CN103798168A - 一种适用于华南沿海盐度渐变式熊本牡蛎室内大规模人工繁育新方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于华南沿海盐度渐变式熊本牡蛎人工繁育新方法。本发明通过亲本促熟、催产孵化、幼虫培育、附着变态、稚贝育成等环节，在室内培育出大量健康熊本牡蛎苗种。本发明结合了熊本牡蛎生态习性及华南沿海区域特点，实现了熊本牡蛎高盐环境下亲贝促熟，中高盐环境幼虫下培养，中盐环境下稚贝育成的逐级降盐式培育模式，具有操作简便、成本低廉、高效易行等优点。为熊本牡蛎苗种生产、土著品种开发及其产业化推广奠定了坚实的基础。

Description

一种适用于华南沿海盐度渐变式熊本牡蛎室内大规模人工繁育新方法

技术领域：

本发明属于海洋农业中贝类苗种繁育技术领域，具体涉及一种适用于华南沿海盐度渐变式熊本牡蛎室内大规模人工繁育新方法。

背景技术：

熊本牡蛎Crassostrea sikamea原产于东亚，分布在日本，韩国及我国浙江以南，广东、广西、海南等地，均为野生种，喜好高温中高盐环境，即咸淡水区域中偏咸区域，主要分布产地集中在海湾及河口区域，属亚热带牡蛎经济种，与香港牡蛎、近江牡蛎、葡萄牙牡蛎、僧帽牡蛎等有生活重叠区。它在华南沿海繁殖季节主要集中在4-10月份，具有性腺发育速度快，周年均可以繁殖等优点。在我国它是仅次于香港牡蛎、葡萄牙牡蛎、长牡蛎之后的第四类重要牡蛎经济种，年产量在10万吨左右，均为野生采捕。

由于熊本牡蛎肉质口感较好，在美国其价格是长牡蛎的2倍，在我国与长牡蛎、葡萄牙牡蛎价格相当，低于香港牡蛎商业价格。其中，为人熟悉的闽南名菜中的牡蛎煎、炒蛎黄、牡蛎汤等牡蛎食品主要原料即为熊本牡蛎。遗憾的是，目前为止，该牡蛎养殖苗种来源均为野生苗，尚无人工苗种生产。对于其人工繁育报道中，仅限对比文件1，即李琪等在2012年申请的国家发明专利《一种熊本牡蛎人工繁育方法》，申请公开号：CN102763617A。但是该方法经过反复生产性论证，这种方式并适合于华南沿海熊本牡蛎苗种生产，直接套用的结果就是很难获得熊本牡蛎苗种，无法进行商业生产。

发明内容：

本发明的目的是提供一种适用于华南沿海盐度渐变式熊本牡蛎人工繁育新方法，该繁育方法具有操作简便、成本低廉、实用性强、高效易行等优点。这为华南沿海熊本牡蛎室内大规模苗种生产、土著品种开发及其产业化推广奠定了坚实基础

本发明的适用于华南沿海盐度渐变式熊本牡蛎室内大规模人工繁育新方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）高盐环境下性腺促熟：采集贝壳完整、活力十足的熊本牡蛎作为亲本，采用吊养的方式在盐度28-32ppt的高盐区虾池中进行生态促熟，直至性腺同步成熟；促熟时间与亲本本身性腺发育度正相关，如果亲本本身性腺就很好，大概经过1-2周，就可以完全同步成熟；如果性腺相对较差，大约要经过5-8周，性腺同步成熟；

（b）中高盐环境下催产孵化：将性腺成熟的熊本牡蛎采用阴干流水刺激进行人工催产，然后置于盐度20-25ppt的中高盐度海水中，获取自然排放的配子进行受精孵化，再经发育得到D形幼虫；

（c）浮游幼虫培育：将发育正常的D形幼虫按照2-3个/ml密度，采用微充气的方式在盐度20-25ppt的中高盐度海水下进行幼虫培育，期间，不换水，饵料以绿色巴夫藻为主，配以酵母，采用少量多次方式进行投饲；

（d）适时采苗：当30-50%幼虫出现眼点、足向外伸时投放附着基进行人工采苗，在此期间，不换水，投喂足量的饵料，稚贝就附着在附着基上；幼虫变态期间，经过5-7d培养，90%以上幼虫附着变态，在此期间，不换水，饵料投喂量增加一倍，投喂方式不变；

