CN113684175A - 一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法 - Google Patents

一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113684175A
CN113684175A CN202111073106.0A CN202111073106A CN113684175A CN 113684175 A CN113684175 A CN 113684175A CN 202111073106 A CN202111073106 A CN 202111073106A CN 113684175 A CN113684175 A CN 113684175A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
serum
suspension
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111073106.0A
Other languages
English (en)
Inventor
刘卫
吴金凤
王春波
赵更凡
徐丽萍
白建秋
王焕焕
晏士杰
赵三侠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Hengye Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shandong Hengye Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Hengye Biotechnology Co ltd filed Critical Shandong Hengye Biotechnology Co ltd
Priority to CN202111073106.0A priority Critical patent/CN113684175A/zh
Publication of CN113684175A publication Critical patent/CN113684175A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/35—Polyols, e.g. glycerin, inositol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其将消化后的贴壁细胞接种至盛有无血清培养基中进行离心沉降，然后在转瓶和摇瓶中以特定的温度、通气、转速等条件下进行特定时长的一次分布增值培养和二次分布增殖培养，最后经5次高存活率传代和5次以上纯化迭代，驯化得到全悬浮细胞系。本方法还提供了一种无血清培养基。本方法克服了现有悬浮驯化技术细胞贴壁展开面积对效率和产量的限制，以及培养过程中对血清的依赖，其不仅减少了工艺步骤、而且缩短了增值周期，而且其培养基在提供细胞驯化过程所需的营养物质的同时，不仅成本低、保藏时间长，而且质量稳定，有效的实现了生产规模的扩大，并保证了下游治疗性蛋白质和疫苗的纯化效率。

Description

一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞驯化技术领域，属于生物技术领域，具体涉及一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法。
背景技术
将贴壁细胞驯化成为全悬浮细胞是国内外研究和大规模生产治疗性蛋白质和疫苗发展的趋势。然而，使用贴壁细胞时，为了让细胞能够附着，必须使用如瓶和微载体等以形成细胞单层，在大量生产时还需要使用更大的培养容器或反应器；另外在培养贴壁细胞时，培养基中须加入一定量的动物血清，用于细胞提供生长因子和满足细胞贴壁需求的各种营养物质，动物血清存在成本高、难保存、批次间质量不稳定等问题，其直接影响得到驯化后的悬浮系品质。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的上述缺陷，提供一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法。
本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法包括以下步骤，
S1沉降：将目标细胞的贴壁细胞复苏，选择汇合度不小于20％的贴壁细胞，用0.2％的胰蛋白酶EDTA消化沉淀的细胞团，将消化细胞接种至盛有无血清培养基的离心管中，置于离心机中以1000rpm离心沉降，将沉淀转移至转瓶中培养；
S2一次分布：将转瓶置于转瓶机内以3rpm，于温度37℃、CO2浓度5％条件下培养，每24h取样计数一次，续培养至96h，若96h活细胞密度高于2.0×106cells/mL，将使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0×106cells/mL，转瓶机调整至6rpm继续培养96h；若96h细胞密度低于1.0×106cells/mL，转瓶机停转静置沉降，弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.5×106cells/mL，继续培养96h；
