间带采集母体海绵时间应选择海绵胚胎成熟时期，颜色鲜艳，表面相对干净的海绵，采集后在基底层肉眼可见胚胎，采集后立即将海绵置于盛海水的小桶里；
2)海绵带回实验室后，用天然清洁海水清洗1-3次，至海水内无颜色及可见胚胎既可，然后将海绵固定于载体上，置于培养器内，通气培养；
3)母体海绵培养过程中需要水流，水流不能太强，影响幼虫释放后在水体内的行为；
4)母体海绵培育过程中，光照强度范围可控制在0-5000lx以内；
5)母体海绵培育过程中，培育温度需要控制在15-25℃范围内；
6)母体海绵培育过程中，随时观察是否有幼虫释放，一旦发现幼虫释放后，立即放入附着基，待附着密度合适时，及时取出，适宜条件下培养；
7)幼虫在附着基上附着后，在温度范围为15-25℃条件下，营养为金藻0.2-1×104/ml，光合细菌0.1-100ppm，硅0.1-60μmol/L，铁0.1-5μmol/L的条件下培育，幼虫发育为小海绵。
实施例1
大连地区繁茂膜海绵在秋季9-10月份体内胚胎成熟，2006年9月份采集带胚胎繁茂膜海绵组织块，实验室内清洗固定于玻璃载体上，12L玻璃缸暂养1天，然后置于1L玻璃缸内，气石通气培养，培养水温22±0.5℃，分别设置光照5000lx和暗培养2种条件，投喂金藻，浓度2×105/ml。每天换水一次，早晚投喂2次。培养第一天即观潮到幼虫释放，鲜艳桔黄色幼虫脱离母体后在水中游泳，幼虫大小在200-300μm之间。实验中光照和暗培养母体都能够释放幼虫，释放时间持续17天，每天释放幼虫数量不同。幼虫释放情况见图4.
实施例2
2006年9月份采集带胚胎繁茂膜海绵组织块，实验室内清洗后固定于玻璃载体上，然后置于1L玻璃缸内，无光照、气石通气培养，设置水温为14±0.5℃、18±0.5℃与25±0.5℃2个温度条件，投喂金藻，浓度2×105/ml。每天换水一次，早晚投喂1次。考察幼虫释放情况。不同温度下母体都能够释放幼虫，实验第一天同样观察到幼虫释放，但是不同温度下母体释放幼虫持续时间和数量不同14±0.5℃母体释放幼虫持续12天，18±0.5℃下培养母体释放幼虫持续22天，25±0.5℃条件下持续6天，不同温度下母体释放幼虫数量见图5。
收集母体海绵释放幼虫，置于1L或10L玻璃缸内静水培养，放置附着基于玻璃缸底，幼虫能够于附着在塑料波纹板、珊瑚砂、石块及玻璃缸底上(图6)。
实施例3
取附着于透明塑料波纹板上14天左右的海绵幼虫，颜色桔黄色，大小为407.5±79.9μm，附着时温度18±0.5℃。选取叉鞭金藻、光合细菌、硅和铁在不同浓度下的不同组合作为营养成分，投喂幼海绵。培养温度为22±0.5℃升温后恒温。幼海绵在不同食物组合下尺寸变化见表1。投喂不同浓度的四种营养成分幼海绵都能够生长，但是浓度不同，幼海绵在短期内尺寸变化不同。
表1
  不同组合   叉鞭金藻(*104/ml)   光合细菌(Ppm)  硅(μmol/L)   Fe3+(μmol/L)   幼虫平均直径
  E1   0.2   10   20   1   480.6
  E2   0.2   25   40   2   582.1
  E3   0.2   50   60   3   563.8
  E4   0.5   10   40   3   516.3
  E5   0.5   25   60   1   608.8
  E6   0.5   50   20   2   615
  E7   1   10   60   2   497.5
  E8   1   25   20   3   497.5
  E9   1   50   40   1   480

Claims (4)

1.一种用于潮间带膜海绵幼虫人工收集培育方法，其特征在于：将在潮间带秋季采集的、含有成熟胚胎的母体海绵带回，用天然清洁海水清洗，然后固定在载体上，放入培养器中培养，投喂藻类饵料，幼虫开始释放后，放入附着基，让幼虫附着，改变营养条件下进行幼虫培养，幼虫发育为幼海绵；
在幼虫释放完成后，幼虫附着后的培育营养条件为，培养海水中：金藻0.2-1×104个/ml，光合细菌0.1-100ppm，硅0.1-60μmol/L，Fe3+0.1-5μmol/L；母体海绵在培育过程中光照强度为0-5000lx；母体海绵在培育过程中温度条件为12-25℃，通气量为0.2-1.5升空气/每升海水·分钟；
母体海绵培养密度2-15‰m/v，培养水体溶氧浓度5-9mg/L，保持培养水体内的NH4 +浓度低于1mg/L；投喂饵料藻类食物时浓度2×104-2×105cells/ml。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述载体为玻璃片、塑料板、石块、珊瑚焦石或陶瓷，母体海绵选择细线固定。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述附着基材质为玻璃、塑料、石头或珊瑚砂。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述藻类为叉鞭金藻、新月菱形藻、亚心形扁藻、小球藻、角毛藻或盐藻。
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