（e）中盐环境下稚贝育成：稚贝置于盐度15-20ppt的中盐度海水中进行稚贝育成，期间以虾池水作为生物饵料进行投喂，保持池水一直处于微微泛绿状态，经培育即可获得健康熊本牡蛎苗种。大约经过50-60d培育，即可获得大量5-10mm的健康熊本牡蛎苗种。

所述的采集贝壳完整、活力十足的熊本牡蛎作为亲本优选是先采集牡蛎样本，然后按照Wang&Guo（2008）方法进行种类鉴定剔除掉其他类牡蛎，留下熊本牡蛎作为亲本。这是由于在我国浙江以南，熊本牡蛎经常与僧帽牡蛎、葡萄牙牡蛎、香港牡蛎、近江牡蛎等其他牡蛎种类有生活重叠区域。

所述的发育正常的D形幼虫是采用320目筛绢网对步骤（b）的D形幼虫进行优选，得到正规D形幼虫，之后再用于后续的幼虫培育。

所述的虾池水是指养虾土塘中海水，由于养虾过程中要投喂大量饵料，会出现残料及其虾粪等有机质，使其海水富营养化较高，含有大量多元化的单胞藻类及有机颗粒，营养丰富，是牡蛎稚贝良好的天然饵料。

与本发明相比，对比文件1（中国海洋大学李琪教授等在2012年申请的国家发明专利《一种熊本牡蛎人工繁育方法》，申请公开号：CN102763617A。）是北方沿海熊本牡蛎的人工繁育技术，经过反复生产性实验论证，这种方式并适合于华南沿海熊本牡蛎苗种生产，因为直接套用的结果就是很难获得熊本牡蛎苗种（见对比例1）。为此，本发明人根据南北方水域环境差异及其熊本牡蛎自身生态习性，创造了一套不同于对比文件1的适用于华南沿海盐度渐变式熊本牡蛎室内大规模繁育新方法。本发明与对比文件1相比，主要创新点如下（图1）：①亲本身份确认，本发明采用分子手段对其采集亲本样品进行了遗传鉴定，确保使用亲本为熊本牡蛎真正意义上的纯种。因为熊本牡蛎经常与其他牡蛎经济种混在一起，由于牡蛎贝壳可塑性很大，很难从外观上直接鉴定出牡蛎类别，尤其是存在个别熊本牡蛎与其他牡蛎的种间杂种，会导致生产苗种的种质不存；②根据熊本牡蛎生态习性，按照盐度渐变式模式进行高盐促熟亲本、中高盐培育幼虫、中盐育成稚贝，可以有效的提高出单位水体出苗量，加快稚贝生长速度；③由于南北方水域环境差异大，本发明提出苗种培育期间不换水，幼虫期间多次少量投喂单胞藻来维持水质清新，稚贝期间以虾池水作为饵料，营养丰富，来源充足，不受天气变化影响；④按育苗成本计算，本发明不换水，节约了大量水源；仅在浮游期使用一种单胞藻作为饵料，减小了饵料培养费用；不但降低了劳动力成本，而且减少了水电成本，使其育苗成本减少70-80%。

本发明结合了熊本牡蛎生态习性及华南沿海区域特点，实现了熊本牡蛎高盐环境下亲贝促熟，中高盐环境幼虫下培养，中盐环境下稚贝育成的逐级降盐式培育模式，具有操作简便、成本低廉、高效易行等优点。为熊本牡蛎苗种生产、土著品种开发及其产业化推广奠定了坚实的基础。

附图说明：

图1：左半部分A是对比文件1技术路线，右半部分B是本发明的技术路线。

图2：熊本牡蛎胚胎发育过程。A，受精卵；B，第一极体；C，第二极体；D，2细胞期；E，4细胞期；F，8细胞期；G，16细胞期，H，桑葚期；I，原肠期；J，囊胚期；K，担轮期；L，D形幼虫。

图3：熊本牡蛎幼虫及稚贝形成。A，D形幼虫；B，面盘前期幼虫；C，面盘中期幼虫；D，面盘后期有虫；E，眼点幼虫；F，稚贝。

图4：熊本牡蛎不同阶段稚贝。

具体实施方式：

以参照北方沿海熊本牡蛎人工繁育方法在华南沿海尝试为对比例1；熊本牡蛎幼虫及稚贝在不同盐度下的表型性状解析为实施例1；盐度渐变式大规模繁育熊本牡蛎健康苗种为实施例2，进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。