S3二次分布：当二次96h培养后，细胞密度增长达到2.0×106cells/mL后，将细胞转到摇瓶中，添加新的无血清培养基将细胞起始密度调整至5×10cells/mL，将摇瓶置于培养箱摇床中以30rpm于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下，继续培养120h；
S4传代：120h后稀释传代，经连续5代摇瓶传代，保持120h活细胞密度增加不小于5倍，且活率高于95％，即可完成驯化，再经过至少5代摇瓶传代驯化培养后，即得到全悬浮细胞系。
具体的，所述无血清培养基按以下质量/体积比制备，
4000mg/L D-葡萄糖、100mg/L丙酮酸钠、40mg/L L-天冬酰胺、70mg/L L-丝氨酸、15mg/L次黄嘌呤、0.6mg/L胸苷、6mg/L胞苷和9mg/L鸟苷、8mg/L叶酸、0.6mg/L核黄素、4mg/L氯化胆碱、30mg/L肌醇、20～30mg/L硝酸铁、0.6mg/L硫酸亚铁、300mg/L氯化钾、700mg/L氯化钠、70mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠，以及2000mg/L剪切力保护剂和70mg/L抗细胞结团剂。
具体的，所述目标细胞为Vero细胞、HEK-293T细胞、BHK-21细胞、PK-15细胞、NBL-6细胞或RK-13细胞。
进一步的，步骤S1所述离心沉降时间为3～5min。
进一步的，步骤S1所述静置沉降静置沉降时间为2～4h。
经本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法所得到的全悬浮细胞系的比生长速率μ不小于8h-1。
本发明一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，克服了现有悬浮驯化技术细胞贴壁展开面积对效率和产量的限制，以及培养过程中对血清的依赖，其通过细胞沉降后在合适条件下进行转瓶和摇瓶的两次分布，在无需依赖贴壁面积的情况下，不仅减少了工艺步骤、而且缩短了增值周期，使用由各类氨基酸和无机辅料制成的无血清培养基，在提供细胞驯化过程所需的营养物质的同时，不仅成本低、保藏时间长，而且质量稳定，有效的实现了生产规模的扩大，并保证了下游治疗性蛋白质和疫苗的纯化效率。
附图说明
下面结合附图对本发明一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法作进一步说明：
图1是本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法实施例1所述BHK-21细胞驯化前贴壁细胞单层的显微图；
图2是本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法实施例1转瓶机停转静置沉降BHK-21细胞的显微图；
图3是本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法实施例1所得全悬浮BHK-21细胞的显微图；
图4是本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法实施例2所述PK-15细胞驯化前贴壁细胞单层的显微图；
图5是本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法实施例2所得全悬浮PK-15细胞的显微图；
图6是本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法实施例3所述HEK-293T细胞驯化前贴壁细胞单层的显微图；
图7是本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法实施例3所得全悬浮HEK-293T细胞的显微图；
图8是本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法实施例4所述NBL-6细胞驯化前贴壁细胞单层的显微图；
图9是本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法实施例4所得全悬浮NBL-6细胞的显微图；
图10是本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法实施例5所述RK-13细胞驯化前贴壁细胞单层的显微图；
图11是本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法实施例5所得全悬浮RK-13细胞的显微图；
图12是本贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法实施例6所得全悬浮Vero细胞的显微图。
具体实施方式
以下用具体实施例对本发明技术方案做进一步描述，但本发明的保护范围不限制于下列实施例。
实施例1：
(1)将健康的BHK-21细胞常规培养在玻璃培养器皿中，至细胞单层贴壁达到80％，如图1所示；
(2)按质量/体积比：4000mg/L D-葡萄糖、100mg/L丙酮酸钠、40mg/L L-天冬酰胺、70mg/L L-丝氨酸、15mg/L次黄嘌呤、0.6mg/L胸苷、6mg/L胞苷和9mg/L鸟苷、8mg/L叶酸、0.6mg/L核黄素、4mg/L氯化胆碱、30mg/L肌醇、20～30mg/L硝酸铁、0.6mg/L硫酸亚铁、300mg/L氯化钾、700mg/L氯化钠、70mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠，以及2000mg/L剪切力保护剂和70mg/L抗细胞结团剂，制备无血清培养基，并分装与离心管中低温保存不少于24h，
(3)用磷酸盐缓冲溶液清洗细胞单层，用0.2％的胰酶EDTA消化沉淀的细胞团，将消化细胞接种至盛有无血清培养基的离心管中，置于离心机中以1000rpm离心沉降为3～5min，将沉淀转移至转瓶中培养；将转瓶置于转瓶机内以3rpm，于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下培养，每24h取样计数一次，续培养至96h，若96h活细胞密度高于2.0×106cells/mL，将使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0×106cells/mL，转瓶机调整至6rpm继续培养96h；若96h细胞密度低于1.0×106cells/mL，转瓶机停转静置沉降2～4h，如图3所示，弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.5×106cells/mL，继续培养96h；当二次96h培养后，细胞密度增长达到2.0×106cells/mL后，将细胞转到摇瓶中，添加新的无血清培养基将细胞起始密度调整至5×10cells/mL，将摇瓶置于培养箱摇床中以30rpm于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下，继续培养120h；120h后稀释传代，经连续5代摇瓶传代，保持120h活细胞密度增加不小于5倍，且活率高于95％，即可完成驯化，再经过至少7代摇瓶传代驯化培养后，即得到全悬浮BHK-21细胞系，如图2所示。
实施例2：
(1)将健康的BHK-21细胞常规培养在玻璃培养器皿中，至细胞单层贴壁达到80％，如图1所示；
(2)按质量/体积比：4000mg/L D-葡萄糖、100mg/L丙酮酸钠、40mg/L L-天冬酰胺、70mg/L L-丝氨酸、15mg/L次黄嘌呤、0.6mg/L胸苷、6mg/L胞苷和9mg/L鸟苷、8mg/L叶酸、0.6mg/L核黄素、4mg/L氯化胆碱、30mg/L肌醇、20～30mg/L硝酸铁、0.6mg/L硫酸亚铁、300mg/L氯化钾、700mg/L氯化钠、70mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠，以及2000mg/L剪切力保护剂和70mg/L抗细胞结团剂，制备无血清培养基，并分装与离心管中低温保存不少于24h，
(3)用磷酸盐缓冲溶液清洗细胞单层，用0.2％的胰酶EDTA消化沉淀的细胞团，将消化细胞接种至盛有无血清培养基的离心管中，置于离心机中以1000rpm离心沉降为3～5min，将沉淀转移至转瓶中培养；将转瓶置于转瓶机内以3rpm，于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下培养，每24h取样计数一次，续培养至96h，若96h活细胞密度高于2.0×106cells/mL，将使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0×106cells/mL，转瓶机调整至6rpm继续培养96h；若96h细胞密度低于1.0×106cells/mL，转瓶机停转静置沉降2～4h，如图3所示，弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.5×106cells/mL，继续培养96h；当二次96h培养后，细胞密度增长达到2.0×106cells/mL后，将细胞转到摇瓶中，添加新的无血清培养基将细胞起始密度调整至5×10cells/mL，将摇瓶置于培养箱摇床中以30rpm于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下，继续培养120h；120h后稀释传代，经连续5代摇瓶传代，保持120h活细胞密度增加不小于5倍，且活率高于95％，即可完成驯化，再经过至少7代摇瓶传代驯化培养后，即得到全悬浮BHK-21细胞系，如图2所示。
实施例2：
(1)将健康的PK-15细胞常规培养在玻璃培养器皿中，至细胞单层贴壁达到80％，如图3所示；
(2)按质量/体积比：4000mg/L D-葡萄糖、100mg/L丙酮酸钠、40mg/L L-天冬酰胺、70mg/L L-丝氨酸、15mg/L次黄嘌呤、0.6mg/L胸苷、6mg/L胞苷和9mg/L鸟苷、8mg/L叶酸、0.6mg/L核黄素、4mg/L氯化胆碱、30mg/L肌醇、20～30mg/L硝酸铁、0.6mg/L硫酸亚铁、300mg/L氯化钾、700mg/L氯化钠、70mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠，以及2000mg/L剪切力保护剂和70mg/L抗细胞结团剂，制备无血清培养基，并分装与离心管中低温保存不少于24h，