对比例1

以北方沿海熊本牡蛎苗种繁育方法在华南沿海的尝试实验为例进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。

（a）亲本采集鉴定：于2013年5月9日，在深圳东涌采集牡蛎样品1000个，大小在30-60mm，经过遗传鉴定（鉴定方法参照Wang&Guo（2008）方法进行种类鉴定）960个为熊本牡蛎，以其作为亲本。

（b）亲本促熟：将这些亲本装在8个扇贝笼中，采用吊养的方式将其放置于深圳南澳东山高盐度的生态虾池中进行促熟，控制虾池中的盐度在30ppt之间，直至性腺同步成熟。

（c）催产孵化：当亲本性腺成熟时，捞出阴干2h，然后再用流动的海水冲刷刺激0.5h的方法对200个个体进行催产，放置于深圳龙科源水产有限公司10m³水泥池中，盐度为30ppt海水中，1.5h后亲本开始产卵排精，大约经过50min，产卵行为结束，将其亲本移走。孵化期间，盐度为30ppt，温度为26.4℃，大约经过21h，受精卵发育为D形幼虫（图2）。在此期间，受精及孵化率较高，均在≥90%，获得1.5亿D形幼虫。

（d）子代培育：利用320目筛绢网对幼虫选优，将幼虫按照2个/mL密度放置于5个10m³水泥池中，幼虫一直在盐度30ppt环境下培养，发现有虫具有生长缓慢，不断死亡的现象。每天都换水，大量投喂饵料之后，发现幼虫在受精后第6-9d后90%以上幼虫下沉死亡，仅有少量幼虫完成变态，其变态率仅为0.1-0.5%。

分别于2013年5月12日、15日、18日重复（a）-（d）步骤进行另外3个批次生产性实验研究，结果表明：幼虫在受精后5-10d之内，几乎全部死亡，虽然可以获得零星少量稚贝，但是无法到达生产要求标准。

也就是说，照搬北方沿海熊本牡蛎人工繁育方法在我国南方进行，很难获得存活稚贝，无法达到商业生产目的及要求。

实施例1

以华南沿海不同盐度下熊本牡蛎受精孵化、子代生长、存活为实施例进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。

以对比例1中的亲本作为繁殖群体，通过解剖方式进行不同盐度下受精孵化、子代表型性状研究。结果表明：熊本牡蛎在盐度30ppt条件下，几乎无法获得稚贝，变态率低于1%；在盐度为25ppt条件下，可以获得大量稚贝，变态率30.6%；在盐度20ppt条件下，可以获得大量稚贝，变态率为27.5%；在盐度15ppt条件下，可以获得一些稚贝，变态率为10.2%；在盐度10ppt条件下，胚胎发育畸形率很高，幼虫无法存活，尚未获得稚贝，变态率为0。

稚贝育成期间，在盐度30ppt条件下稚贝生长个体最小，生长缓慢，存活率仅为72.5%；盐度24ppt条件下，稚贝生长较快，存活率较高90%；盐度18ppt条件下，生长最快，存活率最高接近100%；盐度12ppt条件下，稚贝生长较快，但存活率仅为50.6%。

综合来看，亲本高盐条件下促熟效果最佳，幼虫在中高盐环境下培养最为合适，稚贝在中盐环境下育成最为合理，采用盐度渐变式进行熊本牡蛎苗种培育产量最高、效益最佳，为华南沿海熊本牡蛎苗种培育最佳模式。

实施例2

按照实施例1中的最佳优化条件，在华南沿海进行大规模繁育熊本牡蛎健康苗种为实施例进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。

（a）亲本采集鉴定：于2013年6月15日，在湛江市坡头区乾唐镇海域选出贝壳完整、活力十足的牡蛎样本2000个，壳高在30-60mm。将所有牡蛎放置于镁盐中，待其微微张开双壳时，利用镊子取出一点鳃丝，酒精固定，之后提取DNA，经过复合COI检测（鉴定方法参照Wang&Guo（2008）方法进行种类鉴定），发现1530个熊本牡蛎、127个葡萄牙牡蛎，65个香港牡蛎，13个近江牡蛎，剩余的265个个体没有张开双壳提取样品失败，将其弃掉，以熊本牡蛎作为亲本。

（b）高盐环境下性腺促熟：利用扇贝笼，每层放置15个熊本牡蛎亲本，每个扇贝笼6层，共计利用17个扇贝笼采用吊养的方式在高盐度的恒星“863”基地的高盐度虾池中进行生态促熟，控制高盐度虾池内的海水盐度为28-32ppt。由于亲本本身性腺比较饱满，经过1周的饲育，亲本性腺同步成熟。

（c）中高盐催产孵化：当性腺成熟时，随机筛选1000个性腺成熟个体作为繁殖亲本，采用阴干3h、再用流动的海水冲刷刺激0.5h相结合的办法进行人工催产，之后将亲本放置于12m³水泥池中，控制海水盐度为20～25ppt之间，温度为28.6℃，约经过2h，亲本开始产卵排精，1h之后配子排放结束，将亲本移走。采用微充气的方式进行受精孵化，约经过18h到达D形幼虫（图2）。

（d）幼虫培养：利用320目筛绢网进行D形幼虫优选，得到壳高大于320目网孔的D形幼虫，之后按照2-3个/ml密度放置于5个12m³水泥池中，剩余幼虫放掉；采用微充气的方式在盐度20-25ppt环境下进行幼虫培育。期间，不换水，绿色巴夫藻每天投喂6次，每次投喂量为5000-10000cells/mL；酵母每天投喂一次，投喂量0.2g/m³。

（e）适时采苗：当30-50%幼虫出现眼点、足向外伸时适时投放附着基进行人工采苗（图3），以牡蛎壳与水泥黏在一起的附着基效果最佳。幼虫变态期间，经过7d培养，90%以上幼虫附着变态，形成稚贝（图3）。在此期间，不换水，绿色巴夫藻投喂量增加一倍，酵母用量不变，投喂方式不变。

（f）中盐稚贝育成：再将稚贝置于育成池中，育成池中的海水盐度控制在15-20ppt之间，以虾池水作为生物饵料，大量投喂，保持池水一直处于微微泛绿状态。从受精开始，一共经过56d培育，获得1500万壳高在5-10mm的健康熊本牡蛎苗种（图4），单位水体出苗量为25万/m³。

由此可见，这种盐度渐变式的熊本牡蛎苗种培育模式比较适合于华南沿海，这为大规模繁育熊本牡蛎健康苗种、土著品种开发及其产业化发展奠定了坚实的基础。

Claims (3)

1.一种适用于华南沿海盐度渐变式熊本牡蛎室内大规模人工繁育新方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）高盐环境下性腺促熟：采集贝壳完整、活力十足的熊本牡蛎作为亲本，采用吊养的方式在盐度28-32ppt的高盐区虾池中进行生态促熟，直至性腺同步成熟；

（b）中高盐环境下催产孵化：将性腺成熟的熊本牡蛎采用阴干流水刺激进行人工催产，然后置于盐度20-25ppt的中高盐度海水中，获取自然排放的配子进行受精孵化，再经发育得到D形幼虫；

（c）浮游幼虫培育：将发育正常的D形幼虫按照2-3个/ml密度，采用微充气的方式在盐度20-25ppt的中高盐度海水下进行幼虫培育，期间，不换水，饵料以绿色巴夫藻为主，配以酵母，采用少量多次方式进行投饲；

（d）适时采苗：当30-50%幼虫出现眼点、足向外伸时投放附着基进行人工采苗，在此期间，不换水，投喂足量的饵料，稚贝就附着在附着基上；

（e）中盐环境下稚贝育成：稚贝置于盐度15-20ppt的中盐度海水中进行稚贝育成，期间以虾池水作为生物饵料进行投喂，保持池水一直处于微微泛绿状态，经培育即可获得健康熊本牡蛎苗种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采集贝壳完整、活力十足的熊本牡蛎作为亲本是先采集牡蛎样本，再进行分子遗传鉴定种类，剔除掉其他类牡蛎，留下熊本牡蛎作为亲本。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发育正常的D形幼虫是采用320目筛绢网对步骤（b）的D形幼虫进行优选，得到发育正常的D形幼虫。

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