(3)用磷酸盐缓冲溶液清洗细胞单层，用0.2％的胰酶EDTA消化沉淀的细胞团，将消化细胞接种至盛有无血清培养基的离心管中，置于离心机中以1000rpm离心沉降为3～5min，将沉淀转移至转瓶中培养；将转瓶置于转瓶机内以3rpm，于温度38℃、CO浓度8％条件下培养，每24h取样计数一次，续培养至96h，若96h活细胞密度高于2.0×106cells/mL，将使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0×106cells/mL，转瓶机调整至6rpm继续培养96h；若96h细胞密度低于1.0×106cells/mL，转瓶机停转静置沉降2～4h，弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.5×106cells/mL，继续培养96h；当二次96h培养后，细胞密度增长达到2.0×106cells/mL后，将细胞转到摇瓶中，添加新的无血清培养基将细胞起始密度调整至5×10cells/mL，将摇瓶置于培养箱摇床中以30rpm于温度38℃、CO浓度8％条件下，继续培养120h；120h后稀释传代，经连续5代摇瓶传代，保持120h活细胞密度增加不小于5倍，且活率高于95％，即可完成驯化，再经过至少7代摇瓶传代驯化培养后，即得到全悬浮PK-15细胞系，如图4所示。
实施例3：
(1)将解冻的HEK-293T细胞升温培养在玻璃培养器皿中，至细胞单层贴壁达到80％，如图5所示；
(2)按质量/体积比：4000mg/L D-葡萄糖、100mg/L丙酮酸钠、40mg/L L-天冬酰胺、70mg/L L-丝氨酸、15mg/L次黄嘌呤、0.6mg/L胸苷、6mg/L胞苷和9mg/L鸟苷、8mg/L叶酸、0.6mg/L核黄素、4mg/L氯化胆碱、30mg/L肌醇、20～30mg/L硝酸铁、0.6mg/L硫酸亚铁、300mg/L氯化钾、700mg/L氯化钠、70mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠，以及2000mg/L剪切力保护剂和70mg/L抗细胞结团剂，制备无血清培养基，并分装与离心管中低温保存不少于24h，
(3)用磷酸盐缓冲溶液清洗细胞单层，用0.2％的胰酶EDTA消化沉淀的细胞团，将消化细胞接种至盛有无血清培养基的离心管中，置于离心机中以1000rpm离心沉降为3～5min，将沉淀转移至转瓶中培养；将转瓶置于转瓶机内以3rpm，于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下培养，每24h取样计数一次，续培养至96h，若96h活细胞密度高于2.0×106cells/mL，将使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0×106cells/mL，转瓶机调整至6rpm继续培养96h；若96h细胞密度低于1.0×106cells/mL，转瓶机停转静置沉降2～4h，弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.5×106cells/mL，继续培养96h；当二次96h培养后，细胞密度增长达到2.0×106cells/mL后，将细胞转到摇瓶中，添加新的无血清培养基将细胞起始密度调整至5×10cells/mL，将摇瓶置于培养箱摇床中以30rpm于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下，继续培养120h；120h后稀释传代，经连续5代摇瓶传代，保持120h活细胞密度增加不小于5倍，且活率高于95％，即可完成驯化，再经过至少7代摇瓶传代驯化培养后，即得到全悬浮HEK-293T细胞系，如图6所示。
实施例4：
(1)将健康的NBL-6细胞常规培养在玻璃培养器皿中，至细胞单层贴壁达到80％，如图7所示；
(2)按质量/体积比：4000mg/L D-葡萄糖、100mg/L丙酮酸钠、40mg/L L-天冬酰胺、70mg/L L-丝氨酸、15mg/L次黄嘌呤、0.6mg/L胸苷、6mg/L胞苷和9mg/L鸟苷、8mg/L叶酸、0.6mg/L核黄素、4mg/L氯化胆碱、30mg/L肌醇、20～30mg/L硝酸铁、0.6mg/L硫酸亚铁、300mg/L氯化钾、700mg/L氯化钠、70mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠，以及2000mg/L剪切力保护剂和70mg/L抗细胞结团剂，制备无血清培养基，并分装与离心管中低温保存不少于24h，
(3)用磷酸盐缓冲溶液清洗细胞单层，用0.2％的胰酶EDTA消化沉淀的细胞团，将消化细胞接种至盛有无血清培养基的离心管中，置于离心机中以1000rpm离心沉降为3～5min，将沉淀转移至转瓶中培养；将转瓶置于转瓶机内以3rpm，于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下培养，每24h取样计数一次，续培养至96h，若96h活细胞密度高于2.0×106cells/mL，将使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0×106cells/mL，转瓶机调整至6rpm继续培养96h；若96h细胞密度低于1.0×106cells/mL，转瓶机停转静置沉降2～4h，弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.5×106cells/mL，继续培养96h；当二次96h培养后，细胞密度增长达到2.0×106cells/mL后，将细胞转到摇瓶中，添加新的无血清培养基将细胞起始密度调整至5×10cells/mL，将摇瓶置于培养箱摇床中以30rpm于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下，继续培养120h；120h后稀释传代，经连续5代摇瓶传代，保持120h活细胞密度增加不小于5倍，且活率高于95％，即可完成驯化，再经过至少7代摇瓶传代驯化培养后，即得到全悬浮NBL-6细胞系，如图8所示。
实施例5：
(1)将解冻的RK-13细胞升温培养在玻璃培养器皿中，至细胞单层贴壁达到80％，如图9所示；
(2)按质量/体积比：4000mg/L D-葡萄糖、100mg/L丙酮酸钠、40mg/L L-天冬酰胺、70mg/L L-丝氨酸、15mg/L次黄嘌呤、0.6mg/L胸苷、6mg/L胞苷和9mg/L鸟苷、8mg/L叶酸、0.6mg/L核黄素、4mg/L氯化胆碱、30mg/L肌醇、20～30mg/L硝酸铁、0.6mg/L硫酸亚铁、300mg/L氯化钾、700mg/L氯化钠、70mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠，以及2000mg/L剪切力保护剂和70mg/L抗细胞结团剂，制备无血清培养基，并分装与离心管中低温保存不少于24h，
(3)用磷酸盐缓冲溶液清洗细胞单层，用0.2％的胰酶EDTA消化沉淀的细胞团，将消化细胞接种至盛有无血清培养基的离心管中，置于离心机中以1000rpm离心沉降为3～5min，将沉淀转移至转瓶中培养；将转瓶置于转瓶机内以3rpm，于温度38℃、CO浓度8％条件下培养，每24h取样计数一次，续培养至96h，若96h活细胞密度高于2.0×106cells/mL，将使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0×106cells/mL，转瓶机调整至6rpm继续培养96h；若96h细胞密度低于1.0×106cells/mL，转瓶机停转静置沉降2～4h，弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.5×106cells/mL，继续培养96h；当二次96h培养后，细胞密度增长达到2.0×106cells/mL后，将细胞转到摇瓶中，添加新的无血清培养基将细胞起始密度调整至5×10cells/mL，将摇瓶置于培养箱摇床中以30rpm于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下，继续培养120h；120h后稀释传代，经连续5代摇瓶传代，保持120h活细胞密度增加不小于5倍，且活率高于95％，即可完成驯化，再经过至少7代摇瓶传代驯化培养后，即得到全悬浮RK-13细胞系，如图10所示。
实施例6：
(1)将解冻的Vero细胞常规培养在玻璃培养器皿中，至细胞单层贴壁达到80％，未示出；
(2)按质量/体积比：4000mg/L D-葡萄糖、100mg/L丙酮酸钠、40mg/L L-天冬酰胺、70mg/L L-丝氨酸、15mg/L次黄嘌呤、0.6mg/L胸苷、6mg/L胞苷和9mg/L鸟苷、8mg/L叶酸、0.6mg/L核黄素、4mg/L氯化胆碱、30mg/L肌醇、20～30mg/L硝酸铁、0.6mg/L硫酸亚铁、300mg/L氯化钾、700mg/L氯化钠、70mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠，以及2000mg/L剪切力保护剂和70mg/L抗细胞结团剂，制备无血清培养基，并分装与离心管中低温保存不少于24h，
(3)用磷酸盐缓冲溶液清洗细胞单层，用0.2％的胰酶EDTA消化沉淀的细胞团，将消化细胞接种至盛有无血清培养基的离心管中，置于离心机中以1000rpm离心沉降为3～5min，将沉淀转移至转瓶中培养；将转瓶置于转瓶机内以3rpm，于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下培养，每24h取样计数一次，续培养至96h，若96h活细胞密度高于2.0×106cells/mL，将使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0×106cells/mL，转瓶机调整至6rpm继续培养96h；若96h细胞密度低于1.0×106cells/mL，转瓶机停转静置沉降2～4h，如图3所示，弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.5×106cells/mL，继续培养96h；当二次96h培养后，细胞密度增长达到2.0×106cells/mL后，将细胞转到摇瓶中，添加新的无血清培养基将细胞起始密度调整至5×10cells/mL，将摇瓶置于培养箱摇床中以30rpm于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下，继续培养120h；120h后稀释传代，经连续5代摇瓶传代，保持120h活细胞密度增加不小于5倍，且活率高于95％，即可完成驯化，再经过至少7代摇瓶传代驯化培养后，即得到全悬浮Vero细胞系，如图12所示。
本克服了现有悬浮驯化技术细胞贴壁展开面积对效率和产量的限制，以及培养过程中对血清的依赖，其通过细胞沉降后在合适条件下进行转瓶和摇瓶的两次分布，在无需依赖贴壁面积的情况下，不仅减少了工艺步骤、而且缩短了增值周期，使用由各类氨基酸和无机辅料制成的无血清培养基，在提供细胞驯化过程所需的营养物质的同时，不仅成本低、保藏时间长，而且质量稳定，有效的实现了生产规模的扩大，并保证了下游治疗性蛋白质和疫苗的纯化效率。
以上描述显示了本发明的主要特征、基本原理，以及本发明的优点。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施方式或者实施例的细节，且在不背离本发明的精神或者基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此应将上述实施方式或者实施例看作示范性的，且非限制性的。本发明的范围由所附权利要求而非上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其特征是：所述驯化方法包括以下步骤，
S1沉降：将目标细胞的贴壁细胞复苏，选择汇合度不小于20％的贴壁细胞，用0.2％的胰蛋白酶EDTA消化沉淀的细胞团，将消化细胞接种至盛有无血清培养基的离心管中，置于离心机中以1000rpm离心沉降，将沉淀转移至转瓶中培养；
S2一次分布：将转瓶置于转瓶机内以3rpm，于温度37℃、CO2浓度5％条件下培养，每24h取样计数一次，续培养至96h，若96h活细胞密度高于2.0×106cells/mL，将使用所述无血清培养基稀释细胞至1.0×106cells/mL，转瓶机调整至6rpm继续培养96h；若96h细胞密度低于1.0×106cells/mL，转瓶机停转静置沉降，弃去部分上清液，利用所述无血清培养基调整细胞至1.5×106cells/mL，继续培养96h；
S3二次分布：当二次96h培养后，细胞密度增长达到2.0×106cells/mL后，将细胞转到摇瓶中，添加新的无血清培养基将细胞起始密度调整至5×10cells/mL，将摇瓶置于培养箱摇床中以30rpm于温度于温度37℃、CO2浓度5％条件下，继续培养120h；
S4传代：120h后稀释传代，经连续5代摇瓶传代，保持120h活细胞密度增加不小于5倍，且活率高于95％，即可完成驯化，再经过至少5代摇瓶传代驯化培养后，即得到全悬浮细胞系。
2.根据权利要求1所述的贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其特征是：所述无血清培养基按以下质量/体积比制备，
4000mg/L D-葡萄糖、100mg/L丙酮酸钠、40mg/L L-天冬酰胺、70mg/L L-丝氨酸、15mg/L次黄嘌呤、0.6mg/L胸苷、6mg/L胞苷和9mg/L鸟苷、8mg/L叶酸、0.6mg/L核黄素、4mg/L氯化胆碱、30mg/L肌醇、20～30mg/L硝酸铁、0.6mg/L硫酸亚铁、300mg/L氯化钾、700mg/L氯化钠、70mg/L磷酸氢二钠、60～70mg/L磷酸二氢钠，以及2000mg/L剪切力保护剂和70mg/L抗细胞结团剂。
3.根据权利要求2所述的贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其特征是：所述目标细胞为Vero细胞、HEK-293T细胞、BHK-21细胞、PK-15细胞、NBL-6细胞或RK-13细胞。
4.根据权利要求3所述的贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其特征是：步骤S1所述离心沉降时间为3～5min。
5.根据权利要求3所述的贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其特征是：步骤S1所述静置沉降静置沉降时间为2～4h。
6.根据权利要求4或5所述的贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法，其特征是：所述全悬浮细胞系的比生长速率μ不小于8h-1。
CN202111073106.0A 2021-09-14 2021-09-14 一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法 Pending CN113684175A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111073106.0A CN113684175A (zh) 2021-09-14 2021-09-14 一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111073106.0A CN113684175A (zh) 2021-09-14 2021-09-14 一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113684175A true CN113684175A (zh) 2021-11-23

Family

ID=78586370

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111073106.0A Pending CN113684175A (zh) 2021-09-14 2021-09-14 一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113684175A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114196634A (zh) * 2021-12-15 2022-03-18 香港大学深圳医院 一种循环肿瘤细胞系的建立方法
CN116694575A (zh) * 2023-08-02 2023-09-05 上海澳斯康生物制药有限公司 悬浮培养Marc145细胞的方法

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1556203A (zh) * 2003-12-31 2004-12-22 中国人民解放军军事医学科学院生物工 动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法及其培养基
CN103468638A (zh) * 2013-09-23 2013-12-25 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种293细胞的大规模悬浮培养方法
CN105861422A (zh) * 2016-06-24 2016-08-17 广东温氏大华农生物科技有限公司 一种适应无血清全悬浮培养的mdck细胞系的制备方法及通过该制备方法获得的mdck细胞系
CN106011083A (zh) * 2016-06-24 2016-10-12 广东温氏大华农生物科技有限公司 一种在无血清全悬浮培养的mdck细胞生长的禽流感病毒的制备方法及获得的禽流感病毒
CN107142249A (zh) * 2017-05-08 2017-09-08 广东渔跃生物技术有限公司 一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法
CN107201333A (zh) * 2016-03-16 2017-09-26 金宇保灵生物药品有限公司 可悬浮培养的牛肾细胞在病毒培养及疫苗生产的应用
CN108396006A (zh) * 2018-01-25 2018-08-14 武汉珈创生物技术股份有限公司 一种bhk-21细胞株及其培养方法和用途
CN108865967A (zh) * 2017-05-11 2018-11-23 华威特（江苏）生物制药有限公司 一种快速驯化贴壁细胞为全悬浮细胞系的方法
CN111471644A (zh) * 2020-04-20 2020-07-31 常州艾米能斯生物科技有限公司 Chok1悬浮驯化无血清培养基及悬浮驯化方法
CN111944741A (zh) * 2020-08-21 2020-11-17 上海荣盛生物药业有限公司 Mdck细胞系的悬浮培养驯化方法
CN112063578A (zh) * 2020-08-21 2020-12-11 上海荣盛生物药业有限公司 适应全悬浮细胞培养的培养基及其制备方法和应用
CN112210530A (zh) * 2020-10-15 2021-01-12 山东信得动物疫苗有限公司 一种细胞全悬浮驯化方法、df-1细胞全悬浮驯化方法及应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1556203A (zh) * 2003-12-31 2004-12-22 中国人民解放军军事医学科学院生物工 动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法及其培养基
CN103468638A (zh) * 2013-09-23 2013-12-25 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种293细胞的大规模悬浮培养方法
CN107201333A (zh) * 2016-03-16 2017-09-26 金宇保灵生物药品有限公司 可悬浮培养的牛肾细胞在病毒培养及疫苗生产的应用
CN105861422A (zh) * 2016-06-24 2016-08-17 广东温氏大华农生物科技有限公司 一种适应无血清全悬浮培养的mdck细胞系的制备方法及通过该制备方法获得的mdck细胞系
CN106011083A (zh) * 2016-06-24 2016-10-12 广东温氏大华农生物科技有限公司 一种在无血清全悬浮培养的mdck细胞生长的禽流感病毒的制备方法及获得的禽流感病毒
CN107142249A (zh) * 2017-05-08 2017-09-08 广东渔跃生物技术有限公司 一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法
CN108865967A (zh) * 2017-05-11 2018-11-23 华威特（江苏）生物制药有限公司 一种快速驯化贴壁细胞为全悬浮细胞系的方法
CN108396006A (zh) * 2018-01-25 2018-08-14 武汉珈创生物技术股份有限公司 一种bhk-21细胞株及其培养方法和用途
CN111471644A (zh) * 2020-04-20 2020-07-31 常州艾米能斯生物科技有限公司 Chok1悬浮驯化无血清培养基及悬浮驯化方法
CN111944741A (zh) * 2020-08-21 2020-11-17 上海荣盛生物药业有限公司 Mdck细胞系的悬浮培养驯化方法
CN112063578A (zh) * 2020-08-21 2020-12-11 上海荣盛生物药业有限公司 适应全悬浮细胞培养的培养基及其制备方法和应用
CN112210530A (zh) * 2020-10-15 2021-01-12 山东信得动物疫苗有限公司 一种细胞全悬浮驯化方法、df-1细胞全悬浮驯化方法及应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114196634A (zh) * 2021-12-15 2022-03-18 香港大学深圳医院 一种循环肿瘤细胞系的建立方法
CN116694575A (zh) * 2023-08-02 2023-09-05 上海澳斯康生物制药有限公司 悬浮培养Marc145细胞的方法
CN116694575B (zh) * 2023-08-02 2023-12-01 上海澳斯康生物制药有限公司 悬浮培养Marc145细胞的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10221400B2 (en) Method of producing a polypeptide or virus of interest in a continuous cell culture
CN113684175A (zh) 一种贴壁细胞驯化悬浮细胞的方法
CN100362098C (zh) 适用于多种动物细胞大规模培养的无血清培养基
CN101864393B (zh) 一种用于Vero细胞微载体培养的无动物来源成分无血清培养基
JP2520681B2 (ja) 生合成のヒトの成長ホルモン製品
EP3708658A1 (en) Method for acclimating and suspending vero and second-order production process for virus
CN111944741B (zh) Mdck细胞系的悬浮培养驯化方法
CN108359632A (zh) Mdck细胞系、复制病毒的方法及其应用
CN111454877A (zh) 一种cho细胞培养方法
JP2003506077A (ja) 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用
US20070148753A1 (en) Preparation of cells for production of biologicals
US5156964A (en) Methods for adapting cells for increased product production through exposure to ammonia
CN111662882A (zh) 一种采用mdck细胞系增殖禽流感病毒的方法
JPS62500351A (ja) 微粒子担体からの足場依存性細胞の分離
Kratje et al. Cultivation of recombinant baby hamster kidney cells in a fluidized bed bioreactor system with porous borosilicate glass
Fong et al. Optimization of monoclonal antibody production: combined effects of potassium acetate and perfusion in a stirred tank bioreactor
CN112679601A (zh) 一种高比活性重组人促卵泡激素的制备方法
Terashima et al. Continuous production of human erythropoietin by immobilized recombinant L-929 cells
CN112210542A (zh) 一种用于培养df-1细胞的无血清培养基及其制备方法
El-Bagoury et al. Optimizing culture conditions for increasing production of vero cell
Bols et al. Media for hybridoma growth and monoclonal antibody production
CN113355297A (zh) 一种灌流式培养全悬浮mdck细胞生产重组禽流感病毒的方法
AU2021201392A1 (en) Three-dimensional dynamic culture method for in-vitro expansion of spermatogonial stem cells using microcarriers
ROLLERS INSERM U 284 54511 VANDOEUVRE-LES-NANCY Cedex FRANCE
CN115322955A (zh) 一种全悬浮无血清型pk-15细胞的驯化方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination